·基础医学·
中国当代医药2015年11月第22卷第33期
两种制备大鼠胚胎成纤维细胞的方法比较
李
四川泸州
玲
1
朱自修
2
肖润兰
1
王巧稚3▲
1.四川省泸州市龙马潭区妇幼保健院妇产科，四川泸州646000；2.四川医科大学附属中医院重症监护室，
646000
646000；3.四川医科大学组胚教研室，四川泸州
[摘要]目的比较酶消化法和组织块贴壁法对大鼠胚胎的皮肤成纤维细胞的培养情况，探讨何种方法能更加高效
快捷地获取和培养大鼠的胚胎成纤维细胞。方法选择孕14d大鼠胚胎，取其背部皮肤，分别采用酶消化法和组织块贴壁法获得原代的胚胎成纤维细胞，观察其生物学特点，进行传代、冻存、复苏和HE染色，并绘制细胞生长曲线。结果两种方法都能成功培养出胎鼠成纤维细胞，但组织块贴壁法相对酶消化法更便捷，不易污染，成活率高；传代和复苏后，两种方法获得的细胞无明显差异。结论组织块贴壁法是一种更适应胚鼠成纤维细胞的培养方法。
[关键词]胚胎；成纤维细胞；大鼠[中图分类号]R329
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721（2015）11（c）-0114-03
Comparisonoftwoculturedmethodofembryonicfibroblasts
LILing1ZHUZi-xiu2XIAORun-lan1WANGQiao-zhi3▲
1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,LongmatanDistrictMaternalandChildHealthCare,SichuanProvince,Luzhou
646000,China;2.DepartmentofICU,theAffiliatedHospitalofTraditionalChineseMedicineofSichuanMedi-calUniversity,SichuanProvince,Luzhou646000,China;3.DepartmentofHistologyandEmbryology,SichuanMedicalU-niversity,SichuanProvince,Luzhou646000,China
[Abstract]ObjectiveToexplorewhichwaycanbemoreefficientandfastertoacquireandcultivateratembryonicfi-broblastsinthisstudybyadoptingenzymedigestionandtissueexplantsadherentmethodtocomparecultivationofem-bryonicfibroblastsfromrat′sskin.MethodsEmbryosofpregnancyrats(14days)weretakentogetitsdorsalskin.En-zymedigestionandtissueexplantsadherentmethodwereusedrespectivelytoobtaintheprimaryratembryonicfibrob-lastsandthentoobserveitsbiologicalcharacteristics,whichwaspassaged,cryopreserved,resuscitatedanddonewithHEstaining.Andgrowthcurveofcellswasdrawn.ResultsRatembryonicfibroblastsweresuccessfullycultivatedbybothmethods.Comparedwiththeenzymedigestion,thetissueexplantsadherentmethodwasmoreconvenient,noteasilypol-lutedandwithhighsurvivalrate.Therewasnodifferencebetweencellsacquiredbythetwomethodsafterbeingpas-sagedandresuscitated.ConclusionTissueexplantsadherentmethodisabetterwaytocultivateratembryofibroblast.[Keywords]Embryo;Fibroblasts;Therat
创伤的发生和愈合常伴随人的一生，往往会留下瘢痕，有时还会影响到器官的功能。研究表明，哺乳动物在胚胎发育前2/3的时间段内，胚胎皮肤创伤后愈合不会有瘢痕产生，这种现象称为“无瘢痕愈合”（scarlesshealing）[1]，这为人们提供了一个理想的组织修复模型，研究无瘢痕愈合的机制，使成年人伤口实现无瘢痕愈合成为可能。其中，胚胎成纤维细胞在胚胎无瘢痕愈合中发挥重要作用[2-4]。为探索更简单高效获得胚胎成纤维细胞的方法，本试验分别采用胰酶消化法和组织块法培养大鼠胚胎皮肤的成纤维细胞，并成功进行冻存和复苏，建立一套较完备而快速的胚胎皮肤成纤维细胞的培养模式。
▲
1材料与方法1.1主要试剂与仪器
DMEM培养基、2.5g/L胰蛋白酶（Gibco公司）、
胎牛血清FBS（HyClone公司）；超净工作台（苏州净化设备集团有限公司）、二氧化碳培养箱（Heraeus公司）、倒置相差显微镜（日本Olympus公司）。
1.2实验方法1.2.1皮肤预处理
取孕14d大鼠（四川医科大学实验动物中心，一级实验动物），经麻醉后剖腹取出胚胎，取其臀、背部皮肤，先用75%乙醇消毒，再用含双抗生理盐水浸泡
1min，最后用生理盐水反复冲洗3次（去除残余抗生
素），直至液体清亮透明。
通讯作者
114
CHINAMODERNMEDICINEVol.22No.33November2015
中国当代医药2015年11月第22卷第33期
·基础医学·
沉淀加入含10％FBS培养基，轻轻吹吸均匀，接种于培养瓶中。
1.2.2原代培养方法
1.2.2.1块培养法[5]鼠胚皮肤用Hank液反复冲洗，剪
成0.5～1mm3大小的组织块，用眼科镊子将组织以
1.2.5鼠胚细胞HE染色
取第三代成纤维细胞制成细胞爬片，待细胞长满时，取出爬片，Hank液反复冲洗后，用4%多聚甲醛固定细胞1h，按常规HE染色步骤，以便更好地观察该细胞的特征。
0.5cm间距均匀地铺满培养瓶底。将培养瓶放入培
养箱，待组织块微干后，翻转培养瓶，使瓶底朝上（以避免组织块在加液时漂浮），再沿瓶壁缓缓加入少量含10%FBS的DMEM培养基。然后，把培养瓶翻转，让新加的培养基略润湿组织块。将培养瓶再次置入
2结果
2.1原代培养获得的鼠胚成纤维细胞特征情况
皮肤组织块接种6d后，可在组织块周围观察到有少量细胞迁移出来，并随时间增加，数量逐渐增多。存活的细胞折光性较好，细胞边缘清晰。培养第10天，可见细胞体积增大，呈放射状排列。多数以梭形为主，少数细胞有2～3个突起，有圆形或卵圆形的胞核。（图1A）。
酶消化法获得的原代细胞接种24h后，细胞在低密度的状态下呈短梭形或小多角形，折光性不强。培养至72h，大部分细胞为长梭形，也可见少数不规则的三角形细胞，胞核呈圆形或椭圆形。培养至第6天，细胞有交叉重叠现象，排列紧密，呈放射状（图1B）。
5%CO2、37℃培养箱中，待24h后，组织块贴壁，再加
入新鲜培养基。间隔3d换液一次，同时显微镜下仔细观察组织块周边有无细胞爬出。
1.2.2.2酶消化法[6]鼠胚皮肤剪碎，置于离心管，加入Hank液，以1000r/min离心5min，弃上清液。取胰酶
溶液加入离心管，与管内组织混匀后，37℃水浴震荡
15min后，加FBS终止消化。组织悬液以800r/min
离心5min，将沉淀用10%FBS培养基重悬后，接种入培养瓶。24h后换液，除去未贴壁细胞和残渣。根据细胞生长情况，间隔2～3d换液一次。
1.2.3细胞传代培养和增殖
原代培养细胞达到80%～90%融合时，弃去培养基，用D-Hank液冲洗，以去除残余血清。瓶中加入
0.25％胰酶，倒置显微镜下密切观察，见大部分细胞突
起回缩，形态变圆，细胞间隙变宽后，立即吸去胰酶，加入含10％FBS培养液终止消化。用吸管轻轻吹打，致细胞脱离瓶底，收集细胞悬液，按1∶3的比例进行接种培养。经过3～4次传代处理后，即得到纯化的成纤维细胞。
细胞生长曲线是观察细胞生长规律的重要方法，只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合后续实验的持续使用[7]。为观察不同培养方法对细胞增殖的影响，取生长良好的第二代鼠胚成纤维细胞，制成细胞悬液，经计数后，以1×105个/ml的密度接种至24孔板，每孔接种0.5ml，每日取3孔计数，连续计数7d，取每日均值作图，即为细胞生长曲线[8]，以此计算细胞的生长周期。
图1
A：块培养法；B：酶消化法
原代培养第6天的胎鼠成纤维细胞（×200）
2.2传代的鼠胚成纤维细胞和生长曲线情况
刚传代的细胞为圆形，接种24h后细胞开始伸展、贴壁，呈现梭形形态，大小均一，增殖快速。在用块培养方法获取到的成纤维细胞中，早期传代的细胞中，还可见少量的随原代细胞消化下来的组织块。传代细胞生长速度比原代细胞稍快，2d后细胞出现强大的增殖能力，各代细胞形态无明显变化，仍呈成纤维细胞样生长。一般5d后，细胞可达80%～90%融合，形成单层汇合，紧密平行排列或呈漩涡状。两种方法所获得的传代细胞，在形态和生长速度上无明显差异（图2）。生长曲线图显示，传代培养的细胞潜伏期为
1.2.4细胞的冻存和复苏
取第三代生长旺盛的细胞，消化后收集于离心管，以1000r/min离心5min，收集细胞沉淀，加入细胞冻存液（1份二甲基亚砜与9份DMEM培养液混合），重悬细胞，调整细胞密度达到1×106个/ml。分装入无菌冻存管，密封并标记，按常规细胞冷冻程序处理后[9]，置液氮保存。
细胞复苏时，将冻存管投入37℃水浴箱中快速晃动1～2min，使冻存液迅速融解后，吸取细胞冻存悬液入离心管，加5ml培养基。离心弃上清，获得的细胞
1～2d，然后细胞在3～4d进入缓慢增长期，第5天左
右接种细胞进入指数增长期，约在第7天进入平台期（图3），这与镜下观察到的细胞生长情况相符合。两种培养方法所获得的传代细胞生长曲线非常接近，
无
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CHINAMODERNMEDICINEVol.22No.33November2015
·基础医学·
明显差异。
中国当代医药2015年11月第22卷第33期
功率，应注意到：皮肤组织块要尽量剪细，最好在离开活体2h之内进行细胞培养，以尽可能地保持细胞活性，可缩短细胞从皮肤块中爬出的时间；酶消化培养原代细胞时要严格控制时间长度，过短，细胞消化不下来，过长，会增加细胞死亡的概率。
通常情况下，来源于皮肤的原代和早期传代的培养的成纤维细胞中，都含有少量来自皮肤的上皮细胞[10-11]。酶消化法是较常用的纯化方法，因为上皮角质
A
A：块培养法；B：酶消化法
细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞耐受性较差，会先脱壁，而上皮细胞要消化更长的时间才脱落。所以控制好消化的时间，在大部分细胞脱落时，及时终止消化，即可达到纯化的目的。
但在原代培养阶段，相比较而言，使用酶消化法虽然耗时较短，但消化程度不好控制，细胞易受损，致使获得的原代细胞数量较少。而块培养法虽然耗时较长，但操作简单，省去了消化、吹打、离心等过程，大大减少了理化因素对细胞的损伤，且降低了污染机会，最大程度地保持了细胞的活性。因此同样面积的皮肤，却可获得更多的原代细胞。胚胎皮肤取材不易，采用块培养法能较好地解决细胞原代培养的问题，为后
图2培养6d后的第二代鼠胚成纤维细胞（×100）
酶消化法块培养法
细胞数量（×105个/ml）
培养时间（d）
图3
两种培养方法获得的成纤维细胞生长曲线
续无瘢痕愈合的实验奠定基础。
[参考文献]
[1]BurringtonJD.Woundhealinginthefetallamb[J].JPedi-atrSurg，1971，6（5）：523-528.
[2]WilgusTA.Regenerativehealinginfetalskin：areviewofthe
literature[J].OstomyWoundManage，2007，53（6）：16-21.[3]LorenzHP，WhitbyDJ，LongakerMT，etal.Fetalwoundheal-ing：theontogenyofscarformationinthenon-humanpri-mates[J].AnnSurg，1993，217（4）：391-396.
[4]刘霞，唐胜建，王小柯，等，无瘢痕愈合分子医学研究进
展[J].中国实用美容整形外科杂志，2004，15（2）：98-100.
2.3传代细胞HE染色的结果
低倍镜下可见细胞多为长梭形，胞体较大，也有少量多角形细胞，伸出长短不同的突起。胞核较大，染为蓝色，呈卵圆形或圆形，1～2个核仁。胞质弱嗜碱性，呈浅紫蓝色（图4）。
[5]王捷.动物细胞培养技术与应用[M].北京：化学工业出版
社，2004.
[6]杨奇，史远刚，窦忠英.影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层
的因素[J].动物医学进展，2001，22（4）：45.
[7]张卓然.培养细胞学与细胞培养技术[M].上海：上海科学
技术出版社，2004.
图4
鼠胚第三代成纤维细胞的HE染色（HE，×100）
[8]SiZQ，WuJZ.Cellculture[M].Beijing：TheWorldBookPub-lishCompanyofXianDai，2004：241-243.
[9]张怡，赵连三，汪成孝，等.小鼠胚胎成纤维细胞分离与
培养[J].四川大学学报（医学版），2003，34（2）：344-346.
2.4细胞冻存与复苏的结果
细胞复苏后状态良好，成活率约为73.8%。镜下可见细胞形态与冻存前无明显差别。这证明了鼠胚皮肤成纤维细胞的生物学性状稳定，可成功冻存及复苏。
[10]刘民，李柏青.小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑
制[J].中国实验动物学杂志，2002，1（4）：215.
[11]商爱民，吴靖芳，薛刚，等.大鼠胚胎成纤维细胞的分离
培养及生物学特[J].河北北方学院学报，2010，27（3）：
3讨论
本实验运用组织块贴壁法和酶消化法成功培养出大鼠胚胎皮肤的成纤维细胞。在实验中，为提高成
116
CHINAMODERNMEDICINEVol.22No.33November2015
17-20.
（收稿日期：2015-08-27本文编辑：卫轲
）
·基础医学·
中国当代医药2015年11月第22卷第33期
两种制备大鼠胚胎成纤维细胞的方法比较
李
四川泸州
玲
1
朱自修
2
肖润兰
1
王巧稚3▲
1.四川省泸州市龙马潭区妇幼保健院妇产科，四川泸州646000；2.四川医科大学附属中医院重症监护室，
646000
646000；3.四川医科大学组胚教研室，四川泸州
[摘要]目的比较酶消化法和组织块贴壁法对大鼠胚胎的皮肤成纤维细胞的培养情况，探讨何种方法能更加高效
快捷地获取和培养大鼠的胚胎成纤维细胞。方法选择孕14d大鼠胚胎，取其背部皮肤，分别采用酶消化法和组织块贴壁法获得原代的胚胎成纤维细胞，观察其生物学特点，进行传代、冻存、复苏和HE染色，并绘制细胞生长曲线。结果两种方法都能成功培养出胎鼠成纤维细胞，但组织块贴壁法相对酶消化法更便捷，不易污染，成活率高；传代和复苏后，两种方法获得的细胞无明显差异。结论组织块贴壁法是一种更适应胚鼠成纤维细胞的培养方法。
[关键词]胚胎；成纤维细胞；大鼠[中图分类号]R329
[文献标识码]A
[文章编号]1674-4721（2015）11（c）-0114-03
Comparisonoftwoculturedmethodofembryonicfibroblasts
LILing1ZHUZi-xiu2XIAORun-lan1WANGQiao-zhi3▲
1.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,LongmatanDistrictMaternalandChildHealthCare,SichuanProvince,Luzhou
646000,China;2.DepartmentofICU,theAffiliatedHospitalofTraditionalChineseMedicineofSichuanMedi-calUniversity,SichuanProvince,Luzhou646000,China;3.DepartmentofHistologyandEmbryology,SichuanMedicalU-niversity,SichuanProvince,Luzhou646000,China
[Abstract]ObjectiveToexplorewhichwaycanbemoreefficientandfastertoacquireandcultivateratembryonicfi-broblastsinthisstudybyadoptingenzymedigestionandtissueexplantsadherentmethodtocomparecultivationofem-bryonicfibroblastsfromrat′sskin.MethodsEmbryosofpregnancyrats(14days)weretakentogetitsdorsalskin.En-zymedigestionandtissueexplantsadherentmethodwereusedrespectivelytoobtaintheprimaryratembryonicfibrob-lastsandthentoobserveitsbiologicalcharacteristics,whichwaspassaged,cryopreserved,resuscitatedanddonewithHEstaining.Andgrowthcurveofcellswasdrawn.ResultsRatembryonicfibroblastsweresuccessfullycultivatedbybothmethods.Comparedwiththeenzymedigestion,thetissueexplantsadherentmethodwasmoreconvenient,noteasilypol-lutedandwithhighsurvivalrate.Therewasnodifferencebetweencellsacquiredbythetwomethodsafterbeingpas-sagedandresuscitated.ConclusionTissueexplantsadherentmethodisabetterwaytocultivateratembryofibroblast.[Keywords]Embryo;Fibroblasts;Therat
创伤的发生和愈合常伴随人的一生，往往会留下瘢痕，有时还会影响到器官的功能。研究表明，哺乳动物在胚胎发育前2/3的时间段内，胚胎皮肤创伤后愈合不会有瘢痕产生，这种现象称为“无瘢痕愈合”（scarlesshealing）[1]，这为人们提供了一个理想的组织修复模型，研究无瘢痕愈合的机制，使成年人伤口实现无瘢痕愈合成为可能。其中，胚胎成纤维细胞在胚胎无瘢痕愈合中发挥重要作用[2-4]。为探索更简单高效获得胚胎成纤维细胞的方法，本试验分别采用胰酶消化法和组织块法培养大鼠胚胎皮肤的成纤维细胞，并成功进行冻存和复苏，建立一套较完备而快速的胚胎皮肤成纤维细胞的培养模式。
▲
1材料与方法1.1主要试剂与仪器
DMEM培养基、2.5g/L胰蛋白酶（Gibco公司）、
胎牛血清FBS（HyClone公司）；超净工作台（苏州净化设备集团有限公司）、二氧化碳培养箱（Heraeus公司）、倒置相差显微镜（日本Olympus公司）。
1.2实验方法1.2.1皮肤预处理
取孕14d大鼠（四川医科大学实验动物中心，一级实验动物），经麻醉后剖腹取出胚胎，取其臀、背部皮肤，先用75%乙醇消毒，再用含双抗生理盐水浸泡
1min，最后用生理盐水反复冲洗3次（去除残余抗生
素），直至液体清亮透明。
通讯作者
114
CHINAMODERNMEDICINEVol.22No.33November2015
中国当代医药2015年11月第22卷第33期
·基础医学·
沉淀加入含10％FBS培养基，轻轻吹吸均匀，接种于培养瓶中。
1.2.2原代培养方法
1.2.2.1块培养法[5]鼠胚皮肤用Hank液反复冲洗，剪
成0.5～1mm3大小的组织块，用眼科镊子将组织以
1.2.5鼠胚细胞HE染色
取第三代成纤维细胞制成细胞爬片，待细胞长满时，取出爬片，Hank液反复冲洗后，用4%多聚甲醛固定细胞1h，按常规HE染色步骤，以便更好地观察该细胞的特征。
0.5cm间距均匀地铺满培养瓶底。将培养瓶放入培
养箱，待组织块微干后，翻转培养瓶，使瓶底朝上（以避免组织块在加液时漂浮），再沿瓶壁缓缓加入少量含10%FBS的DMEM培养基。然后，把培养瓶翻转，让新加的培养基略润湿组织块。将培养瓶再次置入
2结果
2.1原代培养获得的鼠胚成纤维细胞特征情况
皮肤组织块接种6d后，可在组织块周围观察到有少量细胞迁移出来，并随时间增加，数量逐渐增多。存活的细胞折光性较好，细胞边缘清晰。培养第10天，可见细胞体积增大，呈放射状排列。多数以梭形为主，少数细胞有2～3个突起，有圆形或卵圆形的胞核。（图1A）。
酶消化法获得的原代细胞接种24h后，细胞在低密度的状态下呈短梭形或小多角形，折光性不强。培养至72h，大部分细胞为长梭形，也可见少数不规则的三角形细胞，胞核呈圆形或椭圆形。培养至第6天，细胞有交叉重叠现象，排列紧密，呈放射状（图1B）。
5%CO2、37℃培养箱中，待24h后，组织块贴壁，再加
入新鲜培养基。间隔3d换液一次，同时显微镜下仔细观察组织块周边有无细胞爬出。
1.2.2.2酶消化法[6]鼠胚皮肤剪碎，置于离心管，加入Hank液，以1000r/min离心5min，弃上清液。取胰酶
溶液加入离心管，与管内组织混匀后，37℃水浴震荡
15min后，加FBS终止消化。组织悬液以800r/min
离心5min，将沉淀用10%FBS培养基重悬后，接种入培养瓶。24h后换液，除去未贴壁细胞和残渣。根据细胞生长情况，间隔2～3d换液一次。
1.2.3细胞传代培养和增殖
原代培养细胞达到80%～90%融合时，弃去培养基，用D-Hank液冲洗，以去除残余血清。瓶中加入
0.25％胰酶，倒置显微镜下密切观察，见大部分细胞突
起回缩，形态变圆，细胞间隙变宽后，立即吸去胰酶，加入含10％FBS培养液终止消化。用吸管轻轻吹打，致细胞脱离瓶底，收集细胞悬液，按1∶3的比例进行接种培养。经过3～4次传代处理后，即得到纯化的成纤维细胞。
细胞生长曲线是观察细胞生长规律的重要方法，只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合后续实验的持续使用[7]。为观察不同培养方法对细胞增殖的影响，取生长良好的第二代鼠胚成纤维细胞，制成细胞悬液，经计数后，以1×105个/ml的密度接种至24孔板，每孔接种0.5ml，每日取3孔计数，连续计数7d，取每日均值作图，即为细胞生长曲线[8]，以此计算细胞的生长周期。
图1
A：块培养法；B：酶消化法
原代培养第6天的胎鼠成纤维细胞（×200）
2.2传代的鼠胚成纤维细胞和生长曲线情况
刚传代的细胞为圆形，接种24h后细胞开始伸展、贴壁，呈现梭形形态，大小均一，增殖快速。在用块培养方法获取到的成纤维细胞中，早期传代的细胞中，还可见少量的随原代细胞消化下来的组织块。传代细胞生长速度比原代细胞稍快，2d后细胞出现强大的增殖能力，各代细胞形态无明显变化，仍呈成纤维细胞样生长。一般5d后，细胞可达80%～90%融合，形成单层汇合，紧密平行排列或呈漩涡状。两种方法所获得的传代细胞，在形态和生长速度上无明显差异（图2）。生长曲线图显示，传代培养的细胞潜伏期为
1.2.4细胞的冻存和复苏
取第三代生长旺盛的细胞，消化后收集于离心管，以1000r/min离心5min，收集细胞沉淀，加入细胞冻存液（1份二甲基亚砜与9份DMEM培养液混合），重悬细胞，调整细胞密度达到1×106个/ml。分装入无菌冻存管，密封并标记，按常规细胞冷冻程序处理后[9]，置液氮保存。
细胞复苏时，将冻存管投入37℃水浴箱中快速晃动1～2min，使冻存液迅速融解后，吸取细胞冻存悬液入离心管，加5ml培养基。离心弃上清，获得的细胞
1～2d，然后细胞在3～4d进入缓慢增长期，第5天左
右接种细胞进入指数增长期，约在第7天进入平台期（图3），这与镜下观察到的细胞生长情况相符合。两种培养方法所获得的传代细胞生长曲线非常接近，
无
115
CHINAMODERNMEDICINEVol.22No.33November2015
·基础医学·
明显差异。
中国当代医药2015年11月第22卷第33期
功率，应注意到：皮肤组织块要尽量剪细，最好在离开活体2h之内进行细胞培养，以尽可能地保持细胞活性，可缩短细胞从皮肤块中爬出的时间；酶消化培养原代细胞时要严格控制时间长度，过短，细胞消化不下来，过长，会增加细胞死亡的概率。
通常情况下，来源于皮肤的原代和早期传代的培养的成纤维细胞中，都含有少量来自皮肤的上皮细胞[10-11]。酶消化法是较常用的纯化方法，因为上皮角质
A
A：块培养法；B：酶消化法
细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同，成纤维细胞耐受性较差，会先脱壁，而上皮细胞要消化更长的时间才脱落。所以控制好消化的时间，在大部分细胞脱落时，及时终止消化，即可达到纯化的目的。
但在原代培养阶段，相比较而言，使用酶消化法虽然耗时较短，但消化程度不好控制，细胞易受损，致使获得的原代细胞数量较少。而块培养法虽然耗时较长，但操作简单，省去了消化、吹打、离心等过程，大大减少了理化因素对细胞的损伤，且降低了污染机会，最大程度地保持了细胞的活性。因此同样面积的皮肤，却可获得更多的原代细胞。胚胎皮肤取材不易，采用块培养法能较好地解决细胞原代培养的问题，为后
图2培养6d后的第二代鼠胚成纤维细胞（×100）
酶消化法块培养法
细胞数量（×105个/ml）
培养时间（d）
图3
两种培养方法获得的成纤维细胞生长曲线
续无瘢痕愈合的实验奠定基础。
[参考文献]
[1]BurringtonJD.Woundhealinginthefetallamb[J].JPedi-atrSurg，1971，6（5）：523-528.
[2]WilgusTA.Regenerativehealinginfetalskin：areviewofthe
literature[J].OstomyWoundManage，2007，53（6）：16-21.[3]LorenzHP，WhitbyDJ，LongakerMT，etal.Fetalwoundheal-ing：theontogenyofscarformationinthenon-humanpri-mates[J].AnnSurg，1993，217（4）：391-396.
[4]刘霞，唐胜建，王小柯，等，无瘢痕愈合分子医学研究进
展[J].中国实用美容整形外科杂志，2004，15（2）：98-100.
2.3传代细胞HE染色的结果
低倍镜下可见细胞多为长梭形，胞体较大，也有少量多角形细胞，伸出长短不同的突起。胞核较大，染为蓝色，呈卵圆形或圆形，1～2个核仁。胞质弱嗜碱性，呈浅紫蓝色（图4）。
[5]王捷.动物细胞培养技术与应用[M].北京：化学工业出版
社，2004.
[6]杨奇，史远刚，窦忠英.影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层
的因素[J].动物医学进展，2001，22（4）：45.
[7]张卓然.培养细胞学与细胞培养技术[M].上海：上海科学
技术出版社，2004.
图4
鼠胚第三代成纤维细胞的HE染色（HE，×100）
[8]SiZQ，WuJZ.Cellculture[M].Beijing：TheWorldBookPub-lishCompanyofXianDai，2004：241-243.
[9]张怡，赵连三，汪成孝，等.小鼠胚胎成纤维细胞分离与
培养[J].四川大学学报（医学版），2003，34（2）：344-346.
2.4细胞冻存与复苏的结果
细胞复苏后状态良好，成活率约为73.8%。镜下可见细胞形态与冻存前无明显差别。这证明了鼠胚皮肤成纤维细胞的生物学性状稳定，可成功冻存及复苏。
[10]刘民，李柏青.小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑
制[J].中国实验动物学杂志，2002，1（4）：215.
[11]商爱民，吴靖芳，薛刚，等.大鼠胚胎成纤维细胞的分离
培养及生物学特[J].河北北方学院学报，2010，27（3）：
3讨论
本实验运用组织块贴壁法和酶消化法成功培养出大鼠胚胎皮肤的成纤维细胞。在实验中，为提高成
116
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17-20.
（收稿日期：2015-08-27本文编辑：卫轲
）