根尖分生组织细胞的有丝分裂实验
一、实验目的
1 、学习植物根尖压片标本制备方法的基本技术。
体简易永久片的制片技术。
2、熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体形态和结构上的动态变化，并学会染色
二、实验原理
有丝分裂是高等动植物体细胞分裂的主要方式，高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点、幼叶等部位的分生组织。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。在有丝分裂过程中，真核细胞的染色质凝集成染色体，每个染色体能复制一份，复制的姐妹染色单体在纺锤丝的牵拉下分向两极，精确地平均分配到两个子细胞中去，从而使产生得两个子细胞及与其母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。由于染色体上有遗传物质 DNA ，因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。染色体的这种特异性、恒定性、连续性和在细胞分裂过程中的正确复制及分配被确认为是遗传物质的载体，是遗传传递规律的细胞学基础。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。
三、实验材料
显微镜、培养箱、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片；Carnoy 固定液、改良苯酚品红染色液、0.002M 8-羟基喹啉水溶液、0.05～0.2% 秋水仙素溶液、对二氯苯饱和水溶液、1M HCl、加拿大树胶。 洋葱（Aillum cepa）根尖，蚕豆（Vicia faba）根尖 。 四、实验器具和药品试剂
五、实验方法和步骤
（一）材料准备
1、培养洋葱根尖 选取底盘大的洋葱做生根材料，剥去外层老皮，用刀削去老根，注意不要削掉四周的根芽，将洋葱的鳞基置于盛水的小烧杯（或广口瓶）上，让洋葱的底部接触杯内的水面。把小烧杯放进 20～25℃培养箱内培养。培养时注意每天换水 1～2 次，防止烂根。待根长约 1.5 cm 时，在上午九时取健壮的根尖进行预处理。 2、种子培养根尖 选取蚕豆（或小麦、玉米等）种子放在烧杯中，放清水浸泡过夜，使种子吸水胀大后倒出，再用清水洗几次，用多层纱布包好种子，放进 20～25℃培养箱内培养。当根尖长 1～1.5cm 时，即可以在上午九时取生长旺盛的根尖进行预处理。 （二）预处理 目的，使获得中期分裂相较多的细胞，使染色体缩短，分散，形态结构稳定，便于压片，有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数。 预处理机理：阻止或破坏纺纺锤体微管的形成，使有丝分裂过程被抑制在分裂中期阶段，以便累积较多的处于分裂中期的分裂相；改变细胞质的粘度；导致染色体高度浓缩、变短，利于染色体的分散。
在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。一般是在分裂高峰前处理 1.5 小时以上。处理的方法如下： 1．秋水仙素水溶液常用浓度为 0.05～0.2%，室温下处理 3～4 小时。对抑制纺锤体活动的效果明显，易于获得较多的中期分裂相，并且染色体收缩较直，有利于对染色体结构的研究。
2．对二氯苯饱和水溶液室温下处理 3～5 小时，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，对染色体小而多的植物中，计数染色体制片效果最好。 3．8-羟基喹啉水溶液 使用浓度为 0.002～0.004M ，一般认为它将引起细胞粘滞度的改变，进而导致纺锤体活动受阻。通常处理 2～4 小时，可使中期染色体在赤道面上保持其相应的排列位置，另一优点是处理后的缢痕区较为清晰。 4．低温处理将材料如小麦，浸入蒸馏水内，放置到 1～4℃冰箱中（玉米及水稻 6～8℃）处理 20～24 小时，也起到良好的效果。
（三）固定 通常采用的是 Carnoy 固定液。固定的目的是用化学的方法把细胞迅速杀死，使蛋白质变性，并尽量保持原来的分裂状态，同时更易于着色。固定时，将根尖投入固定液中室温处理 3～24 小时。材料若不及时用，可经过 90%酒精和 70%酒精浸洗一次，再换入新的 70%酒精中，置于冰箱内 0～4℃保存备用。经过较长时间保存的材料，在进行观察前可用固定液再处理一次，效果较好。 （四）解离 目的是使分生组织细胞之间的果胶质层解掉，并使细胞壁软化，便于压片。解离的时间视根尖的粗细老嫩不同而有差异。方法是：将固定后（或保存后）的根尖分装到小烧杯内，用蒸馏水漂洗，再加入 1N HCl 溶液，在 60℃下水解 8～20 分钟（洋葱用 8 分钟，蚕豆侧根用 10 分钟，玉米用 20 分钟），解离成功的根尖，分生组织发白，伸长区已呈半透明，似烂状。 （五）漂洗 解离后的根尖用蒸馏水漂洗 3～4 次，用吸管吸干水。漂洗时间和次数一定要足够，否则影响染色效果或染不上色 （六）染色、压片 将解离漂洗后的根尖放在小培养皿里，滴加改良苯酚品红染色液染色 10 分钟左右。制片时，取一根尖放在洁净的载玻片上，用刀片切取 1mm 左右的生长区，其余部分弃掉，加 1 滴染色液，加盖玻片。用镊子在材料的地方轻压几下，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上覆盖一层吸水纸用拇指适当用力下压，用解剖针（或竹签）敲击根尖部位，重复几次，力一次比一次大，使材料分散成薄薄的一层，以盖玻片不破裂为准。 （七）观察 将制好的标本片，置于显微镜下先作低倍观察，选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察，注意核及染色体的动态变化。 （八）永久装片 由临时压片材料制做成永久玻片标本，可以将玻片放在 CO2 干冰或生物切片半导体冰冻机上，待玻片结冰后，取出玻片，用刀片迅速揭开盖玻片，放在空气中干燥后，用封藏剂（加拿大树胶）封固。
六、作业
1、每人制作两张洋葱根尖细胞分裂的临时装片。
2、根据自己在实验中观察到的各时期的细胞特点，绘制有丝分裂前期、中期、后期的简图，并能区分各时期细胞的特点。
3、解释什么是染色单体？什么是子染色体？子细胞中的染色体与母细胞中的染色体是否相同，为什么？有什么生物学意义？
七、学习资料
有丝分裂，又称为间接分裂，由 W. Fleming (1882)年首次发现于动物及 E. Strasburger （1880）年发现于植物。特点是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于 (动物和高等植物) 。是真核细胞分裂产生体细胞的过程。 通过有丝分裂，每条染色体精确复制成的两条染色单体并均等地分到两个子细胞，使子细胞含有同母细胞相同的遗传信息。有丝分裂过程是一个连续的过程，为了便于描述人为的
公司产品：无水乙醇、洋红、秋水仙素、8-羟基喹啉、碱性品红、山梨醇、苯酚、甲醛、冰乙酸、地衣红、盐酸、0.05%秋水仙素水溶液、卡诺固定液，Carnoy fixative ）卡诺固定液，Carnoy fixative）、离析液 （解离液 ）、改良苯酚品红染液、1％醋酸洋红（aceto carmine） 、平底试管、预处理后的洋葱根尖、加拿大树胶、有丝分裂（洋葱根尖）实验试剂盒Ⅰ、有丝分裂（洋葱根尖）实验试剂盒Ⅱ。
试剂配制：
1、卡诺固定液Carnoy fixative）： 配方Ⅰ：纯酒精3份 + 冰醋酸1份 ；配方Ⅱ：纯酒精6份 + 冰醋酸1份 + 氯仿3份 。适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。固定时间不宜过久。
2、改良苯酚品红染液 ：
原液A ：将3g 碱性品红溶入100ml 70%酒精，此液可长期保存。
原液B ：将10mlA 液加入到90ml 5%苯酚水溶液中。
原液C ：将55mlB 液加入到6ml 的冰醋酸和6ml 的38%的甲醛中。
染色液：取C 液20ml ，加45%冰醋酸80ml ，充分混匀，再加入1g 山梨醇，放置14天后 使用，可保存3年。
3、1％醋酸洋红（aceto carmine） ：适用于压碎涂抹制片，能使染色体染成深红色，细胞质成浅红色。 配方：洋红1g ； 45％醋酸100ml ，煮沸2h 左右，并随时注意补充加入蒸馏水到原含量，然后冷却过滤，加入4％铁明矾溶液1～2滴（不能多加，否则会发生沉淀），放入棕色瓶中备用。
4、醋酸-地衣红染液： 取45毫升醋酸，跟55毫升蒸馏水相混，加热，徐徐加入地衣红粉末1～2克，搅拌溶解后，缓缓煮沸2小时。冷却后过滤，贮存在棕色瓶里。
5、离析液 （解离液 ）
盐酸-酒精固定离析液 ：一般用于离析根尖细胞。 它能使细胞壁中层（果胶质）溶解，而使细胞分开。
1．盐酸酒精 ，配方:95%酒精 1份，浓盐酸1份。二者混合即成。 2．盐酸溶液 （1）1 mol／L 盐酸 配方：浓盐酸（比重） 用蒸馏水定容 1 000ml 。
盐酸水解时间对染色效果影响很大，水解时间短，易着色但较难压片；水解时间长，染色慢而色淡；超过20min 或水解温度过高，往往染色极淡，或染不上色。各种材料最合适的时间有差别，一般来说，大染色体材料水解时间可较长，小染色体材料宜短。
改用／L 盐酸于60℃恒温下水解10～15min ，对各种类型材料都能获得细胞分离和染色合适的较好效果。
6、预处理液
用于根尖压片的前处理，能使细胞有丝分裂染色体缩短。
（1） 8-羟基奎林水溶液 ：称取 8-羟基奎林溶于1 000ml蒸馏水中。
（2）对二氯代苯饱和水溶液： 将对二氯代苯加入蒸馏水中搅拌至不再溶解为止，即成饱和水溶液。
（3）秋水仙素水溶液：常用浓度为 0.05～0.2%，
7、有丝分裂（洋葱根尖）实验试剂盒Ⅰ：A （预处理后的洋葱根尖）、B 液（离析液）、C 液（染色液）、平底试管组成。
8、有丝分裂（洋葱根尖）实验试剂盒Ⅱ：A 液（0.05%秋水仙素水溶液）、B 液（卡诺固定液）、C 液（离析液）、D 液（染色液）、平底试管组成。
根尖分生组织细胞的有丝分裂实验
一、实验目的
1 、学习植物根尖压片标本制备方法的基本技术。
体简易永久片的制片技术。
2、熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体形态和结构上的动态变化，并学会染色
二、实验原理
有丝分裂是高等动植物体细胞分裂的主要方式，高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点、幼叶等部位的分生组织。在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。在有丝分裂过程中，真核细胞的染色质凝集成染色体，每个染色体能复制一份，复制的姐妹染色单体在纺锤丝的牵拉下分向两极，精确地平均分配到两个子细胞中去，从而使产生得两个子细胞及与其母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。由于染色体上有遗传物质 DNA ，因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。染色体的这种特异性、恒定性、连续性和在细胞分裂过程中的正确复制及分配被确认为是遗传物质的载体，是遗传传递规律的细胞学基础。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。
三、实验材料
显微镜、培养箱、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片；Carnoy 固定液、改良苯酚品红染色液、0.002M 8-羟基喹啉水溶液、0.05～0.2% 秋水仙素溶液、对二氯苯饱和水溶液、1M HCl、加拿大树胶。 洋葱（Aillum cepa）根尖，蚕豆（Vicia faba）根尖 。 四、实验器具和药品试剂
五、实验方法和步骤
（一）材料准备
1、培养洋葱根尖 选取底盘大的洋葱做生根材料，剥去外层老皮，用刀削去老根，注意不要削掉四周的根芽，将洋葱的鳞基置于盛水的小烧杯（或广口瓶）上，让洋葱的底部接触杯内的水面。把小烧杯放进 20～25℃培养箱内培养。培养时注意每天换水 1～2 次，防止烂根。待根长约 1.5 cm 时，在上午九时取健壮的根尖进行预处理。 2、种子培养根尖 选取蚕豆（或小麦、玉米等）种子放在烧杯中，放清水浸泡过夜，使种子吸水胀大后倒出，再用清水洗几次，用多层纱布包好种子，放进 20～25℃培养箱内培养。当根尖长 1～1.5cm 时，即可以在上午九时取生长旺盛的根尖进行预处理。 （二）预处理 目的，使获得中期分裂相较多的细胞，使染色体缩短，分散，形态结构稳定，便于压片，有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数。 预处理机理：阻止或破坏纺纺锤体微管的形成，使有丝分裂过程被抑制在分裂中期阶段，以便累积较多的处于分裂中期的分裂相；改变细胞质的粘度；导致染色体高度浓缩、变短，利于染色体的分散。
在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。一般是在分裂高峰前处理 1.5 小时以上。处理的方法如下： 1．秋水仙素水溶液常用浓度为 0.05～0.2%，室温下处理 3～4 小时。对抑制纺锤体活动的效果明显，易于获得较多的中期分裂相，并且染色体收缩较直，有利于对染色体结构的研究。
2．对二氯苯饱和水溶液室温下处理 3～5 小时，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，对染色体小而多的植物中，计数染色体制片效果最好。 3．8-羟基喹啉水溶液 使用浓度为 0.002～0.004M ，一般认为它将引起细胞粘滞度的改变，进而导致纺锤体活动受阻。通常处理 2～4 小时，可使中期染色体在赤道面上保持其相应的排列位置，另一优点是处理后的缢痕区较为清晰。 4．低温处理将材料如小麦，浸入蒸馏水内，放置到 1～4℃冰箱中（玉米及水稻 6～8℃）处理 20～24 小时，也起到良好的效果。
（三）固定 通常采用的是 Carnoy 固定液。固定的目的是用化学的方法把细胞迅速杀死，使蛋白质变性，并尽量保持原来的分裂状态，同时更易于着色。固定时，将根尖投入固定液中室温处理 3～24 小时。材料若不及时用，可经过 90%酒精和 70%酒精浸洗一次，再换入新的 70%酒精中，置于冰箱内 0～4℃保存备用。经过较长时间保存的材料，在进行观察前可用固定液再处理一次，效果较好。 （四）解离 目的是使分生组织细胞之间的果胶质层解掉，并使细胞壁软化，便于压片。解离的时间视根尖的粗细老嫩不同而有差异。方法是：将固定后（或保存后）的根尖分装到小烧杯内，用蒸馏水漂洗，再加入 1N HCl 溶液，在 60℃下水解 8～20 分钟（洋葱用 8 分钟，蚕豆侧根用 10 分钟，玉米用 20 分钟），解离成功的根尖，分生组织发白，伸长区已呈半透明，似烂状。 （五）漂洗 解离后的根尖用蒸馏水漂洗 3～4 次，用吸管吸干水。漂洗时间和次数一定要足够，否则影响染色效果或染不上色 （六）染色、压片 将解离漂洗后的根尖放在小培养皿里，滴加改良苯酚品红染色液染色 10 分钟左右。制片时，取一根尖放在洁净的载玻片上，用刀片切取 1mm 左右的生长区，其余部分弃掉，加 1 滴染色液，加盖玻片。用镊子在材料的地方轻压几下，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上覆盖一层吸水纸用拇指适当用力下压，用解剖针（或竹签）敲击根尖部位，重复几次，力一次比一次大，使材料分散成薄薄的一层，以盖玻片不破裂为准。 （七）观察 将制好的标本片，置于显微镜下先作低倍观察，选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察，注意核及染色体的动态变化。 （八）永久装片 由临时压片材料制做成永久玻片标本，可以将玻片放在 CO2 干冰或生物切片半导体冰冻机上，待玻片结冰后，取出玻片，用刀片迅速揭开盖玻片，放在空气中干燥后，用封藏剂（加拿大树胶）封固。
六、作业
1、每人制作两张洋葱根尖细胞分裂的临时装片。
2、根据自己在实验中观察到的各时期的细胞特点，绘制有丝分裂前期、中期、后期的简图，并能区分各时期细胞的特点。
3、解释什么是染色单体？什么是子染色体？子细胞中的染色体与母细胞中的染色体是否相同，为什么？有什么生物学意义？
七、学习资料
有丝分裂，又称为间接分裂，由 W. Fleming (1882)年首次发现于动物及 E. Strasburger （1880）年发现于植物。特点是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于 (动物和高等植物) 。是真核细胞分裂产生体细胞的过程。 通过有丝分裂，每条染色体精确复制成的两条染色单体并均等地分到两个子细胞，使子细胞含有同母细胞相同的遗传信息。有丝分裂过程是一个连续的过程，为了便于描述人为的
公司产品：无水乙醇、洋红、秋水仙素、8-羟基喹啉、碱性品红、山梨醇、苯酚、甲醛、冰乙酸、地衣红、盐酸、0.05%秋水仙素水溶液、卡诺固定液，Carnoy fixative ）卡诺固定液，Carnoy fixative）、离析液 （解离液 ）、改良苯酚品红染液、1％醋酸洋红（aceto carmine） 、平底试管、预处理后的洋葱根尖、加拿大树胶、有丝分裂（洋葱根尖）实验试剂盒Ⅰ、有丝分裂（洋葱根尖）实验试剂盒Ⅱ。
试剂配制：
1、卡诺固定液Carnoy fixative）： 配方Ⅰ：纯酒精3份 + 冰醋酸1份 ；配方Ⅱ：纯酒精6份 + 冰醋酸1份 + 氯仿3份 。适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。固定时间不宜过久。
2、改良苯酚品红染液 ：
原液A ：将3g 碱性品红溶入100ml 70%酒精，此液可长期保存。
原液B ：将10mlA 液加入到90ml 5%苯酚水溶液中。
原液C ：将55mlB 液加入到6ml 的冰醋酸和6ml 的38%的甲醛中。
染色液：取C 液20ml ，加45%冰醋酸80ml ，充分混匀，再加入1g 山梨醇，放置14天后 使用，可保存3年。
3、1％醋酸洋红（aceto carmine） ：适用于压碎涂抹制片，能使染色体染成深红色，细胞质成浅红色。 配方：洋红1g ； 45％醋酸100ml ，煮沸2h 左右，并随时注意补充加入蒸馏水到原含量，然后冷却过滤，加入4％铁明矾溶液1～2滴（不能多加，否则会发生沉淀），放入棕色瓶中备用。
4、醋酸-地衣红染液： 取45毫升醋酸，跟55毫升蒸馏水相混，加热，徐徐加入地衣红粉末1～2克，搅拌溶解后，缓缓煮沸2小时。冷却后过滤，贮存在棕色瓶里。
5、离析液 （解离液 ）
盐酸-酒精固定离析液 ：一般用于离析根尖细胞。 它能使细胞壁中层（果胶质）溶解，而使细胞分开。
1．盐酸酒精 ，配方:95%酒精 1份，浓盐酸1份。二者混合即成。 2．盐酸溶液 （1）1 mol／L 盐酸 配方：浓盐酸（比重） 用蒸馏水定容 1 000ml 。
盐酸水解时间对染色效果影响很大，水解时间短，易着色但较难压片；水解时间长，染色慢而色淡；超过20min 或水解温度过高，往往染色极淡，或染不上色。各种材料最合适的时间有差别，一般来说，大染色体材料水解时间可较长，小染色体材料宜短。
改用／L 盐酸于60℃恒温下水解10～15min ，对各种类型材料都能获得细胞分离和染色合适的较好效果。
6、预处理液
用于根尖压片的前处理，能使细胞有丝分裂染色体缩短。
（1） 8-羟基奎林水溶液 ：称取 8-羟基奎林溶于1 000ml蒸馏水中。
（2）对二氯代苯饱和水溶液： 将对二氯代苯加入蒸馏水中搅拌至不再溶解为止，即成饱和水溶液。
（3）秋水仙素水溶液：常用浓度为 0.05～0.2%，
7、有丝分裂（洋葱根尖）实验试剂盒Ⅰ：A （预处理后的洋葱根尖）、B 液（离析液）、C 液（染色液）、平底试管组成。
8、有丝分裂（洋葱根尖）实验试剂盒Ⅱ：A 液（0.05%秋水仙素水溶液）、B 液（卡诺固定液）、C 液（离析液）、D 液（染色液）、平底试管组成。