抗A型红细胞单克隆抗体的制备及应用
一、什么是单克隆抗体
单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）是指由一个B细胞克隆分化增值的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原的抗体。单克隆抗体只针对一种抗原决定簇，也就是只针对一种抗原具有特异性结合的特性。具有高效性，往往能够迅速结合并清除侵入体内的抗原。
制备单克隆抗体的基本原理：
我们可以把分离到的A型血液纯化，获得大量红细胞，这些红细胞在A血型的人体内是不会产生特异性免疫的，所以这里不能把纯化的红细胞注入体内进行制备单克隆抗体。这样我们可以把这些打入异源动物如兔子的体内，这样兔子就能产生针对这一红细胞的特异性抗体，然后经过分离、酶切等就可以获得抗A型的单克隆抗体了。要想获得大量的单克隆抗体，可以将兔体内的浆细胞提取出来与肿瘤细胞杂交，这样，杂交的细胞就获得了无限增值的特性，并且能够分泌特定的单克隆抗体。
二、如何制备具有抗A型红细胞的单克隆抗体？
1、 获得大量A型红细胞
从A血型的人体内抽取一定量的血液，加入抗凝血剂，在进行梯度离心，分离出纯净的红细胞。低温保存。离心速度不宜过快或者过久，否则红细胞易破裂发生溶血现象。
2、 免疫前的准备
佐剂是非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注射入机体内时，可增强机体对抗原的免疫应答。目前使用的佐剂有很多种，这里选用弗氏佐剂。弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗式不完全佐剂。
弗式完全佐剂的制备：在油相中加入死分枝杆菌（终浓度为0.25mg/mL）。弗式不完全佐剂：液体石蜡与羊毛脂混合而成，通常为4:1，配置好后要高压灭菌。
3、 第一次免疫
用弗氏完全佐剂和红细胞按照1:1的比例进行混合，混合后进行磨合。磨合可以使用玻璃针管反复推拉，至佐剂抗原滴入水中既不会产生大面积油花，也不会分层。
取1mL佐剂抗原，对兔子进行多点皮下与皮内注射。再注射的时候要小心，不要感染兔子。在皮下注射应提起兔子的表皮，将针扎入表皮下的空隙内。而皮内注射不需要提起表皮，并且注射完后会鼓起一个小包。
注射完成后把兔子养2周左右。
4、 第二次免疫
用弗式不完全佐剂和红细胞按照1:1的比例进行混合，混合后同样进行磨合。磨合方法及程度和第一次相同。
取2mL佐剂抗原，对兔子进行皮内注射和肌肉注射，肌肉注射1mL，皮下注射1mL。在肌肉注射时不需要多点注射。而在皮下注射时要多点注射。
注射完成后把兔子养1周左右。
5、 第三次免疫
用抗原液2mL对兔子进行多点皮下注射和肌肉注射。肌肉注射1mL，皮下注射1mL。要求和前几次免疫相同。
注射完成后把兔子养1周左右。
6、 第四次免疫
用抗原液2mL对兔子进行多点皮下注射和肌肉注射。肌肉注射1mL，皮下注射1mL。要求和第三次注射相同。
注射完成后把兔子养1周左右。
7、 采血
此时的兔子体内已经产生了大量针对A型血液的抗体。兔子的采血采用心脏采血的方法。用手固定兔子的后腿和前肢，使兔子侧卧，露出左侧部分。用手找到兔子的心跳最厉害的部位，再用针头快速扎入即可，如果扎对了位置，是很容易抽出血液的。但不要在动脉或者静脉采血，这些部位的采血难以保证无菌。
8、 梯度离心
其实兔子血内含有抗A型血的抗体和大量产生抗体的浆细胞，通过梯度离心分离出少量的抗A型血的抗体和一些浆细胞。而所产生的抗体由于量过少不具有使用价值。可以通过梯度离心将兔血清分离出来，用它与A型血红细胞相反应，来鉴定抗体的质量。
9、 细胞培养
将从兔子体内分离的浆细胞进行体外培养。在37°C条件下、95%的空气加5%的二氧化碳的条件下，使用血清培养基，放在三角瓶中培养让细胞贴壁生长。这个过程中一定要注意无菌，否则就要重新做。
10、 细胞融合
这里使用成本比较低廉、效果较好的聚乙二醇发。但该方法会干扰细胞的正常生长。配置50%的PEG溶液：将10gPEG与10mL Eagle氏液混合，即配成50%PEG溶液。调节pH值至6。
找到骨髓瘤细胞，将骨髓瘤细胞与浆细胞放在一起，加入少量聚乙二醇，大约107个细胞需加入1mL 50% PEG溶液，并用吸管吹打，使之与细胞接触1min，加入9mL培养液，离心沉淀，吸去上清液。加入5mL培养液，分别接种5个直径60mm的平皿，每个平皿加培养液至5mL，37°C的二氧化碳培养箱中培养，培养6-24小时。
11、 筛选
将培养后的细胞取出，加入A型血液，如果红细胞产生了凝集，则保留该组细胞。如果均没有产生凝集，则选取培养皿中的细胞进行传代培养，再在细胞板上进行筛选、传代培养、筛选直至出现了凝集现象。也可以在上一步将培养液分在细胞板上进行培养。
12、 细胞培养
将筛选出来的细胞直接注射到小鼠的腹部，培养3-4天。也可以在体外进行培养，不过体外培养对环境要求极高，很容易就感染了菌株从而造成整个实验的失败。
13、
提取单克隆抗体
吸取培养好小鼠的腹水，将抽取的腹水进行梯度离心就可以分离到纯净的抗A型的单克隆抗体。在抽取腹水的时候不要多次抽取，尽量一次抽取成功，否则很容易感染菌株。
三、抗A型红细胞单克隆抗体的应用
最典型的应用就是用与鉴定血型，在临床进行输血前必须选择相同的血型，完全相同后才能输血。在皮肤、肾移植等器官移植的时候需选择血型相符的供体。不孕症和新生儿溶血症病因的分析。亲子鉴定等。
通过上述方法制得的抗A型抗体是可以制成生物导弹的，不过要再经过一步酶切，即用胃蛋白酶进行酶切，切断抗体的Fc段，否则会产生特异性免疫。
抗A型红细胞单克隆抗体的制备及应用
一、什么是单克隆抗体
单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）是指由一个B细胞克隆分化增值的子代细胞（浆细胞）产生的针对单一抗原的抗体。单克隆抗体只针对一种抗原决定簇，也就是只针对一种抗原具有特异性结合的特性。具有高效性，往往能够迅速结合并清除侵入体内的抗原。
制备单克隆抗体的基本原理：
我们可以把分离到的A型血液纯化，获得大量红细胞，这些红细胞在A血型的人体内是不会产生特异性免疫的，所以这里不能把纯化的红细胞注入体内进行制备单克隆抗体。这样我们可以把这些打入异源动物如兔子的体内，这样兔子就能产生针对这一红细胞的特异性抗体，然后经过分离、酶切等就可以获得抗A型的单克隆抗体了。要想获得大量的单克隆抗体，可以将兔体内的浆细胞提取出来与肿瘤细胞杂交，这样，杂交的细胞就获得了无限增值的特性，并且能够分泌特定的单克隆抗体。
二、如何制备具有抗A型红细胞的单克隆抗体？
1、 获得大量A型红细胞
从A血型的人体内抽取一定量的血液，加入抗凝血剂，在进行梯度离心，分离出纯净的红细胞。低温保存。离心速度不宜过快或者过久，否则红细胞易破裂发生溶血现象。
2、 免疫前的准备
佐剂是非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注射入机体内时，可增强机体对抗原的免疫应答。目前使用的佐剂有很多种，这里选用弗氏佐剂。弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗式不完全佐剂。
弗式完全佐剂的制备：在油相中加入死分枝杆菌（终浓度为0.25mg/mL）。弗式不完全佐剂：液体石蜡与羊毛脂混合而成，通常为4:1，配置好后要高压灭菌。
3、 第一次免疫
用弗氏完全佐剂和红细胞按照1:1的比例进行混合，混合后进行磨合。磨合可以使用玻璃针管反复推拉，至佐剂抗原滴入水中既不会产生大面积油花，也不会分层。
取1mL佐剂抗原，对兔子进行多点皮下与皮内注射。再注射的时候要小心，不要感染兔子。在皮下注射应提起兔子的表皮，将针扎入表皮下的空隙内。而皮内注射不需要提起表皮，并且注射完后会鼓起一个小包。
注射完成后把兔子养2周左右。
4、 第二次免疫
用弗式不完全佐剂和红细胞按照1:1的比例进行混合，混合后同样进行磨合。磨合方法及程度和第一次相同。
取2mL佐剂抗原，对兔子进行皮内注射和肌肉注射，肌肉注射1mL，皮下注射1mL。在肌肉注射时不需要多点注射。而在皮下注射时要多点注射。
注射完成后把兔子养1周左右。
5、 第三次免疫
用抗原液2mL对兔子进行多点皮下注射和肌肉注射。肌肉注射1mL，皮下注射1mL。要求和前几次免疫相同。
注射完成后把兔子养1周左右。
6、 第四次免疫
用抗原液2mL对兔子进行多点皮下注射和肌肉注射。肌肉注射1mL，皮下注射1mL。要求和第三次注射相同。
注射完成后把兔子养1周左右。
7、 采血
此时的兔子体内已经产生了大量针对A型血液的抗体。兔子的采血采用心脏采血的方法。用手固定兔子的后腿和前肢，使兔子侧卧，露出左侧部分。用手找到兔子的心跳最厉害的部位，再用针头快速扎入即可，如果扎对了位置，是很容易抽出血液的。但不要在动脉或者静脉采血，这些部位的采血难以保证无菌。
8、 梯度离心
其实兔子血内含有抗A型血的抗体和大量产生抗体的浆细胞，通过梯度离心分离出少量的抗A型血的抗体和一些浆细胞。而所产生的抗体由于量过少不具有使用价值。可以通过梯度离心将兔血清分离出来，用它与A型血红细胞相反应，来鉴定抗体的质量。
9、 细胞培养
将从兔子体内分离的浆细胞进行体外培养。在37°C条件下、95%的空气加5%的二氧化碳的条件下，使用血清培养基，放在三角瓶中培养让细胞贴壁生长。这个过程中一定要注意无菌，否则就要重新做。
10、 细胞融合
这里使用成本比较低廉、效果较好的聚乙二醇发。但该方法会干扰细胞的正常生长。配置50%的PEG溶液：将10gPEG与10mL Eagle氏液混合，即配成50%PEG溶液。调节pH值至6。
找到骨髓瘤细胞，将骨髓瘤细胞与浆细胞放在一起，加入少量聚乙二醇，大约107个细胞需加入1mL 50% PEG溶液，并用吸管吹打，使之与细胞接触1min，加入9mL培养液，离心沉淀，吸去上清液。加入5mL培养液，分别接种5个直径60mm的平皿，每个平皿加培养液至5mL，37°C的二氧化碳培养箱中培养，培养6-24小时。
11、 筛选
将培养后的细胞取出，加入A型血液，如果红细胞产生了凝集，则保留该组细胞。如果均没有产生凝集，则选取培养皿中的细胞进行传代培养，再在细胞板上进行筛选、传代培养、筛选直至出现了凝集现象。也可以在上一步将培养液分在细胞板上进行培养。
12、 细胞培养
将筛选出来的细胞直接注射到小鼠的腹部，培养3-4天。也可以在体外进行培养，不过体外培养对环境要求极高，很容易就感染了菌株从而造成整个实验的失败。
13、
提取单克隆抗体
吸取培养好小鼠的腹水，将抽取的腹水进行梯度离心就可以分离到纯净的抗A型的单克隆抗体。在抽取腹水的时候不要多次抽取，尽量一次抽取成功，否则很容易感染菌株。
三、抗A型红细胞单克隆抗体的应用
最典型的应用就是用与鉴定血型，在临床进行输血前必须选择相同的血型，完全相同后才能输血。在皮肤、肾移植等器官移植的时候需选择血型相符的供体。不孕症和新生儿溶血症病因的分析。亲子鉴定等。
通过上述方法制得的抗A型抗体是可以制成生物导弹的，不过要再经过一步酶切，即用胃蛋白酶进行酶切，切断抗体的Fc段，否则会产生特异性免疫。