广西畜牧兽医 1997年Vol. 13(1)
大的热带地区, 有可能造成灾难, 掌握不好, 会使鸡浸泡致死。现在已转向对舍顶喷水降温, 减少辐射热, 有一定效果。
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帮助鸡排出多余的热量, 但如何使鸡平稳地增加运动量则需要多加考虑, 这是个难题。一个方法是采取限饲可达到这一目的。
6. 通风:通风的重要性众人皆知, 在热带、亚热带
地区尤其重要, 我区鸡舍的设计对通风问题还是考虑得很好的, 但应考虑的是鸡群密度应适宜。
13. 移栖:正常情况下, 鸡舍内不应出现移栖现
象, 如发现移栖就应及时找出问题的原因, 如局部过热, 局部垫料潮湿, 产氨较多, 饮水器或槽位不够等, 应立即采取补救措施。而在南方, 鸡舍两边一般都是开放式的, 解决办法就是每20~30平方米分成小块, 用高的栅栏围起来, 这样就能避免鸡群移栖。
7. 供水:充足、优质的饮水对抗热应激是很重要
的, 当气温上升时, 饮水器应增加25%, 饮水要消毒, 最好通入1~3ppm 的氯气。应强调的是注意输水管的设置, 当水温过高时, 鸡会拒绝饮水, 因此在舍外蓄水池应置于树荫下, 输水管应埋于地下, 避免阳光直射, 在舍内不应安装在紧靠屋顶下, 而应放置在地板上或高出地板1米处。舍外的蓄水池应涂成白色反射阳光, 而不是吸热。有时个别管理者试图采取各种方案冷却供水, 但得不偿失, 成本很高, 效果也并不明显。现在已有冷却供水塔和隔热输水管出售, 方便许多。
14. 活鸡运输:高温天气, 在成鸡运输至屠宰场
之前, 需采取多种相应的措施; 加工之前需停食8~12小时, 但不能停水, 运输车辆需平稳驾驶, 屠宰前, 活鸡的暂居处应保证足够的通风、遮阴, 运输最好在夜间或清晨。如果鸡太多, 可以分批销售、屠宰。
结束语
显然, 如果我们预先采取适当完善措施, 并作到心中有数, 完全有能力减少在热带地区养鸡业普遍存在的由热应激造成的损失。关键在于我们应该重视它, 注意到有这个问题存在。由于在我们这里, 由热应激造成的损失分散在夏季较长时期内, 缺乏准确可靠的统计资料, 短时间内受不到重视, 但从长远来看, 从总的经济效益来计算, 我们就能清楚热应激对鸡造成的危害, 会严重影响我们的收入。
在我国有个种鸭场在1994年6月12日~9月16日三个月时间内受到热应激(午后2点气温在30 以上) 的影响, 种鸭产蛋率下降达12 36%, 死亡率上升到23 8%, 直接经济损失在4万多元。而且家禽热应激过后, 还有较长时期的负后效应, 难以恢复到正常产蛋水平。
据调查, 热应激对我区养鸡业危害很大。据此, 广西农业大学禽病研究室在1995年开展了防制热应激的研究, 经对蛋种鸡初步试验, 产蛋率约提高5个百分点, 死淘率, 破蛋率明显下降, 添加剂对种蛋质量无任何不良影响, 试验达到了预期目的。进一步的扩大试验正在进行中。
8. 增强营养:在炎热的天气, 家禽自然吃食减
少, 为的是减少代谢热, 要克服这种现象, 需添加维生素和矿物质等浓缩料。另外高温使鸡饮水量增加, 引起电解质和维生素不断耗尽, 因此应补加水溶性维生素和矿物质, 维持循环系统的电解质和维生素平衡。
9. 限饲:这种方式应用比较普遍, 在每天的高温
来临之际或以前停止喂食4~8小时, 此对日龄较大的肉鸡尤其适用。这样作, 对肉鸡的生长没有明显的影响, 因为后期或每天晚些时候或夜间可以得到补偿。
10. 鸡群密度:如果高温对鸡群造成了死亡或影
响了肉鸡生长性能, 就要想办法在凉爽的季节多养些鸡, 而在高温时则少养些鸡, 最好以凉爽时的每平方米14只减到10只。
11. 公母分饲:由于母鸡耐热的能力强于公鸡,
这样操作就很有益。分饲有两层含义:一个是在同一鸡场内分饲, 应把公鸡饲养于较凉爽的鸡舍; 另一个是将公母鸡雏分开出售, 有的鸡场可全养公鸡, 有的鸡场则可养母鸡, 这样收益则会均衡些。
12. 增加鸡的运动量:平稳地增加鸡的运动可
动物转基因的技术及其应用
韦 平 广西农业大学 530005
转基因动物(T ransgenic animal) 是体内细胞带有外源基因的动物。整入动物基因组的外源基因则称为转基因(T ransgene) 。严格地讲, 只有部分组织细胞的基mosaic animal) (田小利等, 1995) 。不论那一科或种的动物其DNA 均可在转基因动物中表达。重组DN A 技术允许基因与异源的调控元件相连接, 这样外源基因显
54广西畜牧兽医 1997年Vol. 13(1)
在前病毒的插入中, 重组可在插入的病毒DN A 与两侧的细胞序列之间发生。病毒的包装序列与细胞基因的接近可导致后者结合到反转录病毒的颗粒之中, 这一过程称为转导。这意味着反转录病毒可作为载体将宿主基因从染色体的一个位置转移到另一个位置, 从一个细胞转到另一个细胞, 从一个动物转到另一个动物。反转录病毒所拥有的将非病毒基因包装起来的能力, 使我们能用设计好的反转录病毒载体来携带特定的基因转移到靶细胞上, 用我们所需的基因来取代反转录病毒中不需要的基因, 在反转录病毒基因组中存在有一个称为psi 的序列, 由于它作为允许反转录病毒基因组被包装到病毒颗粒中的一个樗, 因此是必需的。包装细胞系可表达准许反转录病毒颗粒组装的病毒基因, 反转录病毒载体可通过将一个特定设计的反转录病毒基因组转染到包装的细胞而产生。这一载体基因组缺乏病毒的基因, 但含有人们所需的基因以及包括包装标志在内的重要的顺式作用的病毒序列。结果, 所需的基因被包装到反转录病毒颗粒中(Cameron 等, 1994) 。这样形成的反转录病毒载体可感染细胞但不能发生复制, 因为感染颗粒缺乏指导新病毒颗粒合成所需的遗传信息(Donehow er, 1987) 。鼠反转录病毒可根据敏感细胞的类型来分类。有些种类的反转录病毒仅可感染特定宿主的细胞。而另一些则可感染更广范围的宿主。
1985年, 有的研究者证实, 通过应用反转录病毒载体感染附植前胚胎, 可将外来基因导入小鼠胚胎系中, 由于家禽受精卵在产出后已发育至桑椹胚期, 不能进行显微注射操作。而反转录病毒载体对于多细胞的转化十分方便。因此, 这一技术在生产转基因家禽的研究中有广泛的前景。Crittenden 和Salter (1990) 将禽白血病病毒(AL V ) 载体转移到鸡的生殖细胞, 得到了能高水平表达病毒囊膜蛋白的转基因鸡。由于该蛋白封闭了致病病毒侵入时与细胞所结合的受体, 因此转基因鸡对致病性A 亚群白血病病毒的感染有抵抗性。
目前所做的实验表明使用这种方法可产生转基因动物。但多数人却侧重把反转录病毒载体作为基因输送系统而在分娩后的动物上使用, 其最终目的是发展一种对特定的细胞群内使用的基因治疗基因。
然, 要想在所有或大多数细胞中插入外源基因, 必需在胚胎发育的早期阶段进行,
本文将对动物的转基因技术, 方法以及转基因动物在生物医学和动物生产中的应用作一概述。
一、动物的转基因技术
目前所采用的技术主要有如下三种:
(一) 核显微注射技术
在本世纪70年代末和80年代初, 科学家发展了将DNA 和RN A 序列导入小鼠卵或胚胎的核的技术。1980年, Gordon 等报道, 通过显微注射给予小鼠单细胞胚胎的基因序列, 在胚胎移植到受体母亲中后, 能成功地保留在鼠基因组中, 而且胚胎能发育至分娩。不久, 有四个研究小组也报道了使用这一方法生产转基因小鼠都获得成功。在这些报道中, 移植的转基因能在胚胎发育的早期阶段拼入一个或多个宿主的染色体中, 结果这些转基因常能出现在胚细胞中并能转移给后代。自此之后, 转基因小鼠的生产技术及其使用的报道就迅速多了起来。
核显微注射技术是采用显微注射仪(一种精细的玻璃针头) 对受精卵进行注射的。过程比较简单。首先, 需收集大量受精单细胞胚胎, 借助倒置光学显微镜, 用玻璃针头将少量的DNA 溶液注入二个核中的一个。然后, 把无明显损伤的单细胞胚胎移植到受体小鼠的输卵管中。一部分的鼠胚胎可发育至分娩, 这些胚胎有的就携带有转基因。影响核显微注射技术效果的因素当中, 最重要的是所用胚胎的基因型以及所用DNA 的浓度和型号。虽然各个实验室的结果不同, 但能发育至分娩的操作胚胎大体上约占15%~20%, 其中携带有转基因的通常占15%~30%(田少利等, 1995; Cameron 等, 1994) 。
(二) 反转录病毒载体技术
反转录病毒是病毒中的一个大科, 其成员可感染许多不同种属的动物。它与其它病毒的区别在于其复制是通过一个DNA 中间体, 即前病毒来完成的。中间体是反转录病毒生命周期的一个组成部分。反转录病毒携带的反转录酶, 可使R NA 病毒基因组作为模板产生双股的DNA 拷贝。然后, 这一拷贝能有效地插入宿主细胞的基因组中。反转录病毒这种能将其病毒基因插入宿主细胞染色体中的能力, 加上其能对多种细胞类型的非溶解性感染, 使之成为基因转移实验的理想载体。1975年, Jaenisch 等证实, 用鼠的白血病病毒(M uL V) 能够感染小鼠附植前的胚胎。接着, 1976年他又证实, 胚胎感染可使前病毒序列保留在胚胎中, 从而(三) 胚胎干细胞技术
胚胎干(Embryonic stem, ES) 细胞技术是目前这一领域中最令人兴奋的进展。所谓ES 细胞即是从胚细胞分离出来的多能细胞。当在一系列特定条件下培养时, 这些细胞可保持一种不分化的状态(Evans &K anf
广西畜牧兽医 1997年Vol. 13(1)
胞的表型。因此, 将它导入正常小鼠胚细胞中时, 它能够参加胚胎系嵌合体的形式(Bradley 等, 1984) 。应用细胞系使用的任何标准的方法, 包括磷酸钙转染法, 显微注射法, 电穿孔法和反转录病毒载体法, 都可将基因导入ES 细胞。
使用ES 细胞的操作优点在于转基因可被导向到内源基因, 这一过程被称为基因 打靶! (gene target ing) , 这是同源重组。藉此, 外源DNA 可选择地与互补的内源性DN A 重组。这就有可能从中选出已接收DNA 的细胞以及已成功 打靶! 的细胞。结果, 外源性基因被打到特定的位点, 使内源性基因的功能失活。通过这一步骤, 利用位点突变使某一基因失活, 人们就能确定一个特定哺乳动物基因的功能。对这些基因失活小鼠进行表型检测, 即能对比基因正常履行的功能获得更多的了解。利用这一技术可对哺乳动物的基因组进行系统和功能性的分析, 为人类疾病包括癌症的研究提供动物模型以及大大缩短诸如免疫系统等整个领域研究的进程。
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转基因研究还使我们相信真正恶性表现的出现需要系列的活动这一假说。一个动物要在某一特定年龄阶段发生一种特定肿瘤的说法, 使我们对肿瘤表型充分出现之前的早期活动能进行详细而广泛的研究。另外, 还可检查导致恶性肿瘤发生的继发活动, 它们都属于普通的启动活动。此外, 转基因小鼠还可用来检测同一动物活体不同肿瘤基因之间的协同作用, 这种检测是通过不同转基因品系的杂交或因携带病毒性肿瘤基因的反转录病毒感染小鼠而进行的。
三、家畜的转基因研究
从事转基因家畜生产的研究者主要对三个方面有兴趣:促进生长、发展药用畜禽业和抗病育种。在过去几年里已对前两个方面开展了研究, 而对后者目前很大程度上仍停留在概念上。
(一) 促进生长
最早的实验是研究外源性生长调控基因在鼠组织中的表达。1982年Palmiter 等将大鼠生长激素基因序列导入小白鼠的胚胎中, 并证实了转基因对动物表型的显著作用。有些转基因小鼠表现出高水平的大鼠生长激素, 以致有些后代表现出明显加快的生长速度。这种对正常生理学的改变明显地证实了这一技术的潜在用途并开拓了对于有关生长的诸多生物化学作用进行深入研究的途径。为此, 动物生理学家开展了将生长激素和其它生长调控基因导入家畜的研究。绝大多数研究目前集中在猪上, 转基因绵羊也有报道。但结果并不理想。一般而言, 这些动物表现了饲料转化率的提高, 但在很多情况下生长速度并未显著提高。同时一些有害的作用也表现出来, 包括摄食减少, 繁殖性能抑制以及广泛围的病理学异常。
二、转基因小白鼠在医学研究中的应用
目前, 转基因动物技术对于揭示某些动物和人的神秘疾病的病因以及免疫学和肿瘤学方面有较多的应用。下面列举一些不同领域的应用。
(一) 宿主∀病原的相互作用
人们通过基因转移实验可以探索宿主和病原基因的重要性。转基因小鼠已被用来阐明有关瘙痒病病程中众多迷惑不解的问题。
另外当仓鼠P rP 基因在小鼠上表达时, 小鼠变得对仓鼠蛋白粒子很易感并发生该病仓鼠型特征的病理学变化(Scott 等, 1989) 。这就证实基因与传染颗粒之间特有的关系(Bueler 等, 1992) 。应用ES 细胞技术来使小鼠的内源性PrP 基因失活。这些小鼠表型上的正常揭示PrP 基因对于动物的发育和健康不是必需的。这些小鼠是一种可让研究者检查缺乏Pr P 基因小鼠对传染性因子是否易感的重要模型。
(二) 发展药用畜禽业
当前, 转基因家畜最成功的应用就是培育药用畜禽。对人有重要治疗作用而体外又不能合成的蛋白质, 可用家畜来生产。几年来, 位于爱丁堡A FRC 动物生理学和遗传学研究所的一个研究小组已开展了这一方面的研究。Simons 等(1987) 报道, 绵羊 -球蛋白基因可高水平地在小白鼠乳腺中表达。这一发现表明, 这一基因具有乳腺定向表达所需的调控序列。因此, 与这一基因相连的调控序列就可能被用来支持一个外源蛋白在绵羊乳腺的表达。有两种蛋白被选来在绵羊上使用, 用来治疗人肺气肿的 -1-抗胰蛋白酶及凝血蛋白因子IX 。初步的结果显示, 这两个基因可定向于绵羊乳腺组织并可分泌于奶中, 尽管在乳中的含量很低(Wilmut 等, 1990) 。但W ilmut 等(1991) 最近报, 因因
(二) 肿瘤学的研究
肿瘤基因或推测的肿瘤基因的所见的作用, 可通过在转基因动物体内的表述及其表型变化来确定。通过主要的序列调控可使表达是广谱的或定于特定的组织。这样, 对一个肿瘤基因在特定组织中的功能可得到更多的了解, 从而使特定细胞型与肿瘤基因的互补作用的问题得以解决。转基因在胚胎系的存在使小鼠具有遗传的一个特定肿瘤类型的素质, 转基因小鼠的后代还可携带肿瘤基因, 这样就建立了一个特定的研
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基因的作用。核酶是RN A 展开。由于其特定的三级结构, 它能切断个别种类的R NA 。显然, 专门针对某种侵入病原mRNA 的核酶可干扰病原的生活。
此, 这些动物的繁殖以及从其乳中收获人类蛋白质具有很好的商业发展前景。这些实验可能是利用转基因动物来生产医用产品的第一例。
(三) 抗病育种
人们很早就注意到动物对疾病的天然抵抗能力。对于许多疾病抵抗能力的大小, 品种内和品种间都是有差异的。应用遗传学的任务就是选出有抵抗力的等位基因而又不能失去或降低现代家畜原有的生产性能。一个与单一等位基因相关的抗病例子是鼠M x 基因。这一基因与鼠流感的抵抗力有关并作为转基因已被导入易感小鼠体内, 结果小鼠对流感产生了抵抗力(Arnheiter 等, 1990) 。由于人和猪体内也存在有类似的等位基因。因此对比基因的工作就很有趣。
另一个预防疾病的方法是封闭受体。因为许多病毒都是通过特异的细胞受体方进入细胞导致感染的。目前已有很多的例子来说明封闭这一受体可保护细胞免遭感染。
另一种更普通的抗病方法是干扰病原基因的表达。这有两种可供选择的途径。第一是使用反义结构。它们是展开的核苷酸, 因与特定病原的基因相互补, 故能调控衰减这一基因。另一方法是用核酶封闭
四、结论与展望
操作哺乳动物基因组以及分析完整动物体中发生改变的序列的技能, 使得一些重要的研究在生物科学和广大领域中展开来。应用转基因技术通过胚干细胞插入基因以及缺失、突变或添加到特定位点, 将继续是非常重要的方法, 越来越多的研究人员也将发展这一技术, 以试图了解控制许多细胞活动的复杂过程。在家畜中的应用研究也仍处于一个早期阶段, 这主要是所需的费用以及分析培养的转基因品系需要较长时间。另外, 由于我们对许许多多重要区域如抗病的遗传基因还缺乏了解, 所以实验工作还有障碍。
遗传操纵的使用也带来了一些道德和伦理方面的问题。在小白鼠早已有关于使用它们的伦理学的争论。有利于健康或福利的遗传学的改变。不管其对生产的影响如何, 将得到有理的评论, 而为了改进动物的健康状况所设计的实验毫无疑问是值得推崇的。
主要参考文献14编(略)
虾的饲料与营养
封伟贤 编译 广西彼得汉预混饲料有限公司 530023
由于对海虾营养知识的缺乏。很有必要继续对持续发展、检验和应用新的营养概念进行研究。在特定养殖方法下供给虾场的饲料, 须满足营养方面的需要, 且经济实惠。
早在七十年代就已开始了对海虾的营养研究, 然而由于研究方法不同及缺少标准的研究日粮, 故比较这些现有的研究结果相当困难。通常对各种各样差异的比较是无效的。这些差异包括:虾的品种、大小, 来源和生理状况, 环境条件, 实验设计及设备, 日粮形式、组成成分和加工过程。不过, 这些研究已作为商品饲料配制中的质量保证原则。
质比碳水化合物消化率更高。与金枪鱼粉或鱼粉相比, 豆粕的表观消化率较低, 可能是由于豆粕的蛋白含量较低及碳水化合物含量过高的缘故。
蛋白质
在一些动物组织中蛋白质是主要的有机物质, 占干重的65%~75%, 动物必须消耗日粮的蛋白以不断获得氨基酸供给。目前所配制的虾饲料含有高水平的蛋白质。蛋白质是饲料中主要的且昂贵的组分。降低饲料中蛋白的含量或少利用昂贵的蛋白源添加物均可大幅度降低饲料的成本。这就很容易理解为什么对虾营养的研究大多数都集中在蛋白质的研究。
一般认为, 幼虾比成虾需要更高的蛋白水平, 饲料中粗蛋白(CP) 的推荐水平根据品种和大小不同从30%至57%不等(见表1) 。不管所需要的蛋白水平怎样不同, 如果必需氨基酸不平衡(而不是缺乏) , 那么就会出现生长不良的情况。如果养殖方式并不全靠商品饲, , 消化率
Akiyama(1988) 等测定了虾的各种原料干物质
表观消化率(ADM D) 、蛋白质表观消化率(APD) 和氨基酸表观消化率(AAA D) 。含蛋白质高的原料如酪蛋白、明胶、大豆蛋白和小麦面筋的日粮, 比含玉米淀粉的高
广西畜牧兽医 1997年Vol. 13(1)
大的热带地区, 有可能造成灾难, 掌握不好, 会使鸡浸泡致死。现在已转向对舍顶喷水降温, 减少辐射热, 有一定效果。
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帮助鸡排出多余的热量, 但如何使鸡平稳地增加运动量则需要多加考虑, 这是个难题。一个方法是采取限饲可达到这一目的。
6. 通风:通风的重要性众人皆知, 在热带、亚热带
地区尤其重要, 我区鸡舍的设计对通风问题还是考虑得很好的, 但应考虑的是鸡群密度应适宜。
13. 移栖:正常情况下, 鸡舍内不应出现移栖现
象, 如发现移栖就应及时找出问题的原因, 如局部过热, 局部垫料潮湿, 产氨较多, 饮水器或槽位不够等, 应立即采取补救措施。而在南方, 鸡舍两边一般都是开放式的, 解决办法就是每20~30平方米分成小块, 用高的栅栏围起来, 这样就能避免鸡群移栖。
7. 供水:充足、优质的饮水对抗热应激是很重要
的, 当气温上升时, 饮水器应增加25%, 饮水要消毒, 最好通入1~3ppm 的氯气。应强调的是注意输水管的设置, 当水温过高时, 鸡会拒绝饮水, 因此在舍外蓄水池应置于树荫下, 输水管应埋于地下, 避免阳光直射, 在舍内不应安装在紧靠屋顶下, 而应放置在地板上或高出地板1米处。舍外的蓄水池应涂成白色反射阳光, 而不是吸热。有时个别管理者试图采取各种方案冷却供水, 但得不偿失, 成本很高, 效果也并不明显。现在已有冷却供水塔和隔热输水管出售, 方便许多。
14. 活鸡运输:高温天气, 在成鸡运输至屠宰场
之前, 需采取多种相应的措施; 加工之前需停食8~12小时, 但不能停水, 运输车辆需平稳驾驶, 屠宰前, 活鸡的暂居处应保证足够的通风、遮阴, 运输最好在夜间或清晨。如果鸡太多, 可以分批销售、屠宰。
结束语
显然, 如果我们预先采取适当完善措施, 并作到心中有数, 完全有能力减少在热带地区养鸡业普遍存在的由热应激造成的损失。关键在于我们应该重视它, 注意到有这个问题存在。由于在我们这里, 由热应激造成的损失分散在夏季较长时期内, 缺乏准确可靠的统计资料, 短时间内受不到重视, 但从长远来看, 从总的经济效益来计算, 我们就能清楚热应激对鸡造成的危害, 会严重影响我们的收入。
在我国有个种鸭场在1994年6月12日~9月16日三个月时间内受到热应激(午后2点气温在30 以上) 的影响, 种鸭产蛋率下降达12 36%, 死亡率上升到23 8%, 直接经济损失在4万多元。而且家禽热应激过后, 还有较长时期的负后效应, 难以恢复到正常产蛋水平。
据调查, 热应激对我区养鸡业危害很大。据此, 广西农业大学禽病研究室在1995年开展了防制热应激的研究, 经对蛋种鸡初步试验, 产蛋率约提高5个百分点, 死淘率, 破蛋率明显下降, 添加剂对种蛋质量无任何不良影响, 试验达到了预期目的。进一步的扩大试验正在进行中。
8. 增强营养:在炎热的天气, 家禽自然吃食减
少, 为的是减少代谢热, 要克服这种现象, 需添加维生素和矿物质等浓缩料。另外高温使鸡饮水量增加, 引起电解质和维生素不断耗尽, 因此应补加水溶性维生素和矿物质, 维持循环系统的电解质和维生素平衡。
9. 限饲:这种方式应用比较普遍, 在每天的高温
来临之际或以前停止喂食4~8小时, 此对日龄较大的肉鸡尤其适用。这样作, 对肉鸡的生长没有明显的影响, 因为后期或每天晚些时候或夜间可以得到补偿。
10. 鸡群密度:如果高温对鸡群造成了死亡或影
响了肉鸡生长性能, 就要想办法在凉爽的季节多养些鸡, 而在高温时则少养些鸡, 最好以凉爽时的每平方米14只减到10只。
11. 公母分饲:由于母鸡耐热的能力强于公鸡,
这样操作就很有益。分饲有两层含义:一个是在同一鸡场内分饲, 应把公鸡饲养于较凉爽的鸡舍; 另一个是将公母鸡雏分开出售, 有的鸡场可全养公鸡, 有的鸡场则可养母鸡, 这样收益则会均衡些。
12. 增加鸡的运动量:平稳地增加鸡的运动可
动物转基因的技术及其应用
韦 平 广西农业大学 530005
转基因动物(T ransgenic animal) 是体内细胞带有外源基因的动物。整入动物基因组的外源基因则称为转基因(T ransgene) 。严格地讲, 只有部分组织细胞的基mosaic animal) (田小利等, 1995) 。不论那一科或种的动物其DNA 均可在转基因动物中表达。重组DN A 技术允许基因与异源的调控元件相连接, 这样外源基因显
54广西畜牧兽医 1997年Vol. 13(1)
在前病毒的插入中, 重组可在插入的病毒DN A 与两侧的细胞序列之间发生。病毒的包装序列与细胞基因的接近可导致后者结合到反转录病毒的颗粒之中, 这一过程称为转导。这意味着反转录病毒可作为载体将宿主基因从染色体的一个位置转移到另一个位置, 从一个细胞转到另一个细胞, 从一个动物转到另一个动物。反转录病毒所拥有的将非病毒基因包装起来的能力, 使我们能用设计好的反转录病毒载体来携带特定的基因转移到靶细胞上, 用我们所需的基因来取代反转录病毒中不需要的基因, 在反转录病毒基因组中存在有一个称为psi 的序列, 由于它作为允许反转录病毒基因组被包装到病毒颗粒中的一个樗, 因此是必需的。包装细胞系可表达准许反转录病毒颗粒组装的病毒基因, 反转录病毒载体可通过将一个特定设计的反转录病毒基因组转染到包装的细胞而产生。这一载体基因组缺乏病毒的基因, 但含有人们所需的基因以及包括包装标志在内的重要的顺式作用的病毒序列。结果, 所需的基因被包装到反转录病毒颗粒中(Cameron 等, 1994) 。这样形成的反转录病毒载体可感染细胞但不能发生复制, 因为感染颗粒缺乏指导新病毒颗粒合成所需的遗传信息(Donehow er, 1987) 。鼠反转录病毒可根据敏感细胞的类型来分类。有些种类的反转录病毒仅可感染特定宿主的细胞。而另一些则可感染更广范围的宿主。
1985年, 有的研究者证实, 通过应用反转录病毒载体感染附植前胚胎, 可将外来基因导入小鼠胚胎系中, 由于家禽受精卵在产出后已发育至桑椹胚期, 不能进行显微注射操作。而反转录病毒载体对于多细胞的转化十分方便。因此, 这一技术在生产转基因家禽的研究中有广泛的前景。Crittenden 和Salter (1990) 将禽白血病病毒(AL V ) 载体转移到鸡的生殖细胞, 得到了能高水平表达病毒囊膜蛋白的转基因鸡。由于该蛋白封闭了致病病毒侵入时与细胞所结合的受体, 因此转基因鸡对致病性A 亚群白血病病毒的感染有抵抗性。
目前所做的实验表明使用这种方法可产生转基因动物。但多数人却侧重把反转录病毒载体作为基因输送系统而在分娩后的动物上使用, 其最终目的是发展一种对特定的细胞群内使用的基因治疗基因。
然, 要想在所有或大多数细胞中插入外源基因, 必需在胚胎发育的早期阶段进行,
本文将对动物的转基因技术, 方法以及转基因动物在生物医学和动物生产中的应用作一概述。
一、动物的转基因技术
目前所采用的技术主要有如下三种:
(一) 核显微注射技术
在本世纪70年代末和80年代初, 科学家发展了将DNA 和RN A 序列导入小鼠卵或胚胎的核的技术。1980年, Gordon 等报道, 通过显微注射给予小鼠单细胞胚胎的基因序列, 在胚胎移植到受体母亲中后, 能成功地保留在鼠基因组中, 而且胚胎能发育至分娩。不久, 有四个研究小组也报道了使用这一方法生产转基因小鼠都获得成功。在这些报道中, 移植的转基因能在胚胎发育的早期阶段拼入一个或多个宿主的染色体中, 结果这些转基因常能出现在胚细胞中并能转移给后代。自此之后, 转基因小鼠的生产技术及其使用的报道就迅速多了起来。
核显微注射技术是采用显微注射仪(一种精细的玻璃针头) 对受精卵进行注射的。过程比较简单。首先, 需收集大量受精单细胞胚胎, 借助倒置光学显微镜, 用玻璃针头将少量的DNA 溶液注入二个核中的一个。然后, 把无明显损伤的单细胞胚胎移植到受体小鼠的输卵管中。一部分的鼠胚胎可发育至分娩, 这些胚胎有的就携带有转基因。影响核显微注射技术效果的因素当中, 最重要的是所用胚胎的基因型以及所用DNA 的浓度和型号。虽然各个实验室的结果不同, 但能发育至分娩的操作胚胎大体上约占15%~20%, 其中携带有转基因的通常占15%~30%(田少利等, 1995; Cameron 等, 1994) 。
(二) 反转录病毒载体技术
反转录病毒是病毒中的一个大科, 其成员可感染许多不同种属的动物。它与其它病毒的区别在于其复制是通过一个DNA 中间体, 即前病毒来完成的。中间体是反转录病毒生命周期的一个组成部分。反转录病毒携带的反转录酶, 可使R NA 病毒基因组作为模板产生双股的DNA 拷贝。然后, 这一拷贝能有效地插入宿主细胞的基因组中。反转录病毒这种能将其病毒基因插入宿主细胞染色体中的能力, 加上其能对多种细胞类型的非溶解性感染, 使之成为基因转移实验的理想载体。1975年, Jaenisch 等证实, 用鼠的白血病病毒(M uL V) 能够感染小鼠附植前的胚胎。接着, 1976年他又证实, 胚胎感染可使前病毒序列保留在胚胎中, 从而(三) 胚胎干细胞技术
胚胎干(Embryonic stem, ES) 细胞技术是目前这一领域中最令人兴奋的进展。所谓ES 细胞即是从胚细胞分离出来的多能细胞。当在一系列特定条件下培养时, 这些细胞可保持一种不分化的状态(Evans &K anf
广西畜牧兽医 1997年Vol. 13(1)
胞的表型。因此, 将它导入正常小鼠胚细胞中时, 它能够参加胚胎系嵌合体的形式(Bradley 等, 1984) 。应用细胞系使用的任何标准的方法, 包括磷酸钙转染法, 显微注射法, 电穿孔法和反转录病毒载体法, 都可将基因导入ES 细胞。
使用ES 细胞的操作优点在于转基因可被导向到内源基因, 这一过程被称为基因 打靶! (gene target ing) , 这是同源重组。藉此, 外源DNA 可选择地与互补的内源性DN A 重组。这就有可能从中选出已接收DNA 的细胞以及已成功 打靶! 的细胞。结果, 外源性基因被打到特定的位点, 使内源性基因的功能失活。通过这一步骤, 利用位点突变使某一基因失活, 人们就能确定一个特定哺乳动物基因的功能。对这些基因失活小鼠进行表型检测, 即能对比基因正常履行的功能获得更多的了解。利用这一技术可对哺乳动物的基因组进行系统和功能性的分析, 为人类疾病包括癌症的研究提供动物模型以及大大缩短诸如免疫系统等整个领域研究的进程。
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转基因研究还使我们相信真正恶性表现的出现需要系列的活动这一假说。一个动物要在某一特定年龄阶段发生一种特定肿瘤的说法, 使我们对肿瘤表型充分出现之前的早期活动能进行详细而广泛的研究。另外, 还可检查导致恶性肿瘤发生的继发活动, 它们都属于普通的启动活动。此外, 转基因小鼠还可用来检测同一动物活体不同肿瘤基因之间的协同作用, 这种检测是通过不同转基因品系的杂交或因携带病毒性肿瘤基因的反转录病毒感染小鼠而进行的。
三、家畜的转基因研究
从事转基因家畜生产的研究者主要对三个方面有兴趣:促进生长、发展药用畜禽业和抗病育种。在过去几年里已对前两个方面开展了研究, 而对后者目前很大程度上仍停留在概念上。
(一) 促进生长
最早的实验是研究外源性生长调控基因在鼠组织中的表达。1982年Palmiter 等将大鼠生长激素基因序列导入小白鼠的胚胎中, 并证实了转基因对动物表型的显著作用。有些转基因小鼠表现出高水平的大鼠生长激素, 以致有些后代表现出明显加快的生长速度。这种对正常生理学的改变明显地证实了这一技术的潜在用途并开拓了对于有关生长的诸多生物化学作用进行深入研究的途径。为此, 动物生理学家开展了将生长激素和其它生长调控基因导入家畜的研究。绝大多数研究目前集中在猪上, 转基因绵羊也有报道。但结果并不理想。一般而言, 这些动物表现了饲料转化率的提高, 但在很多情况下生长速度并未显著提高。同时一些有害的作用也表现出来, 包括摄食减少, 繁殖性能抑制以及广泛围的病理学异常。
二、转基因小白鼠在医学研究中的应用
目前, 转基因动物技术对于揭示某些动物和人的神秘疾病的病因以及免疫学和肿瘤学方面有较多的应用。下面列举一些不同领域的应用。
(一) 宿主∀病原的相互作用
人们通过基因转移实验可以探索宿主和病原基因的重要性。转基因小鼠已被用来阐明有关瘙痒病病程中众多迷惑不解的问题。
另外当仓鼠P rP 基因在小鼠上表达时, 小鼠变得对仓鼠蛋白粒子很易感并发生该病仓鼠型特征的病理学变化(Scott 等, 1989) 。这就证实基因与传染颗粒之间特有的关系(Bueler 等, 1992) 。应用ES 细胞技术来使小鼠的内源性PrP 基因失活。这些小鼠表型上的正常揭示PrP 基因对于动物的发育和健康不是必需的。这些小鼠是一种可让研究者检查缺乏Pr P 基因小鼠对传染性因子是否易感的重要模型。
(二) 发展药用畜禽业
当前, 转基因家畜最成功的应用就是培育药用畜禽。对人有重要治疗作用而体外又不能合成的蛋白质, 可用家畜来生产。几年来, 位于爱丁堡A FRC 动物生理学和遗传学研究所的一个研究小组已开展了这一方面的研究。Simons 等(1987) 报道, 绵羊 -球蛋白基因可高水平地在小白鼠乳腺中表达。这一发现表明, 这一基因具有乳腺定向表达所需的调控序列。因此, 与这一基因相连的调控序列就可能被用来支持一个外源蛋白在绵羊乳腺的表达。有两种蛋白被选来在绵羊上使用, 用来治疗人肺气肿的 -1-抗胰蛋白酶及凝血蛋白因子IX 。初步的结果显示, 这两个基因可定向于绵羊乳腺组织并可分泌于奶中, 尽管在乳中的含量很低(Wilmut 等, 1990) 。但W ilmut 等(1991) 最近报, 因因
(二) 肿瘤学的研究
肿瘤基因或推测的肿瘤基因的所见的作用, 可通过在转基因动物体内的表述及其表型变化来确定。通过主要的序列调控可使表达是广谱的或定于特定的组织。这样, 对一个肿瘤基因在特定组织中的功能可得到更多的了解, 从而使特定细胞型与肿瘤基因的互补作用的问题得以解决。转基因在胚胎系的存在使小鼠具有遗传的一个特定肿瘤类型的素质, 转基因小鼠的后代还可携带肿瘤基因, 这样就建立了一个特定的研
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基因的作用。核酶是RN A 展开。由于其特定的三级结构, 它能切断个别种类的R NA 。显然, 专门针对某种侵入病原mRNA 的核酶可干扰病原的生活。
此, 这些动物的繁殖以及从其乳中收获人类蛋白质具有很好的商业发展前景。这些实验可能是利用转基因动物来生产医用产品的第一例。
(三) 抗病育种
人们很早就注意到动物对疾病的天然抵抗能力。对于许多疾病抵抗能力的大小, 品种内和品种间都是有差异的。应用遗传学的任务就是选出有抵抗力的等位基因而又不能失去或降低现代家畜原有的生产性能。一个与单一等位基因相关的抗病例子是鼠M x 基因。这一基因与鼠流感的抵抗力有关并作为转基因已被导入易感小鼠体内, 结果小鼠对流感产生了抵抗力(Arnheiter 等, 1990) 。由于人和猪体内也存在有类似的等位基因。因此对比基因的工作就很有趣。
另一个预防疾病的方法是封闭受体。因为许多病毒都是通过特异的细胞受体方进入细胞导致感染的。目前已有很多的例子来说明封闭这一受体可保护细胞免遭感染。
另一种更普通的抗病方法是干扰病原基因的表达。这有两种可供选择的途径。第一是使用反义结构。它们是展开的核苷酸, 因与特定病原的基因相互补, 故能调控衰减这一基因。另一方法是用核酶封闭
四、结论与展望
操作哺乳动物基因组以及分析完整动物体中发生改变的序列的技能, 使得一些重要的研究在生物科学和广大领域中展开来。应用转基因技术通过胚干细胞插入基因以及缺失、突变或添加到特定位点, 将继续是非常重要的方法, 越来越多的研究人员也将发展这一技术, 以试图了解控制许多细胞活动的复杂过程。在家畜中的应用研究也仍处于一个早期阶段, 这主要是所需的费用以及分析培养的转基因品系需要较长时间。另外, 由于我们对许许多多重要区域如抗病的遗传基因还缺乏了解, 所以实验工作还有障碍。
遗传操纵的使用也带来了一些道德和伦理方面的问题。在小白鼠早已有关于使用它们的伦理学的争论。有利于健康或福利的遗传学的改变。不管其对生产的影响如何, 将得到有理的评论, 而为了改进动物的健康状况所设计的实验毫无疑问是值得推崇的。
主要参考文献14编(略)
虾的饲料与营养
封伟贤 编译 广西彼得汉预混饲料有限公司 530023
由于对海虾营养知识的缺乏。很有必要继续对持续发展、检验和应用新的营养概念进行研究。在特定养殖方法下供给虾场的饲料, 须满足营养方面的需要, 且经济实惠。
早在七十年代就已开始了对海虾的营养研究, 然而由于研究方法不同及缺少标准的研究日粮, 故比较这些现有的研究结果相当困难。通常对各种各样差异的比较是无效的。这些差异包括:虾的品种、大小, 来源和生理状况, 环境条件, 实验设计及设备, 日粮形式、组成成分和加工过程。不过, 这些研究已作为商品饲料配制中的质量保证原则。
质比碳水化合物消化率更高。与金枪鱼粉或鱼粉相比, 豆粕的表观消化率较低, 可能是由于豆粕的蛋白含量较低及碳水化合物含量过高的缘故。
蛋白质
在一些动物组织中蛋白质是主要的有机物质, 占干重的65%~75%, 动物必须消耗日粮的蛋白以不断获得氨基酸供给。目前所配制的虾饲料含有高水平的蛋白质。蛋白质是饲料中主要的且昂贵的组分。降低饲料中蛋白的含量或少利用昂贵的蛋白源添加物均可大幅度降低饲料的成本。这就很容易理解为什么对虾营养的研究大多数都集中在蛋白质的研究。
一般认为, 幼虾比成虾需要更高的蛋白水平, 饲料中粗蛋白(CP) 的推荐水平根据品种和大小不同从30%至57%不等(见表1) 。不管所需要的蛋白水平怎样不同, 如果必需氨基酸不平衡(而不是缺乏) , 那么就会出现生长不良的情况。如果养殖方式并不全靠商品饲, , 消化率
Akiyama(1988) 等测定了虾的各种原料干物质
表观消化率(ADM D) 、蛋白质表观消化率(APD) 和氨基酸表观消化率(AAA D) 。含蛋白质高的原料如酪蛋白、明胶、大豆蛋白和小麦面筋的日粮, 比含玉米淀粉的高