化学发光酶免疫法检测玉米中玉米赤霉烯酮

*

化学发光酶免疫法检测玉米中玉米赤霉烯酮

卢江,许杨,楚金申,谢琳

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,330047)中德联合研究院,江西南昌,

应用抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体,以辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系,建立了一种

快速、高特异性的间接竞争化学发光酶免疫法用于检测玉米中的玉米赤霉烯酮。所建立的方法分析灵敏简便、

度为0.09ng/mL,批内变异系数小于9.1﹪,批间变异系数小于14.7﹪,样品的加标回收率为79.6﹪~97.6﹪,所建立的标准曲线相关系数为0.9884,检测线性范围为0.104~1.69ng/mL,检测时间为60min。关键词

玉米赤霉烯酮(ZEN),间接竞争化学发光酶免疫法(CLEIA),检测

[7-10][11]

、气相色谱法(GC/MS)和酶联谱(HPLC)法

[12-13]

免疫吸附法(ELISA)等。前两种方法灵敏、准确,但耗时,费力,成本高且需要昂贵的设备和专业的

ZEN)化学名称为6-玉米赤霉烯酮(zearalenone,

(10-6-2羟基-氧基碳烯基)-β-雷锁酸-μ-内酯,又名F-毒素。是一种主要由镰刀菌

[1]

在玉米、谷物上生长

过程中所产生具有雌激素作用的真菌毒素。ZEN对DNA和染色体毒性、人体及动物具有生殖毒性、免疫能诱发肿瘤等作用毒性、

[2]

人员操作;酶联免疫吸附法快速、特异性好,但灵敏度不够高。间接竞争化学发光酶免疫法既具有放射免疫法的高灵敏度,又具有酶联免疫法操作简便、快速

线性范围宽、测试中无需使用对人体有害的的特点,试剂

[14]

,主要通过影响机体的生

[3]

殖性能,引起细胞凋亡、致畸、损伤DNA、氧化损害、影响免疫机能等机制来影响动物与人类的健康

鉴于ZEN的毒性,为了减少或防止其对动物毒害及对人体健康的影响,很多国家都制定了饲料和粮食中ZEN的限量标准,我国将该指标定为:小麦、玉米中ZEN不得超过60μg/kg[4],饲料中ZEN不得超过500μg/kg[5]。

表1

国家

澳大利亚

。因此建立这种毒素的化学发光酶免疫检测

方法意义重大。

本研究利用鲁米诺-过氧化氢化学发光体系建立了检测玉米中玉米赤霉烯酮的间接竞争化学发光酶

免疫法(CLEIA),该法与传统的间接竞争酶免疫法(ELISA)相比较,灵敏度提高了3.33倍,同时保持了传统的间接竞争酶免疫法(ELISA)简单快速,特异性为检测玉米中玉米赤霉烯酮的污染提供了好的特点,方法学依据。

各国对ZEN的限量标准

食品、饲料谷物(食品)

饲料(青春期雌猪)牛饲料

饲料(青春期雌猪)谷物、植物油饲料孕期雌猪儿童饲料

谷物谷物、植物油、所有食品玉米

谷物、可食性种子、豆类

[6]

ZEN的限量/

(μg·kg-1)

[***********]0100302000

1

1.1

材料与方法

试验材料

德国法国匈牙利意大利罗马尼亚巴西芬兰

ZEN)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,伏马菌素B1

(FumonisinB1,FB1)、伏马菌素B2(FumonisinB2,FB2)、OTA)、赭曲霉毒素A(ochratoxinA,黄曲霉毒

AFB1)、HRP,Sigma素B1(AflatoxinsB1,羊抗鼠IgG-公司;辣根过氧经物酶(HRP)(RZ>3),上海生工;

ZEN人工抗原、含民ZEN单克隆抗体的小鼠腹水,本实验室自制;玉米、玉米饲料,购自农户、养猪厂或超市;检测谷物中ZEN的ELISA试剂盒,南昌博恒生物Pierce公司(USA)。制品公司。化学发光底物液,1.2仪器与设备

台式高速冷冻离心机(SORVALLBlofugestra-tos),Q超纯水仪,美国Mil-德国Heraeus公司;Mill-

目前常用的检测ZEN的方法主要有高效液相色

第一作者:硕士研究生(许杨教授为通讯作者)。

*国家“863”计划项目(2007AA10Z427)收稿日期:2010-12-10,改回日期:2011-01-21

lipore公司;单管可调微量移液器、酶联免疫检测仪,芬兰Labsystems公司;96孔化学发光板,深圳金灿华公司;化学发光检测仪,Thermo公司(USA)。1.3溶液配制

1×PBS磷酸缓冲液(0.01mol/L,pH值7.4):NaCl8.0g,KH2PO40.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,KCl0.2g,蒸馏水定容至1000mL。

PBST(洗液):NaCl8.0g,KH2PO40.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,KCl0.2g,Tween-200.5mL,蒸馏水定容至1000mL。

pH值9.6):NaH-碳酸盐缓冲液(0.10mol/L,CO34.2g,Na2CO35.3g蒸馏水溶解,蒸馏水定容至1L。1.4

试验方法与步骤

1.4.1CLEIA的基本步骤

(1)用0.05mol/mL磷酸缓冲液稀释抗原至1.4

4℃包被12h;μg/mL向微孔板中每孔加100μL,

(2)用PBST洗板液洗板3次,每孔加300μL封

37℃封闭1h;闭液(5%的脱脂牛奶),

(3)甩弃封闭液洗板3次,在吸水纸上拍干微孔

板,每孔中加入标准品或样品50μL,同时加入1∶40000倍稀释的抗体溶液50μL,37℃温育混匀,30min;

(4)甩弃孔中液体洗板4次,加入1∶2000稀释

HRP,100μL/孔,37℃温育30min;的羊抗鼠IgG-(5)甩弃孔中液体洗板4次,拍干微孔板,每孔

加发光底物液100μL,用化学发光检测仪测量相对RLU)。发光强度单位(relativelightunits,1.4.2建立CLEIA方法检测ZEN

15],RLUmax/IC50越大,CLEIA的灵敏据文献[

度和重复性则越好,因此引入RLUmax/IC50评价各种因素的影响(RLUmax是实验中测得的相对发光强度

IC50值为相对化学发光强度最大值50%时的最大值,

对应ZEN标准品的浓度值)。

1.4.3抗原包被浓度的确定

(1)采用磷酸缓冲液分别稀释抗原至0.6、1.0、1.4、1.8、2.2μg/mL分别向微孔板中每孔加100μL,4℃包被12h;

(2)其他步骤同1.4.1中的(2)~(5)。

(3)按照IC50和RLUmax/IC50的变化规律确定抗原包被浓度。

1.4.4抗体工作浓度的确定

(1)采用1.4.3确定的最佳的抗原包被浓度包

被化学发光板;

(2)封闭同1.4.1的(2)

(3)甩弃封闭液洗板3次,在吸水纸上拍干,每10同时加入5000、孔中加入标准品或样品50μL,20000、40000倍稀释的抗体溶液50μL,000、混匀,37℃温育30min;

(4)其他步骤同1.4.1:(4)~(5);

(5)按照IC50和RLUmax/IC50的变化规律确定抗体的稀释倍数。

1.4.5竞争反应时间的确定

(1)包被抗原和封闭同1.4.1中的A~B;(2)甩弃封闭液洗板3次,在吸水纸上拍干,每孔中加入标准品或样品50μL,同时加入1.4.4中确

37℃分别温混匀,定的稀释倍数的抗体溶液50μL,10、15、20、25min竞争反应;育5、

(3)其他步骤同1.4.1中的(4)~(5);

(4)按照IC50和RLUmax/IC50的变化规律确定竞争反应时间。1.4.6

HRP的工作浓度的确定羊抗鼠IgG-(1)包被抗原和封闭同1.4.1的A~B;

(2)甩弃封闭液洗板3次,在吸水纸上拍干,每

孔中加入标准品或样品50μL,同时加入1.4.4中确定的稀释倍数的抗体溶液50μL,混匀,按照1.4.5中确定的竞争反应时间37℃温育;

(3)甩弃孔中液体洗板4次,分别加入1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP,100μL/孔,37℃温育30min;

(4)同1.4.1中的E

(5)按照IC50和RLUmax/IC50的变化规律确定羊HRP的工作浓度。抗鼠IgG-1.4.7羊抗鼠IgG-HRP孵育时间的确定

(1)步骤同1.4.6中的(1)~(2);(2)甩弃孔中液体洗板4次,按照1.4.6中确定

HRP,的稀释倍数稀释羊抗鼠IgG-每孔加入100μL,37℃分别温育20、25、30、35、40、45min;

(3)同1.4.1中的(5);

(4)按照IC50和RLUmax/IC50的变化规律确定羊

HRP的温育时间。抗鼠IgG-1.4.81.4.8.1

CLEIA方法学分析

标准曲线

准确称取4.0mgZEN标准品溶于1mL蒸馏水中,配制成4mg/mLZEN标准品母液,将ZEN标准品

0.2、0.375、0.75、母液分别稀释至终浓度为0.1、

161

1.5、3ng/mL,14]建立CLEIA标准曲线。参照文献[1.4.8.2灵敏度

计算相对发光强度对零标准点平行测定10次,

再由平均值减去两倍标准偏的平均值及其标准偏差,

差,得出的值代入校准曲线所求得的浓度即是灵敏

度,重复实验3次,计算平均灵敏度。1.4.8.3

批内批间变异测定

随机抽取板条分别进行3个批次的包被,每批次6个平行进行测定,分别计算IC50的批内及批间变异。1.4.8.4

回收率

2

2.1

结果与分析

CLEIA方法的建立抗原包被浓度的选择

2.1.1

1.0、1.4、采用磷酸缓冲液分别稀释抗原至0.6、

1.8、2.2μg/mL,1,操作步骤参照1.4.3,结果如,由IC50随着抗原包被浓度的增大逐渐增大,图1可见,

RLUmax/IC50随着抗原浓度的增大先增大然后减小,在抗原浓度为1.4μg/mL时达到最大,因此选用1.4μg/mL作为抗原包被浓度。

200、500μg/kg的在玉米样品中分别添加50、

ZEN标准品,依照1.4.8.6进行样品提取,用CLEIA检测样品中ZEN的含量。1.4.8.5特异性

FB1、FB2、选取五种常见的真菌毒素(AFB1)、脱

氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和OTA,采用CLEIA方法测定了与ZEN的交叉反应。

1.4.8.6CLEIA方法快速筛查样品

(1)称取5g粉碎样品于100mL带塞三角瓶内,准确加入25mL60%甲醇水溶液V(甲醇)∶V(水)=60∶40)。将加入甲醇水的样品放入振荡器内,充分振荡3min后,用定性滤纸过滤,取滤液2mL,加入6mL20%甲醇水溶液,混匀,用定性滤纸过滤,滤液为样品待检液。

(2)按照1.4.3确定的抗原浓度包被化学发光

4℃包被12h;板,每孔100μL,(3)封闭同1.4.1的B;

(4)用PBST洗酶标板4次,拍干,加入不同浓度

1.5,0.75,0.375,0.2,0.1,0的ZEN标准溶液(10.0,

ng/mL的ZEN)或样品提取液(待测样品),同时加入

抗ZEN单克隆抗体(以1.4.4确定的稀释倍数稀释)50μL,37℃,混匀,恒温一定时间(按1.4.5确定的竞争反应时间反应)。

(5)甩弃孔中液体洗板4次,加入羊抗鼠IgG-HRP(以1.4.6确定的稀释倍数稀释),100μL/孔,37℃温育一定时间(以1.4.7确定的孵育时间为准)。

(6)甩弃孔中液体洗板4次,拍干,每孔加发光底物液100μL,用化学发光检测仪测量相对发光强度单位。

(7)对应标准抑制曲线计算测定结果。

2.1.3

图2

CLEIA抗体稀释倍数的优化图1

CLEIA抗原包被浓度的优化

2.1.2抗体工作浓度的选择

10000、用磷酸缓冲液将抗体分别稀释5000、

20000、40000倍,操作步骤参照1.4.4。结果如图2。由图2可见,IC50逐渐随着抗体稀释倍数的增大,

RLUmax/IC50逐渐增大趋于平稳,同时又考虑减小,

到RLUmax的值会随着抗体稀释倍数的提高而下降,为保证一定发光强度,因此将抗体的稀释倍数定为40000倍。

竞争反应时间的选择

按照1.4.5操作步骤分别选择竞争反应时间为10、20、30、40min,结果如图3。由图3可见随着竞争IC50呈现逐渐增大的趋势,RLUmax/IC50时间的延长,

无明显变化,同时考虑到减少反应时间的原则,选定20min作为竞争反应时间。

图3CLEIA竞争反应时间的优化图5CLEIA羊抗鼠IgG-HRP工作浓度的优化

2.1.4

HRP孵育时间的确定羊抗鼠IgG-HRP按照1.4.6操作步骤分别选择羊抗鼠IgG-

30、40、50min。实验结果如图4。由孵育时间为20、

IC50缓慢增大,RLU-图4可见随着孵育时间的增长,

max/IC50先增大然后趋于平稳,同时考虑到减少反应时间的原则选定40min作为孵育时间。

图6CLEIA的标准曲线

敏度为0.09ng/mL,较ELISA的0.3ng/mL提高了

3.33倍;IC50的批内变异系数为6.9%~9.1%,批间变异系数为14.7%。具体结果见表3

表3

图4

CLEIA羊抗鼠IgG-HRP孵育时间的优化

批次1(n=6)

2(n=6)3(n=6)

CLEIA对ZEN测定的精密度

CLEIA

检测50ng·mL-10.37820.44510.5085

批内变异/

%8.76.99.1

批间变异/

%14.7

2.1.5HRP工作浓度的确定羊抗鼠IgG-

用磷酸缓冲液将抗体分别稀释1∶1000、

1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000稀释羊抗鼠IgG-HRP,操作步骤参照1.4.7。结果如图5,表2。由图5可见,HRP稀释倍数的增大,RLU-随着羊抗鼠IgG-max/IC50逐渐减小,但从表2中可以看出若羊抗鼠IgG-HRP稀释倍数过小,发光本底会增大,考虑到IC50选定1∶2000作为羊抗鼠IgG-HRP工作浓度。

HRP稀释倍数对发光本底的影响表2羊抗鼠IgG-HRP羊抗鼠IgG-稀释倍数10003.223

20001.516

30001.838

40001.476

50001.384

2.1.8

回收率

按照1.4.8.4方法分析回收率,结果见表4,由

CLEIA加标回收率在79.6%~97.6%。表4知,

表4

CLEIA对玉米中ZEN测定的加标回收率

CLEIA(n=3)

检测平均值/(μg·kg-1)

40.2195.1398.1

回收率/%80.497.679.6

变异/%9.25.88.7

加标浓度/(μg·kg-1)

50200500

2.1.6CLEIA标准曲线的建立

2.1.9

特异性

FB1、FB2、选取5种常见的真菌毒素:AFB1、

按照1.4.8.1绘制CLEIA标准曲线见图6。线

2

性回归方程为Y=-22.19Ln(X)+31.69(R=IC50=0.4381ng/mL,0.9884),检测范围(IC20~IC80)为0.104~1.69ng/mL。

2.1.7灵敏度和精密度

按照1.4.8.2和1.4.8.3计算得CLEIA平均灵

DON和OTA,采用CLEIA方法测定了与ZEN的交叉反应率,结果(图7)未见有交叉反应。

2.2CLEIA与ELISA试剂盒样品检测对照

分别采用CLEIA和ELISA测定了在南昌市场上

163

3结论

(1)采用HRP催化鲁米诺-过氧化氢化学发光优化并确定了化学发光酶免疫反应的各种条件体系,

4℃包被12h,1∶40000为:稀释抗原至1.4μg/mL,

1:2000稀释羊抗鼠稀释ZEN抗体竞争反应20min,

IgG-HRP孵育反应40min。

(2)建立了测定玉米中ZEN化学发光酶免疫分析方法,方法分析灵敏度为0.09ng/mL,批内变异系批间变异系数小于14.7﹪,以玉米为数小于9.1﹪,

样品的分析回收率为79.6﹪~97.6﹪,所建立的标检测线性范围为0.104~准曲线相关系数为0.9884,

1.69ng/mL,样品检测时间为60min。

(3)建立的CLEIA与ELISA试剂盒相比灵敏度提高了3.33倍。采用CLEIA和ELISA试剂盒测定了40份市场样品,并进行了对照,两者的线性相关系数为0.967。

图7ZEN与其他5种常见真菌毒素的交叉反应试验

随机购买的40份玉米样品,两种方法检测结果见表

5,ELISA测定值为Y轴,以CLEIA的测定值为X轴,作图得相关曲线,如图8,线性拟合的方程为Y=0.9984X+11.256,相关系数为0.967。

表5

样品号[***********][1**********]20

CLEIA和ELISA试剂盒的样品测定结果

CLEIA/

ELISA/μg·kg-1

453.9373.4151.8380.2129.812.393.9<6<6<6106.5330.98.9321.6647.39.2514.912.716.9576.6

样品号[***********][***********]3940

CLEIA/μg·kg-1

3.46311.951.819.4108.723.1<286.421.74.3103.648.1198.6164.532.9<231.12.787.1

ELISA/μg·kg-1

<6

57.38.657.123.5145.124.4<695.724.4<683.854.2217.4228.228.7<636.1<679.3

μg·kg-1485.5309.9123.1298.8124.812.884.72.83.23.883.2218.15.1246.7672.65.3589.511.918.6543.1

[1]ZinedineA,SorianoJM,MoltoJC,etal.Reviewonthe

toxicity,occurrence,metabolism,detoxification,regulationsandintakeofzearalenone:Anoestrogenicmycotoxin[J].2007,45(1):1-18.FoodAndChemicalToxicology,

[2]GromadzkaK,WaskiewiczA,ChelkowskiJ,etal.

tox-Zearalenoneanditsmetabolites:occurrence,detection,icityandguidelines[J].WorldMycotoxinJounal,2008,1(2):209-220.

[3]邓友田,J].动袁慧.玉米赤霉烯酮毒性机理研究进展[

2007,28(2):89-92.物医学进展,

[4]GB2715-2005.粮食卫生标准[S].

[5]GB13078.2-2006.饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯

S].酮的允许量[

[6]章英.建立IAC-HPLC检测谷物中的玉米赤霉烯酮和

D].南昌:南昌大学,2007.赭曲霉毒素A[

[7]王向红,刘涛,王忠斌,等.高效液相色谱法同时测定谷

.中国食品学物中的赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮[J]2008,8(5):148-152.报,

[8]尹青岗,王峰,周红杰等.高效液相色谱法对玉米中玉

.中国粮油学报,2009,24(7):米赤霉烯酮的测定[J]138-141.

[9]BlajovaE,RuovaD.Singlelaboratory-validatedHPLC

methodsfordeterminationofochratoxinA,fumonisinB1

图8CLEIA的测定值与ELISA试剂盒测定值的相关性

andB2,zearalenoneanddeoxynivalenolincerealsandce-real-basedfoods[J].JournalofFoodAndNutritionRe-seach,2010,2:57-68.

[10]

BerthillerF,SchuhmacherR,ButtingerG,etal.RapidsimultaneousdeterminationofmajortypeA-andB-tricho-thecenesaswellaszearalenoneinmaizebyhighperform-anceliquidchromatography-tandemmassspectrometry[J].JournalofChromatographyA,2005,1062:209-216.

[11]TanakaT,YonedaA,InoueS,etal.Simultaneousdetermi-nationoftrichothecenemycotoxinsandzearalenoneince-J].Jour-realsbygaschromatography-massspectrometry[nalofChromatographyA,2000,882:23-28.

[12]刘涛,王向红,常彧,等.直接竞争酶联免疫吸附法检测

[15]

.食品与机械,2008,24大麦中的玉米赤霉烯酮[J](2):97-100.

[13]王玉平,计融,江涛,等.玉米赤霉烯酮ELISA定量检

.卫生研究,2006,35(2):221-测试剂盒研制[J]224.

[14]JimenezAM,NavasMJ.Chemiluminescencemethods

(presentandfuture)[J].GrasasgAceites,2002.53:64-75.

immunosorbentassayforthedeterminationoffumonisinB1infoodsamples[J].AnalyticaChimicaActa,2006,580:1-8.

ChemiluminescenceEnzymeImmunoassayforthe

DeterminationofZearalenoneinCorn

LuJiang,XuYang,ChuJin-shen,XieLin

(Sino-GermanyJointResearchInstitute,TheStateKeyLaboratoryofFoodScience

andTechnology,NanchangUniversity,Nanchang330047,China)

ABSTRACTAsensitiveindirectcompetitivechemiluminescenceenzymeimmunoassay(CLEIA)forzearalenonein

cornhasbeendeveloped.TheoptimizedCLEIAgavealimitdetectionof0.09ng/mLandadetectionrangeof0.104-1.69ng/mL,withanIC50of0.4381ng/mLanditwasabout3timesmoresensitivethanthatofcolorimetricELISA.Ithasbeenvalidatedoncerealssamplesintermsofprecision(intra-andinterassaycoefficientvariationsoflessthan9.1﹪and14.7﹪,respectively)andaccuracy(meanrecovery79.6﹪~97.6﹪).Theseassayperformancesindicated

thatCLEIAwascapableofbeingappliedforthespecificdetectionandroutinemonitoringofZENincornsamples.Keywords

zearalenone(ZEN),chemiluminescenceenzymeimmunoassay(CLEIA),determination

(上接第159页)

TheInfluenceofMembrane'sTypeandthePretreatmentMethodstotheDetectionofStaphylococcalEnterotoxinA,BandCin

RawMilkbyLateralFlowTestStrips

LinSong,HeYan-ling,WangLi-zhe,ZhaoYu,YuanFei,

YangHai-rong,ChenYing

ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100123,China)

ABSTRACTToestablishrapidassaysforindividualdetectionofStaphylococalEnterotoxinA,BandC(SEA,

SEB,SEC)inrawmilksamples,LateralFlowImmunoassayteststripswerestudied.Themodelsofnitrocellulose-membraneandthepretreatmentmethodsofrawmilkwerechosenandoptimized,andthemembraneofHF09002andthemethodof2timesdilutionshowedthebestresultforthefielddetectionofrawmilksamples.TheSensitivtiesofStaphylococcalEnterotoxinA,BandCteststripswere10ng/mL,4ng/mLand8ng/mL,andthereisnoobservedifferenceobjectedthatcomparedwith3M(tm)Tecra(tm)StaphEnterotoxinIDTestmethod.Keywords

StaphenterotoxinA,BandC,Tawmilk,lateralflowimmunoassay

165

*

化学发光酶免疫法检测玉米中玉米赤霉烯酮

卢江,许杨,楚金申,谢琳

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,330047)中德联合研究院,江西南昌,

应用抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体,以辣根过氧化物酶催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系,建立了一种

快速、高特异性的间接竞争化学发光酶免疫法用于检测玉米中的玉米赤霉烯酮。所建立的方法分析灵敏简便、

度为0.09ng/mL,批内变异系数小于9.1﹪,批间变异系数小于14.7﹪,样品的加标回收率为79.6﹪~97.6﹪,所建立的标准曲线相关系数为0.9884,检测线性范围为0.104~1.69ng/mL,检测时间为60min。关键词

玉米赤霉烯酮(ZEN),间接竞争化学发光酶免疫法(CLEIA),检测

[7-10][11]

、气相色谱法(GC/MS)和酶联谱(HPLC)法

[12-13]

免疫吸附法(ELISA)等。前两种方法灵敏、准确,但耗时,费力,成本高且需要昂贵的设备和专业的

ZEN)化学名称为6-玉米赤霉烯酮(zearalenone,

(10-6-2羟基-氧基碳烯基)-β-雷锁酸-μ-内酯,又名F-毒素。是一种主要由镰刀菌

[1]

在玉米、谷物上生长

过程中所产生具有雌激素作用的真菌毒素。ZEN对DNA和染色体毒性、人体及动物具有生殖毒性、免疫能诱发肿瘤等作用毒性、

[2]

人员操作;酶联免疫吸附法快速、特异性好,但灵敏度不够高。间接竞争化学发光酶免疫法既具有放射免疫法的高灵敏度,又具有酶联免疫法操作简便、快速

线性范围宽、测试中无需使用对人体有害的的特点,试剂

[14]

,主要通过影响机体的生

[3]

殖性能,引起细胞凋亡、致畸、损伤DNA、氧化损害、影响免疫机能等机制来影响动物与人类的健康

鉴于ZEN的毒性,为了减少或防止其对动物毒害及对人体健康的影响,很多国家都制定了饲料和粮食中ZEN的限量标准,我国将该指标定为:小麦、玉米中ZEN不得超过60μg/kg[4],饲料中ZEN不得超过500μg/kg[5]。

表1

国家

澳大利亚

。因此建立这种毒素的化学发光酶免疫检测

方法意义重大。

本研究利用鲁米诺-过氧化氢化学发光体系建立了检测玉米中玉米赤霉烯酮的间接竞争化学发光酶

免疫法(CLEIA),该法与传统的间接竞争酶免疫法(ELISA)相比较,灵敏度提高了3.33倍,同时保持了传统的间接竞争酶免疫法(ELISA)简单快速,特异性为检测玉米中玉米赤霉烯酮的污染提供了好的特点,方法学依据。

各国对ZEN的限量标准

食品、饲料谷物(食品)

饲料(青春期雌猪)牛饲料

饲料(青春期雌猪)谷物、植物油饲料孕期雌猪儿童饲料

谷物谷物、植物油、所有食品玉米

谷物、可食性种子、豆类

[6]

ZEN的限量/

(μg·kg-1)

[***********]0100302000

1

1.1

材料与方法

试验材料

德国法国匈牙利意大利罗马尼亚巴西芬兰

ZEN)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone,伏马菌素B1

(FumonisinB1,FB1)、伏马菌素B2(FumonisinB2,FB2)、OTA)、赭曲霉毒素A(ochratoxinA,黄曲霉毒

AFB1)、HRP,Sigma素B1(AflatoxinsB1,羊抗鼠IgG-公司;辣根过氧经物酶(HRP)(RZ>3),上海生工;

ZEN人工抗原、含民ZEN单克隆抗体的小鼠腹水,本实验室自制;玉米、玉米饲料,购自农户、养猪厂或超市;检测谷物中ZEN的ELISA试剂盒,南昌博恒生物Pierce公司(USA)。制品公司。化学发光底物液,1.2仪器与设备

台式高速冷冻离心机(SORVALLBlofugestra-tos),Q超纯水仪,美国Mil-德国Heraeus公司;Mill-

目前常用的检测ZEN的方法主要有高效液相色

第一作者:硕士研究生(许杨教授为通讯作者)。

*国家“863”计划项目(2007AA10Z427)收稿日期:2010-12-10,改回日期:2011-01-21

lipore公司;单管可调微量移液器、酶联免疫检测仪,芬兰Labsystems公司;96孔化学发光板,深圳金灿华公司;化学发光检测仪,Thermo公司(USA)。1.3溶液配制

1×PBS磷酸缓冲液(0.01mol/L,pH值7.4):NaCl8.0g,KH2PO40.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,KCl0.2g,蒸馏水定容至1000mL。

PBST(洗液):NaCl8.0g,KH2PO40.2g,Na2HPO4·12H2O2.9g,KCl0.2g,Tween-200.5mL,蒸馏水定容至1000mL。

pH值9.6):NaH-碳酸盐缓冲液(0.10mol/L,CO34.2g,Na2CO35.3g蒸馏水溶解,蒸馏水定容至1L。1.4

试验方法与步骤

1.4.1CLEIA的基本步骤

(1)用0.05mol/mL磷酸缓冲液稀释抗原至1.4

4℃包被12h;μg/mL向微孔板中每孔加100μL,

(2)用PBST洗板液洗板3次,每孔加300μL封

37℃封闭1h;闭液(5%的脱脂牛奶),

(3)甩弃封闭液洗板3次,在吸水纸上拍干微孔

板,每孔中加入标准品或样品50μL,同时加入1∶40000倍稀释的抗体溶液50μL,37℃温育混匀,30min;

(4)甩弃孔中液体洗板4次,加入1∶2000稀释

HRP,100μL/孔,37℃温育30min;的羊抗鼠IgG-(5)甩弃孔中液体洗板4次,拍干微孔板,每孔

加发光底物液100μL,用化学发光检测仪测量相对RLU)。发光强度单位(relativelightunits,1.4.2建立CLEIA方法检测ZEN

15],RLUmax/IC50越大,CLEIA的灵敏据文献[

度和重复性则越好,因此引入RLUmax/IC50评价各种因素的影响(RLUmax是实验中测得的相对发光强度

IC50值为相对化学发光强度最大值50%时的最大值,

对应ZEN标准品的浓度值)。

1.4.3抗原包被浓度的确定

(1)采用磷酸缓冲液分别稀释抗原至0.6、1.0、1.4、1.8、2.2μg/mL分别向微孔板中每孔加100μL,4℃包被12h;

(2)其他步骤同1.4.1中的(2)~(5)。

(3)按照IC50和RLUmax/IC50的变化规律确定抗原包被浓度。

1.4.4抗体工作浓度的确定

(1)采用1.4.3确定的最佳的抗原包被浓度包

被化学发光板;

(2)封闭同1.4.1的(2)

(3)甩弃封闭液洗板3次,在吸水纸上拍干,每10同时加入5000、孔中加入标准品或样品50μL,20000、40000倍稀释的抗体溶液50μL,000、混匀,37℃温育30min;

(4)其他步骤同1.4.1:(4)~(5);

(5)按照IC50和RLUmax/IC50的变化规律确定抗体的稀释倍数。

1.4.5竞争反应时间的确定

(1)包被抗原和封闭同1.4.1中的A~B;(2)甩弃封闭液洗板3次,在吸水纸上拍干,每孔中加入标准品或样品50μL,同时加入1.4.4中确

37℃分别温混匀,定的稀释倍数的抗体溶液50μL,10、15、20、25min竞争反应;育5、

(3)其他步骤同1.4.1中的(4)~(5);

(4)按照IC50和RLUmax/IC50的变化规律确定竞争反应时间。1.4.6

HRP的工作浓度的确定羊抗鼠IgG-(1)包被抗原和封闭同1.4.1的A~B;

(2)甩弃封闭液洗板3次,在吸水纸上拍干,每

孔中加入标准品或样品50μL,同时加入1.4.4中确定的稀释倍数的抗体溶液50μL,混匀,按照1.4.5中确定的竞争反应时间37℃温育;

(3)甩弃孔中液体洗板4次,分别加入1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP,100μL/孔,37℃温育30min;

(4)同1.4.1中的E

(5)按照IC50和RLUmax/IC50的变化规律确定羊HRP的工作浓度。抗鼠IgG-1.4.7羊抗鼠IgG-HRP孵育时间的确定

(1)步骤同1.4.6中的(1)~(2);(2)甩弃孔中液体洗板4次,按照1.4.6中确定

HRP,的稀释倍数稀释羊抗鼠IgG-每孔加入100μL,37℃分别温育20、25、30、35、40、45min;

(3)同1.4.1中的(5);

(4)按照IC50和RLUmax/IC50的变化规律确定羊

HRP的温育时间。抗鼠IgG-1.4.81.4.8.1

CLEIA方法学分析

标准曲线

准确称取4.0mgZEN标准品溶于1mL蒸馏水中,配制成4mg/mLZEN标准品母液,将ZEN标准品

0.2、0.375、0.75、母液分别稀释至终浓度为0.1、

161

1.5、3ng/mL,14]建立CLEIA标准曲线。参照文献[1.4.8.2灵敏度

计算相对发光强度对零标准点平行测定10次,

再由平均值减去两倍标准偏的平均值及其标准偏差,

差,得出的值代入校准曲线所求得的浓度即是灵敏

度,重复实验3次,计算平均灵敏度。1.4.8.3

批内批间变异测定

随机抽取板条分别进行3个批次的包被,每批次6个平行进行测定,分别计算IC50的批内及批间变异。1.4.8.4

回收率

2

2.1

结果与分析

CLEIA方法的建立抗原包被浓度的选择

2.1.1

1.0、1.4、采用磷酸缓冲液分别稀释抗原至0.6、

1.8、2.2μg/mL,1,操作步骤参照1.4.3,结果如,由IC50随着抗原包被浓度的增大逐渐增大,图1可见,

RLUmax/IC50随着抗原浓度的增大先增大然后减小,在抗原浓度为1.4μg/mL时达到最大,因此选用1.4μg/mL作为抗原包被浓度。

200、500μg/kg的在玉米样品中分别添加50、

ZEN标准品,依照1.4.8.6进行样品提取,用CLEIA检测样品中ZEN的含量。1.4.8.5特异性

FB1、FB2、选取五种常见的真菌毒素(AFB1)、脱

氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和OTA,采用CLEIA方法测定了与ZEN的交叉反应。

1.4.8.6CLEIA方法快速筛查样品

(1)称取5g粉碎样品于100mL带塞三角瓶内,准确加入25mL60%甲醇水溶液V(甲醇)∶V(水)=60∶40)。将加入甲醇水的样品放入振荡器内,充分振荡3min后,用定性滤纸过滤,取滤液2mL,加入6mL20%甲醇水溶液,混匀,用定性滤纸过滤,滤液为样品待检液。

(2)按照1.4.3确定的抗原浓度包被化学发光

4℃包被12h;板,每孔100μL,(3)封闭同1.4.1的B;

(4)用PBST洗酶标板4次,拍干,加入不同浓度

1.5,0.75,0.375,0.2,0.1,0的ZEN标准溶液(10.0,

ng/mL的ZEN)或样品提取液(待测样品),同时加入

抗ZEN单克隆抗体(以1.4.4确定的稀释倍数稀释)50μL,37℃,混匀,恒温一定时间(按1.4.5确定的竞争反应时间反应)。

(5)甩弃孔中液体洗板4次,加入羊抗鼠IgG-HRP(以1.4.6确定的稀释倍数稀释),100μL/孔,37℃温育一定时间(以1.4.7确定的孵育时间为准)。

(6)甩弃孔中液体洗板4次,拍干,每孔加发光底物液100μL,用化学发光检测仪测量相对发光强度单位。

(7)对应标准抑制曲线计算测定结果。

2.1.3

图2

CLEIA抗体稀释倍数的优化图1

CLEIA抗原包被浓度的优化

2.1.2抗体工作浓度的选择

10000、用磷酸缓冲液将抗体分别稀释5000、

20000、40000倍,操作步骤参照1.4.4。结果如图2。由图2可见,IC50逐渐随着抗体稀释倍数的增大,

RLUmax/IC50逐渐增大趋于平稳,同时又考虑减小,

到RLUmax的值会随着抗体稀释倍数的提高而下降,为保证一定发光强度,因此将抗体的稀释倍数定为40000倍。

竞争反应时间的选择

按照1.4.5操作步骤分别选择竞争反应时间为10、20、30、40min,结果如图3。由图3可见随着竞争IC50呈现逐渐增大的趋势,RLUmax/IC50时间的延长,

无明显变化,同时考虑到减少反应时间的原则,选定20min作为竞争反应时间。

图3CLEIA竞争反应时间的优化图5CLEIA羊抗鼠IgG-HRP工作浓度的优化

2.1.4

HRP孵育时间的确定羊抗鼠IgG-HRP按照1.4.6操作步骤分别选择羊抗鼠IgG-

30、40、50min。实验结果如图4。由孵育时间为20、

IC50缓慢增大,RLU-图4可见随着孵育时间的增长,

max/IC50先增大然后趋于平稳,同时考虑到减少反应时间的原则选定40min作为孵育时间。

图6CLEIA的标准曲线

敏度为0.09ng/mL,较ELISA的0.3ng/mL提高了

3.33倍;IC50的批内变异系数为6.9%~9.1%,批间变异系数为14.7%。具体结果见表3

表3

图4

CLEIA羊抗鼠IgG-HRP孵育时间的优化

批次1(n=6)

2(n=6)3(n=6)

CLEIA对ZEN测定的精密度

CLEIA

检测50ng·mL-10.37820.44510.5085

批内变异/

%8.76.99.1

批间变异/

%14.7

2.1.5HRP工作浓度的确定羊抗鼠IgG-

用磷酸缓冲液将抗体分别稀释1∶1000、

1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000稀释羊抗鼠IgG-HRP,操作步骤参照1.4.7。结果如图5,表2。由图5可见,HRP稀释倍数的增大,RLU-随着羊抗鼠IgG-max/IC50逐渐减小,但从表2中可以看出若羊抗鼠IgG-HRP稀释倍数过小,发光本底会增大,考虑到IC50选定1∶2000作为羊抗鼠IgG-HRP工作浓度。

HRP稀释倍数对发光本底的影响表2羊抗鼠IgG-HRP羊抗鼠IgG-稀释倍数10003.223

20001.516

30001.838

40001.476

50001.384

2.1.8

回收率

按照1.4.8.4方法分析回收率,结果见表4,由

CLEIA加标回收率在79.6%~97.6%。表4知,

表4

CLEIA对玉米中ZEN测定的加标回收率

CLEIA(n=3)

检测平均值/(μg·kg-1)

40.2195.1398.1

回收率/%80.497.679.6

变异/%9.25.88.7

加标浓度/(μg·kg-1)

50200500

2.1.6CLEIA标准曲线的建立

2.1.9

特异性

FB1、FB2、选取5种常见的真菌毒素:AFB1、

按照1.4.8.1绘制CLEIA标准曲线见图6。线

2

性回归方程为Y=-22.19Ln(X)+31.69(R=IC50=0.4381ng/mL,0.9884),检测范围(IC20~IC80)为0.104~1.69ng/mL。

2.1.7灵敏度和精密度

按照1.4.8.2和1.4.8.3计算得CLEIA平均灵

DON和OTA,采用CLEIA方法测定了与ZEN的交叉反应率,结果(图7)未见有交叉反应。

2.2CLEIA与ELISA试剂盒样品检测对照

分别采用CLEIA和ELISA测定了在南昌市场上

163

3结论

(1)采用HRP催化鲁米诺-过氧化氢化学发光优化并确定了化学发光酶免疫反应的各种条件体系,

4℃包被12h,1∶40000为:稀释抗原至1.4μg/mL,

1:2000稀释羊抗鼠稀释ZEN抗体竞争反应20min,

IgG-HRP孵育反应40min。

(2)建立了测定玉米中ZEN化学发光酶免疫分析方法,方法分析灵敏度为0.09ng/mL,批内变异系批间变异系数小于14.7﹪,以玉米为数小于9.1﹪,

样品的分析回收率为79.6﹪~97.6﹪,所建立的标检测线性范围为0.104~准曲线相关系数为0.9884,

1.69ng/mL,样品检测时间为60min。

(3)建立的CLEIA与ELISA试剂盒相比灵敏度提高了3.33倍。采用CLEIA和ELISA试剂盒测定了40份市场样品,并进行了对照,两者的线性相关系数为0.967。

图7ZEN与其他5种常见真菌毒素的交叉反应试验

随机购买的40份玉米样品,两种方法检测结果见表

5,ELISA测定值为Y轴,以CLEIA的测定值为X轴,作图得相关曲线,如图8,线性拟合的方程为Y=0.9984X+11.256,相关系数为0.967。

表5

样品号[***********][1**********]20

CLEIA和ELISA试剂盒的样品测定结果

CLEIA/

ELISA/μg·kg-1

453.9373.4151.8380.2129.812.393.9<6<6<6106.5330.98.9321.6647.39.2514.912.716.9576.6

样品号[***********][***********]3940

CLEIA/μg·kg-1

3.46311.951.819.4108.723.1<286.421.74.3103.648.1198.6164.532.9<231.12.787.1

ELISA/μg·kg-1

<6

57.38.657.123.5145.124.4<695.724.4<683.854.2217.4228.228.7<636.1<679.3

μg·kg-1485.5309.9123.1298.8124.812.884.72.83.23.883.2218.15.1246.7672.65.3589.511.918.6543.1

[1]ZinedineA,SorianoJM,MoltoJC,etal.Reviewonthe

toxicity,occurrence,metabolism,detoxification,regulationsandintakeofzearalenone:Anoestrogenicmycotoxin[J].2007,45(1):1-18.FoodAndChemicalToxicology,

[2]GromadzkaK,WaskiewiczA,ChelkowskiJ,etal.

tox-Zearalenoneanditsmetabolites:occurrence,detection,icityandguidelines[J].WorldMycotoxinJounal,2008,1(2):209-220.

[3]邓友田,J].动袁慧.玉米赤霉烯酮毒性机理研究进展[

2007,28(2):89-92.物医学进展,

[4]GB2715-2005.粮食卫生标准[S].

[5]GB13078.2-2006.饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯

S].酮的允许量[

[6]章英.建立IAC-HPLC检测谷物中的玉米赤霉烯酮和

D].南昌:南昌大学,2007.赭曲霉毒素A[

[7]王向红,刘涛,王忠斌,等.高效液相色谱法同时测定谷

.中国食品学物中的赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮[J]2008,8(5):148-152.报,

[8]尹青岗,王峰,周红杰等.高效液相色谱法对玉米中玉

.中国粮油学报,2009,24(7):米赤霉烯酮的测定[J]138-141.

[9]BlajovaE,RuovaD.Singlelaboratory-validatedHPLC

methodsfordeterminationofochratoxinA,fumonisinB1

图8CLEIA的测定值与ELISA试剂盒测定值的相关性

andB2,zearalenoneanddeoxynivalenolincerealsandce-real-basedfoods[J].JournalofFoodAndNutritionRe-seach,2010,2:57-68.

[10]

BerthillerF,SchuhmacherR,ButtingerG,etal.RapidsimultaneousdeterminationofmajortypeA-andB-tricho-thecenesaswellaszearalenoneinmaizebyhighperform-anceliquidchromatography-tandemmassspectrometry[J].JournalofChromatographyA,2005,1062:209-216.

[11]TanakaT,YonedaA,InoueS,etal.Simultaneousdetermi-nationoftrichothecenemycotoxinsandzearalenoneince-J].Jour-realsbygaschromatography-massspectrometry[nalofChromatographyA,2000,882:23-28.

[12]刘涛,王向红,常彧,等.直接竞争酶联免疫吸附法检测

[15]

.食品与机械,2008,24大麦中的玉米赤霉烯酮[J](2):97-100.

[13]王玉平,计融,江涛,等.玉米赤霉烯酮ELISA定量检

.卫生研究,2006,35(2):221-测试剂盒研制[J]224.

[14]JimenezAM,NavasMJ.Chemiluminescencemethods

(presentandfuture)[J].GrasasgAceites,2002.53:64-75.

immunosorbentassayforthedeterminationoffumonisinB1infoodsamples[J].AnalyticaChimicaActa,2006,580:1-8.

ChemiluminescenceEnzymeImmunoassayforthe

DeterminationofZearalenoneinCorn

LuJiang,XuYang,ChuJin-shen,XieLin

(Sino-GermanyJointResearchInstitute,TheStateKeyLaboratoryofFoodScience

andTechnology,NanchangUniversity,Nanchang330047,China)

ABSTRACTAsensitiveindirectcompetitivechemiluminescenceenzymeimmunoassay(CLEIA)forzearalenonein

cornhasbeendeveloped.TheoptimizedCLEIAgavealimitdetectionof0.09ng/mLandadetectionrangeof0.104-1.69ng/mL,withanIC50of0.4381ng/mLanditwasabout3timesmoresensitivethanthatofcolorimetricELISA.Ithasbeenvalidatedoncerealssamplesintermsofprecision(intra-andinterassaycoefficientvariationsoflessthan9.1﹪and14.7﹪,respectively)andaccuracy(meanrecovery79.6﹪~97.6﹪).Theseassayperformancesindicated

thatCLEIAwascapableofbeingappliedforthespecificdetectionandroutinemonitoringofZENincornsamples.Keywords

zearalenone(ZEN),chemiluminescenceenzymeimmunoassay(CLEIA),determination

(上接第159页)

TheInfluenceofMembrane'sTypeandthePretreatmentMethodstotheDetectionofStaphylococcalEnterotoxinA,BandCin

RawMilkbyLateralFlowTestStrips

LinSong,HeYan-ling,WangLi-zhe,ZhaoYu,YuanFei,

YangHai-rong,ChenYing

ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100123,China)

ABSTRACTToestablishrapidassaysforindividualdetectionofStaphylococalEnterotoxinA,BandC(SEA,

SEB,SEC)inrawmilksamples,LateralFlowImmunoassayteststripswerestudied.Themodelsofnitrocellulose-membraneandthepretreatmentmethodsofrawmilkwerechosenandoptimized,andthemembraneofHF09002andthemethodof2timesdilutionshowedthebestresultforthefielddetectionofrawmilksamples.TheSensitivtiesofStaphylococcalEnterotoxinA,BandCteststripswere10ng/mL,4ng/mLand8ng/mL,andthereisnoobservedifferenceobjectedthatcomparedwith3M(tm)Tecra(tm)StaphEnterotoxinIDTestmethod.Keywords

StaphenterotoxinA,BandC,Tawmilk,lateralflowimmunoassay

165


相关内容

  • 玉米赤霉烯酮对养猪业的危害
  • 青岛农业大学 本 科 生 课 程 论 文 论 文 题 目 玉米赤霉烯酮对养猪业的危害 学生专业班级 动物医学2012级03班 学生姓名(学号) 王琪(20121662) 指 导 教 师 陈 甫 完 成 时 间 2015年4月14 日 2015 年 4 月 14 日 课 程 论 文 任 务 书 学生姓 ...

  • 浅析猪霉菌毒素中毒的症状及防治方法
  • 广州日锋畜牧有限公司技术中心 浅述猪霉菌毒素中毒的症状及防治方法 防治饲料霉菌毒素中毒的重要意义在于霉菌的广泛存在,从谷物的收获.贮藏.运输以及加工调制等诸多环节,饲料原料和配合饲料成品遭到霉菌的污染是不可避免的,在世界谷物中25% 遭到霉菌毒素污染.几乎100%的猪场所投喂的均是遭到霉菌毒素污染了 ...

  • 玉米赤霉烯酮降解微生物的筛选与鉴定
  • 玉米赤霉烯酮降解微生物的 筛选与鉴定 黄 1,22221哲,孙长坡,伍松陵,常晓娇,屈凌波 (1.河南工业大学微生物学院,河南郑州450000;2.国家粮食局科学研究院,北京100037) 摘 要:从全国各地的土壤.污水.受污染的玉米.家畜肠道粪便等134份样品中分离得到1628株 菌落形态各异的微 ...

  • 3.霉菌毒素的产生与在饲料中的危害_20110519
  • -- 霉菌毒素的危害 Romer Labs 张 喆 2011-07-25 目 录 1 2 3 4 5 什么是霉菌毒素 霉菌毒素的发现与产生 霉菌毒素的致病性 霉菌毒素的种类与结构 几种常见的霉菌毒素 什么是霉菌毒素? M YCOTOXINS 霉菌毒素 - toxic, secondary metab ...

  • 霉菌毒素检测方法综述
  • 霉菌毒素检测方法综述 由于产生毒素的霉菌无处不在,以及我们对大多数有利于霉菌生长和霉菌毒素产生的条件控制不力,造成食品和饲料的霉菌毒素污染问题越来越成为现代农业生产中不可忽视的重大难题.在各种农产品上生长着的各种各样的霉菌,这些霉菌都能产生霉菌毒素,霉菌毒素是有毒的化合物,有些甚至是致癌的.霉菌毒素 ...

  • 黄曲霉毒素测定综述
  • 黄曲霉毒素测定综述 (一).黄曲霉毒素的总类及性质: 黄曲霉毒素(Aflatoxins,简写AF)主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的代谢产物.上世纪60年代,在英国发生的十万只火鸡突发性死亡事件被确认与从巴西进口的花生粕有关.进一步的调研证明,这些花生粕被黄曲霉(Aspergillus.flavus)产生 ...

  • 农产品质量安全
  • <农产品质量安全检测>教学大纲 <农产品质量安全检测>教学大纲 一.课程基本信息 1.课程名称:农产品质量安全检测(Detection of Agricultural Product Quality and Safety) 2.课程代码: 3.课程管理: 4.教学对象: 5. ...

  • 第八章真菌引起的毒素中毒症
  • 第八章 真菌引起的毒素中毒症 真菌引起的毒素中毒症 • 真菌在环境中大量存在,分布广泛,粮食.食品.饲料等常被污染,其中有些菌株能产生真菌毒素(真菌的有毒代谢产物),很多种毒素具有毒性.致癌性.致突变性和致畸毒性.摄入后可引起人或家畜的急性或慢性真菌中毒症(mycotoxicosis). • 谷物中 ...

  • 鸡饲料加工工艺及饲料检测---陈德林
  • 蛋鸡饲料的加工及检测 陈德林 S20153415 (四川农业大学动物营养研究所,动物抗病营养教育部重点实验室,成都 611130) 摘要:我国饲料加工业已经走过30多年的历程,蛋鸡饲料加工一直沿用传统的加工工艺,一般都是粉碎料较粗的粉状配合饲料.随着人们生活水平的提高和对食品安全的高度关注,饲料安全 ...