山东大学分子生物学实验报告论文
利用强启动子随机插入策略构建瑞氏木霉
纤维二糖水解酶Ⅱ高产菌株
学院年级：2012级泰山学堂生物取向
论文作者：赵杰瑞（学号[1**********]2）
同组成员：何硕楠 吴晓康 于诚慧
指导教师：钟耀华
利用强启动子随机插入策略构建瑞氏木霉
纤维二糖水解酶Ⅱ高产菌株
赵杰瑞，何硕楠，吴晓康，于诚慧
(泰山学堂，山东大学，济南，250100)
摘要 以瑞氏木霉（Trichoderma reesei）为代表的丝状真菌能够分泌大量的纤维素酶用以降解纤维素。本课题通过利用强启动子构建纤维二糖水解酶Ⅱ（CBH Ⅱ）表达盒，并运用随机插入策略转化入瑞氏木霉，可以得到CBH Ⅱ高表达的重组菌株，从而提高了CB HⅡ的产量和纤维素的降解效率。
关键词 瑞氏木霉 强启动子 纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）
Constructing CBHⅡ-high-yield Trichoderma reesei strains by using strategy of random insertion of strong promoters
Zhao Jierui, He Shuonan, Wu Xiaokang, Yu Chenghui
(Taishan College, Shandong University, Jinan, 250100, China)
Abstract Filamentous fungi represented by Trichoderma reesei can secrete abundant cellulose to degrade cellulose. Our project construct the expression cassette of cellobio-hydrolase Ⅱ(CBHⅡ) , using strong promoters, and then transform the cassette to Trichoderma reesei by using strategy of random insertion. This method can obtain CBHⅡ-high-yield recombinant strains and thus improves the yield of CBH Ⅱand the efficiency of cellulose degradation.
Key words Trichoderma reesei strong promoters cellobiohydrolase Ⅱ(CBHⅡ)
工业真菌瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是一种能利用多种碳源和氮源生长的腐生丝状真菌，具有产生多种初级和次级代谢产物的能力[1]，且具有高达40g/L的强大分泌能力[2]。在瑞氏木霉的分泌蛋白中，外切纤维素酶CBH Ⅰ和CBH Ⅱ占总分泌蛋白量的80%以上[3,4]。因而瑞氏木霉是生产纤维素酶的优秀菌株。
2
降解纤维素的酶类主要包括三大类：内切纤维素酶（EG ）水解纤维素内部的糖苷键，通过攻击纤维素中的无定形区来促进纤维素的降解，这为纤维二糖水解酶提供新的自由末端从而加速水解。外切纤维素酶即纤维二糖水解酶（CBH ）作用于链的两端，产物主要是纤维二糖。纤维二糖进一步被β-葡萄糖苷酶（BGL ）水解成葡萄糖。前人的研究发现，在瑞氏木霉中CB HⅡ和EG Ⅱ是主要的纤维素酶。因为瑞氏木霉的分泌蛋白中CBH Ⅱ含量很高，故本文采用强启动子随机插入策略构建CBH Ⅱ高产菌株，以研究其在降解纤维素的工业中应用的可能性。
本实验构建的表达盒以gpd 和rps 强启动子作为启动子。gpd 是常规的组成型启动子，而rps 是核糖体启动子，其表达谱比gpd 高10倍。通过将构建的表达盒转化入瑞氏木霉，经筛选和糖化实验可以得到CBHⅡ高表达的目的菌株。
1 材料与方法
1.1 表达盒与菌株构建
本实验构建的表达盒以gpd 和rps 作为启动子，CBH Ⅱ编码基因为目的基因，色氨酸终止子TtrpC 为终止子。潮霉素抗性基因hph 为用于筛选的抗性基因，没有hph 基因的转化子不能在加入潮霉素的培养基上生长。构建的表达盒转化进实验室已有的瑞氏木霉菌株QM9414中，经筛选后得到重组菌株。
1.2 表达盒DNA 片段扩增与连接
扩增与连接片段的引物见表1。
表1 PCR 扩增与连接使用的引物
3
1.2.1 PCR 扩增片段
PCR 扩增反应体系:
ddH 2O 14.4μl
10×Hifi buffer 2μl
10μM上游引物 1μl
10μM下游引物 1μl
模板DNA 1μl
2.5mM dNTPs 0.4μl
Hifi taq 0.2μl
总计 20μl
PCR 扩增反应条件：
94℃ 3min
94℃ 30s
56℃（hph 片段58℃）个循环
72℃ 90s （hph 片段2min48s ）
72℃ 10min
4℃保存
1.2.2 PCR （double joint PCR）连接片段
PCR 连接反应体系:
ddH 2O 15μl
10×Hifi buffer 2.5μl
2.5mM dNTPs 2μl
启动子片段:目的基因片段:终止子片段=1:2:1 10μl
Hifi taq 0.5μl
总计 30μl
PCR 连接反应条件：
4
94℃ 3min
94℃ 30s
58℃个循环
72℃ 3min42s
72℃ 10min
4℃保存
1.3 瑞氏木霉原生质体的制备及转化
1.3.1 瑞氏木霉原生质体的制备
取PDA 固体培养基，加热融化，准备16个无菌平板，在超净环境下倒平板，每板约10ml ，待凝。
提前准备好无菌玻璃纸（大小与平板一致），用镊子夹取放在PDA 上，重复加完，将提前洗好的瑞氏木霉孢子（提前一周用PDA 平板生孢）悬液取出，每板加入100μl孢子悬液，用涂布棒涂匀，尽量涂平。30℃培养12.5小时。
培养约12.5小时后取出平板镜检，观察是否在40×视野中菌丝占视野的1/3—2/3。配制两平板的裂解酶溶液，0.1g 酶溶解于20ml 溶液I （溶液配制见表2）中，在超净台中吹吸使酶溶解。用镊子小心将平板上的玻璃纸依次取下，放入酶液中洗涤干净（注意丢弃玻璃纸时尽量不要带去酶液），吹吸均匀。30℃下裂解90min 。
在裂解的90min 内倒制转化平板下层培养基（配制见表3），每个转化片段约需5-6个平板，每板20ml 左右，待凝。同时将转化用铁架台、移液枪所用物品置于超净台中，开紫外灭菌。取冰，提前打开4℃离心机。
裂解完成后在冰上进行过滤，滤前先用5ml 溶液Ⅰ润洗漏斗，接着用5ml 枪头(预先剪过) 吸取裂解菌体进行过滤。注意动作要轻，防止破坏原生质体。
4℃ 2500rpm离心10min ，取出，轻轻弃掉上清，加4ml 溶液Ⅱ（溶液配制见表2）轻轻重悬，4℃ 2500rpm 离心10min ，弃上清，用适量溶液Ⅱ重悬原生质体，镜检。
1.3.2 瑞氏木霉转化
配制转化体系：200μl原生质体、10μl纯化的表达盒DNA （浓度不小于1μg /μl）、5μl潮霉素片段和50μl溶液Ⅲ（溶液配制见表2）充分混匀1min30s 。在冰上孵
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育20min 后，加入2ml 溶液Ⅲ，室温放置5min 后，加入4ml 溶液Ⅱ轻轻混匀。
在转化体系的制备过程中，融化转化上培养基（配制见表3），冷却至稍不烫手时，向其中加入4.5‰潮霉素，并用5ml 移液枪将上述转化体系轻轻加入，混匀，迅速倒入下层培养基上，每板约10ml ，超净下待凝（打开风机），30℃培养3-4天观察转化情况。
表2 瑞氏木霉原生质体制备及转化使用溶液的配制
表3 转化培养基的配制
1.4 重组菌株的筛选与纯化
取转化3-4天后的转化平板，挑取转化子用复筛板（只含转化下培养基和潮霉素）复筛。仍能生长的转化子说明已转化入潮霉素片段，挑取菌丝至MM 液体
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培养基（配制见表4）中，200rpm 30℃摇菌2-3天，提染色体。用引物进行PCR 验证表达盒是否转入。用MM 固体培养基（加入潮霉素，配制见表4）将转入表达盒的转化子划线，纯化菌株并分单孢。挑出孢子，接入PDA 培养基生孢，挑取菌丝至MM 液体培养基中，200rpm 30℃摇菌2-3天，提染色体验证。
表4 MM培养基与产酶培养基的配制
1.5 重组菌株的总蛋白量和纤维素酶活测定
取纯化后的重组菌株（gpd 重组菌株g101和rps 重组菌株r-40）和对照菌株（QM9414）的孢子2×107个（用血球计数板计数）加入到MM 液体培养基中，30℃ 200rpm摇菌30—36小时后取10ml 加入到产酶培养基（配制见表4）中，取接菌后3天、5天、7天、9天的菌液，2000rpm 离心10min ，取上清即为酶液，分别测定酶液的如下各项数据，绘制曲线，研究重组菌株的产酶性能。
1.5.1 滤纸酶活法（FPA 法）测定总纤维素酶活
取25ml 刻度具塞试管，分别向四支管中加入预先准备的50mg 滤纸，加入
1.50ml 柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH4.8），加入酶液原液或用柠檬酸缓冲液稀释好的待测酶液0.50ml ，空白管不加酶液，混匀。将试管置于50℃水浴中，准确计时，反应60min ，取出。准确、迅速地向管中加入DNS 试剂3.0ml, 于对照的空白管中准确加入酶液原液或用柠檬酸缓冲液稀释好的待测酶液0.50ml ，将试管迅速同时放入沸水浴中，准确计时，加热10min ，取出，迅速冷却至室温，用
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水定容至25ml 。以空白管（对照液）为零点，在分光光度计波长540nm 下，用酶标管测定试管中液体的吸光度，每个酶液样品做两组实验组和两组对照组，取平均值，通过查标准曲线求出还原糖的含量。
1.5.2 羧甲基纤维素钠酶活法（CMC-Na 法）测定内切纤维素酶活
取25ml 刻度具塞试管，分别向四支管中加入2.00ml CMC-Na 液（2.000g CMC-Na 溶于300ml 柠檬酸缓冲液），加入酶液原液或用柠檬酸缓冲液稀释好的待测酶液0.50ml ，空白管不加酶液，混匀。将试管置于50℃水浴中，准确计时，反应30min ，取出。准确、迅速地向管中加入DNS 试剂3.0ml, 于于对照的空白管中准确加入酶液原液或用柠檬酸缓冲液稀释好的待测酶液0.50ml ，将试管迅速同时放入沸水浴中，准确计时，加热10min ，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25ml 。以空白管（对照液）为零点，在酶标仪波长540nm 下，用酶标管测定试管中液体的吸光度，每个酶液样品做一组实验组和一组对照组，通过查标准曲线求出还原糖的含量。
1.5.3 PNPC法测定CBH Ⅰ酶活
取100μl用柠檬酸缓冲液恰当稀释的待测酶液，加入50μlPNPC ，于50℃水浴反应30min ，准确计时，反应后迅速加入10% NaCO 3溶液150μl，对照组用100μl
柠檬酸缓冲液代替酶液。以对照组为零点，在酶标仪波长405nm 下，用酶标管测定反应后溶液的吸光度，每个酶液样品做三组实验组和三组对照组，通过查标准曲线计算CBH Ⅰ的酶活。
1.5.4 PNPG法测定β-葡萄糖苷酶（BGL ）酶活
取100μl用柠檬酸缓冲液恰当稀释的待测酶液，加入50μlPNPG ，于50℃水浴反应30min ，准确计时，反应后迅速加入10% NaCO 3溶液150μl，对照组用100μl
柠檬酸缓冲液代替酶液。以对照组为零点，在酶标仪波长405nm 下，用酶标管测定反应后溶液的吸光度，每个酶液样品做三组实验组和三组对照组，通过查标准曲线计算BGL 的酶活。
1.5.5 总蛋白量的测定
取20μl用PBS 缓冲液恰当稀释的待测酶液，加入200μl Bradford 试剂，室温下反应5min ，准确计时，对照组用PBS 缓冲液或蒸馏水代替酶液。以对照组为零点，在酶标仪波长595nm 下，用酶标管测定反应后溶液的吸光度，每个酶
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液样品做三组实验组和三组对照组，通过查标准曲线计算酶液中的总蛋白量。
2 结果与讨论
2.1 表达盒DNA 片段扩增与连接
如图1所示，经琼脂糖凝胶电泳验证，通过PCR 扩增，我们得到了构建表达盒的各DNA 片段。
图1 电泳验证PCR 片段扩增的结果
随后通过double joint PCR对各片段进行连接，再经PCR 片段扩增后，我们得到了需要构建的rps 和gpd 表达盒，如图2所示。
图2 回收胶后检验纯化的表达盒连接产物
2.2 瑞氏木霉原生质体的制备及转化
生长12.5小时的瑞氏木霉的菌丝（如图3A 所示）已达到原生质体的制备要求。通过制备原生质体，我们得到了用于转化的合适的瑞氏木霉QM9414菌株的原生质体（如图3B 所示）。
2.3 重组菌株的总蛋白量和纤维素酶活测定
2.3.1 滤纸酶活法（FPA 法）测定总纤维素酶活
如图4所示，通过测定菌种培养3天、5天、7天和9天的酶液总纤维素酶
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图3 生长12.5h 的瑞氏木霉的菌丝（A ）及制备的原生质体（B ）
活，可以发现转化入rps 和gpd 表达盒的菌株r-40和g101在培养3天后，其总纤维素酶活水平相比于对照的QM9414菌株QM1和QM2明显提高（第9天的g101酶活检测可能因取样问题导致检测的酶活下降），说明过表达CBH Ⅱ基因可以明显提高瑞氏木霉降解纤维素的效率。
在酶活检测过程中，可能因摇菌的孢子数没有保持一致，或操作过程中染菌，导致QM2菌株的酶活水平比QM1高，且QM2的其它检测实验的数据也有较大误差。 A B
图4 滤纸酶活法（FPA 法）测定总纤维素酶活
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2.3.2 羧甲基纤维素钠酶活法（CMC-Na 法）测定内切纤维素酶活
图5 羧甲基纤维素钠酶活法（CMC-Na 法）测定内切纤维素酶活
如图5所示，转入gpd 和rps 表达盒的菌株g101和r-40在接种后，其内切纤维素酶活相比对照菌株QM1明显提高(QM2对照因操作问题导致测量结果存在误差) ，特别是g101菌株在培养的第9天，酶活已达1.2490IU/mL，而QM1只有0.8051IU/mL。这表明通过过表达CBH Ⅱ基因可能会同时提高内切纤维素酶EG 降解纤维素的效率。
2.3.3 PNPC法测定CBH Ⅰ酶活
如图6所示，用PNPC 法测定CBH Ⅰ酶活后可以看出，g101和r-40菌株的C BHⅠ表达量较QM1菌株显著提高，在菌中培养的3-5天尤为明显。第5天r-40的CBH Ⅰ酶活（181.40IU/mL）接近QM1（66.26IU/mL）的3倍。实验结果显示通过过表达CBH Ⅱ基因可以同时提高CBH Ⅰ的表达，这与之前的研究结果一致。这说明在瑞氏木霉中，CBH Ⅰ和CBH Ⅱ基因之间可能存在协同的相互作用。
2.3.4 PNPG法测定β-葡萄糖苷酶（BGL ）酶活
如图7所示，除QM2菌株因操作问题导致测量误差过大而使数据没有参考意义外，QM1、g101和r-40菌株在培养第9天时BGL 的酶活水平基本一致，但在培养过程中，特别是第5天和第7天，g101和r-40菌株的BGL
表达水平要高于
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QM1菌株，但g101和r-40的BGL 表达水平都从第5天开始逐渐下降，可能说明从第5天开始，菌株的分泌蛋白中CBH 的比例越来越大而BGL 则越来越少。
图6 PNPC法测定CBH Ⅰ酶活
图7 PNPG法测定β-葡萄糖苷酶（BGL ）酶活
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2.3.5 总蛋白量的测定
图8 总蛋白量的测定
如图8所示，4种菌株的总蛋白量随着菌种培养天数的增加都是持续增加的，在菌种培养的第5天，g101和r-40菌株分泌的总蛋白量急剧提高，到第9天时分别达到712.8μg/mL和547.2μg/mL，而对照菌株QM1的分泌蛋白量则增加缓慢，到第9天只有347.7μg/mL。这说明通过用强启动子过表达CBH Ⅱ基因会显著提高分泌蛋白（CBH 占80%以上）的总量。
然而虽然rps 启动子的表达谱比gpd 强10倍，但在本次实验的各项检测中，并没有显示出r-40菌株相比g101菌株有显著的酶活水平提高。一方面这可能与实验操作（如孢子接种量、酶液制备等）不当有关，也可能gpd 和rps 在过表达CBH Ⅱ启动子方面没有显著差异，具体的原因还需要进一步实验研究。
3 感悟与展望
本实验成功构建了g101和r-40重组菌株，并通过初步的酶活检测可以发现重组菌株的纤维二糖水解酶产量显著提高，降解纤维素的效率也有增加。但一次的实验并不能说明实验结果，要进一步检测重组菌株的性能，
需要重复实验以及
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相关的其他实验验证。
通过本次分子生物学实验，我和同组成员不仅了解了分子生物学实验室常用的各种分子生物学技术，熟练地掌握了基本的分子生物学实验技能，更对科研工作以及日后的科研求学道路有了整体的认识。在实验过程中，实验操作的准确性对实验结果有着至关重要的影响，同时学好生命科学的基础理论知识又对实验有着极为重要的促进作用。在钟耀华老师实验室工作了一学期的时间，我基本了解了用瑞氏木霉以及其他丝状真菌研究纤维素酶的科研工作内容，并对其产生了极大兴趣。我深刻认识到降解纤维素对国家工业生产的重要意义以及分子生物学技术在工业上的应用会对社会产生巨大的经济效益。
通过一学期的实验，我们虽然没有做出完美的实验结果，但是通过实验时经历的各种失败以及获得的成果，我吸取了很多经验教训，并将其总结成一个完整的“故事”，这对我日后从事科研工作提供了非常宝贵的经历。
致谢
感谢山东大学生命科学学院北楼109实验室的钟耀华老师能为我们提供这样一个做科研工作的机会，感谢钟耀华老师和任美斌师姐对我们整个实验的悉心指导，特别感谢钟耀华老师对我们日后科研工作方向及发展路线的指导和教诲。感谢分子生物学实验室全体师兄师姐对我们实验中经历的各种问题的指导与帮助。
参考文献
[1]汪天虹, 吴静, 邹玉霞. 瑞氏木霉分子生物学研究进展[J]. 菌物系统, 2000, 19(1): 147-152.
[2]钟耀华, 王晓利, 汪天虹. 丝状真菌高效表达异源蛋白研究进展[J]. 生物工程学报, 2008, 24(4): 531-540.
[3]汪天虹等. 丝状真菌瑞氏木霉外源基因表达系统的构建[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2003, 19(6): 736-742.
[4]钟耀华, 钱远超, 任美斌, 汪天虹. 丝状真菌降解转化纤维素的机制与遗传改良前景[J]. 生物加工过程, 2014, 12(1): 48-54.
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山东大学分子生物学实验报告论文
利用强启动子随机插入策略构建瑞氏木霉
纤维二糖水解酶Ⅱ高产菌株
学院年级：2012级泰山学堂生物取向
论文作者：赵杰瑞（学号[1**********]2）
同组成员：何硕楠 吴晓康 于诚慧
指导教师：钟耀华
利用强启动子随机插入策略构建瑞氏木霉
纤维二糖水解酶Ⅱ高产菌株
赵杰瑞，何硕楠，吴晓康，于诚慧
(泰山学堂，山东大学，济南，250100)
摘要 以瑞氏木霉（Trichoderma reesei）为代表的丝状真菌能够分泌大量的纤维素酶用以降解纤维素。本课题通过利用强启动子构建纤维二糖水解酶Ⅱ（CBH Ⅱ）表达盒，并运用随机插入策略转化入瑞氏木霉，可以得到CBH Ⅱ高表达的重组菌株，从而提高了CB HⅡ的产量和纤维素的降解效率。
关键词 瑞氏木霉 强启动子 纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）
Constructing CBHⅡ-high-yield Trichoderma reesei strains by using strategy of random insertion of strong promoters
Zhao Jierui, He Shuonan, Wu Xiaokang, Yu Chenghui
(Taishan College, Shandong University, Jinan, 250100, China)
Abstract Filamentous fungi represented by Trichoderma reesei can secrete abundant cellulose to degrade cellulose. Our project construct the expression cassette of cellobio-hydrolase Ⅱ(CBHⅡ) , using strong promoters, and then transform the cassette to Trichoderma reesei by using strategy of random insertion. This method can obtain CBHⅡ-high-yield recombinant strains and thus improves the yield of CBH Ⅱand the efficiency of cellulose degradation.
Key words Trichoderma reesei strong promoters cellobiohydrolase Ⅱ(CBHⅡ)
工业真菌瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是一种能利用多种碳源和氮源生长的腐生丝状真菌，具有产生多种初级和次级代谢产物的能力[1]，且具有高达40g/L的强大分泌能力[2]。在瑞氏木霉的分泌蛋白中，外切纤维素酶CBH Ⅰ和CBH Ⅱ占总分泌蛋白量的80%以上[3,4]。因而瑞氏木霉是生产纤维素酶的优秀菌株。
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降解纤维素的酶类主要包括三大类：内切纤维素酶（EG ）水解纤维素内部的糖苷键，通过攻击纤维素中的无定形区来促进纤维素的降解，这为纤维二糖水解酶提供新的自由末端从而加速水解。外切纤维素酶即纤维二糖水解酶（CBH ）作用于链的两端，产物主要是纤维二糖。纤维二糖进一步被β-葡萄糖苷酶（BGL ）水解成葡萄糖。前人的研究发现，在瑞氏木霉中CB HⅡ和EG Ⅱ是主要的纤维素酶。因为瑞氏木霉的分泌蛋白中CBH Ⅱ含量很高，故本文采用强启动子随机插入策略构建CBH Ⅱ高产菌株，以研究其在降解纤维素的工业中应用的可能性。
本实验构建的表达盒以gpd 和rps 强启动子作为启动子。gpd 是常规的组成型启动子，而rps 是核糖体启动子，其表达谱比gpd 高10倍。通过将构建的表达盒转化入瑞氏木霉，经筛选和糖化实验可以得到CBHⅡ高表达的目的菌株。
1 材料与方法
1.1 表达盒与菌株构建
本实验构建的表达盒以gpd 和rps 作为启动子，CBH Ⅱ编码基因为目的基因，色氨酸终止子TtrpC 为终止子。潮霉素抗性基因hph 为用于筛选的抗性基因，没有hph 基因的转化子不能在加入潮霉素的培养基上生长。构建的表达盒转化进实验室已有的瑞氏木霉菌株QM9414中，经筛选后得到重组菌株。
1.2 表达盒DNA 片段扩增与连接
扩增与连接片段的引物见表1。
表1 PCR 扩增与连接使用的引物
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1.2.1 PCR 扩增片段
PCR 扩增反应体系:
ddH 2O 14.4μl
10×Hifi buffer 2μl
10μM上游引物 1μl
10μM下游引物 1μl
模板DNA 1μl
2.5mM dNTPs 0.4μl
Hifi taq 0.2μl
总计 20μl
PCR 扩增反应条件：
94℃ 3min
94℃ 30s
56℃（hph 片段58℃）个循环
72℃ 90s （hph 片段2min48s ）
72℃ 10min
4℃保存
1.2.2 PCR （double joint PCR）连接片段
PCR 连接反应体系:
ddH 2O 15μl
10×Hifi buffer 2.5μl
2.5mM dNTPs 2μl
启动子片段:目的基因片段:终止子片段=1:2:1 10μl
Hifi taq 0.5μl
总计 30μl
PCR 连接反应条件：
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94℃ 3min
94℃ 30s
58℃个循环
72℃ 3min42s
72℃ 10min
4℃保存
1.3 瑞氏木霉原生质体的制备及转化
1.3.1 瑞氏木霉原生质体的制备
取PDA 固体培养基，加热融化，准备16个无菌平板，在超净环境下倒平板，每板约10ml ，待凝。
提前准备好无菌玻璃纸（大小与平板一致），用镊子夹取放在PDA 上，重复加完，将提前洗好的瑞氏木霉孢子（提前一周用PDA 平板生孢）悬液取出，每板加入100μl孢子悬液，用涂布棒涂匀，尽量涂平。30℃培养12.5小时。
培养约12.5小时后取出平板镜检，观察是否在40×视野中菌丝占视野的1/3—2/3。配制两平板的裂解酶溶液，0.1g 酶溶解于20ml 溶液I （溶液配制见表2）中，在超净台中吹吸使酶溶解。用镊子小心将平板上的玻璃纸依次取下，放入酶液中洗涤干净（注意丢弃玻璃纸时尽量不要带去酶液），吹吸均匀。30℃下裂解90min 。
在裂解的90min 内倒制转化平板下层培养基（配制见表3），每个转化片段约需5-6个平板，每板20ml 左右，待凝。同时将转化用铁架台、移液枪所用物品置于超净台中，开紫外灭菌。取冰，提前打开4℃离心机。
裂解完成后在冰上进行过滤，滤前先用5ml 溶液Ⅰ润洗漏斗，接着用5ml 枪头(预先剪过) 吸取裂解菌体进行过滤。注意动作要轻，防止破坏原生质体。
4℃ 2500rpm离心10min ，取出，轻轻弃掉上清，加4ml 溶液Ⅱ（溶液配制见表2）轻轻重悬，4℃ 2500rpm 离心10min ，弃上清，用适量溶液Ⅱ重悬原生质体，镜检。
1.3.2 瑞氏木霉转化
配制转化体系：200μl原生质体、10μl纯化的表达盒DNA （浓度不小于1μg /μl）、5μl潮霉素片段和50μl溶液Ⅲ（溶液配制见表2）充分混匀1min30s 。在冰上孵
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育20min 后，加入2ml 溶液Ⅲ，室温放置5min 后，加入4ml 溶液Ⅱ轻轻混匀。
在转化体系的制备过程中，融化转化上培养基（配制见表3），冷却至稍不烫手时，向其中加入4.5‰潮霉素，并用5ml 移液枪将上述转化体系轻轻加入，混匀，迅速倒入下层培养基上，每板约10ml ，超净下待凝（打开风机），30℃培养3-4天观察转化情况。
表2 瑞氏木霉原生质体制备及转化使用溶液的配制
表3 转化培养基的配制
1.4 重组菌株的筛选与纯化
取转化3-4天后的转化平板，挑取转化子用复筛板（只含转化下培养基和潮霉素）复筛。仍能生长的转化子说明已转化入潮霉素片段，挑取菌丝至MM 液体
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培养基（配制见表4）中，200rpm 30℃摇菌2-3天，提染色体。用引物进行PCR 验证表达盒是否转入。用MM 固体培养基（加入潮霉素，配制见表4）将转入表达盒的转化子划线，纯化菌株并分单孢。挑出孢子，接入PDA 培养基生孢，挑取菌丝至MM 液体培养基中，200rpm 30℃摇菌2-3天，提染色体验证。
表4 MM培养基与产酶培养基的配制
1.5 重组菌株的总蛋白量和纤维素酶活测定
取纯化后的重组菌株（gpd 重组菌株g101和rps 重组菌株r-40）和对照菌株（QM9414）的孢子2×107个（用血球计数板计数）加入到MM 液体培养基中，30℃ 200rpm摇菌30—36小时后取10ml 加入到产酶培养基（配制见表4）中，取接菌后3天、5天、7天、9天的菌液，2000rpm 离心10min ，取上清即为酶液，分别测定酶液的如下各项数据，绘制曲线，研究重组菌株的产酶性能。
1.5.1 滤纸酶活法（FPA 法）测定总纤维素酶活
取25ml 刻度具塞试管，分别向四支管中加入预先准备的50mg 滤纸，加入
1.50ml 柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH4.8），加入酶液原液或用柠檬酸缓冲液稀释好的待测酶液0.50ml ，空白管不加酶液，混匀。将试管置于50℃水浴中，准确计时，反应60min ，取出。准确、迅速地向管中加入DNS 试剂3.0ml, 于对照的空白管中准确加入酶液原液或用柠檬酸缓冲液稀释好的待测酶液0.50ml ，将试管迅速同时放入沸水浴中，准确计时，加热10min ，取出，迅速冷却至室温，用
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水定容至25ml 。以空白管（对照液）为零点，在分光光度计波长540nm 下，用酶标管测定试管中液体的吸光度，每个酶液样品做两组实验组和两组对照组，取平均值，通过查标准曲线求出还原糖的含量。
1.5.2 羧甲基纤维素钠酶活法（CMC-Na 法）测定内切纤维素酶活
取25ml 刻度具塞试管，分别向四支管中加入2.00ml CMC-Na 液（2.000g CMC-Na 溶于300ml 柠檬酸缓冲液），加入酶液原液或用柠檬酸缓冲液稀释好的待测酶液0.50ml ，空白管不加酶液，混匀。将试管置于50℃水浴中，准确计时，反应30min ，取出。准确、迅速地向管中加入DNS 试剂3.0ml, 于于对照的空白管中准确加入酶液原液或用柠檬酸缓冲液稀释好的待测酶液0.50ml ，将试管迅速同时放入沸水浴中，准确计时，加热10min ，取出，迅速冷却至室温，用水定容至25ml 。以空白管（对照液）为零点，在酶标仪波长540nm 下，用酶标管测定试管中液体的吸光度，每个酶液样品做一组实验组和一组对照组，通过查标准曲线求出还原糖的含量。
1.5.3 PNPC法测定CBH Ⅰ酶活
取100μl用柠檬酸缓冲液恰当稀释的待测酶液，加入50μlPNPC ，于50℃水浴反应30min ，准确计时，反应后迅速加入10% NaCO 3溶液150μl，对照组用100μl
柠檬酸缓冲液代替酶液。以对照组为零点，在酶标仪波长405nm 下，用酶标管测定反应后溶液的吸光度，每个酶液样品做三组实验组和三组对照组，通过查标准曲线计算CBH Ⅰ的酶活。
1.5.4 PNPG法测定β-葡萄糖苷酶（BGL ）酶活
取100μl用柠檬酸缓冲液恰当稀释的待测酶液，加入50μlPNPG ，于50℃水浴反应30min ，准确计时，反应后迅速加入10% NaCO 3溶液150μl，对照组用100μl
柠檬酸缓冲液代替酶液。以对照组为零点，在酶标仪波长405nm 下，用酶标管测定反应后溶液的吸光度，每个酶液样品做三组实验组和三组对照组，通过查标准曲线计算BGL 的酶活。
1.5.5 总蛋白量的测定
取20μl用PBS 缓冲液恰当稀释的待测酶液，加入200μl Bradford 试剂，室温下反应5min ，准确计时，对照组用PBS 缓冲液或蒸馏水代替酶液。以对照组为零点，在酶标仪波长595nm 下，用酶标管测定反应后溶液的吸光度，每个酶
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液样品做三组实验组和三组对照组，通过查标准曲线计算酶液中的总蛋白量。
2 结果与讨论
2.1 表达盒DNA 片段扩增与连接
如图1所示，经琼脂糖凝胶电泳验证，通过PCR 扩增，我们得到了构建表达盒的各DNA 片段。
图1 电泳验证PCR 片段扩增的结果
随后通过double joint PCR对各片段进行连接，再经PCR 片段扩增后，我们得到了需要构建的rps 和gpd 表达盒，如图2所示。
图2 回收胶后检验纯化的表达盒连接产物
2.2 瑞氏木霉原生质体的制备及转化
生长12.5小时的瑞氏木霉的菌丝（如图3A 所示）已达到原生质体的制备要求。通过制备原生质体，我们得到了用于转化的合适的瑞氏木霉QM9414菌株的原生质体（如图3B 所示）。
2.3 重组菌株的总蛋白量和纤维素酶活测定
2.3.1 滤纸酶活法（FPA 法）测定总纤维素酶活
如图4所示，通过测定菌种培养3天、5天、7天和9天的酶液总纤维素酶
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图3 生长12.5h 的瑞氏木霉的菌丝（A ）及制备的原生质体（B ）
活，可以发现转化入rps 和gpd 表达盒的菌株r-40和g101在培养3天后，其总纤维素酶活水平相比于对照的QM9414菌株QM1和QM2明显提高（第9天的g101酶活检测可能因取样问题导致检测的酶活下降），说明过表达CBH Ⅱ基因可以明显提高瑞氏木霉降解纤维素的效率。
在酶活检测过程中，可能因摇菌的孢子数没有保持一致，或操作过程中染菌，导致QM2菌株的酶活水平比QM1高，且QM2的其它检测实验的数据也有较大误差。 A B
图4 滤纸酶活法（FPA 法）测定总纤维素酶活
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2.3.2 羧甲基纤维素钠酶活法（CMC-Na 法）测定内切纤维素酶活
图5 羧甲基纤维素钠酶活法（CMC-Na 法）测定内切纤维素酶活
如图5所示，转入gpd 和rps 表达盒的菌株g101和r-40在接种后，其内切纤维素酶活相比对照菌株QM1明显提高(QM2对照因操作问题导致测量结果存在误差) ，特别是g101菌株在培养的第9天，酶活已达1.2490IU/mL，而QM1只有0.8051IU/mL。这表明通过过表达CBH Ⅱ基因可能会同时提高内切纤维素酶EG 降解纤维素的效率。
2.3.3 PNPC法测定CBH Ⅰ酶活
如图6所示，用PNPC 法测定CBH Ⅰ酶活后可以看出，g101和r-40菌株的C BHⅠ表达量较QM1菌株显著提高，在菌中培养的3-5天尤为明显。第5天r-40的CBH Ⅰ酶活（181.40IU/mL）接近QM1（66.26IU/mL）的3倍。实验结果显示通过过表达CBH Ⅱ基因可以同时提高CBH Ⅰ的表达，这与之前的研究结果一致。这说明在瑞氏木霉中，CBH Ⅰ和CBH Ⅱ基因之间可能存在协同的相互作用。
2.3.4 PNPG法测定β-葡萄糖苷酶（BGL ）酶活
如图7所示，除QM2菌株因操作问题导致测量误差过大而使数据没有参考意义外，QM1、g101和r-40菌株在培养第9天时BGL 的酶活水平基本一致，但在培养过程中，特别是第5天和第7天，g101和r-40菌株的BGL
表达水平要高于
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QM1菌株，但g101和r-40的BGL 表达水平都从第5天开始逐渐下降，可能说明从第5天开始，菌株的分泌蛋白中CBH 的比例越来越大而BGL 则越来越少。
图6 PNPC法测定CBH Ⅰ酶活
图7 PNPG法测定β-葡萄糖苷酶（BGL ）酶活
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2.3.5 总蛋白量的测定
图8 总蛋白量的测定
如图8所示，4种菌株的总蛋白量随着菌种培养天数的增加都是持续增加的，在菌种培养的第5天，g101和r-40菌株分泌的总蛋白量急剧提高，到第9天时分别达到712.8μg/mL和547.2μg/mL，而对照菌株QM1的分泌蛋白量则增加缓慢，到第9天只有347.7μg/mL。这说明通过用强启动子过表达CBH Ⅱ基因会显著提高分泌蛋白（CBH 占80%以上）的总量。
然而虽然rps 启动子的表达谱比gpd 强10倍，但在本次实验的各项检测中，并没有显示出r-40菌株相比g101菌株有显著的酶活水平提高。一方面这可能与实验操作（如孢子接种量、酶液制备等）不当有关，也可能gpd 和rps 在过表达CBH Ⅱ启动子方面没有显著差异，具体的原因还需要进一步实验研究。
3 感悟与展望
本实验成功构建了g101和r-40重组菌株，并通过初步的酶活检测可以发现重组菌株的纤维二糖水解酶产量显著提高，降解纤维素的效率也有增加。但一次的实验并不能说明实验结果，要进一步检测重组菌株的性能，
需要重复实验以及
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相关的其他实验验证。
通过本次分子生物学实验，我和同组成员不仅了解了分子生物学实验室常用的各种分子生物学技术，熟练地掌握了基本的分子生物学实验技能，更对科研工作以及日后的科研求学道路有了整体的认识。在实验过程中，实验操作的准确性对实验结果有着至关重要的影响，同时学好生命科学的基础理论知识又对实验有着极为重要的促进作用。在钟耀华老师实验室工作了一学期的时间，我基本了解了用瑞氏木霉以及其他丝状真菌研究纤维素酶的科研工作内容，并对其产生了极大兴趣。我深刻认识到降解纤维素对国家工业生产的重要意义以及分子生物学技术在工业上的应用会对社会产生巨大的经济效益。
通过一学期的实验，我们虽然没有做出完美的实验结果，但是通过实验时经历的各种失败以及获得的成果，我吸取了很多经验教训，并将其总结成一个完整的“故事”，这对我日后从事科研工作提供了非常宝贵的经历。
致谢
感谢山东大学生命科学学院北楼109实验室的钟耀华老师能为我们提供这样一个做科研工作的机会，感谢钟耀华老师和任美斌师姐对我们整个实验的悉心指导，特别感谢钟耀华老师对我们日后科研工作方向及发展路线的指导和教诲。感谢分子生物学实验室全体师兄师姐对我们实验中经历的各种问题的指导与帮助。
参考文献
[1]汪天虹, 吴静, 邹玉霞. 瑞氏木霉分子生物学研究进展[J]. 菌物系统, 2000, 19(1): 147-152.
[2]钟耀华, 王晓利, 汪天虹. 丝状真菌高效表达异源蛋白研究进展[J]. 生物工程学报, 2008, 24(4): 531-540.
[3]汪天虹等. 丝状真菌瑞氏木霉外源基因表达系统的构建[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2003, 19(6): 736-742.
[4]钟耀华, 钱远超, 任美斌, 汪天虹. 丝状真菌降解转化纤维素的机制与遗传改良前景[J]. 生物加工过程, 2014, 12(1): 48-54.
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