188 2009, Vol. 30, No. 22
食品科学※工艺技术
庆大霉素免疫亲和柱的制备及测定
李 哲，胡拥明，张柳伟，刘丽强，陈 伟，王利兵，胥传来*
(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)
摘 要：建立庆大霉素残留的间接竞争ELISA 检测方法及其用于样品处理的免疫亲和柱的制备。结果表明：ELISA 方法的IC 50为3.8ng/ml，线性范围为0.1～25ng/ml(R 2＝0.99) ，检测限为0.1ng/ml；用该抗体做的免疫亲和柱使用条件进行了探索，表明当洗脱液为70%甲醇-磷酸盐缓冲液(7:3，V/V) ，体积为5ml 时，可以达到最佳的洗脱；利用庆大霉素标准品建立了HPLC 测定的标准曲线，测得吸附率均在90%以上，回收率均在60%以上，可以重复使用大约5次左右，说明该免疫亲和柱的灵敏性和可靠性。
关键词：庆大霉素；多克隆抗体；间接竞争酶联免疫法；免疫亲和柱
Preparation of Immunoaffinity Column for Separation and Indrect ELISA Determination of Gentamycin
LI Zhe，HU Yong-ming，ZHANG Liu-wei，LIU Li-qiang，CHEN Wei，WANG Li-bing，XU Chuan-lai*
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)
Abstract ：Gentamycin residues were analyzed through indrect ELISA method, and immunoaffinity columns specific togentamycin was prepared for its separation. The optimal ELISA for detecting gentamycin in swine tissues was studied. The IC50for gentamycin was 3.8 ng/ml. The linear range was 0.1～25 ng/ml (R 2=0.99) with a detection limit of 0.1 ng/ml. The immunoaffinitycolumn was prepared using such antibody, and could be eluted with 5ml methanol/PBS (7:3, V/V) solution. The rate of adsroptionto gentamycin was more than 90% and recovery more than 60%, could be repeatedly used for about 5 times.Key words：gentamycin ；polyclonal antibody；indirect competitive-ELISA；immunoaffinity column
中图分类号：R978.12 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)22-0188-04
由于动物源食品中氨基糖苷类药物残留对人体健康的巨大危害。目前对于氨基糖苷类药物残留的检测方法不管是仪器检测还是ELISA 等免疫检测方法[1-7]，都需要对样品进行前处理，快速高效的样品前处理技术可以大大简化和加快检测流程，目前可应用于样品快速前处理的庆大霉素免疫亲和柱国内尚无报道，因此研究和制备出庆大霉素的免疫亲和柱具有一定的开创性[8-16]，为今后的深入研究和免疫亲和柱(immuno-affinity column ，IAC) 快速样品前处理方法的应用提供参考。１1.1
材料与方法
材料与试剂
硫酸庆大霉素(gentamycin sulfate，GS) 武汉远城
甲醇(均为色谱纯) 美国Fisher 公司；Milli-Q 超纯水 美国Millipore 公司。1.2
仪器与设备
TGL-40B 台式低速离心机 上海安亭科学仪器厂；石英自动双重纯水蒸馏器 金坛市荣华仪器制造有限公司；Multiska Mks 酶标仪、可调试移液器 Thermo Labsystems 公司；涡旋混合器 上海沪西仪器分析；Agilent 6890N气相色谱-Agilent 5973N型质谱检测器 美国Finigon 质谱公司；Alliance 型高效液相色谱系统、Symmetry C18色谱柱(250mm×4.6mm ，5μm) 、ZMD 质谱检测器 美国Waters 公司；FA25匀质器 Fluka公司。1.31.3.1
方法
庆大霉素抗体的性能测试
科技发展有限公司；苯甲酸 中国医药集团上海化学试剂总公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)康成生物工程公司；四甲基联苯胺(TMB) 华美生物工程公司；四甲氧基硅烷(TMOS) Sigma 公司；乙腈、
收稿日期：2009-07-08
采用间接ELISA 方法来测试庆大霉素抗体的性能。将庆大霉素包被原用包被缓冲液稀释至最佳工作浓度后包被96孔酶标板，100μl/孔置于4℃冰箱过夜。次日
作者简介：李哲(1984－) ，女，硕士研究生，研究方向为残留检测。E-mail ：[email protected]－) ：
※工艺技术食品科学
2009, Vol. 30, No. 22189
取出酶标板于室温，每孔注入200μl PBST 溶液，摇床振荡3min ，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤3次。以下洗涤方法相同。
充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200μl/孔置于37℃温育箱内温育2h 后取出烘干待用；每孔注入一定体积比的工作浓度纯化抗体和系列浓度的标准品，37℃孵育30min 后洗涤、拍干；每孔加入100μl ，3000倍稀释的HRP 标记的羊抗兔IgG ，37℃孵育30min 后洗涤、拍干；每孔加入100μl 显色液，暗处37℃反应一定时间，取出后每孔加入100μl 终止液，用酶标仪在波长450nm 处测定OD 值。1.3.2
ic-ELISA 方法的灵敏度测定
将标准庆大霉素配成浓度为0、0.1、0.5、1、5、10、50ng/ml系列浓度，按间接竞争ELISA 方法测定。以无庆大霉素标准品抑制时的OD 值为B 0，相应浓度庆大霉素抑制时的OD 值为B ，以抑制率B /B 0为纵坐标，以庆大霉素浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线，得出庆大霉素标准曲线的线性方程，则得到IC 50值。1.3.3
免疫亲和柱的制备
取0.2ml 0.04mol/L HCl，0.75ml 去离子水，3.4ml TM O S ，混合、摇匀；将上述混合液超声粉碎，注意粉碎时温度要控制在冰点，超声时间30min ；称取质量已知的烧杯，吸取20mg/ml的庆大霉素抗体溶液10μl ，用0.01mol/L的PBS 稀释至1ml ，冰袋保存；取超声完了的等份试样1ml ，加入到冷藏后的抗体溶液中；期间溶液逐渐凝结成胶，待全部凝胶后，再次称重烧杯，然后室温保存，期间是凝胶老化过程；等老化的凝胶失去初重的50%时，老化过程结束；将剩余的凝胶硅酸盐玻璃研磨粉碎，快速加入免疫亲和柱中，加甲醇活化免疫亲和柱，待用。1.3.4
免疫亲和柱的使用方法
平衡：用15ml PBS 平衡；上样：取一定浓度的标准品上样；洗涤：加10ml PBS 、10ml 水洗涤免疫亲和柱；洗脱：4ml 甲醇-PBS(7:3，V/V) 洗脱、收集、待检；再生：加15～20ml PBS 溶液，4℃冰箱保存。1.3.5
标准曲线的建立
将硫酸庆大霉素配制成1μg/ml的标准品，分别用0.1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8μl 的进样量进行质谱检测，绘制以标准品的不同进样量对相应峰面积的标准曲线。
庆大霉素分子极性大，在色谱柱上保留时间短，且该分子中无发色基团，无法采用反相液相色谱法直接测定，可通过LC-MS 法，在碱性条件下对庆大霉素进行定性定量分析。由于庆大霉素5种主要组分C 1、C 1a 、C 2、C 2a 、C 2b 中有3种组分C 2、C 2a 、C 2b 是相同分子
量的同分异构体，在质谱图上难以区分，C 1a 组分在实验室中硫酸庆大霉素中含量不多，出峰有限，故本实验只测定了庆大霉素中C 1组分的量。1.3.6
吸附率及回收率测定
用1、750、500ng/ml 3种不同浓度的庆大霉素标准品分别过柱，上样量5ml ，洗脱液是甲醇-水(7:3，V/V) 的混合液，根据过滤液和洗脱液质谱图中478.5nm 波长处的峰面积(进样量均为1μl) 计算出吸附率和回收率。
过滤液的峰值面积
吸附率(%)=(1－—————————) ×100
标准品的峰值面积
洗脱液的峰值面积
回收率(%)=—————————×100
标准品的峰值面积
２2.1
结果与分析
庆大霉素抗体间接ELISA 测定结果
[***********]0100
0.1
0.5
5
10
50100
质量浓度(ng/ml)
图１ 硫酸庆大霉素标准品间接ＥＬＩＳＡ测定的标准曲线Fig.1 Indirect ELISA standard curve of gentamycin sulfate
以庆大霉素标品的浓度为横坐标x ，以抑制率B /B 0
为纵坐标y ，绘制标准曲线如图1所示，线性回归方程为y ＝－0.1569x ＋0.8812(R 2＝0.935) ，表明其线性范围为0.1～25ng/ml(R 2＝0.99) ；IC 50为3.8ng/ml，最低检测限可以达到0.1ng/ml。2.2
免疫亲和柱的吸附率和回收率
庆大霉素标准品的正离子质谱图见图2，根据进样量的不同，在组分C 1的特征峰478.5nm 波长处的峰面积见表1。由表1可知，以标准品的进样量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制出标准曲线，得到线性回归方程为y ＝1265.5x －9.5305(R 2＝0.9988) ，表明溶液在范围内线性关系良好。由此当进样量为1μl 时，根据方程得出478.5nm 处峰面积约为1256；进样量为0.75μl 时，478.5nm 处峰面积约为940；进样量为0.5μl 时，478.5nm 处峰面积约为623，结合1、750、500ng/ml 3种不同浓度的庆大霉素样品进样量均为1μl 时过滤液和洗脱液
B /B 0(%)
190 2009, Vol. 30, No. 22
食品科学
[***********]0100
50
A
※工艺技术
在478.5nm 处的峰面积(图3～5) ，根据1.3.6节方法得相
相对丰度(%)
应的吸附率和回收率，结果见表2。
[***********]0100
322. 2
450. 3472. 2486. 3501. 3500. 3
574. 6599. 3632. 6
相对丰度(%)
166
126. 2
160. 1180. 9222. 9256. 8302. 8323. 2372. 7398. 7
0.5
690. 5714. 5
1
1.522.533.5时间(min)
44.55
m/z
图２ 硫酸庆大霉素标准品正离子质谱图
Fig.2 Positive ion mass spectra of gentamycin sulfate standard
相对丰度(%)
[***********]700
[***********]0100
598B
0.5
表１ 庆大霉素标准品不同进样量的峰面积
Table 1 Injection volume of gentamycin sulfate standard vs. peak
a re a
进样量(μl) 峰面积
0.1117
0.2231
0.4518
0.6745
0.8999
11.522.533.5
时间(min)
44.55
图４ 浓度为750ng/ml，进样量为1μl 庆大霉素过滤液和洗脱液的
峰形面积图
Fig.4 HPLC chromatogram of gentamycin in filtrate and eluent at
478.5 nm (gentamycin 750 ng/ml, injection volumn 1μl)
表２ 1、750、500 ng/ml三种不同浓度的庆大霉素样品进样量１Table 2 Adsorption rate and recovery of gentamicin with various
concentration(1, 750, 500 ng/ml), injection volumn １μｌ样品浓度(ng/ml)
1750500
吸附率(%)90.794.796.9
回收率(%)64.663.669.0
相对丰度(%)
μｌ时吸附率和回收率
[***********]0100
19
A
0.51
1.522.533.5时间(min)
44.55
[***********]0100
118A
相对丰度(%)
[***********]0100
430B
相对丰度(%)
0.51
1.522.533.5时间(min)
B
44.550.51
1.522.533.5时间(min)
44.55
[***********]0100
图５ 浓度为500 ng/ml，进样量为1μl 庆大霉素过滤液和洗脱液的峰
811
形面积图（前４ｍｌ）：
Fig.5 HPLC chromatogram of gentamycin in filtrate and eluent at 478.5 nm (gentamycin 500 ng/ml, injection volumn 1μl, first 1－4
ml of the eluent)
相对丰度(%)
0.511.522.533.5时间(min)
44.55
通过对1、750ng/ml两个较高浓度的标准品吸附率和回收率的测定，初步得知了庆大霉素标准品对庆大霉
素抗体的亲和程度，但是，洗脱条件最佳的情况下，不能得知免疫亲和柱中是否仍然含有未洗脱下来的标准品，故将4ml 后的洗脱液1ml/管收集，以测定最佳洗脱体积。由图5B 和图6可知，洗脱体积为4ml 时，478.5nm 处峰面积为430，第5ml 洗脱液该处峰面积为324，第
A. 过滤液；B. 洗脱液。峰上数据为峰面积。下同
图３ 浓度为1μg/ml，进样量为1μｌ庆大霉素过滤液和洗脱液的峰形
面积图
Fig.3 HPLC chromatogram of gentamycin in filtrate and eluent at
478.5 nm (gentamycin 1μg/ml, injection volumn 1μｌ)
※工艺技术食品科学
[1][2][3]
324
a
[4][5][6]
0.51
1.5
22.533.5时间(min)
44.5
5
[7]
2009, Vol. 30, No. 22191
6ml 该处峰面积为27，说明第5ml 已经洗脱出绝大部分的庆大霉素，而前4ml 又没有洗脱完全，第6ml 已基本没有标准品能够洗脱下来，故最佳洗脱体积为5m l 。
[***********]0100
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相对丰度(%)
[***********]0100
27
b
相对丰度(%)
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0.51
1.5
22.533.5时间(min)
44.5
5
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a. 第5m l ；b. 第6m l 。
图６ 浓度为500 ng/ml，进样量为1μl 庆大霉素洗脱液在478.5 nm
处的峰形面积图(第6ml)
Fig.6 HPLC chromatogram of gentamycin in filtrate and eluent at 478.5 nm (gentamycin 500 ng/ml, injection volumn 1μl, following
5－6 ml of the eluent)
[12][11]
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本实验初步研究了庆大霉素免疫亲和柱的制备进程，包括免疫亲和柱的装载和净化，通过对不同浓度庆大霉素的吸附率及回收率的测定，吸附率均大于90%，回收率均大于60%，说明免疫亲和柱的灵敏性。经测试，免疫亲和柱重复使用次数大约为5次左右，说明了免疫亲和柱的可靠性。对庆大霉素的残留检测IAC 样品前处理方法进行了探索性研究，为其后庆大霉素残留检测提供参考。
参考文献：
188 2009, Vol. 30, No. 22
食品科学※工艺技术
庆大霉素免疫亲和柱的制备及测定
李 哲，胡拥明，张柳伟，刘丽强，陈 伟，王利兵，胥传来*
(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)
摘 要：建立庆大霉素残留的间接竞争ELISA 检测方法及其用于样品处理的免疫亲和柱的制备。结果表明：ELISA 方法的IC 50为3.8ng/ml，线性范围为0.1～25ng/ml(R 2＝0.99) ，检测限为0.1ng/ml；用该抗体做的免疫亲和柱使用条件进行了探索，表明当洗脱液为70%甲醇-磷酸盐缓冲液(7:3，V/V) ，体积为5ml 时，可以达到最佳的洗脱；利用庆大霉素标准品建立了HPLC 测定的标准曲线，测得吸附率均在90%以上，回收率均在60%以上，可以重复使用大约5次左右，说明该免疫亲和柱的灵敏性和可靠性。
关键词：庆大霉素；多克隆抗体；间接竞争酶联免疫法；免疫亲和柱
Preparation of Immunoaffinity Column for Separation and Indrect ELISA Determination of Gentamycin
LI Zhe，HU Yong-ming，ZHANG Liu-wei，LIU Li-qiang，CHEN Wei，WANG Li-bing，XU Chuan-lai*
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)
Abstract ：Gentamycin residues were analyzed through indrect ELISA method, and immunoaffinity columns specific togentamycin was prepared for its separation. The optimal ELISA for detecting gentamycin in swine tissues was studied. The IC50for gentamycin was 3.8 ng/ml. The linear range was 0.1～25 ng/ml (R 2=0.99) with a detection limit of 0.1 ng/ml. The immunoaffinitycolumn was prepared using such antibody, and could be eluted with 5ml methanol/PBS (7:3, V/V) solution. The rate of adsroptionto gentamycin was more than 90% and recovery more than 60%, could be repeatedly used for about 5 times.Key words：gentamycin ；polyclonal antibody；indirect competitive-ELISA；immunoaffinity column
中图分类号：R978.12 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)22-0188-04
由于动物源食品中氨基糖苷类药物残留对人体健康的巨大危害。目前对于氨基糖苷类药物残留的检测方法不管是仪器检测还是ELISA 等免疫检测方法[1-7]，都需要对样品进行前处理，快速高效的样品前处理技术可以大大简化和加快检测流程，目前可应用于样品快速前处理的庆大霉素免疫亲和柱国内尚无报道，因此研究和制备出庆大霉素的免疫亲和柱具有一定的开创性[8-16]，为今后的深入研究和免疫亲和柱(immuno-affinity column ，IAC) 快速样品前处理方法的应用提供参考。１1.1
材料与方法
材料与试剂
硫酸庆大霉素(gentamycin sulfate，GS) 武汉远城
甲醇(均为色谱纯) 美国Fisher 公司；Milli-Q 超纯水 美国Millipore 公司。1.2
仪器与设备
TGL-40B 台式低速离心机 上海安亭科学仪器厂；石英自动双重纯水蒸馏器 金坛市荣华仪器制造有限公司；Multiska Mks 酶标仪、可调试移液器 Thermo Labsystems 公司；涡旋混合器 上海沪西仪器分析；Agilent 6890N气相色谱-Agilent 5973N型质谱检测器 美国Finigon 质谱公司；Alliance 型高效液相色谱系统、Symmetry C18色谱柱(250mm×4.6mm ，5μm) 、ZMD 质谱检测器 美国Waters 公司；FA25匀质器 Fluka公司。1.31.3.1
方法
庆大霉素抗体的性能测试
科技发展有限公司；苯甲酸 中国医药集团上海化学试剂总公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)康成生物工程公司；四甲基联苯胺(TMB) 华美生物工程公司；四甲氧基硅烷(TMOS) Sigma 公司；乙腈、
收稿日期：2009-07-08
采用间接ELISA 方法来测试庆大霉素抗体的性能。将庆大霉素包被原用包被缓冲液稀释至最佳工作浓度后包被96孔酶标板，100μl/孔置于4℃冰箱过夜。次日
作者简介：李哲(1984－) ，女，硕士研究生，研究方向为残留检测。E-mail ：[email protected]－) ：
※工艺技术食品科学
2009, Vol. 30, No. 22189
取出酶标板于室温，每孔注入200μl PBST 溶液，摇床振荡3min ，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤3次。以下洗涤方法相同。
充分洗涤后，用封闭缓冲液封闭酶标板，200μl/孔置于37℃温育箱内温育2h 后取出烘干待用；每孔注入一定体积比的工作浓度纯化抗体和系列浓度的标准品，37℃孵育30min 后洗涤、拍干；每孔加入100μl ，3000倍稀释的HRP 标记的羊抗兔IgG ，37℃孵育30min 后洗涤、拍干；每孔加入100μl 显色液，暗处37℃反应一定时间，取出后每孔加入100μl 终止液，用酶标仪在波长450nm 处测定OD 值。1.3.2
ic-ELISA 方法的灵敏度测定
将标准庆大霉素配成浓度为0、0.1、0.5、1、5、10、50ng/ml系列浓度，按间接竞争ELISA 方法测定。以无庆大霉素标准品抑制时的OD 值为B 0，相应浓度庆大霉素抑制时的OD 值为B ，以抑制率B /B 0为纵坐标，以庆大霉素浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线，得出庆大霉素标准曲线的线性方程，则得到IC 50值。1.3.3
免疫亲和柱的制备
取0.2ml 0.04mol/L HCl，0.75ml 去离子水，3.4ml TM O S ，混合、摇匀；将上述混合液超声粉碎，注意粉碎时温度要控制在冰点，超声时间30min ；称取质量已知的烧杯，吸取20mg/ml的庆大霉素抗体溶液10μl ，用0.01mol/L的PBS 稀释至1ml ，冰袋保存；取超声完了的等份试样1ml ，加入到冷藏后的抗体溶液中；期间溶液逐渐凝结成胶，待全部凝胶后，再次称重烧杯，然后室温保存，期间是凝胶老化过程；等老化的凝胶失去初重的50%时，老化过程结束；将剩余的凝胶硅酸盐玻璃研磨粉碎，快速加入免疫亲和柱中，加甲醇活化免疫亲和柱，待用。1.3.4
免疫亲和柱的使用方法
平衡：用15ml PBS 平衡；上样：取一定浓度的标准品上样；洗涤：加10ml PBS 、10ml 水洗涤免疫亲和柱；洗脱：4ml 甲醇-PBS(7:3，V/V) 洗脱、收集、待检；再生：加15～20ml PBS 溶液，4℃冰箱保存。1.3.5
标准曲线的建立
将硫酸庆大霉素配制成1μg/ml的标准品，分别用0.1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8μl 的进样量进行质谱检测，绘制以标准品的不同进样量对相应峰面积的标准曲线。
庆大霉素分子极性大，在色谱柱上保留时间短，且该分子中无发色基团，无法采用反相液相色谱法直接测定，可通过LC-MS 法，在碱性条件下对庆大霉素进行定性定量分析。由于庆大霉素5种主要组分C 1、C 1a 、C 2、C 2a 、C 2b 中有3种组分C 2、C 2a 、C 2b 是相同分子
量的同分异构体，在质谱图上难以区分，C 1a 组分在实验室中硫酸庆大霉素中含量不多，出峰有限，故本实验只测定了庆大霉素中C 1组分的量。1.3.6
吸附率及回收率测定
用1、750、500ng/ml 3种不同浓度的庆大霉素标准品分别过柱，上样量5ml ，洗脱液是甲醇-水(7:3，V/V) 的混合液，根据过滤液和洗脱液质谱图中478.5nm 波长处的峰面积(进样量均为1μl) 计算出吸附率和回收率。
过滤液的峰值面积
吸附率(%)=(1－—————————) ×100
标准品的峰值面积
洗脱液的峰值面积
回收率(%)=—————————×100
标准品的峰值面积
２2.1
结果与分析
庆大霉素抗体间接ELISA 测定结果
[***********]0100
0.1
0.5
5
10
50100
质量浓度(ng/ml)
图１ 硫酸庆大霉素标准品间接ＥＬＩＳＡ测定的标准曲线Fig.1 Indirect ELISA standard curve of gentamycin sulfate
以庆大霉素标品的浓度为横坐标x ，以抑制率B /B 0
为纵坐标y ，绘制标准曲线如图1所示，线性回归方程为y ＝－0.1569x ＋0.8812(R 2＝0.935) ，表明其线性范围为0.1～25ng/ml(R 2＝0.99) ；IC 50为3.8ng/ml，最低检测限可以达到0.1ng/ml。2.2
免疫亲和柱的吸附率和回收率
庆大霉素标准品的正离子质谱图见图2，根据进样量的不同，在组分C 1的特征峰478.5nm 波长处的峰面积见表1。由表1可知，以标准品的进样量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制出标准曲线，得到线性回归方程为y ＝1265.5x －9.5305(R 2＝0.9988) ，表明溶液在范围内线性关系良好。由此当进样量为1μl 时，根据方程得出478.5nm 处峰面积约为1256；进样量为0.75μl 时，478.5nm 处峰面积约为940；进样量为0.5μl 时，478.5nm 处峰面积约为623，结合1、750、500ng/ml 3种不同浓度的庆大霉素样品进样量均为1μl 时过滤液和洗脱液
B /B 0(%)
190 2009, Vol. 30, No. 22
食品科学
[***********]0100
50
A
※工艺技术
在478.5nm 处的峰面积(图3～5) ，根据1.3.6节方法得相
相对丰度(%)
应的吸附率和回收率，结果见表2。
[***********]0100
322. 2
450. 3472. 2486. 3501. 3500. 3
574. 6599. 3632. 6
相对丰度(%)
166
126. 2
160. 1180. 9222. 9256. 8302. 8323. 2372. 7398. 7
0.5
690. 5714. 5
1
1.522.533.5时间(min)
44.55
m/z
图２ 硫酸庆大霉素标准品正离子质谱图
Fig.2 Positive ion mass spectra of gentamycin sulfate standard
相对丰度(%)
[***********]700
[***********]0100
598B
0.5
表１ 庆大霉素标准品不同进样量的峰面积
Table 1 Injection volume of gentamycin sulfate standard vs. peak
a re a
进样量(μl) 峰面积
0.1117
0.2231
0.4518
0.6745
0.8999
11.522.533.5
时间(min)
44.55
图４ 浓度为750ng/ml，进样量为1μl 庆大霉素过滤液和洗脱液的
峰形面积图
Fig.4 HPLC chromatogram of gentamycin in filtrate and eluent at
478.5 nm (gentamycin 750 ng/ml, injection volumn 1μl)
表２ 1、750、500 ng/ml三种不同浓度的庆大霉素样品进样量１Table 2 Adsorption rate and recovery of gentamicin with various
concentration(1, 750, 500 ng/ml), injection volumn １μｌ样品浓度(ng/ml)
1750500
吸附率(%)90.794.796.9
回收率(%)64.663.669.0
相对丰度(%)
μｌ时吸附率和回收率
[***********]0100
19
A
0.51
1.522.533.5时间(min)
44.55
[***********]0100
118A
相对丰度(%)
[***********]0100
430B
相对丰度(%)
0.51
1.522.533.5时间(min)
B
44.550.51
1.522.533.5时间(min)
44.55
[***********]0100
图５ 浓度为500 ng/ml，进样量为1μl 庆大霉素过滤液和洗脱液的峰
811
形面积图（前４ｍｌ）：
Fig.5 HPLC chromatogram of gentamycin in filtrate and eluent at 478.5 nm (gentamycin 500 ng/ml, injection volumn 1μl, first 1－4
ml of the eluent)
相对丰度(%)
0.511.522.533.5时间(min)
44.55
通过对1、750ng/ml两个较高浓度的标准品吸附率和回收率的测定，初步得知了庆大霉素标准品对庆大霉
素抗体的亲和程度，但是，洗脱条件最佳的情况下，不能得知免疫亲和柱中是否仍然含有未洗脱下来的标准品，故将4ml 后的洗脱液1ml/管收集，以测定最佳洗脱体积。由图5B 和图6可知，洗脱体积为4ml 时，478.5nm 处峰面积为430，第5ml 洗脱液该处峰面积为324，第
A. 过滤液；B. 洗脱液。峰上数据为峰面积。下同
图３ 浓度为1μg/ml，进样量为1μｌ庆大霉素过滤液和洗脱液的峰形
面积图
Fig.3 HPLC chromatogram of gentamycin in filtrate and eluent at
478.5 nm (gentamycin 1μg/ml, injection volumn 1μｌ)
※工艺技术食品科学
[1][2][3]
324
a
[4][5][6]
0.51
1.5
22.533.5时间(min)
44.5
5
[7]
2009, Vol. 30, No. 22191
6ml 该处峰面积为27，说明第5ml 已经洗脱出绝大部分的庆大霉素，而前4ml 又没有洗脱完全，第6ml 已基本没有标准品能够洗脱下来，故最佳洗脱体积为5m l 。
[***********]0100
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相对丰度(%)
[***********]0100
27
b
相对丰度(%)
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0.51
1.5
22.533.5时间(min)
44.5
5
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a. 第5m l ；b. 第6m l 。
图６ 浓度为500 ng/ml，进样量为1μl 庆大霉素洗脱液在478.5 nm
处的峰形面积图(第6ml)
Fig.6 HPLC chromatogram of gentamycin in filtrate and eluent at 478.5 nm (gentamycin 500 ng/ml, injection volumn 1μl, following
5－6 ml of the eluent)
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本实验初步研究了庆大霉素免疫亲和柱的制备进程，包括免疫亲和柱的装载和净化，通过对不同浓度庆大霉素的吸附率及回收率的测定，吸附率均大于90%，回收率均大于60%，说明免疫亲和柱的灵敏性。经测试，免疫亲和柱重复使用次数大约为5次左右，说明了免疫亲和柱的可靠性。对庆大霉素的残留检测IAC 样品前处理方法进行了探索性研究，为其后庆大霉素残留检测提供参考。
参考文献：