()—409—
蛋白由上海计划生育研究所(1mg/ml)提供。金颗粒购自华美生物工程公司。硝酸纤维素膜购自上海生物医学公司。血清标本来源:本院不孕门诊女性标本共500份,年龄(23~
44)岁。对照血清30份来自男性健康自愿者,其中抗核抗体
215 重复试验与稳定性检测 取ELISA检测出的阳性血
清和阴性血清各4份,用DIGFA重复检验10次,结果均一致,将点样后的膜与金标抗体置冰箱冷藏,间隔15d测定1次,共测12次,结果无改变。说明DIGFA所用纤维素膜和金标抗体在(0~4)℃至少可以保存半年。
3 讨论
阳性血清样本10份,类风湿因子阳性5份。抗精子抗体阳性血清40份均来自本院。
μ112 DIGFA法的建立 取1l人卵透明带抗原(zp)液滴加μl在硝酸纤维素膜中央,其下方加健康人血清IgG(2g/L)015作为质控线,4℃放置2h,37℃恒温箱内烘干,冷藏备用。测μ定:在圆孔膜上滴加封闭液100l,待渗入;滴加未稀释血清μμ标本50l,渗入完全后加金标羊抗人IgG50l,待渗入,加入μPBS100l,置37℃温箱6min内观察结果。在膜中央出现红色斑点者为阳性,不显色者为阴性,颜色稍浅者为可疑,其下方质量控制线呈红色。
113 ELISA法 抗人卵透明带抗体ELISA试剂盒购自上
免疫性不孕在不孕原因中所占比例逐步升高,例如像抗精子抗体,抗子宫内膜抗体,zp免疫对生育力的影响已获大量动物IVF-ET临床实践证实,以往采用ELISA法操作繁琐,需时长,不利于及时诊断及治疗。DIGFA法是采用金标记物,固相载体和免疫渗滤技术相结合的一种新的检测方法,使整个检测过程仅需数分钟,即可直接观察结果,同时,在金标记IgG向膜下方渗滤时,未与硝酸纤维素膜上已固化抗原结合的血清抗体被冲洗,不能与已封闭的膜结合而渗入膜下,避免了非特异性显色。本文中DIGFA法与ELISA法相比表明,DIGFA具有较高敏感性、特异性和符合率,且重复性好,试剂稳定,不需特殊设备,简化了繁琐的操作过程,同时也减少了因操作引起的误差,方便实用,便于普及推广。
海玉兰生物技术研究所,按说明书操作。
2 结果
211 DIGFA结果 用本法测定不孕者血清500例,阳性率2112%(106/500)。对照血清30份均为阴性。
212 吸收试验 将纯化的zpAg与ELISA检出的zpAb阳性
参考文献
1刘义,综述1子宫内膜异位症研究进展1国外医学妇科分册11995,22:3371
2沙国柱(综述)1精子生育抗原的研究进展1男性学杂志11996,10:531
3罗丽兰1不孕与不育1第1版1北京:人民卫生出版社11998,3541
4黄宇峰1男科诊断学1第1版1上海第二军医大学出版社11999,1861
(2004-08-20收稿)
血清20份等体积混合后用DIGFA检测zpAb,结果均为阴性。
213 交叉试验 将抗核抗体阳性血清10份,5份类风湿因
子阳性及40份抗精子抗体阳性血清样本分别进行DIGFA检测,未发现zpAb阳性。
214 对比试验 用DIGFA与ELISA法同时测定不孕妇女500例血清样本,并与ELISA法相比,敏感性为9613%,特异
性为9514%,符合率为9611%,两法比较无显著性差异(x2
=3166,P>0105)。
・论 著・
尿游离皮质醇化学发光免疫分析
天津医科大学总医院特检中心(300052) 刘金玲 马堪悦 李 江 李聪新 高 硕
摘要 目的:应用IMMULITE化学发光系统测定尿游离皮质醇并进行评价。方法:尿液以二氯甲烷抽提
后行化学发光免疫分析。结果:抽提回收率为(9217~105133)%,平均为97174%;稀释试验O/E比值为8719~10719,平均为100176%;批内变异系数分别为914%、317%、811%,平均711%,批间变异系数为717%、517%、917%,平均717%;42份样本结果分析本法与RIA相关性好r=0.905(P
关键词 尿游离皮质醇 抽提法 化学发光免疫分析
ANewMethodofChemiluminescentImmunoassayforUrinaryFreeCortisolDetermination
LiuJinling,MaKanyue,LiJiang,etal.
GeneralHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin(300052)
Abstract Objective TodevelopanewmethodformeasurementofurinaryfreecortisolwiththeIMMULITEAutomated
—410—()
ChemiluminisentSystem.Methods Urinarysampleswereextractedwithdichloromentaneandtheextractwasdetectedforfreecor2tisolwithCCIA.Results Therecoveryratesofextractionwere92.7%~105.3%(mean97.74%),O/E%ofdilutionassaywere87.9%~107.9%(mean100.76%);Intra-andinter-assaycoefficientsofvariationwere9.4%,3.7%,8.1%(mean7.1%)and7.7%,5.7%,9.7%(mean7.7%)respectively.Resultsfrom42samplestestedwithbothCLISAandRIAshowedgoodcor2
μg/24h.Conclusion Thisrelation(r=0.905,P
methodshowedgoodaccuracy,validityandreproducibilityandwasfitforclinicaluse.
KeyWords urinaryfreecortisol,extractionmethods,chemiluminescentimmunoassay
皮质醇(COR)是肾上腺皮质分泌的主要糖皮质激素,为评价和监测肾上腺功能的重要指标。血循环中COR主要与类固醇结合蛋白结合,只有10%的为游离状态具生物活性;当血COR增高时,游离COR也迅速增加,可随尿液排出。测定尿液游离COR比测定血中总COR更能准确反映肾上腺皮质的分泌功能,是目前诊断Cushing’s综合征最可靠指标1。本文将化学发光免疫分析法(CLIA)与尿液抽提技术有机结合,建立本室尿液游离COR测定方法。
1 材料和方法
111 样本采集 本文包括经筛查肝、肾功能正常,无内分泌
疾病的健康人38例(男19,女19),年龄(15~58)岁,平均36岁;93份样本来自2002年3月~2003年9月内分泌门诊和住院病人。
112 仪器与试剂 IMMULITE化学发光仪及配套试剂(美
国DPC公司);二氯甲烷(天津化学试剂公司);COR标准物
(上海生物化学试剂公司);RIAkit及COR零标准液(天津
德普生物技术有限公司)。
113 方法
11311 样本抽提 试验对象普通饮食,收集24h尿液混匀,
精确记录尿量,取10ml混合后尿液离心备用。取015ml离心后尿液于有塞抽提管,加入二氯甲烷1ml,振荡提取5min,倒入离心管低速离心5min;小心将上层抽提后尿液吸弃,吸取抽提液014ml放蒸发管,37℃水浴空气吹干2;将COR零标准液012ml加入蒸发管,充分溶解放置10min,待测。11312 化学发光免疫分析 加样探针自动吸取10μl溶解液,与一定量碱性磷酸酶标记的COR溶液同时加入含COR抗体包被珠的测试杯,37℃温育30min,经仪器自动清洗离心,去除未结合部分,加发光底物,第二次温育10min,产生发光效应,测量应用内存效正曲线,测得结果,计算24h尿液
COR含量。
11313 方法评价 尿液抽提回收试验、高浓度样本稀释试
验;精密度测定;尿液抽提与直接测定对比及本法与RIA法的对比试验。
11314 统计学处理 应用Spss统计软件,做配对t检验和
相关性分析。
2 结果
211 尿液抽提回收实验 选取COR低值尿液,在此尿液中分
别加入三个不同浓度的COR标准物,使其最终浓度为10、20、40μg/dl,常规萃取,复管测定(n=5),并计算平均抽提回收率。
表1 尿液COR抽提回收率(n=5)
理论值
实测值
回收率
平均回收率
(μg/dl)(μg/dl)(%)(%)
109.2792.702019.0495.2097.7
40
42.13
105.33
212 尿液抽提与直接测定的比较 选择51份尿液样本,分
别进行抽提溶解液和原尿液的化学发光免疫测定,测定结果范围分别为2116~56818和30~975,中值为76125和17413
μg/24h,后者明显高于前者,且数值离散度大,t检验有差异,P
213 实验精密度 实验的批内和批间的精密度用变异系数
表示,三个不同剂量水平的尿液在同一批测定(n=3),计算批内的变异系数;在不同批次测定作为批间的变异系数(n=
11),本法符合免疫分析要求,见表2。
表2 尿液COR测定的批内、批间CV%
样本x
()—409—
蛋白由上海计划生育研究所(1mg/ml)提供。金颗粒购自华美生物工程公司。硝酸纤维素膜购自上海生物医学公司。血清标本来源:本院不孕门诊女性标本共500份,年龄(23~
44)岁。对照血清30份来自男性健康自愿者,其中抗核抗体
215 重复试验与稳定性检测 取ELISA检测出的阳性血
清和阴性血清各4份,用DIGFA重复检验10次,结果均一致,将点样后的膜与金标抗体置冰箱冷藏,间隔15d测定1次,共测12次,结果无改变。说明DIGFA所用纤维素膜和金标抗体在(0~4)℃至少可以保存半年。
3 讨论
阳性血清样本10份,类风湿因子阳性5份。抗精子抗体阳性血清40份均来自本院。
μ112 DIGFA法的建立 取1l人卵透明带抗原(zp)液滴加μl在硝酸纤维素膜中央,其下方加健康人血清IgG(2g/L)015作为质控线,4℃放置2h,37℃恒温箱内烘干,冷藏备用。测μ定:在圆孔膜上滴加封闭液100l,待渗入;滴加未稀释血清μμ标本50l,渗入完全后加金标羊抗人IgG50l,待渗入,加入μPBS100l,置37℃温箱6min内观察结果。在膜中央出现红色斑点者为阳性,不显色者为阴性,颜色稍浅者为可疑,其下方质量控制线呈红色。
113 ELISA法 抗人卵透明带抗体ELISA试剂盒购自上
免疫性不孕在不孕原因中所占比例逐步升高,例如像抗精子抗体,抗子宫内膜抗体,zp免疫对生育力的影响已获大量动物IVF-ET临床实践证实,以往采用ELISA法操作繁琐,需时长,不利于及时诊断及治疗。DIGFA法是采用金标记物,固相载体和免疫渗滤技术相结合的一种新的检测方法,使整个检测过程仅需数分钟,即可直接观察结果,同时,在金标记IgG向膜下方渗滤时,未与硝酸纤维素膜上已固化抗原结合的血清抗体被冲洗,不能与已封闭的膜结合而渗入膜下,避免了非特异性显色。本文中DIGFA法与ELISA法相比表明,DIGFA具有较高敏感性、特异性和符合率,且重复性好,试剂稳定,不需特殊设备,简化了繁琐的操作过程,同时也减少了因操作引起的误差,方便实用,便于普及推广。
海玉兰生物技术研究所,按说明书操作。
2 结果
211 DIGFA结果 用本法测定不孕者血清500例,阳性率2112%(106/500)。对照血清30份均为阴性。
212 吸收试验 将纯化的zpAg与ELISA检出的zpAb阳性
参考文献
1刘义,综述1子宫内膜异位症研究进展1国外医学妇科分册11995,22:3371
2沙国柱(综述)1精子生育抗原的研究进展1男性学杂志11996,10:531
3罗丽兰1不孕与不育1第1版1北京:人民卫生出版社11998,3541
4黄宇峰1男科诊断学1第1版1上海第二军医大学出版社11999,1861
(2004-08-20收稿)
血清20份等体积混合后用DIGFA检测zpAb,结果均为阴性。
213 交叉试验 将抗核抗体阳性血清10份,5份类风湿因
子阳性及40份抗精子抗体阳性血清样本分别进行DIGFA检测,未发现zpAb阳性。
214 对比试验 用DIGFA与ELISA法同时测定不孕妇女500例血清样本,并与ELISA法相比,敏感性为9613%,特异
性为9514%,符合率为9611%,两法比较无显著性差异(x2
=3166,P>0105)。
・论 著・
尿游离皮质醇化学发光免疫分析
天津医科大学总医院特检中心(300052) 刘金玲 马堪悦 李 江 李聪新 高 硕
摘要 目的:应用IMMULITE化学发光系统测定尿游离皮质醇并进行评价。方法:尿液以二氯甲烷抽提
后行化学发光免疫分析。结果:抽提回收率为(9217~105133)%,平均为97174%;稀释试验O/E比值为8719~10719,平均为100176%;批内变异系数分别为914%、317%、811%,平均711%,批间变异系数为717%、517%、917%,平均717%;42份样本结果分析本法与RIA相关性好r=0.905(P
关键词 尿游离皮质醇 抽提法 化学发光免疫分析
ANewMethodofChemiluminescentImmunoassayforUrinaryFreeCortisolDetermination
LiuJinling,MaKanyue,LiJiang,etal.
GeneralHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin(300052)
Abstract Objective TodevelopanewmethodformeasurementofurinaryfreecortisolwiththeIMMULITEAutomated
—410—()
ChemiluminisentSystem.Methods Urinarysampleswereextractedwithdichloromentaneandtheextractwasdetectedforfreecor2tisolwithCCIA.Results Therecoveryratesofextractionwere92.7%~105.3%(mean97.74%),O/E%ofdilutionassaywere87.9%~107.9%(mean100.76%);Intra-andinter-assaycoefficientsofvariationwere9.4%,3.7%,8.1%(mean7.1%)and7.7%,5.7%,9.7%(mean7.7%)respectively.Resultsfrom42samplestestedwithbothCLISAandRIAshowedgoodcor2
μg/24h.Conclusion Thisrelation(r=0.905,P
methodshowedgoodaccuracy,validityandreproducibilityandwasfitforclinicaluse.
KeyWords urinaryfreecortisol,extractionmethods,chemiluminescentimmunoassay
皮质醇(COR)是肾上腺皮质分泌的主要糖皮质激素,为评价和监测肾上腺功能的重要指标。血循环中COR主要与类固醇结合蛋白结合,只有10%的为游离状态具生物活性;当血COR增高时,游离COR也迅速增加,可随尿液排出。测定尿液游离COR比测定血中总COR更能准确反映肾上腺皮质的分泌功能,是目前诊断Cushing’s综合征最可靠指标1。本文将化学发光免疫分析法(CLIA)与尿液抽提技术有机结合,建立本室尿液游离COR测定方法。
1 材料和方法
111 样本采集 本文包括经筛查肝、肾功能正常,无内分泌
疾病的健康人38例(男19,女19),年龄(15~58)岁,平均36岁;93份样本来自2002年3月~2003年9月内分泌门诊和住院病人。
112 仪器与试剂 IMMULITE化学发光仪及配套试剂(美
国DPC公司);二氯甲烷(天津化学试剂公司);COR标准物
(上海生物化学试剂公司);RIAkit及COR零标准液(天津
德普生物技术有限公司)。
113 方法
11311 样本抽提 试验对象普通饮食,收集24h尿液混匀,
精确记录尿量,取10ml混合后尿液离心备用。取015ml离心后尿液于有塞抽提管,加入二氯甲烷1ml,振荡提取5min,倒入离心管低速离心5min;小心将上层抽提后尿液吸弃,吸取抽提液014ml放蒸发管,37℃水浴空气吹干2;将COR零标准液012ml加入蒸发管,充分溶解放置10min,待测。11312 化学发光免疫分析 加样探针自动吸取10μl溶解液,与一定量碱性磷酸酶标记的COR溶液同时加入含COR抗体包被珠的测试杯,37℃温育30min,经仪器自动清洗离心,去除未结合部分,加发光底物,第二次温育10min,产生发光效应,测量应用内存效正曲线,测得结果,计算24h尿液
COR含量。
11313 方法评价 尿液抽提回收试验、高浓度样本稀释试
验;精密度测定;尿液抽提与直接测定对比及本法与RIA法的对比试验。
11314 统计学处理 应用Spss统计软件,做配对t检验和
相关性分析。
2 结果
211 尿液抽提回收实验 选取COR低值尿液,在此尿液中分
别加入三个不同浓度的COR标准物,使其最终浓度为10、20、40μg/dl,常规萃取,复管测定(n=5),并计算平均抽提回收率。
表1 尿液COR抽提回收率(n=5)
理论值
实测值
回收率
平均回收率
(μg/dl)(μg/dl)(%)(%)
109.2792.702019.0495.2097.7
40
42.13
105.33
212 尿液抽提与直接测定的比较 选择51份尿液样本,分
别进行抽提溶解液和原尿液的化学发光免疫测定,测定结果范围分别为2116~56818和30~975,中值为76125和17413
μg/24h,后者明显高于前者,且数值离散度大,t检验有差异,P
213 实验精密度 实验的批内和批间的精密度用变异系数
表示,三个不同剂量水平的尿液在同一批测定(n=3),计算批内的变异系数;在不同批次测定作为批间的变异系数(n=
11),本法符合免疫分析要求,见表2。
表2 尿液COR测定的批内、批间CV%
样本x