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综 述
成骨细胞钾、钙离子通道的研究进展
Advances in research on osteoblast potassium and calcium ion channels
孙中洋1，李东韬1,2 综述 张 舒1 审校
12第四军医大学 航空航天生物动力学教研室，航空航天医学教育部重点实验室，陕西西安 710032；海军总医院 心脏中心，北京 100048
摘要：骨质疏松的发病率呈现逐年上升的趋势，患者生活质量下降，其所带来的危害已引起全世界的广泛关注。骨质疏松的发病机制复杂，涉及因素较多，但成骨细胞功能障碍处于中心环节。研究发现成骨细胞表达多种离子通道，本文将对钾离子和钙离子通道进行综述分析。
关键词：成骨细胞；骨质疏松；钾离子通道；钙离子通道
10.3969/j.issn.2095-5227.2014.02.026中图分类号：R 348 文献标志码：A 文章编号：2095-5227(2014)02-0186-04 DOI：网络出版时间：2013-10-24 10:19 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20131024.1019.002.html
骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种最常见的代谢性
1.1 电压依赖性钾离子通道 具有6个跨膜段和1个孔区的K+通道亚型。成骨细胞上表达的电压依赖性钾离子通道主要有以下4种。电压门控性钾离子通道(voltage-gated potassium channels，Kv)由4个孔道形成亚基α和4个辅助亚基β组成，α亚基有6个穿膜结构域，其主要负责细胞膜的复极化[2-3]。大电导钙激活钾离子通道(large-conduc-tance calcium activated potassium channels，BK)由α亚单位和β亚单位组成，其中α亚单位组成孔道，β亚单位可调节通道的电学和药理学特点。BK属于机械敏感性通道，因其在成骨细胞上高表达和可在膜牵张时开放，能够使机械牵张转变成为胞内反应，可将其看作是骨组织的机械感受器[4]。BK参与许多胞内活动，比如细胞容积的调节，控制细胞的黏附，在机械负荷下调节细胞膜电位，调节细胞因子释放和细胞迁徙等[5-7]，并参与细胞形态的保持[8]。此外，成骨细胞上BK还可快速持续地反馈调节细胞膜去极化[9]。BK可被奎尼丁、粉防己碱和四乙胺阻断，被异松脂酸、甲状旁腺素和前列腺素E2激活，表现为Ca2+和电压依赖[10]。BK通道的活性还受到动态聚合状态或解离状态肌动蛋白等细胞骨架的影响[4]。中电导钙激活钾离子通道(intermediate-conductance calcium activated potassium channels，IK)与BK相似，在成骨细胞上广泛表达，而且有着相似的电生理性质。即使在ATP足够的情况下，BK调控细胞膜电位的作用也较小； 相反，IK可在激动剂的作用下促进Ca2+的移动，从而调控细胞膜电位。ATP介导的细胞内Ca2+浓度增加主
收稿日期：2013-09-02基金项目：国家自然科学基金项目(31170889；30870595)；教育部留学回国启动基金(HG4406)
Supported by the National Natural Science Foundation of China(31170889;30870595); Project-sponsored by SRF for ROCS, SEM(HG4406)作者简介：孙中洋，男，在读硕士。研究方向：航空航天医学。Email:[email protected]通信作者：张舒，男，博士，教授，博士生导师。Email: [email protected]
骨病，病理特征为骨量减低，骨组织微结构退行性变和骨脆性增加。OP主要症状是骨痛和肌无力，严重者可发生骨折和脊柱变形。成骨细胞在骨重建过程中起到核心作用。成骨细胞不仅调节骨的矿化，还间接调节破骨细胞的骨吸收功能，它的数量和功能变化直接影响代谢性骨病的发生、发展和预后[1]。作为骨代谢治疗药物的靶细胞，成骨细胞功能受许多激素和骨组织局部调节因子的影响。因此，成骨细胞的功能及调节机制已成为OP研究的重中之重。现已发现，成骨细胞存在多种离子通道，尤以K+通道和Ca2+通道的研究最为深入。这些离子通道不仅调节成骨细胞的分化和增殖等生理活动，还参与机械信号感知、传递及转导过程，进而影响其成骨功能。本文针对成骨细胞上K+通道和Ca2+通道的结构和特性等相关研究进行综述。1 成骨细胞上钾、钙离子通道的分类与特征
K+是细胞内的重要离子，有很高的电化学活性。在成骨细胞的收缩过程起始阶段起作用。其在成骨细胞的线粒体上也有分布，并且和细胞的凋亡关系密切[2]。依据拓扑结构，成骨细胞上K+通道可划分为3大类，分别为电压依赖性钾离子通道(voltage-dependent potassium channels)，内向整流钾离子通道(inwardly rectifying potassium channels，Kir)和双孔钾离子通道(two-pore domain potassium channel，2PK+)。
要是激活IK，引起细胞膜的超极化。IK通道表现为Ca2+依赖，可被环磷酰胺阻断[11]。瞬时外向钾离子通道(transient outward potassium channels)电流在去极化刺激时被引出，表现出激活快，失活慢的特点[12]。细胞膜的去极化和细胞内Ca2+的浓度增加都可激活此通道，从而缓冲胞内Ca2+浓度。瞬时外向钾离子通道在成骨细胞中Ca2+信号转导机制起到重要作用，由于它的存在，细胞内Ca2+增加是暂时的[13]。
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1.2 内向整流钾离子通道 具有2个跨膜段和1个孔区，这2个跨膜结构域形成了孔道。Kir是由4个α亚基组成的同聚体或异聚体[2]。Kir负责当膜电位小于K+平衡电位时内向转运K+，从而使电流进入细胞比出细胞更容易。这种内向电流伴随着细胞外K+
浓度的增加而增加。它还可增加K+膜电导，有效地控制膜电位接近K+的平衡电位。值得注意的是Kir虽具有整流作用，但无电压依赖性[14]。Kir的门控特性不仅受到膜电位的影响也受到细胞外K+浓度的调节[13]。其最具确定意义的特点是可被细胞外Ba2+可逆性阻断。1.3 双孔钾离子通道 双孔钾离子通道是20世纪90年代发现的具有4个跨膜段和2个孔区的K+通道亚型。由于该通道无电压依赖性，可在静息电位时开放，故也被称为背景K+通道或漏流通道[4,14]。2PK+的表达分布非常广泛，与细胞增殖和细胞膜静息电位的关系密切。在成骨细胞中与在神经系统中的作用相似，调节静息电位和细胞电兴奋性。2PK+对机械作用敏感，与电压门控和Ca2+激活的K+通道配合，使细胞膜的复极化速率与机械作用的影响相偶联。2PK+还可作为机械信号转导下游通路信号[14]。2PK+对细胞膜的牵张、pH、温度等因素敏感，而对于传统K+通道阻断剂不敏感，但又能被前列腺素和cAMP阻断[15]
。
除此以外，最近还发现一类特殊的K+通道-EAG(ether
a go-go related)通道。传统观点认为K+通道通过控制膜电位，调节K+内流从而促进细胞的增殖，但EAG通道能够抑制细胞的增殖[16]。K+通道对成骨细胞的数量、形态和矿化等能力的影响是复杂的，在调节其生理活动过程中扮演了极为重要的角色。2 钙离子通道
Ca2+在成骨细胞中发挥了至关重要的作用。Ca2+的增
加可来自细胞外也可来自细胞内钙库释放。细胞内的钙库在成骨细胞是指内质网。为了了解成骨细胞中的Ca2+
稳态，要区分一个重要的概念，信号Ca2+和无机Ca2+。在细胞外的矿化作用中，无机Ca2+作为细胞内其他信号通路的下游被调控，和羟基磷灰石晶体一同沉积在蛋白质支架上。在第二信使作用中，信号Ca2+在激活细胞反应中起到基础作用。作为主要的细胞内离子，Ca2+
已经被证明和细胞内的许多功能相关，但更重要的是，Ca2+信号的微小变化可以在细胞中产生不同的信号通路，从而产生不同的作用。任何原因、任何形式的细胞内Ca2+长时程的增多都会引起细胞的死亡或凋亡[17]。成骨细胞膜片钳研究集中在2大类Ca2+通道，即电压敏感性钙离子通道(voltage-sensitive calcium channels，VSCC)和配基门控性钙离子通道(ligand-gated calcium channels)。
2.1 电压敏感性钙离子通道 电压敏感性钙离子通道是蛋白质复合体，可调节Ca2+内流等生理功能。根据通道的动力学和药理学特性，可以将VSCC超家族分为5个亚群： L，T，P，N和Q。其中L型是细胞中发现分布最广研究最透彻的Ca2+通道，其次是T型，而P、N和Q型少有报道[18-20]。VSCC是异质二聚体，由4个亚单位组成，分别是α1、α2、β和δ[21-22]。α亚单位组成通道的孔道，这个亚单
位由4个跨膜结构域组成，每个结构域又是由6穿膜结构组成[23]。α亚单位既有电压敏感的序列，也有二氢吡啶结合的序列。可认为α亚单位是产生通道活性的唯一亚单位，在其他亚单位缺失的情况下，α仍然可以发挥作用，但此时膜电流密度变低，电压激活更加缓慢[18,24]。分子克隆证明VSCC具有非常大的多态性，α亚基就由至少3个基因调控。根据α1亚基药理学和生理学功能的不同，VSCC可以分为以下两类，高电压激活型(L，P/Q，N和R亚型)和低电压激活型(T亚型)[25]。低电压激活的通道和高电压激活的通道在蛋白质水平序列的相似性＜25%，并且在功能特性上有着显著的差异[22]。其他辅助亚基，特别是β亚基，调节VSCC的门控特性和控制通道的装配和运输。β亚基可促进VSCC的正确折叠，并帮助其在细胞膜上定位。研究发现β亚基与和细胞膜链接的鸟苷酸激酶蛋白结构相似[26-28]。β亚基通过许多不同蛋白质的相互作用影响细胞间的信号转导。成骨细胞上有3种β亚基，其中β2亚基的密度最大，并起到主要作用[29]。δ亚基的分子量有24 kU和27 kU两种。
成骨细胞上表达的VSCC是可兴奋细胞上的特征性通道，但又很难引起钙诱导的钙释放现象，而此现象又是绝大多数可兴奋细胞的重要特征[30]。成骨细胞上VSCC表达与一般可兴奋细胞的最大不同在于其表达的数量要少得多。比如，成熟的横纹肌细胞上VSCC的数量是成骨细胞数十倍，VSCC数量上的不同也体现在mRNA水平[31]。推测成骨细胞可根据其功能需要的不同，表达出数量介于可兴奋细胞和不可兴奋细胞之间的VSCC。其功能是随着激素和机械刺激的影响，调节多种细胞外基质蛋白的分泌[32-33]。VSCC在成骨细胞乃至骨骼系统的生理作用中起到核心作用。
L型VSCC在细胞体外培养7 ~ 8 d后才能被检测出来，在1 ~ 2周时活性达到峰值。但如果用无血清的培养基来培养成骨细胞，L型的活性可更早出现。然而，T型在培养2 ~4 d后就可检出，而且活性在8 d后就减低或消失[34]。由此产生一个假设，T型在细胞分化的早期发挥作用，而L型和分化一直相关。L型是高电压激活且电流持续时间长，可被二氢吡啶特异性阻断。而T型能够在微小去极化的情况下被激活且很快失活，T型对二氢吡啶不敏感但可被Ni2+阻断，此为T型通道的主要特征[35]。
胞膜去极化、VD3、PTH和表皮生长因子可调节成骨细胞上VSCC的功能。VSCC的功能是根据Ca2+进入细胞的时空方式不同而改变。而Ca2+进入细胞的时空方式不同主要是因为细胞膜上表达不同亚型的VSCC，每种亚型都具有不同的激活和失活动力学特征、药理学特征和组织的分布特征[36]。
2.2 配基门控性钙离子通道 代谢型谷氨酸受体和离子型谷氨酸受体在成骨细胞上功能性表达。离子型谷氨酸受体作为谷氨酸门控型离子通道，它的激活可引起Ca2+内流。而代谢型谷氨酸受体可和G蛋白偶联，进而激活磷脂酶C合成二酰甘油和三磷酸盐，或被动地与腺核苷酸环化酶结合[37]。
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离子型受体根据激活受体的配体不同，可以将其分
为N-methyl-D-aspartate (NMDA)，a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid (AMPA)和Kainate (KA)等不同型别，研究主要集中在NMDA上[37-38]。
成骨细胞上离子型受体的激活引起细胞膜去极化和Ca2+内流，进而增加谷氨酸释放和激活第二信号通路，同时也会影响成骨细胞表型。离子型谷氨酸受体的阻断会使骨质合成减少，减缓成骨细胞的分化，降低骨基质蛋白的翻译，说明谷氨酸信号的调控可促进骨质形成[39]。3 问题与展望
综上所述，钾、钙离子通道通过调节成骨细胞的增殖和分化等功能影响骨组织的生长和发育，揭示了钾、钙离子通道，成骨细胞和骨质疏松的密切关系。成骨细胞上钾、钙离子通道的进一步研究将对理解和治疗骨质疏松有积极意义。参考文献
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骨病，病理特征为骨量减低，骨组织微结构退行性变和骨脆性增加。OP主要症状是骨痛和肌无力，严重者可发生骨折和脊柱变形。成骨细胞在骨重建过程中起到核心作用。成骨细胞不仅调节骨的矿化，还间接调节破骨细胞的骨吸收功能，它的数量和功能变化直接影响代谢性骨病的发生、发展和预后[1]。作为骨代谢治疗药物的靶细胞，成骨细胞功能受许多激素和骨组织局部调节因子的影响。因此，成骨细胞的功能及调节机制已成为OP研究的重中之重。现已发现，成骨细胞存在多种离子通道，尤以K+通道和Ca2+通道的研究最为深入。这些离子通道不仅调节成骨细胞的分化和增殖等生理活动，还参与机械信号感知、传递及转导过程，进而影响其成骨功能。本文针对成骨细胞上K+通道和Ca2+通道的结构和特性等相关研究进行综述。1 成骨细胞上钾、钙离子通道的分类与特征
K+是细胞内的重要离子，有很高的电化学活性。在成骨细胞的收缩过程起始阶段起作用。其在成骨细胞的线粒体上也有分布，并且和细胞的凋亡关系密切[2]。依据拓扑结构，成骨细胞上K+通道可划分为3大类，分别为电压依赖性钾离子通道(voltage-dependent potassium channels)，内向整流钾离子通道(inwardly rectifying potassium channels，Kir)和双孔钾离子通道(two-pore domain potassium channel，2PK+)。
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1.2 内向整流钾离子通道 具有2个跨膜段和1个孔区，这2个跨膜结构域形成了孔道。Kir是由4个α亚基组成的同聚体或异聚体[2]。Kir负责当膜电位小于K+平衡电位时内向转运K+，从而使电流进入细胞比出细胞更容易。这种内向电流伴随着细胞外K+
浓度的增加而增加。它还可增加K+膜电导，有效地控制膜电位接近K+的平衡电位。值得注意的是Kir虽具有整流作用，但无电压依赖性[14]。Kir的门控特性不仅受到膜电位的影响也受到细胞外K+浓度的调节[13]。其最具确定意义的特点是可被细胞外Ba2+可逆性阻断。1.3 双孔钾离子通道 双孔钾离子通道是20世纪90年代发现的具有4个跨膜段和2个孔区的K+通道亚型。由于该通道无电压依赖性，可在静息电位时开放，故也被称为背景K+通道或漏流通道[4,14]。2PK+的表达分布非常广泛，与细胞增殖和细胞膜静息电位的关系密切。在成骨细胞中与在神经系统中的作用相似，调节静息电位和细胞电兴奋性。2PK+对机械作用敏感，与电压门控和Ca2+激活的K+通道配合，使细胞膜的复极化速率与机械作用的影响相偶联。2PK+还可作为机械信号转导下游通路信号[14]。2PK+对细胞膜的牵张、pH、温度等因素敏感，而对于传统K+通道阻断剂不敏感，但又能被前列腺素和cAMP阻断[15]
。
除此以外，最近还发现一类特殊的K+通道-EAG(ether
a go-go related)通道。传统观点认为K+通道通过控制膜电位，调节K+内流从而促进细胞的增殖，但EAG通道能够抑制细胞的增殖[16]。K+通道对成骨细胞的数量、形态和矿化等能力的影响是复杂的，在调节其生理活动过程中扮演了极为重要的角色。2 钙离子通道
Ca2+在成骨细胞中发挥了至关重要的作用。Ca2+的增
加可来自细胞外也可来自细胞内钙库释放。细胞内的钙库在成骨细胞是指内质网。为了了解成骨细胞中的Ca2+
稳态，要区分一个重要的概念，信号Ca2+和无机Ca2+。在细胞外的矿化作用中，无机Ca2+作为细胞内其他信号通路的下游被调控，和羟基磷灰石晶体一同沉积在蛋白质支架上。在第二信使作用中，信号Ca2+在激活细胞反应中起到基础作用。作为主要的细胞内离子，Ca2+
已经被证明和细胞内的许多功能相关，但更重要的是，Ca2+信号的微小变化可以在细胞中产生不同的信号通路，从而产生不同的作用。任何原因、任何形式的细胞内Ca2+长时程的增多都会引起细胞的死亡或凋亡[17]。成骨细胞膜片钳研究集中在2大类Ca2+通道，即电压敏感性钙离子通道(voltage-sensitive calcium channels，VSCC)和配基门控性钙离子通道(ligand-gated calcium channels)。
2.1 电压敏感性钙离子通道 电压敏感性钙离子通道是蛋白质复合体，可调节Ca2+内流等生理功能。根据通道的动力学和药理学特性，可以将VSCC超家族分为5个亚群： L，T，P，N和Q。其中L型是细胞中发现分布最广研究最透彻的Ca2+通道，其次是T型，而P、N和Q型少有报道[18-20]。VSCC是异质二聚体，由4个亚单位组成，分别是α1、α2、β和δ[21-22]。α亚单位组成通道的孔道，这个亚单
位由4个跨膜结构域组成，每个结构域又是由6穿膜结构组成[23]。α亚单位既有电压敏感的序列，也有二氢吡啶结合的序列。可认为α亚单位是产生通道活性的唯一亚单位，在其他亚单位缺失的情况下，α仍然可以发挥作用，但此时膜电流密度变低，电压激活更加缓慢[18,24]。分子克隆证明VSCC具有非常大的多态性，α亚基就由至少3个基因调控。根据α1亚基药理学和生理学功能的不同，VSCC可以分为以下两类，高电压激活型(L，P/Q，N和R亚型)和低电压激活型(T亚型)[25]。低电压激活的通道和高电压激活的通道在蛋白质水平序列的相似性＜25%，并且在功能特性上有着显著的差异[22]。其他辅助亚基，特别是β亚基，调节VSCC的门控特性和控制通道的装配和运输。β亚基可促进VSCC的正确折叠，并帮助其在细胞膜上定位。研究发现β亚基与和细胞膜链接的鸟苷酸激酶蛋白结构相似[26-28]。β亚基通过许多不同蛋白质的相互作用影响细胞间的信号转导。成骨细胞上有3种β亚基，其中β2亚基的密度最大，并起到主要作用[29]。δ亚基的分子量有24 kU和27 kU两种。
成骨细胞上表达的VSCC是可兴奋细胞上的特征性通道，但又很难引起钙诱导的钙释放现象，而此现象又是绝大多数可兴奋细胞的重要特征[30]。成骨细胞上VSCC表达与一般可兴奋细胞的最大不同在于其表达的数量要少得多。比如，成熟的横纹肌细胞上VSCC的数量是成骨细胞数十倍，VSCC数量上的不同也体现在mRNA水平[31]。推测成骨细胞可根据其功能需要的不同，表达出数量介于可兴奋细胞和不可兴奋细胞之间的VSCC。其功能是随着激素和机械刺激的影响，调节多种细胞外基质蛋白的分泌[32-33]。VSCC在成骨细胞乃至骨骼系统的生理作用中起到核心作用。
L型VSCC在细胞体外培养7 ~ 8 d后才能被检测出来，在1 ~ 2周时活性达到峰值。但如果用无血清的培养基来培养成骨细胞，L型的活性可更早出现。然而，T型在培养2 ~4 d后就可检出，而且活性在8 d后就减低或消失[34]。由此产生一个假设，T型在细胞分化的早期发挥作用，而L型和分化一直相关。L型是高电压激活且电流持续时间长，可被二氢吡啶特异性阻断。而T型能够在微小去极化的情况下被激活且很快失活，T型对二氢吡啶不敏感但可被Ni2+阻断，此为T型通道的主要特征[35]。
胞膜去极化、VD3、PTH和表皮生长因子可调节成骨细胞上VSCC的功能。VSCC的功能是根据Ca2+进入细胞的时空方式不同而改变。而Ca2+进入细胞的时空方式不同主要是因为细胞膜上表达不同亚型的VSCC，每种亚型都具有不同的激活和失活动力学特征、药理学特征和组织的分布特征[36]。
2.2 配基门控性钙离子通道 代谢型谷氨酸受体和离子型谷氨酸受体在成骨细胞上功能性表达。离子型谷氨酸受体作为谷氨酸门控型离子通道，它的激活可引起Ca2+内流。而代谢型谷氨酸受体可和G蛋白偶联，进而激活磷脂酶C合成二酰甘油和三磷酸盐，或被动地与腺核苷酸环化酶结合[37]。
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离子型受体根据激活受体的配体不同，可以将其分
为N-methyl-D-aspartate (NMDA)，a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid (AMPA)和Kainate (KA)等不同型别，研究主要集中在NMDA上[37-38]。
成骨细胞上离子型受体的激活引起细胞膜去极化和Ca2+内流，进而增加谷氨酸释放和激活第二信号通路，同时也会影响成骨细胞表型。离子型谷氨酸受体的阻断会使骨质合成减少，减缓成骨细胞的分化，降低骨基质蛋白的翻译，说明谷氨酸信号的调控可促进骨质形成[39]。3 问题与展望
综上所述，钾、钙离子通道通过调节成骨细胞的增殖和分化等功能影响骨组织的生长和发育，揭示了钾、钙离子通道，成骨细胞和骨质疏松的密切关系。成骨细胞上钾、钙离子通道的进一步研究将对理解和治疗骨质疏松有积极意义。参考文献
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