抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则

抗药抗体免疫原性分析方法验证指导原则

皇家药院译

摘要:

几乎所有的生物制药产品都会引起一定的抗药抗体(anti-drug antibody,ADA)反应,抗药抗体反应可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应。在人体内,抗药抗体通常不会引起明显的临床反应。但是对于某些治疗性蛋白质,抗药抗体反应能引起各种临床的不良反应,包括温和事件及严重不良事件。临床前研究表明,抗药抗体能对药物暴露、药物毒性作用、药物代谢动力学、药物效应动力学等造成影响。因此治疗性蛋白质的免疫原性引起了临床医生、药企及监管机构的注意。为了评估生物药物分子的免疫原性,以及将实验结果与临床事件联系起来,在临床前研究和临床研究中,很有必要开发可靠的能够有效评估抗药抗体反应的实验方法。这里方法学验证显得尤为重要,并且方法学验证是药物上市申请必不可少的。现行的监管文件对于免疫分析方法的验证的指导相当有限,特别是缺乏有关免疫原性分析方法的验证的指导。因此,本文对抗药抗体免疫分析方法的验证提供科学的建议。在现有的关于生物分析的规范性文件的基础上加入独特的性能验证。笔者建议采用实验和统计学的方法进行免疫分析的方法学验证。这些建议被视为最佳的例子,旨在促进整个医药行业形成一个更加统一的抗体检测方法。

1.简介:

生物制药产品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸,一般通过人细胞系、哺乳动物细胞或细菌进行表达,比常规的小分子药物更大(一般大于1~3KD)。由于以上特性,生物制药产品引起免疫反应的潜力更大。生物制药的免疫原性与产品的内在因素(种属特异性表位、外源性、糖基化程度、聚合或变性程度、杂质和制剂)、外在因素(给药途径、慢性或急性给药、药代动力学及内源性当量)、患者因素(自身免疫性疾病、免疫抑制、和替代疗法)相关。

抗药抗体反应可能会导致严重的临床症状,包括过敏、自身免疫和不同的药代动力学特征(例如,药物中和、生物分布异常和药物清除率增强等均可能会使药物的的疗效发生改变)。药物引起的免疫反应是药物安全性和有效性的重要指标,这也是监管机构、生产企业、临床医生和患者共同关注的。因此,美国食品药品监督管理局以及欧盟、日本、加拿大、澳大利亚等国家的监管机构均要求通过药理学或毒理学相关的方法对抗药抗体进行评估。免疫原性与临床症状之间的相关性的研究依赖于临床前研究和临床研究中对于抗药抗体的客观检测和表征。因此免疫原性生物分析方法在用于检测研究样本之前应进行适当的开发及验证。已有出版物提供了关于抗药抗体检测和表征的策略、方法开发及优化等方面的指南。方法学验证是对分析方法的评价,通过特定的实验室方法表明采用的分析方法适用于相应的检测要求。具体到抗药抗体的检测方法,验证就是指证明该方法能可靠的(例如一致性和重复性)在复杂的生物基质(血清或血浆)中检测出低量的药物特异性抗体。方法学验证应该通过预先研究阶段和研究阶段两个阶段进行,预先研究阶段是指在分析样品之前的工作,研究阶段是指样品的分析工作,预先研究阶段和研究阶段对于表明分析方法的有效性和可控性同等重要。本文主要介绍抗药抗体免疫分析方法验证的主要性能特征,推荐方法学验证相关的方法和措施。本指南应当被视为最佳实践范例,考虑到具体实际分析方法时,在保持科学合理性和客观性的情况下,也可以采取替代方法。若采用替代方法,建议与监管机构进行充分讨论。以细胞功能为基础的中和抗药抗体生物检测和细胞介导的免疫分析不在本指南的讨论范围内。

2.方法

2.1 抗药抗体检测

临床和非临床研究通常是通过对治疗引起的抗药抗体反应的检测和表征来评估药物的免疫原性。目前可通过多种方法可用于抗药抗体的检测,包括酶联免疫法(ELISA)、放射免疫检定法(RIA)、放射免疫沉淀法(RIPA)、表面等离子体共振(SPR)、电化学发光法(ECL)。每一种检测方法均有其优点和局限性,在最近的文章中已进行过讨论[8,14]。不管是采用何种方法,在方法开发和优化后均应进行正式的方法学验证,以保证该方法适合相应的检测要求。因此可以预测,本指南的验证建议适用于大部分的抗药抗体免疫检测。研究人员应根据检测系统的特点确定合适的方法学验证方案。

临床研究中抗药抗体的检测和表征通常包括四种不同类型的方法。抗药抗体检测试验通常包括筛选试验和特异性确证试验,表征试验通常包括抗体滴定和中和抗体检测[10]。应用到具体研究样本时,抗药抗体分析试验需要两个关键决策参数,分别为筛选试验的筛选临界点(screening cut point)和特异性确证试验的特异性临界点(specificity cut point)。筛选临界点有助于抗药抗体检测结果的分类,高于筛选临界点为活性样品(活性样品通常为潜在阳性样品),低于临界点为无活性样品。活性样品通过特异性确证试验(如竞争性药物抑制信号通路)检测是阳性(特异性活性)还是阴性(非特异性活性)。特异性临界点为抑制信号通路所需的样品量,也就是具体药物的抗药抗体,需要通过试验确定。

抗药抗体的检测方法通常是非定量试验(有时是半定量试验),因为没有可用的标准化的物种特异性的抗药抗体作为校正标准品[15]。阳性对照一般都是内部开发的(例如单克隆抗体或高免血清的多克隆抗体),不可能将受试者检测到的所有抗药抗体作为阳性对照。如果准备使用质量单位标示抗药抗体水平,那应该证明标准品和试验样品的平行性,以确定样品的浓度的准确性[8,10]。若未证明样品与标准品间的平行性,则准确性是可疑的。滴定法是另一种评估抗体水平的方法,该方法不同样品稀释间容易缺乏平行性。然而,值得注意的是已有研究表明,滴定法适用于抗体水平的评估。几十年来,临床上感染、自身免疫疾病的诊断和治疗以及预防接种等都采用这一方法[16~22]。滴定法比较抗药抗体反应

更为简便且所需的验证工作更少,因为其不需要再对不同产品的抗药抗体与标准品间的平行性进行详细描述与证明。此外质量单位法每当标准品品改变时均需要进行重新验证。综上所述,两种方法都无法提供准确的定量数据。因此,赞助商建议采用相对浓度(质量单位)或滴度表示抗药抗体水平。某些监管机构会更倾向于使用滴度单位。滴度是仍能产生阳性结果的最大稀释倍数的倒数。

在方法的开发和优化阶段,应先确定方法并进行记录,例如选择所需的试剂、最佳浓度、预期样品所需的最大稀释倍数等。这些需要研究人员在预先研究阶段进行简单或重复确证。本文假定以下属性在验证之前已被确证:免疫分析方案及方法设计,分析基质的类型,最大稀释倍数(MRD)、试剂的最佳浓度、酶标板的均匀性评估(如位置的影响、漂移等)。监管机构可能会要求提供相关的数据支持。在方法的开发和优化阶段,通过对对照品的检测,对方法的变异性有一个初步的认识。

2.2 统计学的应用

降低验证过程中的主观作用是本文的重点之一。为了确保实验的客观性必须依靠于统计手段。由于大多数研究者无法获得统计学家的服务,本文提供了简单且足够严格和有效的统计学方法。所涉及的统计计算都可以采用商业统计软件进行计算,计算过程不需要经验丰富的统计学家。然而,如果有统计学家协助进行验证实验设计和数据处理的话,统计学的应用可能会比本文提供的更为严格和有效。

3.预研究验证

临床和非临床研究中在开始样品生物分析前的验证试验称为预研究验证,它主要从数学和可定量方面描述分析方法的性能特征[8]。预验证(prevalidation)是指研究工作启动前的筹备工作,两者不能混淆。另一方面,在研究验证是指监控整个方法使用过程的性能特征,以确保方法的有效性和数据的可靠性。通过完整的方法开发和优化后,分析方法应具备验证的条件,如优化试验数据表明检测方法具有潜在的可靠性和适用于相应的检测要求。方法的可靠性依赖于分析设备和计算机系统的正常运转以及试验人员的熟练程度。本质上,

分析方法是包含多个因素的整体系统而不仅仅是试剂而已。验证方法应包括系统适用性,这属于在研究验证范畴。

建议开始预研究验证之前制定相应的验证实验方案或验证实验标准操作程序(SOP),验证实验方案应说明该方法的预期目的、分析方法的详细说明、待验证的性能特征以及精密度、稳健性、稳定性和耐用性的预期验收标准。此外建议在验证实验方案中加入适当的实验细节和数据处理步骤,这样可以为验证人员提供一个明确的指导以确保更好的处理数据。

抗药抗体检测应建立相应的验收标准,有助于确保在研阶段的试验的有效性。为此,应通过对验证过程中获得的数据进行统计评价后建立用于质控的系统适用性标准(可接受范围)。此外,在研验证阶段中间精密度试验,对照品和样品检测也应有相应的验收标准。当在研验证阶段的分析数据不符合验收标准时,应拒绝该数据。在预研验证阶段不应建立验收标准,因为这可能会使某些验证数据被排除,导致不能准确估计分析误差。除了可明原因(如技术误差)、有意或无意偏离实验方案所得分析数据应被剔除外,预研阶段的所有分析数据都应计算在内。目前,美国食品药品监督管理局(FDA)、国际协调会议(ICH)和美国药典的指导性文件阐述了定量检测的分析验证应研究的一般性能特点[23~25]。由于抗药抗体免疫分析属于半定量检测,所以有些要求并不不适用。对于抗药抗体免疫分析方法学验证,应对以下9项参数进行测定:

1. 筛选临界点

2.确证临界点

3.灵敏度*

4.系统适用性控制(QCs)验收标准

5.耐药性*

6.精密度

7.鲁棒性

8.稳定性*

9.耐用性(有条件时)

如果分析方法的开发和优化过程已充分说明并得到适当记录,在预研验证阶段不需要对以上标有*的参数进行重复验证,尽管验证报告中应提供相关的数据。如果最终的方法有所变动的话,预研验证阶段应重新测定。

抗药抗体检测方法开发阶段的预期用途和产品上市后的用途可能会不同。例如,在开发早期只有一个分析人员进行试验,开发工作完成后和上市后可能会有多个分析人员进行试验。整个产品生命周期的验证要求应随着检测方法应用的改变而改变。然后,在药物申请期间还是应对以上列出的参数进行验证。

传统分析方法的稀释线性测试不适用于抗药抗体检测。当使用滴度标示抗药抗体反应时,需要使用阳性对照,或者最好使用累积抗药抗体阳性样品,在合理稀释范围内不出现异常非线性。通常,在方法开发阶段都会包括最大稀释浓度(MRD)的选择,验证阶段不需要进行重复测定。如果出现前带效应,建议选择一个不受前带效应影响的MRD,或者采用多种稀释样品。稀释线性信息有助于设计系统适应性质量控制。

3.1筛选临界点

筛选临界点定义为筛选试验的响应水平,响应值高于该临界点的样品为活性样品(或者称为潜在阳性),响应值低于该临界点的样品为阴性样品。一个有效的筛选临界点需要在预研究验证阶段对一些列样品测定值进行系统性的统计分析确定,所使用的样品要求来自代表药物使用目标群体或受试者。

当免疫分析的方法存在错误风险时,筛选试验宁可出现假阳性也要避免假阴性[8,10]。如果筛选试验中不能识别出活性样品,应怀疑该方法检测低阳性样品的能力。约5%的筛选试验的阳性结果为假阳性,从而保证可以检测出低阳性样品[8]。在实践中,假阳性结果总比没有阳性结果好(如假阳性率可能不等于5%)。

3.1.1 筛选临界点的类型

可以应用于在研验证阶段的筛选临界点共有三种:固定临界点、浮动临界点、动态临界点。

(a)固定临界点:

预研验证阶段确定固定临界点,然后应用于在研验证阶段。固定临界点用于测试样品的分析,直到需要重新验证或改变(如测定方法发生关键变化、转移到另一个实验室进行试验或仪器升级等)。固定临界值在一个目标人群的同一研究中或多目标人群的各研究间是固定的。当预研究阶段的整个试验的均值相等、方差齐性时,采用固定临界点。

(b)浮动临界点

浮动临界点有两种计算方法,分析过程中数据需要进行对数(Log)转换时,通过预研阶段确定的特定归一化因子乘以在研阶段的生物背景计算而得;分析过程无对数转换时,计算方法归一化因子加上生物背景,生物背景可以由阴性对照(由样品的基质组成,抗药抗体反应为阴性)、分析稀释剂或预处理受试者样品(个体特异性临界点)标示。浮动临界点可以是每一次试验每一块板(每一次试验中的若干块板)所特有的或每一个受试者所特有的(使用受试者的预处理/基线样本结果)。如果采用个体特异性临界点,需要在同一块板上检测预处理样品和处理后样品(或至少在同一试验中检测)。由于浮动临界点的确定过程需要对预研究验证的数据进行方差估计,所以不同试验间的结果应表现出方差齐性。采用阴性对照进行归一化时,应确保阴性对照结果能代表目标人群的药物初治基质样品的结果,例如通过验证阴性对照均值和生物基质样品均值在整个试验中是相关联的。如果均值相关,阴性对照均值适用于计算浮动临界点。如果均值不相关,则使用稀释液或预处理样品结果进行归一化处理更为合理。

(c)动态临界点、

同一试验的不同板之间、同一研究的不同试验间或不同研究间的动态临界点均不同。动态临界点的确定不需要预研究阶段的方差估计。这一特征将动态临界点和浮动临界点区别开来。只有当不同试验间的结果方差有显著性差异时,才使用动态临界点。实际使用时,动态临界点的限制性因素是每次试验都需要大量的样本数才能确定临界点。建议优先采用固定临界点或浮动临界点。如果试验间的均值或方差存在差异,建议在采用动态临界点之前先进行差异来源调查。例如,若果差异来源于分析员或设备,则采用分析员或设备的固定临界点或浮动临界点

代替动态临界点。因为动态临界点是一种不常见的非常规方法,建议谨慎制定该临界点,最好能与监管机构进行充分沟通。

3.1.2 评估临界点的样品

建议从适当的人群中抽样用于分析临界点的评估。有时候需要在开始预研究验证试验之前从目标疾病人群中获得样品基质是不实际的,甚至是不可能的。因此,一般从药物初治健康受试者的样本中进行评估,并确立一个起始临界点。该方法适用于于临床I期的研究。当临床研究开展到临床II期以后,便可得到目标疾病患者的样本,应该对不同的目标人群重新评估临界点。如果目标人群和正常志愿者的响应值的平均值和方差相当,可以使用同一个临界点。如果没有可比性,则需要采用目标疾病特异性的临界点。

为了确定临界点,在验证阶段应分析足够数量的样本,这样才能对生物和分析变异进行有效的统计学评估。通常在临床研究中,需要分析超过50个独立受试者的样本。非临床研究至少需要15个样品。不应使用混合基质样品进行临界点评估,因为从混合样品中测试重复的样品,检测的只是分析变异而不是生物变异。建议采用平衡实验设计有效评估潜在的变异性来源(see Appendix A)。如果将有多个分析员在研究过程进行分析样品操作,那么在预研究验证阶段应至少包括两位分析员。如果研究过程中只有一个分析员进行样品分析,而这个分析员与验证阶段的分析员不同,预研究验证阶段也应至少包括两位分析员。是否需要对同一样品进行重复试验取决于在研验证的报告形式(例如在微量滴定板中进行两个复孔或三个复孔)。

3.1.3 排除异常值

应确认药物初治患者的偶然活性样本,以确保药物的特异性。在这一点上,确证临界点将不能真正的确认阳性,此时应该使用科学的判断方法,应排除无法确定是否为偶然活性样本。在分析临界点的统计学评估时应去除抗药抗体阳性样品和统计学异常样品(样品响应值过高或过低)。因为下部极端异常值通常会使差异性波动从而影响临界点,所以应当排除。去除较高或较低异常值会得到一个较低的临界点,通常会增加假阳性率而变得更为谨慎(假阳性样本会在随后的特

异性确证试验中被证明为阴性)。如果在临界点评估中使用了强大的统计方法(例如基于中位数的方法,图基的Tukey’s biweight函数),则不需要排除异常点。

3.1.4 确定筛选临界点

为了确定筛选临界点的类型,需要进行一系列的数据评估,如图1所示。首先,如果使用参数估计的方法,需要对药物初治的样本结果的分布类型进行检验(正态分布检验),如果数据不符合正态分布,则可以对数据进行适当的转换(如对数转换),然后排除异常值(Appendix B.1)。如果不需要用到参数估计(第95百分位),则不需要进行数据转换,但仍需要排除异常值。其次,采用单因素方差分析(ANOVA-based statistical methods)的统计学方法处理比较每一次试验运行的平均值和方差,从而决定采用固定临界点、浮动临界点还是动态临界点(Appendix B.2)。在浮动临界点的评价过程中,如果归一化过程使用了阴性对照,则应该将阴性对照的均值与目标人群的基质样本进行比较,以确定是否适合使用阴性对照。最后,基于以上评估,使用适当的统计学方法计算出临界点(Appendix B.3)。

3.2 确证临界点

特异性是分析方法在其它基质成分存在的条件下明确检测目标分析物的能力[23]。筛选试验筛选出活性样品(通常称为潜在阳性),因为筛选临界点允许5%的假阳性率,所以这些活性样品可能是非特异性的。因此从活性样品中鉴定出阳性样品需要药物的特异性活性。检测人源样本的抗药抗体特异性是一种常见的做法,动物样本也一样。特异性确证试验通常是一个竞争性抑制试验,通过检测含或不含预孵育研究药物的样品的信号变化来进行评估。此外还可通过比较相同大小和电荷的免疫无关的蛋白质进行评估。还有一些研究者通过比较加药和不加药的信号区别进行评估,然而本文建议与监管机构积极讨论这一方法的可接受性。以上的任何一种方法,确证阳性信号的变化值称为确证临界点。确证临界点将抗体与药物的特异性结合和非特异性结合区别开来,其有效性非常关键,必须客观评估。不鼓励使用50%信号抑制等主观标准。信号略高于临界点的低信号的抗药抗体弱阳性样品的评价尤为重要。抗药抗体强阳性药品需要用过量的药物进行竞

争性抑制,所以一般不会出现这一问题。当评价抗药抗体弱阳性样品时,即使是加标药物样品的信号很细微的减弱都可能会使相对应的未加标药物样品的信号降低50%以上,从而导致假阳性。此外,只有将抗药抗体阳性样品的信号下降到背景信号,这信号强度只有未抑制样品信号的50%以下,这样可能会出现假阴性。因此,特异性确证临界点应该通过客观的方法进行评估,在弱阳性样本附近评估分析方法的变异性。有多种试验方法可以用于特异性确证临界点的评估。

建议在筛选临界点的验证过程评估特异性确证临界点。筛选临界点评估试验所用到的药物初治样本可以加入药物后再以相同的方式检验。计算未加标药物样本(抑制)的均值和标准偏差(SD),特异性确证临界点为抑制平均值加上3.09倍的SD值(如果预期假阳性率为1%)。与筛选临界点的评估一样,特异性确证临界点的评估过程也需要排除异常值。特异性确证临界点的详细计算步骤参见附录C(Appendix C)。

在某些实验室,会在低于筛选临界点的样品(建议样本量大于等于25)中加标阳性对照使其信号值等于或稍微大于筛选临界点。用过量药物孵育后,计算平均抑制百分率,并通过“×SD”值进行校正,确定特异性确证临界点(“×”取决于适当的假阳性率)。必须确保阳性对照样品的信号不会高于筛选临界点太多,以免使假阳性率增高。这一方法确定的特异性确证临界点高度依赖于所使用的阳性对照品。值得注意的是,研究样本中的低抗药抗体亲和力样本(特别是多价IgM,亲和力成熟的IgG)可能会不被抑制。因此,使用单一阳性对照品确定的特异性确证临界点可能无法有效地将一个研究样品分为特异性样品还是非特异性样品。

Neyer等提出了一种基于T检验(t-test)的表示抗药抗体特异性的方法,该方法的原理是比较未加标药物样品与加标药物样品的信号值。然而,该分析法的竞争性抑制结果的观测样本量相当有限,没有考虑到生物变异的影响。

然而,以上列举的方法均比人为的50%抑制率更为客观、可靠。一些研究人员进行抗体免疫耗竭(如Protein A),这一方法并不涉及特异性药物,它只能证明信号来源于免疫球蛋白。这种方法可以用作支撑测试,不建议作为药物特异性的决定性试验。

3.3 灵敏度

完全定量方法一般采用适当的参考标准曲线来估计分析方法灵敏度,而抗药抗体分析的灵敏度高度依赖于所用的阳性对照试剂。例如,在同一个分析试验中,使用高亲和力阳性对照品得到的灵敏度优于低亲和力阳性对照品。因此当有一种以上的阳性对照品时,通常会发现不同的阳性对照品会得到不一样的灵敏度。此外,没有一种阳性对照品能表示出不同化合物处理后的免疫应答图谱。尽管如此,分析灵敏度提供了分析方法的一般相关性,需要进行测定并报告。灵敏度有助于在分析方法开发阶段选择最优的抗药抗体检测方法(方法开发起始阶段比较不同方法),也有助于确定低阳性对照品的验证。

抗药抗体分析的灵敏度指阳性对照抗体能稳定产生阳性信号的最低浓度。例如,预期试验的结果的95%高于筛选临界点的对照抗体的浓度,具体的比例取决于一致性水平。确定分析灵敏度的试验方法参见附录D(Appendix)。

3.4 系统适用性控制

系统适用性控制确保了分析方法的有效性[24]。分析方法通常都包含一系列的质量控制(强、弱阳性对照和阴性对照),这些质量控制确保了性能的一致性,从而确保了结果的有效性。换言之,系统适应性控制有助于确保了分析方法在整个研究阶段都是有效的。因此,系统适用性控制帮助确认试验运行是否通过验证的验收标准。关于系统适用性控制开发和相关的验收标准的详细信息参见附录E(Appendix E)。

3.5 选择性/干扰性(耐药性)

考虑到样品中的其它组分可能会影响抗药抗体的检测。选择性就是指分析方法在其它组分存在的情况下检测目的物质的能力[27],通过从含有潜在干扰组分(多个)的样品中检测分析物(模拟阳性对照品)的回收率来进行表征。当阳性对照和样品基质来源于不同物种时,anti-framework抗体和抗异种抗体常常会阻碍阳性对照品的回收。注意当使用阳性对照时,抗药抗体分析的选择性不太可能会影响测定临床或非临床样品的选择性。尽管如此,还是很有必要去了解抗药抗体检测的试验条件,基质中可能含有研究药物、内源性抗体、合并用药和类风

湿因子等。

3.5.1 基质成分的干扰

抗药抗体分析的回收率评估包括在试验条件下检测基质成分是否会抑制抗药抗体与药物的结合。如果可能的话,选择性研究应包括阳性对照与疾病状态下的血清的对照试验,因为某些人群或疾病状态下可能会产生干扰性物质。如果有显著比例的测试样本出现溶血或高血脂,则需要进行回收率评价。为了确定目标基质样品的回收率,应将高、低浓度的特异性抗药抗体对照品(单克隆或多克隆)加入分析缓冲液(不含基质成分)、健康个体的生物基质(血清或血浆)、治疗人群样本。比较缓冲液的响应值与生物基质的响应值,可接受标准通常为两者的差异超过20%,具体差异取决于所用的阳性对照。在试验中选择表达高、低非特异性背景的捐助者是很有帮助的。不仅能够检测回收率,还能检查基质的干扰性,确证最小稀释浓度(MRD)。

3.5.2 药物干扰研究(耐药性)

抗药抗体检测的主要干扰物质通常来自药物本身。由于目标药物和试验过程用到的捕获试剂的特异性抗体的产生存在竞争性作用,含药样品可能存在干扰物质,导致出现假阴性。通常的做法是确定抑制阳性对照抗体检测的药物浓度,并将此耐药限度应用于研究样本抗药抗体状态的决策方面。这一做法存在一定的缺陷,因为耐药性高度依赖于所使用的阳性对照,在同一个试验中,使用高亲和力阳性对照可以获得较低的耐药性,而低亲和力对照获得的耐药性更高。因为抗药抗体存在个体差异性,所以研究样本的抗体获得的真正的耐药性可能会与阳性对照的耐药性不同。事实上,当有一个以上阳性对照时,通常会发现每一个阳性对照会对应一个不同的耐药性值。因此,真正的耐药性是无法确定的。与灵敏度类似,耐药性仅限于了解试验中药物是否会产生干扰,在方法的开发和优化阶段可以用于比较不同方法。尽管如此,确定耐药性是监管期望。

为了测定药物的耐药性,先用系列稀释的药物对低浓度ADA QC进行预孵育,然后再进行检测。抑制低浓度QC信号检测的最低药物浓度就是试验的药物耐受限,该耐受限会随着阳性对照的不同而改变。研究阶段的生物分析报告中,

当在抗药抗体阴性的样本中检测药物时,建议附上该抗药抗体阴性样本可能伴随的药物干扰声明。

3.6 精密度

精密度是指分析方法一系列随机测量值的变异程度,精密度的可接受标准应该在免疫分析的常用预期范围内;同时也应该适合所用的平台(例如,电化学发光法的标准要严于Elisa法)。建议采用平衡实验设计进行精密度性能验证,如附录A(Appendix A)所示。筛选试验、特异性确证试验和滴定方法的精密度确定方法如下。如果可行,建议在研究阶段将精密度试验适当放大至预期实际使用规模。

3.6.1 筛选试验精密度

对试验对照品(阴性对照、高、低浓度阳性对照)进行至少6次独立检测,分析相应数据确定筛选试验精密度。以上数据可以通过附录D(Appendix D)所述的灵敏度确定试验获得。从以上试验中计算出高浓度阳性样品和低浓度阳性样品(刚好高于临界点)的不精确性,不精确性可以用变异系数(CV%)表示,变异系数表征了先关变异的来源。批内分析精密度(也称批内精密度或内部运行精密度)和中间精密度(也称运行间精密度、批间精密度、中间精密度或整体精密度)都应该用变异系数CV%表示,例如最近出版物的表示方式[27]。如果分析研究样本是使用了分析员特异性临界点,则应该测定分析员中间精密度(inter-analyst CV)。

3.6.2 特异性确证试验精密度

特异性确证试验精密度的目的是检测信号抑制的重复性。为了计算百分抑制率(%),特异性确证临界点的确定试验中,在至少6次独立运行中,往高、低浓度对照组中加入适量的药物。以上试验已经有足够的数据计算批间精密度,计算方式如3.6.1.

3.7 稳健性

鲁棒性能够指示分析方法的可靠性。鲁棒性是指当方法的参数发生故意的微小变化时,分析方法不受影响的能力[23]。鲁棒性关注的是在标准试验室发生真

实生活的变化时分析方法的一致性。验证过程中鲁棒性参数测定需要基于具体的分析方及其相关风险[28]。应该评估特定实验室哪些试验条件可能发生变化,并设计适当的测试,以检查被认为关键的参数。包括微孔板批次、孵育时间、温度、每一次运行的微孔板数、试剂批次和浓度或者设备。研究样本或阳性对照样本都可用于检测鲁棒性。建议在鲁棒性验证过程中使用系统适用性控制的验收标准 (在方法开发和优化阶段计算或验证系统适用性验收标准)

3.8 稳定性

稳定性研究评估分析方法在预期样品的储存条件下的分析性能。理想状态下,稳定性测试条件应模仿预期样品和试剂的装卸条件、储存温度和不同的储存时间。 考虑到分析物的稳定性,抗药抗体的本质属性值得深思。不管抗药抗体分析物是抗X药物抗体还是抗Y药物抗体,他们都是多克隆抗体。因此,有理由认为抗药抗体的稳定性都是一样的。按照这一逻辑,抗药抗体的稳定性接近血清或血浆中任意抗原的免疫球蛋白的稳定性。建议对每一物种的的基质样本分开进行稳定性表征,无论是临床的还是非临床的,然后在研究实验室内将试验结果推广至所有的药物检测项目,有必要检测来自目标适应症(如类风湿性关节炎)的基质。因此,并未规定分析不同药物时样品稳定性都要分开进行验证。需要注意一个事实,当不同受试者注射不同的药物时,产生的IgM,IgG1, IgG2,IgG3或IgG4的比例各不相同,不可以知道并模拟不同人群的免疫球蛋白的比例。因此使用该法评价分析物质的稳定性是合理的。

加了阳性对照的药物初治基质可以用作模拟阳性样本进行稳定性测定,但是这样的样本是否能合理的模拟预期测试样品需要科学的判断。最好是能有多个不同浓度的阳性样品,至少也要包含一个强阳性对照和一个弱阳性对照。更详细的信息参见附录F(Appendix F)。

稳定性表征还应包括关键试剂的稳定性,如质量控制样品、涂层试验板或芯片(如果有使用)以及其它关键试剂(如偶联物)。然而,这是一个商业决策而不是规定的验证项目,因为抗药抗体分析是一个稳定性指标试验方法(如,关键试剂的稳定性缺失就会导致分析性能不佳或分析失败,可以由系统适用性控制

进行监控)。

3.9 重现性

重现性是指在一个以上实验室进行试验时,分析方法的可靠性。因此它需要证明分析方法在不同实验室间是有效的。在FDA和ICH的方法学验证指导原则中并没有重现性这一术语[13,23,24]。美国药典将其描述为实验室间精密度和分析员间精密度。分析员间精密度在ICH的文件中描述为中间精密度[23,24]。ICH将实验室间精密度描述为再现性(reproducibility)。重现性经常被错误的解释为“常规的变化”(routine changes),如设备间的不精确性,实际上属于稳健性的范畴。

因为有些公司可能含有多个生物分析实验室,或者由于外包的不断增长,建议在这种情况下验证重现性。重现性成为评价分析方法的“转让性能”的好方法,如在两个或两个以上的实验室测试样本的邮箱,并比较不同实验室的数据。例如,分析灵敏度使用了单一的阳性对照,应对临界值和控制范围进行评估;可以在主办方的试验室中产生盲样然后由接收实验室进行检测。当只有一个实验室进行抗药抗体分析时,直到该方法要转移到另一个实验室时才需要进行重现性验证。

4.在研究验证(监控)和重新验证

在研究验证(系统适用性监控或保持)和重新验证是生物分析方法的关键组成部分。因此,分析方法的验证工作直到该方法停止使用时才结束。

对于定量生物分析方法的在研究验证,通常需要精密度和准确性的验收标准

[13]。因为抗药抗体分析方法中并未涉及准确性,所以按照3.4部分描述的办法监测质量控制样品的性能。再度确保该监测系统是适用预定用途的,如分析方法仍是有效的,其性能仍像预先研究验证阶段一样。弱阳性对照的使用确保了分析方法的灵敏度。关于样品和微孔板的验收标准参见附录E2(Appendix E2)。 建议根据测定法减少“漂移”的需要,对分析方法进行重新验证。例如,当分析方法的关键部分、设备或者样品(疾病适应症)发生改变时,需要进行重新验证。重新验证应包括部分或全部验证特性(如部分或全部重新验证)。分析关键试剂的批号与预先研究验证阶段的批号不同时不需要进行重新验证,但必须通

过适当的实验资质进行支持,以保持系统适应性。

5、结语

关于免疫原性评估系列论文共有三篇,第一篇介绍了生物制药产品抗体免疫分析方法的开发和优化[8],第二篇介绍了抗药抗体的评估策略[10],本文介绍了抗药抗体免疫分析验证的重要性能特点,并提供了测定各性能的建议。旨在促进整个生物制药行业形成治疗性蛋白质免疫原性评估的标准化方法。这三篇论文里的建议都应被视为最佳实践范例。只要保持科学原理和客观性,也可以接受替代方法。

期望在此推荐的方法可以产生高质量的抗药抗体数据,从而更好的了解免疫原性在临床上的影响。同时也希望论文的发表会促进全世界的监管机构颁布具体的指导文件。

附录

附录A(Appendix A)平衡实验设计的使用

设计验证实验的重要目的就是尽量消除或较少干扰因素,也就是实验中对于任何变量的评估都完全取决该因素自身而不受其他因素的干扰,如分析员、批次/运行等每个变量的影响。建议在筛选试验、特异性确证试验和精密度试验中采用平衡实验设计以减少干扰因素的影响。

例如,当评估精密度时,应该考虑分析员、试验运行、微孔板间的差异,

假定,由两位分析员进行三次试验运行,每次运行包含三板。为了分别消除不同分析员、不同试验运行和不同微孔板间的差异,实验设计如表一所示。

1. 将样品均分为三个小组,

2.每个分析员的每次运行的每一块板的样品都来自三个小组。

非平衡实验设计会对验证试验的结论产生负面影响。假如每个小组的样品均在同一块板上进行,板间差异就会干扰样品的组间差异,也就是说,不同板之间的结果差异不能是由于板的检测顺利造成的,而应该是取决于不同组样品之间的差异。相似的,如果每个小组的样品没有分散在不同的运行进行检测,那么不同运行间的差异将会干扰样品的组间差异。最后,如果分析员没有检测不同组的样品,那么分析员间的差异将会干扰样品的差异。因此在验证实验设计过程中,应确保对照样品和验证基质样品在所有关键因素间平衡分配。

表一

Analyst Assay run Assay plate P1

R1 P2

P3

P1

A1 R2 P2

P3

P1

R3 P2

P3

P1

R1 P2

P3

P1

A2 R2 P2

P3

P1

R3 P2

P3 Validation serum samples S1-S20 X X X X X X S21-S40 X X X X X X S41-S60 X X X X X X

表一,平衡实验设计,表格描述了具体的实验设计,将关键变量因素进行平衡,

关键变量因素包括分析员、试验运行、平板检测顺序、样本测试组。在这样的情境下,两个分析员分别进行三个试验运行,检测60个药物初治基质样品。这样的平衡设计确保了每一因素的差异都不受其它因素的干扰,从而获得一个对关键变量的可靠评估。这里所说的板测试顺利指的是运行内的平板检测顺序(假设为P1、P2、P3)。

附录B

B1. 临界点评估:结果的分布调查和排除异常值

在筛选临界点的建立前期,应先研究结果的分布类型。分布类型评估包括:正态性检验、选择合适的数据转换类型(例如对数转换)、统计学异常值的识别。

为了满足统计分析(如,ANOVA)的分布假设通常需要进行数据转换。在筛选临界点的评估过程中,分析或生物异常引起的高、低异常值应进行排除或适当降权(如中位数和绝对中位差或杜克biweight函数)。异常值会增加试验的变异性,从而增加假阳性率。检测异常值的常用如下:

1. 报告结果的箱图(box-plots)

2. 方差分析的学生化残差图。

学生化残差图法可能需要统计学家的帮助,而箱图法更为简单,且也是可以接受的。

在统计学软件JMP(SAS软件研究所,凯里,北卡罗来纳州,美国)中,箱图法可以使用离群箱图。箱图法能识别出所有高离群点和低离群点,高离群点为该点高于第75百分位(Q3)加上1.5倍四分位范围,低离群点为该点低于第25百分位减去1.5倍四分位范围。这些极端结果会分别绘制在图表中。

图二展示了原始数据和进行对数(log)转换后的分布结果,使用Shapiro–Wilk test进行正态性检验。因为原始数据的分布高度向右倾斜,所以考虑进行对数(log)转换,然后以对数形式评估异常值。

尽管进行了对数转换,Shapiro–Wilk test正态性检验显示该分布为非正太分布,这是因为多个对数异常值的存在。将这些异常值排除后进行正态性检验,结果服从正态分布,如图三所示。此时,试验运行的均值和方差可以采用3.1.4部分的方法进行比较。

B.2. 临界点评估:通过比较试验运行的均值和方差,以确定选用固定临界点、浮动临界点或动态临界点。

 当运行间的均值和方差都没有统计学差异时,选用固定临界点,然而也可以

优先选用浮动临界点或动态临界点。

 当运行间的均值在统计学上存在显著性差异而方差齐性时,

选用浮动临界点。

然而也可以优先选用动态临界点。

 当药物初治基质样品结果存在显著性差异时使用分析员特异性临界点或设

备特异性临界点。

试验运行间均值的比较可以在单因素方差分析(ANOVA)框架下进行,将试验运行当做统计模型的固定效果。首先计算均值相等时的P值,然后通过Levene test计算方差齐性时的P值,如果方差齐性且均值没有显著性差异,则选用浮动临界点。还可以选择更为严格的多因素方差分析,将试验运行和样品都当做随机因素,当需要评价其它设计因素(人群或分析员)的均值差异和方差齐性时可以采用此法。

图4显示了试验运行间的比较。当P值等于0.3068时表示在显著性水平为0.05时,均值无显著性差异。Levene test检验的P值等于0.6565表示试验运行间的方差在显著性水平为0.05时无显著性差异。因此可以采用固定临界点,然后也可以优先选用浮动临界点。

B.3. 临界点评估:计算筛选临界点

利用预研究验证数据评估筛选临界点的统计学方法如下:

1.参数法:均值+1.645SD。使用ANOVA评估均值和标准偏差(SD)。参数法需要进行正态性检验和排除异常值。如果数据不服从正态分布,则应该进行适当的数据转换。标准偏差的计算应包括分析差异的标准偏差和生物差异的标准偏差。一个近似的计算方法是计算每一次运行的方差,然后计算加权平均数,权重就是每一运行的自由度。如果运行间的样本数是一样,那么权重相同,联合方差就是方差的算数平均数。联合方差的平方根就是联合标准偏差,用联合标准偏差进行临界点评估。下面介绍另一个结合分析和生物差异的更严格的方法,在随机因素方差分析的框架下采用约束最大似然法进行方差分量分析,通常需要统计学家的帮助才能完成。

2.健壮参数化方法:中位数+1.645×(1.483×MAD),MAD指的是中位数绝对偏差。这一计算公式类似于参数法,中位数替代均值,1.483×MAD替代标准偏差。可以考虑采用如Tukey’s biweight method等其它方法。当某些数据点可能是异常

值而统计学测试又没有识别出来时,健壮参数化方法最为有用。此法要求数据服从正态分布但不需要排除异常值。如果数据不服从正态分布,应该进行适当的数据转换。

3.非参数化方法:经验性的第95百分位。对于非正态分布比较稳健,但对于异常值较为敏感。因此,此法不需要进行数据转换,只需要按照附录B.1的方法排除异常值。例如,含有60个样本中的第95百分点就是对结果排序之后的排在第57位的样本。

根据我们的经验,分析异常值和生物异常值都与极高值相关。这些极高值往往比相关的平均值高出6个标准差,即使是进行了数据转换也如此。这些异常值不具备代表性。如果不能删除这些异常值或进行降权,将会导致不可接受的高临界点。因此,相比于其它方法,排除异常值更为适合用自身风险的方法。

如果选择了固定临界点,采用运行特应性均值和标准偏差计算联合均值和联合标准偏差。如果使用了多因素方差分析,那么这些参数就直接可以从模型中获得,然后采用联合均值和联合标准偏差计算总体筛选临界点。在研究阶段不需要对筛选临界点进行进一步的评估。

如果选择了浮动临界点,并且采用阴性对照做为归一化的生物背景,那么应该根据预先研究验证确定归一化因子。注意这种情况仅限于验证阶段,然后归一化因子用于研究验证阶段的浮动临界点评估。归一化因子等于浮动临界点减去预研究阶段的阴性样本值的平均值。研究验证阶段的浮动临界点的计算方法是阴性对照平均值加上归一化因子。如果进行了数据转换,应以转换后的数据进行计算,但是浮动临界点报告时应转换为原始数据。

大多数情况下,临界点的计算都需要进行对数转换。浮动临界点的计算方法通常为阴性对照乘以归一化因子。

如果发现阴性对照不适合用于计算浮动临界点,给药前患者样本可以用于确定患者特异性浮动临界点。然后浮动临界点等于给药前患者的均值加上1.645倍的SD值,这里的SD值是预研究阶段确定的SD值。然而,值得注意的是,给药前样本和给药后样本应该在同一块板或者至少在同一个运行中进行测试。

如果有必要采用动态临界点,则使用步骤1的参数法,此时的均值和标准偏差均来源于每次运行的研究样本。跟3.1.1提到的一样,这通常会收到实际样本量的限制,而且试验设计因素的进一步研究也较为困难,动态临界点费时费力,不适合大规模应用,所以通常不使用动态临界点。动态临界点的应用应谨慎研究,最好征求监管机构的同意。

附录G(Appendix G)提供了筛选临界点计算的具体例子,附录B.1中所述的每一步骤,方差估计和临界点计算都采用了对数转换。类似的,采用了附录B.2描述的方法,浮动临界点的计算过程采用了阴性对照计算归一化因子,并应用于研究验证阶段临界点的计算。参考3.1.1部分的建议,通过研究每次运行中阴性对照均值与生物基质样品均值的相关性,建立阴性对照的相关性。

附录C 通过竞争性抑制试验评估特异性确证临界点。

建议采用以下步骤评估固定特异性确证临界点:

1.确定能够抑制高抗药抗体水平样本的药物浓度:采用可行的阳性对照,确定能够抑制最强信号的药物浓度(仪器度数动态范围的上端)。例如在ELISA法中,读板机的读数动态范围为0-4.0,在基质或缓冲液中准备模拟强阳性样品使其信号接近3.0OD,然后连续增加药物浓度,以确定一个能够将强阳性样品信号抑制到低于筛选临界点水平的药物浓度。在研究验证阶段应使用更高的药物浓度(如采用确定浓度的10倍,以减少由于研究阶段亲和力改变引起的假阴性率)。为了确保这一药物浓度不对模拟弱阳性样品浓度造成影响,应该进行另外的实验进行确证,将其加到各种模拟低浓度阳性样品中。然后验证这一药物用于抑制样本。这一意味着信号高于3.0的研究样本需要稀释至信号低于3.0 OD,在加入药物进行特异性验证之前。

2.计算“潜在阳性”非特异性样本的平均抑制率和标准偏差(SD):将样本进行

预孵育,如果在筛选临界点没有进行此实验,建议在筛选临界点实验中采用相似的实验设计进行。用以下公式计算每一样品的平均抑制率:

信号抑制率(%)=100[1-(研究药物抑制样品/未抑制样品)]

计算平均百分抑制率,然后计算相对标准偏差。在研究百分抑制率时通常需要进行对数转换。负抑制值在进行对数转换可能会构成挑战,这个问题的解决办法是计算标价药物比上未标价药物的比例的对数转换。

3.计算固定特异性确证临界点:应用步骤2算得的平均值和SD值,未进行对数转换时,特异性临界点=平均值+3.09×SD。若果进行了对数转换,则先计算添加药物样本与未添加药物样本的比值,进行对数转换后计算平均值和标准偏差,则特异性确证临界点计算公式为:100×[1-log-1(平均值-3.09×SD)]。注意:3.09是根据正正态分布的99.9%而来的。由于这是一个确证试验,只有研究药物的特异性阳性样品才能计算在内,将假阳性率控制在0.1%左右。此外,如果选用1%的假阳性率,则上面公式中的3.09应该改为2.33。

附录D. 分析灵敏度测定

实验性地,我们建议配制五个或更多稀释度的阳性样品,使稀释范围跨过筛选临界点。阳性对照应根据实验设计用未稀释的合并基质进行配制。建议采用合并基质代替个体基质是因为个体基质间的生物差异会对结果造成干扰,采用合并基质后可以确保仅检测出分析差异。在某些情况下不适合这种配置方法,例如蛋白A/G纯化的具有药物特异性阳性的人源单抗,此种情况下人特异性抗体IgG的存在会显著人源基质的回收率。此时,可以选用稀释液代替基质进行灵敏度测定。

应在每一次运行中检测阴性对照(合并药物初治基质)和稀释液(如果可接受的话),以便计算精密度(3.6.1部分)和应用浮动临界点。应选用适当的回归模型来对每个稀释度曲线进行拟合,将筛选临界点带入回归方差计算相应的浓度。注意如果选用了浮动临界点,应使用运行特异性临界点进行内插法计算。

灵敏度可以定义为内插值法得到的阳性对照浓度的平均值。在这种情况下,这个灵敏度水平上的样品被检测为阳性的概率仅为50%(一致性为50%)。

如果报告灵敏度的一致性为95%时,计算阳性对照浓度的平均值和标准偏差,计算公式为:平均值+t0.05,df×SD。这里的平均值和SD值都应该是对数形式。t0.05,df表示t分布中,0.05表示假阳性率为5%,df为自由度,主要取决于样本量和

运行次数。最后需要将平均值+t0.05,df×SD进行反对数运算。值得注意的是,我们

建议用t分布的t0.05,df代替常用的正态分布的1.645是因为灵敏度确定的样本

量很有限。以上算得的灵敏度再乘以最小稀释倍数(MRD)才是报告时的灵敏度。灵敏度应以能检测到的最低抗体浓度表示,单位为质量/单位体积。如果采用了一个以上的阳性对照进行灵敏度计算,那么在报告中灵敏度可以是一个灵敏度范围。

附录E.系统适应性质控(QCs)和验收标准的开发

E.1.1 步骤一:系统适应性质控的定义

选择一个信号强度能达到线性曲线上端的高浓度阳性对照,该阳性对照在抗药抗体检测中极少使用,然后在容易产生钩状效应的方法、跟踪检测性能、试剂限定和排除故障中广泛使用。应从稀释曲线的线性范围上选取该高阳性对照的浓度,通常略低于曲线的上端,另外如果有研究样品的抗药抗体范围的先验信息,也可以采用曲线的最高点。

与高浓度阳性对照不同,低阳性对照确保了分析方法的可靠性,所以其阳性对照是强制性的。

低信号阳性对照的响应值应高于临界点,并具有可重复性,但有时候其信号可能会低于临界点(失败/无效的检测),另一方面,如果低信号阳性对照的样品浓度过高,其产生的信号可能远高于临界点,这是不合理的。为了选择一个客观的低信号阳性对照浓度,可以观察检测不合格率,也就是低阳性对照的信号低于

临界点[8]。例如,低信号阳性对照的合理目标的不合格率为1%,计算公式为:平均值+ t0.01,df×SD,平均值和SD值来自于灵敏度试验或相关的开发阶段的数据,t0.01,df表示t分布的置信区间为99%,df为自由度。理论上意味着99%的低阳性对照样品的数据等于或高于临界点。通常采用基质阴性对照监测非特异性生物背景。在有些分析试验中可能会采用稀释液对照作为额外的阴性对照,因为基质蛋白可能会产生阻塞效应而使信号变低,相比于只有稀释液测定的背景信号。 E.2.步骤2:建立系统适应性质控的验收标准

研究阶段的系统适应性质控必须采用验收标准,该验收标准来源于预研究验证阶段的数据结果。制定验收标准的数据要求为:两个或两个以上分析员至少开展3次运行,每次运行三板,试验样品为阳性对照、基质阴性对照、和稀释液阴性对照,复孔的数量与预期研究样品的一致。也可以使用符合要求的其它性能验证的数据。

阴性对照的验收标准应该有一个上限,下限是可选的。阳性对照通常具有上限和下限,当仪器的信号处于线性范围时,上限没有下限关键。检测信号高于正常时会导致非特异性阳性样品的增加,这些特异性样品会在特应性确证试验中被检出,因此不会对检测的假阴性率造成影响。

当基质阴性对照和稀释液阴性对照的错误率为1%时,阴性对照的上限为:平均相应值+ t0.01,df×SD,平均值和SD来自于上述试验,t0.01,df为步骤1的值。对于阴性对照:如果界定上限和下限,那么验收范围为平均值±t0.005,SD,t0.005,df×

可以根据不同的错误率选择不同的阈值。df表示极低值和极高值的错误率为1%。

有一些科学家还会在滴定试验中设定滴定对照以确认阳性对照的稀释线性,但在研究阶段通常不需要进行这一试验。此外,阴性对照和低阳性对照的验收标准有部分重叠是可以接受的,只要这些验收限度是客观制定的就可以了。

如果在研究阶段的筛选临界点选择了浮动临界点,系统适应性标准可以定义为低阳性对照于阴性对照的比值,也可以是高阳性对照与阴性对照的比值,如果使用了高阳性对照,使用上述类似的公式进行计算(可能需要进行对数转换)。这里用来评估筛选临界点的阴性对照应与在研究阶段的阴性对照一致。如果阴性

对照、低阳性对照和高阳性对照样品的趋势相同,质控比值符合系统适应性限度,使用浮动临界点将会有助于确保试验的有效性。也可以考虑在这些限值的基础上添加阴性对照的上限。

当原始测定信号变异性较大时(光密度或相对发光单位),一些实验室选用阳性对照的终点滴度标准,而不是基于原始信号的验收标准。此时,阳性对照会产生预期的最小滴度终点,这种情况下的验收标准应适当验证。

在研究阶段的样品分析过程中,阳性对照和测试样品(分析信号等于或高于筛选临界点)的重复精密度(CV)应采用合适的验收标准进行控制,以确保获得有意义数据的一致性。低于临界点的结果不需要符合变异系数限定标准。建议精密度的验收标准应该适合所使用的平台(例如电化学发光法的验收标准要严于ELISA),可以参考方法开发的数据和该技术平台和分析方法的经验数值。

附录F. 在基质中测试分析物的稳定性

通过比较新鲜配制的对照品或供试品与在预期储存条件储存的对照品或供试品来确定对照品或供试品的稳定性。基于预期的样品处理和储存条件,稳定性检测条件通常包括:反复动容、-20℃储存、冷藏储存和在特定储存温度下的稀释样品的稳定性。由于参考文献显示,抗体在低于20℃的温度下,稳定性为两年或更长[29,30],所以不需要评估-60℃以下的稳定性。

总之,应该比较新鲜对照品和储存对照品的结果,建议储存对照品的验收标准为储存对照品的滴度落在系列稀释的新鲜对照品的滴度范围内。例如,当滴定试验采用2倍稀释时,新鲜阳性对照的滴度为40时,储存阳性对照的滴度在20-80之间可认为两者相等。另一替代方法是,采用原始测试信号或浓度值进行比较,回收率的可接受范围为80-120%。还可以采用统计学方法比较两个间的差异。此外,当一个样品的稳定性超出验收标准范围时,应进行重复试验,以确保结果不是因为试验异常造成的,而是因为样品不稳定性造成的。

抗药抗体反应具有不均一性,应该注意阳性对照的稳定性不一定会影响实际研究样品的稳定性。可能的话,研究样品的稳定性应该通过检测储存前、后的样

品,并比较终点滴定度,原始测试信号或计算浓度。

附录G. 筛选临界点的计算说明

表2a和表2b提供了帅选临界点的计算过程,检测药品为药物初治基质样品,由两个分析员分为三个运行进行检测(总共6个运行)。表二中列举用于临界点评估的50个样本数据。其中有两个样本数据为生物异常值,这两个样本的所有结果都被排除。此外,运行6中有两个有另外两个样本的数值被作为分析异常值去除。因此6个运行的样本数分别为48、48、48、48、48、46。在计算联合临界点的时候需要考虑不同运行间样本量的大小。

对数(Log)转换确保了数据的近似正态性(附录B.1)。试验运行的均值没有显著性差异,方差大致相当(附录B.2)。按照图1,判断在研究阶段选用固定临界点;然而也可以使用浮动临界点。附录B.3列出了具体的计算步骤,附录

B.3部分的步骤2中提供了计算公式,表2a进行了说明。在研究阶段浮动临界点的评估中,归一化因子的计算在表2b进行了说明。因为该临界点的评估进行了对数转换,所以归一化因子为对数尺度的累加,未转换数据的累乘。在研究阶段的性能测试中,用表2b的乘积因子乘以阴性对照的平均值,从而推导出该运行的浮动临界点。如果知道每位分析员的乘法归一化因子间的差异,则应该选用分析员特异性乘法归一化因子,由此计算出分析员特异性浮动临界点。

抗药抗体免疫原性分析方法验证指导原则

皇家药院译

摘要:

几乎所有的生物制药产品都会引起一定的抗药抗体(anti-drug antibody,ADA)反应,抗药抗体反应可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应。在人体内,抗药抗体通常不会引起明显的临床反应。但是对于某些治疗性蛋白质,抗药抗体反应能引起各种临床的不良反应,包括温和事件及严重不良事件。临床前研究表明,抗药抗体能对药物暴露、药物毒性作用、药物代谢动力学、药物效应动力学等造成影响。因此治疗性蛋白质的免疫原性引起了临床医生、药企及监管机构的注意。为了评估生物药物分子的免疫原性,以及将实验结果与临床事件联系起来,在临床前研究和临床研究中,很有必要开发可靠的能够有效评估抗药抗体反应的实验方法。这里方法学验证显得尤为重要,并且方法学验证是药物上市申请必不可少的。现行的监管文件对于免疫分析方法的验证的指导相当有限,特别是缺乏有关免疫原性分析方法的验证的指导。因此,本文对抗药抗体免疫分析方法的验证提供科学的建议。在现有的关于生物分析的规范性文件的基础上加入独特的性能验证。笔者建议采用实验和统计学的方法进行免疫分析的方法学验证。这些建议被视为最佳的例子,旨在促进整个医药行业形成一个更加统一的抗体检测方法。

1.简介:

生物制药产品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸,一般通过人细胞系、哺乳动物细胞或细菌进行表达,比常规的小分子药物更大(一般大于1~3KD)。由于以上特性,生物制药产品引起免疫反应的潜力更大。生物制药的免疫原性与产品的内在因素(种属特异性表位、外源性、糖基化程度、聚合或变性程度、杂质和制剂)、外在因素(给药途径、慢性或急性给药、药代动力学及内源性当量)、患者因素(自身免疫性疾病、免疫抑制、和替代疗法)相关。

抗药抗体反应可能会导致严重的临床症状,包括过敏、自身免疫和不同的药代动力学特征(例如,药物中和、生物分布异常和药物清除率增强等均可能会使药物的的疗效发生改变)。药物引起的免疫反应是药物安全性和有效性的重要指标,这也是监管机构、生产企业、临床医生和患者共同关注的。因此,美国食品药品监督管理局以及欧盟、日本、加拿大、澳大利亚等国家的监管机构均要求通过药理学或毒理学相关的方法对抗药抗体进行评估。免疫原性与临床症状之间的相关性的研究依赖于临床前研究和临床研究中对于抗药抗体的客观检测和表征。因此免疫原性生物分析方法在用于检测研究样本之前应进行适当的开发及验证。已有出版物提供了关于抗药抗体检测和表征的策略、方法开发及优化等方面的指南。方法学验证是对分析方法的评价,通过特定的实验室方法表明采用的分析方法适用于相应的检测要求。具体到抗药抗体的检测方法,验证就是指证明该方法能可靠的(例如一致性和重复性)在复杂的生物基质(血清或血浆)中检测出低量的药物特异性抗体。方法学验证应该通过预先研究阶段和研究阶段两个阶段进行,预先研究阶段是指在分析样品之前的工作,研究阶段是指样品的分析工作,预先研究阶段和研究阶段对于表明分析方法的有效性和可控性同等重要。本文主要介绍抗药抗体免疫分析方法验证的主要性能特征,推荐方法学验证相关的方法和措施。本指南应当被视为最佳实践范例,考虑到具体实际分析方法时,在保持科学合理性和客观性的情况下,也可以采取替代方法。若采用替代方法,建议与监管机构进行充分讨论。以细胞功能为基础的中和抗药抗体生物检测和细胞介导的免疫分析不在本指南的讨论范围内。

2.方法

2.1 抗药抗体检测

临床和非临床研究通常是通过对治疗引起的抗药抗体反应的检测和表征来评估药物的免疫原性。目前可通过多种方法可用于抗药抗体的检测,包括酶联免疫法(ELISA)、放射免疫检定法(RIA)、放射免疫沉淀法(RIPA)、表面等离子体共振(SPR)、电化学发光法(ECL)。每一种检测方法均有其优点和局限性,在最近的文章中已进行过讨论[8,14]。不管是采用何种方法,在方法开发和优化后均应进行正式的方法学验证,以保证该方法适合相应的检测要求。因此可以预测,本指南的验证建议适用于大部分的抗药抗体免疫检测。研究人员应根据检测系统的特点确定合适的方法学验证方案。

临床研究中抗药抗体的检测和表征通常包括四种不同类型的方法。抗药抗体检测试验通常包括筛选试验和特异性确证试验,表征试验通常包括抗体滴定和中和抗体检测[10]。应用到具体研究样本时,抗药抗体分析试验需要两个关键决策参数,分别为筛选试验的筛选临界点(screening cut point)和特异性确证试验的特异性临界点(specificity cut point)。筛选临界点有助于抗药抗体检测结果的分类,高于筛选临界点为活性样品(活性样品通常为潜在阳性样品),低于临界点为无活性样品。活性样品通过特异性确证试验(如竞争性药物抑制信号通路)检测是阳性(特异性活性)还是阴性(非特异性活性)。特异性临界点为抑制信号通路所需的样品量,也就是具体药物的抗药抗体,需要通过试验确定。

抗药抗体的检测方法通常是非定量试验(有时是半定量试验),因为没有可用的标准化的物种特异性的抗药抗体作为校正标准品[15]。阳性对照一般都是内部开发的(例如单克隆抗体或高免血清的多克隆抗体),不可能将受试者检测到的所有抗药抗体作为阳性对照。如果准备使用质量单位标示抗药抗体水平,那应该证明标准品和试验样品的平行性,以确定样品的浓度的准确性[8,10]。若未证明样品与标准品间的平行性,则准确性是可疑的。滴定法是另一种评估抗体水平的方法,该方法不同样品稀释间容易缺乏平行性。然而,值得注意的是已有研究表明,滴定法适用于抗体水平的评估。几十年来,临床上感染、自身免疫疾病的诊断和治疗以及预防接种等都采用这一方法[16~22]。滴定法比较抗药抗体反应

更为简便且所需的验证工作更少,因为其不需要再对不同产品的抗药抗体与标准品间的平行性进行详细描述与证明。此外质量单位法每当标准品品改变时均需要进行重新验证。综上所述,两种方法都无法提供准确的定量数据。因此,赞助商建议采用相对浓度(质量单位)或滴度表示抗药抗体水平。某些监管机构会更倾向于使用滴度单位。滴度是仍能产生阳性结果的最大稀释倍数的倒数。

在方法的开发和优化阶段,应先确定方法并进行记录,例如选择所需的试剂、最佳浓度、预期样品所需的最大稀释倍数等。这些需要研究人员在预先研究阶段进行简单或重复确证。本文假定以下属性在验证之前已被确证:免疫分析方案及方法设计,分析基质的类型,最大稀释倍数(MRD)、试剂的最佳浓度、酶标板的均匀性评估(如位置的影响、漂移等)。监管机构可能会要求提供相关的数据支持。在方法的开发和优化阶段,通过对对照品的检测,对方法的变异性有一个初步的认识。

2.2 统计学的应用

降低验证过程中的主观作用是本文的重点之一。为了确保实验的客观性必须依靠于统计手段。由于大多数研究者无法获得统计学家的服务,本文提供了简单且足够严格和有效的统计学方法。所涉及的统计计算都可以采用商业统计软件进行计算,计算过程不需要经验丰富的统计学家。然而,如果有统计学家协助进行验证实验设计和数据处理的话,统计学的应用可能会比本文提供的更为严格和有效。

3.预研究验证

临床和非临床研究中在开始样品生物分析前的验证试验称为预研究验证,它主要从数学和可定量方面描述分析方法的性能特征[8]。预验证(prevalidation)是指研究工作启动前的筹备工作,两者不能混淆。另一方面,在研究验证是指监控整个方法使用过程的性能特征,以确保方法的有效性和数据的可靠性。通过完整的方法开发和优化后,分析方法应具备验证的条件,如优化试验数据表明检测方法具有潜在的可靠性和适用于相应的检测要求。方法的可靠性依赖于分析设备和计算机系统的正常运转以及试验人员的熟练程度。本质上,

分析方法是包含多个因素的整体系统而不仅仅是试剂而已。验证方法应包括系统适用性,这属于在研究验证范畴。

建议开始预研究验证之前制定相应的验证实验方案或验证实验标准操作程序(SOP),验证实验方案应说明该方法的预期目的、分析方法的详细说明、待验证的性能特征以及精密度、稳健性、稳定性和耐用性的预期验收标准。此外建议在验证实验方案中加入适当的实验细节和数据处理步骤,这样可以为验证人员提供一个明确的指导以确保更好的处理数据。

抗药抗体检测应建立相应的验收标准,有助于确保在研阶段的试验的有效性。为此,应通过对验证过程中获得的数据进行统计评价后建立用于质控的系统适用性标准(可接受范围)。此外,在研验证阶段中间精密度试验,对照品和样品检测也应有相应的验收标准。当在研验证阶段的分析数据不符合验收标准时,应拒绝该数据。在预研验证阶段不应建立验收标准,因为这可能会使某些验证数据被排除,导致不能准确估计分析误差。除了可明原因(如技术误差)、有意或无意偏离实验方案所得分析数据应被剔除外,预研阶段的所有分析数据都应计算在内。目前,美国食品药品监督管理局(FDA)、国际协调会议(ICH)和美国药典的指导性文件阐述了定量检测的分析验证应研究的一般性能特点[23~25]。由于抗药抗体免疫分析属于半定量检测,所以有些要求并不不适用。对于抗药抗体免疫分析方法学验证,应对以下9项参数进行测定:

1. 筛选临界点

2.确证临界点

3.灵敏度*

4.系统适用性控制(QCs)验收标准

5.耐药性*

6.精密度

7.鲁棒性

8.稳定性*

9.耐用性(有条件时)

如果分析方法的开发和优化过程已充分说明并得到适当记录,在预研验证阶段不需要对以上标有*的参数进行重复验证,尽管验证报告中应提供相关的数据。如果最终的方法有所变动的话,预研验证阶段应重新测定。

抗药抗体检测方法开发阶段的预期用途和产品上市后的用途可能会不同。例如,在开发早期只有一个分析人员进行试验,开发工作完成后和上市后可能会有多个分析人员进行试验。整个产品生命周期的验证要求应随着检测方法应用的改变而改变。然后,在药物申请期间还是应对以上列出的参数进行验证。

传统分析方法的稀释线性测试不适用于抗药抗体检测。当使用滴度标示抗药抗体反应时,需要使用阳性对照,或者最好使用累积抗药抗体阳性样品,在合理稀释范围内不出现异常非线性。通常,在方法开发阶段都会包括最大稀释浓度(MRD)的选择,验证阶段不需要进行重复测定。如果出现前带效应,建议选择一个不受前带效应影响的MRD,或者采用多种稀释样品。稀释线性信息有助于设计系统适应性质量控制。

3.1筛选临界点

筛选临界点定义为筛选试验的响应水平,响应值高于该临界点的样品为活性样品(或者称为潜在阳性),响应值低于该临界点的样品为阴性样品。一个有效的筛选临界点需要在预研究验证阶段对一些列样品测定值进行系统性的统计分析确定,所使用的样品要求来自代表药物使用目标群体或受试者。

当免疫分析的方法存在错误风险时,筛选试验宁可出现假阳性也要避免假阴性[8,10]。如果筛选试验中不能识别出活性样品,应怀疑该方法检测低阳性样品的能力。约5%的筛选试验的阳性结果为假阳性,从而保证可以检测出低阳性样品[8]。在实践中,假阳性结果总比没有阳性结果好(如假阳性率可能不等于5%)。

3.1.1 筛选临界点的类型

可以应用于在研验证阶段的筛选临界点共有三种:固定临界点、浮动临界点、动态临界点。

(a)固定临界点:

预研验证阶段确定固定临界点,然后应用于在研验证阶段。固定临界点用于测试样品的分析,直到需要重新验证或改变(如测定方法发生关键变化、转移到另一个实验室进行试验或仪器升级等)。固定临界值在一个目标人群的同一研究中或多目标人群的各研究间是固定的。当预研究阶段的整个试验的均值相等、方差齐性时,采用固定临界点。

(b)浮动临界点

浮动临界点有两种计算方法,分析过程中数据需要进行对数(Log)转换时,通过预研阶段确定的特定归一化因子乘以在研阶段的生物背景计算而得;分析过程无对数转换时,计算方法归一化因子加上生物背景,生物背景可以由阴性对照(由样品的基质组成,抗药抗体反应为阴性)、分析稀释剂或预处理受试者样品(个体特异性临界点)标示。浮动临界点可以是每一次试验每一块板(每一次试验中的若干块板)所特有的或每一个受试者所特有的(使用受试者的预处理/基线样本结果)。如果采用个体特异性临界点,需要在同一块板上检测预处理样品和处理后样品(或至少在同一试验中检测)。由于浮动临界点的确定过程需要对预研究验证的数据进行方差估计,所以不同试验间的结果应表现出方差齐性。采用阴性对照进行归一化时,应确保阴性对照结果能代表目标人群的药物初治基质样品的结果,例如通过验证阴性对照均值和生物基质样品均值在整个试验中是相关联的。如果均值相关,阴性对照均值适用于计算浮动临界点。如果均值不相关,则使用稀释液或预处理样品结果进行归一化处理更为合理。

(c)动态临界点、

同一试验的不同板之间、同一研究的不同试验间或不同研究间的动态临界点均不同。动态临界点的确定不需要预研究阶段的方差估计。这一特征将动态临界点和浮动临界点区别开来。只有当不同试验间的结果方差有显著性差异时,才使用动态临界点。实际使用时,动态临界点的限制性因素是每次试验都需要大量的样本数才能确定临界点。建议优先采用固定临界点或浮动临界点。如果试验间的均值或方差存在差异,建议在采用动态临界点之前先进行差异来源调查。例如,若果差异来源于分析员或设备,则采用分析员或设备的固定临界点或浮动临界点

代替动态临界点。因为动态临界点是一种不常见的非常规方法,建议谨慎制定该临界点,最好能与监管机构进行充分沟通。

3.1.2 评估临界点的样品

建议从适当的人群中抽样用于分析临界点的评估。有时候需要在开始预研究验证试验之前从目标疾病人群中获得样品基质是不实际的,甚至是不可能的。因此,一般从药物初治健康受试者的样本中进行评估,并确立一个起始临界点。该方法适用于于临床I期的研究。当临床研究开展到临床II期以后,便可得到目标疾病患者的样本,应该对不同的目标人群重新评估临界点。如果目标人群和正常志愿者的响应值的平均值和方差相当,可以使用同一个临界点。如果没有可比性,则需要采用目标疾病特异性的临界点。

为了确定临界点,在验证阶段应分析足够数量的样本,这样才能对生物和分析变异进行有效的统计学评估。通常在临床研究中,需要分析超过50个独立受试者的样本。非临床研究至少需要15个样品。不应使用混合基质样品进行临界点评估,因为从混合样品中测试重复的样品,检测的只是分析变异而不是生物变异。建议采用平衡实验设计有效评估潜在的变异性来源(see Appendix A)。如果将有多个分析员在研究过程进行分析样品操作,那么在预研究验证阶段应至少包括两位分析员。如果研究过程中只有一个分析员进行样品分析,而这个分析员与验证阶段的分析员不同,预研究验证阶段也应至少包括两位分析员。是否需要对同一样品进行重复试验取决于在研验证的报告形式(例如在微量滴定板中进行两个复孔或三个复孔)。

3.1.3 排除异常值

应确认药物初治患者的偶然活性样本,以确保药物的特异性。在这一点上,确证临界点将不能真正的确认阳性,此时应该使用科学的判断方法,应排除无法确定是否为偶然活性样本。在分析临界点的统计学评估时应去除抗药抗体阳性样品和统计学异常样品(样品响应值过高或过低)。因为下部极端异常值通常会使差异性波动从而影响临界点,所以应当排除。去除较高或较低异常值会得到一个较低的临界点,通常会增加假阳性率而变得更为谨慎(假阳性样本会在随后的特

异性确证试验中被证明为阴性)。如果在临界点评估中使用了强大的统计方法(例如基于中位数的方法,图基的Tukey’s biweight函数),则不需要排除异常点。

3.1.4 确定筛选临界点

为了确定筛选临界点的类型,需要进行一系列的数据评估,如图1所示。首先,如果使用参数估计的方法,需要对药物初治的样本结果的分布类型进行检验(正态分布检验),如果数据不符合正态分布,则可以对数据进行适当的转换(如对数转换),然后排除异常值(Appendix B.1)。如果不需要用到参数估计(第95百分位),则不需要进行数据转换,但仍需要排除异常值。其次,采用单因素方差分析(ANOVA-based statistical methods)的统计学方法处理比较每一次试验运行的平均值和方差,从而决定采用固定临界点、浮动临界点还是动态临界点(Appendix B.2)。在浮动临界点的评价过程中,如果归一化过程使用了阴性对照,则应该将阴性对照的均值与目标人群的基质样本进行比较,以确定是否适合使用阴性对照。最后,基于以上评估,使用适当的统计学方法计算出临界点(Appendix B.3)。

3.2 确证临界点

特异性是分析方法在其它基质成分存在的条件下明确检测目标分析物的能力[23]。筛选试验筛选出活性样品(通常称为潜在阳性),因为筛选临界点允许5%的假阳性率,所以这些活性样品可能是非特异性的。因此从活性样品中鉴定出阳性样品需要药物的特异性活性。检测人源样本的抗药抗体特异性是一种常见的做法,动物样本也一样。特异性确证试验通常是一个竞争性抑制试验,通过检测含或不含预孵育研究药物的样品的信号变化来进行评估。此外还可通过比较相同大小和电荷的免疫无关的蛋白质进行评估。还有一些研究者通过比较加药和不加药的信号区别进行评估,然而本文建议与监管机构积极讨论这一方法的可接受性。以上的任何一种方法,确证阳性信号的变化值称为确证临界点。确证临界点将抗体与药物的特异性结合和非特异性结合区别开来,其有效性非常关键,必须客观评估。不鼓励使用50%信号抑制等主观标准。信号略高于临界点的低信号的抗药抗体弱阳性样品的评价尤为重要。抗药抗体强阳性药品需要用过量的药物进行竞

争性抑制,所以一般不会出现这一问题。当评价抗药抗体弱阳性样品时,即使是加标药物样品的信号很细微的减弱都可能会使相对应的未加标药物样品的信号降低50%以上,从而导致假阳性。此外,只有将抗药抗体阳性样品的信号下降到背景信号,这信号强度只有未抑制样品信号的50%以下,这样可能会出现假阴性。因此,特异性确证临界点应该通过客观的方法进行评估,在弱阳性样本附近评估分析方法的变异性。有多种试验方法可以用于特异性确证临界点的评估。

建议在筛选临界点的验证过程评估特异性确证临界点。筛选临界点评估试验所用到的药物初治样本可以加入药物后再以相同的方式检验。计算未加标药物样本(抑制)的均值和标准偏差(SD),特异性确证临界点为抑制平均值加上3.09倍的SD值(如果预期假阳性率为1%)。与筛选临界点的评估一样,特异性确证临界点的评估过程也需要排除异常值。特异性确证临界点的详细计算步骤参见附录C(Appendix C)。

在某些实验室,会在低于筛选临界点的样品(建议样本量大于等于25)中加标阳性对照使其信号值等于或稍微大于筛选临界点。用过量药物孵育后,计算平均抑制百分率,并通过“×SD”值进行校正,确定特异性确证临界点(“×”取决于适当的假阳性率)。必须确保阳性对照样品的信号不会高于筛选临界点太多,以免使假阳性率增高。这一方法确定的特异性确证临界点高度依赖于所使用的阳性对照品。值得注意的是,研究样本中的低抗药抗体亲和力样本(特别是多价IgM,亲和力成熟的IgG)可能会不被抑制。因此,使用单一阳性对照品确定的特异性确证临界点可能无法有效地将一个研究样品分为特异性样品还是非特异性样品。

Neyer等提出了一种基于T检验(t-test)的表示抗药抗体特异性的方法,该方法的原理是比较未加标药物样品与加标药物样品的信号值。然而,该分析法的竞争性抑制结果的观测样本量相当有限,没有考虑到生物变异的影响。

然而,以上列举的方法均比人为的50%抑制率更为客观、可靠。一些研究人员进行抗体免疫耗竭(如Protein A),这一方法并不涉及特异性药物,它只能证明信号来源于免疫球蛋白。这种方法可以用作支撑测试,不建议作为药物特异性的决定性试验。

3.3 灵敏度

完全定量方法一般采用适当的参考标准曲线来估计分析方法灵敏度,而抗药抗体分析的灵敏度高度依赖于所用的阳性对照试剂。例如,在同一个分析试验中,使用高亲和力阳性对照品得到的灵敏度优于低亲和力阳性对照品。因此当有一种以上的阳性对照品时,通常会发现不同的阳性对照品会得到不一样的灵敏度。此外,没有一种阳性对照品能表示出不同化合物处理后的免疫应答图谱。尽管如此,分析灵敏度提供了分析方法的一般相关性,需要进行测定并报告。灵敏度有助于在分析方法开发阶段选择最优的抗药抗体检测方法(方法开发起始阶段比较不同方法),也有助于确定低阳性对照品的验证。

抗药抗体分析的灵敏度指阳性对照抗体能稳定产生阳性信号的最低浓度。例如,预期试验的结果的95%高于筛选临界点的对照抗体的浓度,具体的比例取决于一致性水平。确定分析灵敏度的试验方法参见附录D(Appendix)。

3.4 系统适用性控制

系统适用性控制确保了分析方法的有效性[24]。分析方法通常都包含一系列的质量控制(强、弱阳性对照和阴性对照),这些质量控制确保了性能的一致性,从而确保了结果的有效性。换言之,系统适应性控制有助于确保了分析方法在整个研究阶段都是有效的。因此,系统适用性控制帮助确认试验运行是否通过验证的验收标准。关于系统适用性控制开发和相关的验收标准的详细信息参见附录E(Appendix E)。

3.5 选择性/干扰性(耐药性)

考虑到样品中的其它组分可能会影响抗药抗体的检测。选择性就是指分析方法在其它组分存在的情况下检测目的物质的能力[27],通过从含有潜在干扰组分(多个)的样品中检测分析物(模拟阳性对照品)的回收率来进行表征。当阳性对照和样品基质来源于不同物种时,anti-framework抗体和抗异种抗体常常会阻碍阳性对照品的回收。注意当使用阳性对照时,抗药抗体分析的选择性不太可能会影响测定临床或非临床样品的选择性。尽管如此,还是很有必要去了解抗药抗体检测的试验条件,基质中可能含有研究药物、内源性抗体、合并用药和类风

湿因子等。

3.5.1 基质成分的干扰

抗药抗体分析的回收率评估包括在试验条件下检测基质成分是否会抑制抗药抗体与药物的结合。如果可能的话,选择性研究应包括阳性对照与疾病状态下的血清的对照试验,因为某些人群或疾病状态下可能会产生干扰性物质。如果有显著比例的测试样本出现溶血或高血脂,则需要进行回收率评价。为了确定目标基质样品的回收率,应将高、低浓度的特异性抗药抗体对照品(单克隆或多克隆)加入分析缓冲液(不含基质成分)、健康个体的生物基质(血清或血浆)、治疗人群样本。比较缓冲液的响应值与生物基质的响应值,可接受标准通常为两者的差异超过20%,具体差异取决于所用的阳性对照。在试验中选择表达高、低非特异性背景的捐助者是很有帮助的。不仅能够检测回收率,还能检查基质的干扰性,确证最小稀释浓度(MRD)。

3.5.2 药物干扰研究(耐药性)

抗药抗体检测的主要干扰物质通常来自药物本身。由于目标药物和试验过程用到的捕获试剂的特异性抗体的产生存在竞争性作用,含药样品可能存在干扰物质,导致出现假阴性。通常的做法是确定抑制阳性对照抗体检测的药物浓度,并将此耐药限度应用于研究样本抗药抗体状态的决策方面。这一做法存在一定的缺陷,因为耐药性高度依赖于所使用的阳性对照,在同一个试验中,使用高亲和力阳性对照可以获得较低的耐药性,而低亲和力对照获得的耐药性更高。因为抗药抗体存在个体差异性,所以研究样本的抗体获得的真正的耐药性可能会与阳性对照的耐药性不同。事实上,当有一个以上阳性对照时,通常会发现每一个阳性对照会对应一个不同的耐药性值。因此,真正的耐药性是无法确定的。与灵敏度类似,耐药性仅限于了解试验中药物是否会产生干扰,在方法的开发和优化阶段可以用于比较不同方法。尽管如此,确定耐药性是监管期望。

为了测定药物的耐药性,先用系列稀释的药物对低浓度ADA QC进行预孵育,然后再进行检测。抑制低浓度QC信号检测的最低药物浓度就是试验的药物耐受限,该耐受限会随着阳性对照的不同而改变。研究阶段的生物分析报告中,

当在抗药抗体阴性的样本中检测药物时,建议附上该抗药抗体阴性样本可能伴随的药物干扰声明。

3.6 精密度

精密度是指分析方法一系列随机测量值的变异程度,精密度的可接受标准应该在免疫分析的常用预期范围内;同时也应该适合所用的平台(例如,电化学发光法的标准要严于Elisa法)。建议采用平衡实验设计进行精密度性能验证,如附录A(Appendix A)所示。筛选试验、特异性确证试验和滴定方法的精密度确定方法如下。如果可行,建议在研究阶段将精密度试验适当放大至预期实际使用规模。

3.6.1 筛选试验精密度

对试验对照品(阴性对照、高、低浓度阳性对照)进行至少6次独立检测,分析相应数据确定筛选试验精密度。以上数据可以通过附录D(Appendix D)所述的灵敏度确定试验获得。从以上试验中计算出高浓度阳性样品和低浓度阳性样品(刚好高于临界点)的不精确性,不精确性可以用变异系数(CV%)表示,变异系数表征了先关变异的来源。批内分析精密度(也称批内精密度或内部运行精密度)和中间精密度(也称运行间精密度、批间精密度、中间精密度或整体精密度)都应该用变异系数CV%表示,例如最近出版物的表示方式[27]。如果分析研究样本是使用了分析员特异性临界点,则应该测定分析员中间精密度(inter-analyst CV)。

3.6.2 特异性确证试验精密度

特异性确证试验精密度的目的是检测信号抑制的重复性。为了计算百分抑制率(%),特异性确证临界点的确定试验中,在至少6次独立运行中,往高、低浓度对照组中加入适量的药物。以上试验已经有足够的数据计算批间精密度,计算方式如3.6.1.

3.7 稳健性

鲁棒性能够指示分析方法的可靠性。鲁棒性是指当方法的参数发生故意的微小变化时,分析方法不受影响的能力[23]。鲁棒性关注的是在标准试验室发生真

实生活的变化时分析方法的一致性。验证过程中鲁棒性参数测定需要基于具体的分析方及其相关风险[28]。应该评估特定实验室哪些试验条件可能发生变化,并设计适当的测试,以检查被认为关键的参数。包括微孔板批次、孵育时间、温度、每一次运行的微孔板数、试剂批次和浓度或者设备。研究样本或阳性对照样本都可用于检测鲁棒性。建议在鲁棒性验证过程中使用系统适用性控制的验收标准 (在方法开发和优化阶段计算或验证系统适用性验收标准)

3.8 稳定性

稳定性研究评估分析方法在预期样品的储存条件下的分析性能。理想状态下,稳定性测试条件应模仿预期样品和试剂的装卸条件、储存温度和不同的储存时间。 考虑到分析物的稳定性,抗药抗体的本质属性值得深思。不管抗药抗体分析物是抗X药物抗体还是抗Y药物抗体,他们都是多克隆抗体。因此,有理由认为抗药抗体的稳定性都是一样的。按照这一逻辑,抗药抗体的稳定性接近血清或血浆中任意抗原的免疫球蛋白的稳定性。建议对每一物种的的基质样本分开进行稳定性表征,无论是临床的还是非临床的,然后在研究实验室内将试验结果推广至所有的药物检测项目,有必要检测来自目标适应症(如类风湿性关节炎)的基质。因此,并未规定分析不同药物时样品稳定性都要分开进行验证。需要注意一个事实,当不同受试者注射不同的药物时,产生的IgM,IgG1, IgG2,IgG3或IgG4的比例各不相同,不可以知道并模拟不同人群的免疫球蛋白的比例。因此使用该法评价分析物质的稳定性是合理的。

加了阳性对照的药物初治基质可以用作模拟阳性样本进行稳定性测定,但是这样的样本是否能合理的模拟预期测试样品需要科学的判断。最好是能有多个不同浓度的阳性样品,至少也要包含一个强阳性对照和一个弱阳性对照。更详细的信息参见附录F(Appendix F)。

稳定性表征还应包括关键试剂的稳定性,如质量控制样品、涂层试验板或芯片(如果有使用)以及其它关键试剂(如偶联物)。然而,这是一个商业决策而不是规定的验证项目,因为抗药抗体分析是一个稳定性指标试验方法(如,关键试剂的稳定性缺失就会导致分析性能不佳或分析失败,可以由系统适用性控制

进行监控)。

3.9 重现性

重现性是指在一个以上实验室进行试验时,分析方法的可靠性。因此它需要证明分析方法在不同实验室间是有效的。在FDA和ICH的方法学验证指导原则中并没有重现性这一术语[13,23,24]。美国药典将其描述为实验室间精密度和分析员间精密度。分析员间精密度在ICH的文件中描述为中间精密度[23,24]。ICH将实验室间精密度描述为再现性(reproducibility)。重现性经常被错误的解释为“常规的变化”(routine changes),如设备间的不精确性,实际上属于稳健性的范畴。

因为有些公司可能含有多个生物分析实验室,或者由于外包的不断增长,建议在这种情况下验证重现性。重现性成为评价分析方法的“转让性能”的好方法,如在两个或两个以上的实验室测试样本的邮箱,并比较不同实验室的数据。例如,分析灵敏度使用了单一的阳性对照,应对临界值和控制范围进行评估;可以在主办方的试验室中产生盲样然后由接收实验室进行检测。当只有一个实验室进行抗药抗体分析时,直到该方法要转移到另一个实验室时才需要进行重现性验证。

4.在研究验证(监控)和重新验证

在研究验证(系统适用性监控或保持)和重新验证是生物分析方法的关键组成部分。因此,分析方法的验证工作直到该方法停止使用时才结束。

对于定量生物分析方法的在研究验证,通常需要精密度和准确性的验收标准

[13]。因为抗药抗体分析方法中并未涉及准确性,所以按照3.4部分描述的办法监测质量控制样品的性能。再度确保该监测系统是适用预定用途的,如分析方法仍是有效的,其性能仍像预先研究验证阶段一样。弱阳性对照的使用确保了分析方法的灵敏度。关于样品和微孔板的验收标准参见附录E2(Appendix E2)。 建议根据测定法减少“漂移”的需要,对分析方法进行重新验证。例如,当分析方法的关键部分、设备或者样品(疾病适应症)发生改变时,需要进行重新验证。重新验证应包括部分或全部验证特性(如部分或全部重新验证)。分析关键试剂的批号与预先研究验证阶段的批号不同时不需要进行重新验证,但必须通

过适当的实验资质进行支持,以保持系统适应性。

5、结语

关于免疫原性评估系列论文共有三篇,第一篇介绍了生物制药产品抗体免疫分析方法的开发和优化[8],第二篇介绍了抗药抗体的评估策略[10],本文介绍了抗药抗体免疫分析验证的重要性能特点,并提供了测定各性能的建议。旨在促进整个生物制药行业形成治疗性蛋白质免疫原性评估的标准化方法。这三篇论文里的建议都应被视为最佳实践范例。只要保持科学原理和客观性,也可以接受替代方法。

期望在此推荐的方法可以产生高质量的抗药抗体数据,从而更好的了解免疫原性在临床上的影响。同时也希望论文的发表会促进全世界的监管机构颁布具体的指导文件。

附录

附录A(Appendix A)平衡实验设计的使用

设计验证实验的重要目的就是尽量消除或较少干扰因素,也就是实验中对于任何变量的评估都完全取决该因素自身而不受其他因素的干扰,如分析员、批次/运行等每个变量的影响。建议在筛选试验、特异性确证试验和精密度试验中采用平衡实验设计以减少干扰因素的影响。

例如,当评估精密度时,应该考虑分析员、试验运行、微孔板间的差异,

假定,由两位分析员进行三次试验运行,每次运行包含三板。为了分别消除不同分析员、不同试验运行和不同微孔板间的差异,实验设计如表一所示。

1. 将样品均分为三个小组,

2.每个分析员的每次运行的每一块板的样品都来自三个小组。

非平衡实验设计会对验证试验的结论产生负面影响。假如每个小组的样品均在同一块板上进行,板间差异就会干扰样品的组间差异,也就是说,不同板之间的结果差异不能是由于板的检测顺利造成的,而应该是取决于不同组样品之间的差异。相似的,如果每个小组的样品没有分散在不同的运行进行检测,那么不同运行间的差异将会干扰样品的组间差异。最后,如果分析员没有检测不同组的样品,那么分析员间的差异将会干扰样品的差异。因此在验证实验设计过程中,应确保对照样品和验证基质样品在所有关键因素间平衡分配。

表一

Analyst Assay run Assay plate P1

R1 P2

P3

P1

A1 R2 P2

P3

P1

R3 P2

P3

P1

R1 P2

P3

P1

A2 R2 P2

P3

P1

R3 P2

P3 Validation serum samples S1-S20 X X X X X X S21-S40 X X X X X X S41-S60 X X X X X X

表一,平衡实验设计,表格描述了具体的实验设计,将关键变量因素进行平衡,

关键变量因素包括分析员、试验运行、平板检测顺序、样本测试组。在这样的情境下,两个分析员分别进行三个试验运行,检测60个药物初治基质样品。这样的平衡设计确保了每一因素的差异都不受其它因素的干扰,从而获得一个对关键变量的可靠评估。这里所说的板测试顺利指的是运行内的平板检测顺序(假设为P1、P2、P3)。

附录B

B1. 临界点评估:结果的分布调查和排除异常值

在筛选临界点的建立前期,应先研究结果的分布类型。分布类型评估包括:正态性检验、选择合适的数据转换类型(例如对数转换)、统计学异常值的识别。

为了满足统计分析(如,ANOVA)的分布假设通常需要进行数据转换。在筛选临界点的评估过程中,分析或生物异常引起的高、低异常值应进行排除或适当降权(如中位数和绝对中位差或杜克biweight函数)。异常值会增加试验的变异性,从而增加假阳性率。检测异常值的常用如下:

1. 报告结果的箱图(box-plots)

2. 方差分析的学生化残差图。

学生化残差图法可能需要统计学家的帮助,而箱图法更为简单,且也是可以接受的。

在统计学软件JMP(SAS软件研究所,凯里,北卡罗来纳州,美国)中,箱图法可以使用离群箱图。箱图法能识别出所有高离群点和低离群点,高离群点为该点高于第75百分位(Q3)加上1.5倍四分位范围,低离群点为该点低于第25百分位减去1.5倍四分位范围。这些极端结果会分别绘制在图表中。

图二展示了原始数据和进行对数(log)转换后的分布结果,使用Shapiro–Wilk test进行正态性检验。因为原始数据的分布高度向右倾斜,所以考虑进行对数(log)转换,然后以对数形式评估异常值。

尽管进行了对数转换,Shapiro–Wilk test正态性检验显示该分布为非正太分布,这是因为多个对数异常值的存在。将这些异常值排除后进行正态性检验,结果服从正态分布,如图三所示。此时,试验运行的均值和方差可以采用3.1.4部分的方法进行比较。

B.2. 临界点评估:通过比较试验运行的均值和方差,以确定选用固定临界点、浮动临界点或动态临界点。

 当运行间的均值和方差都没有统计学差异时,选用固定临界点,然而也可以

优先选用浮动临界点或动态临界点。

 当运行间的均值在统计学上存在显著性差异而方差齐性时,

选用浮动临界点。

然而也可以优先选用动态临界点。

 当药物初治基质样品结果存在显著性差异时使用分析员特异性临界点或设

备特异性临界点。

试验运行间均值的比较可以在单因素方差分析(ANOVA)框架下进行,将试验运行当做统计模型的固定效果。首先计算均值相等时的P值,然后通过Levene test计算方差齐性时的P值,如果方差齐性且均值没有显著性差异,则选用浮动临界点。还可以选择更为严格的多因素方差分析,将试验运行和样品都当做随机因素,当需要评价其它设计因素(人群或分析员)的均值差异和方差齐性时可以采用此法。

图4显示了试验运行间的比较。当P值等于0.3068时表示在显著性水平为0.05时,均值无显著性差异。Levene test检验的P值等于0.6565表示试验运行间的方差在显著性水平为0.05时无显著性差异。因此可以采用固定临界点,然后也可以优先选用浮动临界点。

B.3. 临界点评估:计算筛选临界点

利用预研究验证数据评估筛选临界点的统计学方法如下:

1.参数法:均值+1.645SD。使用ANOVA评估均值和标准偏差(SD)。参数法需要进行正态性检验和排除异常值。如果数据不服从正态分布,则应该进行适当的数据转换。标准偏差的计算应包括分析差异的标准偏差和生物差异的标准偏差。一个近似的计算方法是计算每一次运行的方差,然后计算加权平均数,权重就是每一运行的自由度。如果运行间的样本数是一样,那么权重相同,联合方差就是方差的算数平均数。联合方差的平方根就是联合标准偏差,用联合标准偏差进行临界点评估。下面介绍另一个结合分析和生物差异的更严格的方法,在随机因素方差分析的框架下采用约束最大似然法进行方差分量分析,通常需要统计学家的帮助才能完成。

2.健壮参数化方法:中位数+1.645×(1.483×MAD),MAD指的是中位数绝对偏差。这一计算公式类似于参数法,中位数替代均值,1.483×MAD替代标准偏差。可以考虑采用如Tukey’s biweight method等其它方法。当某些数据点可能是异常

值而统计学测试又没有识别出来时,健壮参数化方法最为有用。此法要求数据服从正态分布但不需要排除异常值。如果数据不服从正态分布,应该进行适当的数据转换。

3.非参数化方法:经验性的第95百分位。对于非正态分布比较稳健,但对于异常值较为敏感。因此,此法不需要进行数据转换,只需要按照附录B.1的方法排除异常值。例如,含有60个样本中的第95百分点就是对结果排序之后的排在第57位的样本。

根据我们的经验,分析异常值和生物异常值都与极高值相关。这些极高值往往比相关的平均值高出6个标准差,即使是进行了数据转换也如此。这些异常值不具备代表性。如果不能删除这些异常值或进行降权,将会导致不可接受的高临界点。因此,相比于其它方法,排除异常值更为适合用自身风险的方法。

如果选择了固定临界点,采用运行特应性均值和标准偏差计算联合均值和联合标准偏差。如果使用了多因素方差分析,那么这些参数就直接可以从模型中获得,然后采用联合均值和联合标准偏差计算总体筛选临界点。在研究阶段不需要对筛选临界点进行进一步的评估。

如果选择了浮动临界点,并且采用阴性对照做为归一化的生物背景,那么应该根据预先研究验证确定归一化因子。注意这种情况仅限于验证阶段,然后归一化因子用于研究验证阶段的浮动临界点评估。归一化因子等于浮动临界点减去预研究阶段的阴性样本值的平均值。研究验证阶段的浮动临界点的计算方法是阴性对照平均值加上归一化因子。如果进行了数据转换,应以转换后的数据进行计算,但是浮动临界点报告时应转换为原始数据。

大多数情况下,临界点的计算都需要进行对数转换。浮动临界点的计算方法通常为阴性对照乘以归一化因子。

如果发现阴性对照不适合用于计算浮动临界点,给药前患者样本可以用于确定患者特异性浮动临界点。然后浮动临界点等于给药前患者的均值加上1.645倍的SD值,这里的SD值是预研究阶段确定的SD值。然而,值得注意的是,给药前样本和给药后样本应该在同一块板或者至少在同一个运行中进行测试。

如果有必要采用动态临界点,则使用步骤1的参数法,此时的均值和标准偏差均来源于每次运行的研究样本。跟3.1.1提到的一样,这通常会收到实际样本量的限制,而且试验设计因素的进一步研究也较为困难,动态临界点费时费力,不适合大规模应用,所以通常不使用动态临界点。动态临界点的应用应谨慎研究,最好征求监管机构的同意。

附录G(Appendix G)提供了筛选临界点计算的具体例子,附录B.1中所述的每一步骤,方差估计和临界点计算都采用了对数转换。类似的,采用了附录B.2描述的方法,浮动临界点的计算过程采用了阴性对照计算归一化因子,并应用于研究验证阶段临界点的计算。参考3.1.1部分的建议,通过研究每次运行中阴性对照均值与生物基质样品均值的相关性,建立阴性对照的相关性。

附录C 通过竞争性抑制试验评估特异性确证临界点。

建议采用以下步骤评估固定特异性确证临界点:

1.确定能够抑制高抗药抗体水平样本的药物浓度:采用可行的阳性对照,确定能够抑制最强信号的药物浓度(仪器度数动态范围的上端)。例如在ELISA法中,读板机的读数动态范围为0-4.0,在基质或缓冲液中准备模拟强阳性样品使其信号接近3.0OD,然后连续增加药物浓度,以确定一个能够将强阳性样品信号抑制到低于筛选临界点水平的药物浓度。在研究验证阶段应使用更高的药物浓度(如采用确定浓度的10倍,以减少由于研究阶段亲和力改变引起的假阴性率)。为了确保这一药物浓度不对模拟弱阳性样品浓度造成影响,应该进行另外的实验进行确证,将其加到各种模拟低浓度阳性样品中。然后验证这一药物用于抑制样本。这一意味着信号高于3.0的研究样本需要稀释至信号低于3.0 OD,在加入药物进行特异性验证之前。

2.计算“潜在阳性”非特异性样本的平均抑制率和标准偏差(SD):将样本进行

预孵育,如果在筛选临界点没有进行此实验,建议在筛选临界点实验中采用相似的实验设计进行。用以下公式计算每一样品的平均抑制率:

信号抑制率(%)=100[1-(研究药物抑制样品/未抑制样品)]

计算平均百分抑制率,然后计算相对标准偏差。在研究百分抑制率时通常需要进行对数转换。负抑制值在进行对数转换可能会构成挑战,这个问题的解决办法是计算标价药物比上未标价药物的比例的对数转换。

3.计算固定特异性确证临界点:应用步骤2算得的平均值和SD值,未进行对数转换时,特异性临界点=平均值+3.09×SD。若果进行了对数转换,则先计算添加药物样本与未添加药物样本的比值,进行对数转换后计算平均值和标准偏差,则特异性确证临界点计算公式为:100×[1-log-1(平均值-3.09×SD)]。注意:3.09是根据正正态分布的99.9%而来的。由于这是一个确证试验,只有研究药物的特异性阳性样品才能计算在内,将假阳性率控制在0.1%左右。此外,如果选用1%的假阳性率,则上面公式中的3.09应该改为2.33。

附录D. 分析灵敏度测定

实验性地,我们建议配制五个或更多稀释度的阳性样品,使稀释范围跨过筛选临界点。阳性对照应根据实验设计用未稀释的合并基质进行配制。建议采用合并基质代替个体基质是因为个体基质间的生物差异会对结果造成干扰,采用合并基质后可以确保仅检测出分析差异。在某些情况下不适合这种配置方法,例如蛋白A/G纯化的具有药物特异性阳性的人源单抗,此种情况下人特异性抗体IgG的存在会显著人源基质的回收率。此时,可以选用稀释液代替基质进行灵敏度测定。

应在每一次运行中检测阴性对照(合并药物初治基质)和稀释液(如果可接受的话),以便计算精密度(3.6.1部分)和应用浮动临界点。应选用适当的回归模型来对每个稀释度曲线进行拟合,将筛选临界点带入回归方差计算相应的浓度。注意如果选用了浮动临界点,应使用运行特异性临界点进行内插法计算。

灵敏度可以定义为内插值法得到的阳性对照浓度的平均值。在这种情况下,这个灵敏度水平上的样品被检测为阳性的概率仅为50%(一致性为50%)。

如果报告灵敏度的一致性为95%时,计算阳性对照浓度的平均值和标准偏差,计算公式为:平均值+t0.05,df×SD。这里的平均值和SD值都应该是对数形式。t0.05,df表示t分布中,0.05表示假阳性率为5%,df为自由度,主要取决于样本量和

运行次数。最后需要将平均值+t0.05,df×SD进行反对数运算。值得注意的是,我们

建议用t分布的t0.05,df代替常用的正态分布的1.645是因为灵敏度确定的样本

量很有限。以上算得的灵敏度再乘以最小稀释倍数(MRD)才是报告时的灵敏度。灵敏度应以能检测到的最低抗体浓度表示,单位为质量/单位体积。如果采用了一个以上的阳性对照进行灵敏度计算,那么在报告中灵敏度可以是一个灵敏度范围。

附录E.系统适应性质控(QCs)和验收标准的开发

E.1.1 步骤一:系统适应性质控的定义

选择一个信号强度能达到线性曲线上端的高浓度阳性对照,该阳性对照在抗药抗体检测中极少使用,然后在容易产生钩状效应的方法、跟踪检测性能、试剂限定和排除故障中广泛使用。应从稀释曲线的线性范围上选取该高阳性对照的浓度,通常略低于曲线的上端,另外如果有研究样品的抗药抗体范围的先验信息,也可以采用曲线的最高点。

与高浓度阳性对照不同,低阳性对照确保了分析方法的可靠性,所以其阳性对照是强制性的。

低信号阳性对照的响应值应高于临界点,并具有可重复性,但有时候其信号可能会低于临界点(失败/无效的检测),另一方面,如果低信号阳性对照的样品浓度过高,其产生的信号可能远高于临界点,这是不合理的。为了选择一个客观的低信号阳性对照浓度,可以观察检测不合格率,也就是低阳性对照的信号低于

临界点[8]。例如,低信号阳性对照的合理目标的不合格率为1%,计算公式为:平均值+ t0.01,df×SD,平均值和SD值来自于灵敏度试验或相关的开发阶段的数据,t0.01,df表示t分布的置信区间为99%,df为自由度。理论上意味着99%的低阳性对照样品的数据等于或高于临界点。通常采用基质阴性对照监测非特异性生物背景。在有些分析试验中可能会采用稀释液对照作为额外的阴性对照,因为基质蛋白可能会产生阻塞效应而使信号变低,相比于只有稀释液测定的背景信号。 E.2.步骤2:建立系统适应性质控的验收标准

研究阶段的系统适应性质控必须采用验收标准,该验收标准来源于预研究验证阶段的数据结果。制定验收标准的数据要求为:两个或两个以上分析员至少开展3次运行,每次运行三板,试验样品为阳性对照、基质阴性对照、和稀释液阴性对照,复孔的数量与预期研究样品的一致。也可以使用符合要求的其它性能验证的数据。

阴性对照的验收标准应该有一个上限,下限是可选的。阳性对照通常具有上限和下限,当仪器的信号处于线性范围时,上限没有下限关键。检测信号高于正常时会导致非特异性阳性样品的增加,这些特异性样品会在特应性确证试验中被检出,因此不会对检测的假阴性率造成影响。

当基质阴性对照和稀释液阴性对照的错误率为1%时,阴性对照的上限为:平均相应值+ t0.01,df×SD,平均值和SD来自于上述试验,t0.01,df为步骤1的值。对于阴性对照:如果界定上限和下限,那么验收范围为平均值±t0.005,SD,t0.005,df×

可以根据不同的错误率选择不同的阈值。df表示极低值和极高值的错误率为1%。

有一些科学家还会在滴定试验中设定滴定对照以确认阳性对照的稀释线性,但在研究阶段通常不需要进行这一试验。此外,阴性对照和低阳性对照的验收标准有部分重叠是可以接受的,只要这些验收限度是客观制定的就可以了。

如果在研究阶段的筛选临界点选择了浮动临界点,系统适应性标准可以定义为低阳性对照于阴性对照的比值,也可以是高阳性对照与阴性对照的比值,如果使用了高阳性对照,使用上述类似的公式进行计算(可能需要进行对数转换)。这里用来评估筛选临界点的阴性对照应与在研究阶段的阴性对照一致。如果阴性

对照、低阳性对照和高阳性对照样品的趋势相同,质控比值符合系统适应性限度,使用浮动临界点将会有助于确保试验的有效性。也可以考虑在这些限值的基础上添加阴性对照的上限。

当原始测定信号变异性较大时(光密度或相对发光单位),一些实验室选用阳性对照的终点滴度标准,而不是基于原始信号的验收标准。此时,阳性对照会产生预期的最小滴度终点,这种情况下的验收标准应适当验证。

在研究阶段的样品分析过程中,阳性对照和测试样品(分析信号等于或高于筛选临界点)的重复精密度(CV)应采用合适的验收标准进行控制,以确保获得有意义数据的一致性。低于临界点的结果不需要符合变异系数限定标准。建议精密度的验收标准应该适合所使用的平台(例如电化学发光法的验收标准要严于ELISA),可以参考方法开发的数据和该技术平台和分析方法的经验数值。

附录F. 在基质中测试分析物的稳定性

通过比较新鲜配制的对照品或供试品与在预期储存条件储存的对照品或供试品来确定对照品或供试品的稳定性。基于预期的样品处理和储存条件,稳定性检测条件通常包括:反复动容、-20℃储存、冷藏储存和在特定储存温度下的稀释样品的稳定性。由于参考文献显示,抗体在低于20℃的温度下,稳定性为两年或更长[29,30],所以不需要评估-60℃以下的稳定性。

总之,应该比较新鲜对照品和储存对照品的结果,建议储存对照品的验收标准为储存对照品的滴度落在系列稀释的新鲜对照品的滴度范围内。例如,当滴定试验采用2倍稀释时,新鲜阳性对照的滴度为40时,储存阳性对照的滴度在20-80之间可认为两者相等。另一替代方法是,采用原始测试信号或浓度值进行比较,回收率的可接受范围为80-120%。还可以采用统计学方法比较两个间的差异。此外,当一个样品的稳定性超出验收标准范围时,应进行重复试验,以确保结果不是因为试验异常造成的,而是因为样品不稳定性造成的。

抗药抗体反应具有不均一性,应该注意阳性对照的稳定性不一定会影响实际研究样品的稳定性。可能的话,研究样品的稳定性应该通过检测储存前、后的样

品,并比较终点滴定度,原始测试信号或计算浓度。

附录G. 筛选临界点的计算说明

表2a和表2b提供了帅选临界点的计算过程,检测药品为药物初治基质样品,由两个分析员分为三个运行进行检测(总共6个运行)。表二中列举用于临界点评估的50个样本数据。其中有两个样本数据为生物异常值,这两个样本的所有结果都被排除。此外,运行6中有两个有另外两个样本的数值被作为分析异常值去除。因此6个运行的样本数分别为48、48、48、48、48、46。在计算联合临界点的时候需要考虑不同运行间样本量的大小。

对数(Log)转换确保了数据的近似正态性(附录B.1)。试验运行的均值没有显著性差异,方差大致相当(附录B.2)。按照图1,判断在研究阶段选用固定临界点;然而也可以使用浮动临界点。附录B.3列出了具体的计算步骤,附录

B.3部分的步骤2中提供了计算公式,表2a进行了说明。在研究阶段浮动临界点的评估中,归一化因子的计算在表2b进行了说明。因为该临界点的评估进行了对数转换,所以归一化因子为对数尺度的累加,未转换数据的累乘。在研究阶段的性能测试中,用表2b的乘积因子乘以阴性对照的平均值,从而推导出该运行的浮动临界点。如果知道每位分析员的乘法归一化因子间的差异,则应该选用分析员特异性乘法归一化因子,由此计算出分析员特异性浮动临界点。


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