固定化酶制备及酶活力测定
实验者：张玲玲 绿药1班 [1**********]6 同组者：金雨馨、管青青
实验日期：2015/3/13 报告完成日期：2015/3/20
实验指导：易喻
摘要：酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的
催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。
关键词：固定化酶 酶活力 包埋法
Abstract：Enzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity.
前言：酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区
域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。 测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。
正文：
1.实验过程
1.1试剂与仪器
1.1.1试剂
①海藻酸钠、3.0%氯化钙 ②碱性蛋白酶（1.0mg/mL） ③福林试剂
④1%酪蛋白溶液 ⑤PH10缓冲液 ⑥标准酪氨酸溶液
⑦0.4mol/L碳酸钠溶液，0.4mol/L三氯醋酸溶液 1.1.2仪器 ①磁力搅拌器 ②恒温水浴锅 ③注射器
④烧杯（100mL,500mL） ⑤布氏漏斗 ⑥分析天平 ⑦容量瓶 ⑧移液管
⑨721分光光度计
1.2操作步骤
1.2.1酶的固定化
称取1.00g海藻酸钠于盛有30mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷却至38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20mL。
用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200mL3.0％氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤2-3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。 1.2.1酶活力的测定
1.2.1.1制备酪氨酸标准曲线
(1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（见下表） (2) 在上述7支试管中，分别加入，于40℃水浴中保温15 min，取出后，加入0.4 mol/L三氯醋酸3 mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。 (3)分别吸取滤液1mL放入另7支试管中，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL蒸馏水，充分摇匀。 (4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm处测定光密度。 (5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
试管编号
0 1 2 3 4 5 6
酪氨酸含量 （μg ）
0 100 200 300 400 500 600
1㎎/mL酪氨酸 标准溶液（mL）
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
蒸馏水 ( mL ) 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4
1.2.2固定化酶活力测定
上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10缓冲液的三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40℃水浴保温15min后，取3 mL置于试管中，加3 mL
三氯醋酸溶液。对照管为1 mL缓冲液＋1 mL蛋白酶液＋3 mL三氯醋酸溶液＋1 mL 1%酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40℃水浴保温15min。
摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1mL，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂1 mL，充分摇匀，于40℃水浴保温15min，然后每管各加入3 mL蒸馏水，摇匀。用721型分光光度计在波长680 nm处，以对照管为对照，测定吸光值。
2.结果与讨论
2.1结果
2.1.1酪氨酸标准曲线的绘制
表2-1酪氨酸含量与吸光度关系表
舍去与拟合直线差距较大的点（500,0.563），再次拟合，得到的标准曲线线性较好。
y=0.001x+0.0051
2.1.2酶活力的测定
本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：
1克碱性蛋白酶粉在pH 10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位（U）。
本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算： 每克碱性蛋白酶的活力单位 = m / t ×f
m： 样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg）； t： 酶促反应的时间（15 min）；
f： 酶的稀释倍数，本实验中f = 1000
表2-4固定酶与游离酶活力的测定比较表
2.2讨论
2.2.1标准曲线的分析
2
图2-2为将实验测得的六组数据绘制的标准曲线，拟合得到的R＜0.99，线性关系不是很理想，因此舍去了偏离直线较远的点（500，0.563）,得到图2-3，线性关系良好。部分数据与直线偏离较远，可能是由于比色皿没有洗干净,水浴保温时每管的水浴时间不一样等其它原因。标准曲线是为了计算酪氨酸含量的，标准曲线越标准，计算出来的数据才有意义，如果线性不好的话，会对结果造成影响。
2.2.2酶活力的分析
表2-4为酶活力的测定以及比较。由表中数据分析得：固定酶的酶活力要低于游离酶的酶活力，说明在酶固定的过程中有部分酶的损失。并且从表中可发现相同酶的两组OD值还是有差距的，尤其是游离酶的两组实验数据的差距比较大，可能是在实验的过程中保温时间控制的不好，没有及时加入三氯醋酸。实验结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。
3.注意事项与心得总结
3.1注意事项
①酶液与加热溶解的海藻酸钠混合时，海藻酸钠溶液一定要冷却至40℃以下后再加入酶液，以免高温导致碱性蛋白酶酶失活。
②固定化酶颗粒制备中，海藻酸钠－酶混合物向CaCl2溶液滴加的速度不要过快，混合物要呈颗粒进入CaCl2溶液，以免形成念珠状颗粒。
③在制备酶活力测定的空白对照时要先加入三氯醋酸使酶失活，再加入酪蛋白溶液，顺序不可以颠倒。
④在酶活力测定是要严格控制水浴保温的时间一致，控制变量，减少实验误差。
3.2心得总结
本实验通过包埋法进行了固定化酶的制备及固定酶与游离酶的酶活力比较，发现固定酶虽然能够增强酶的稳定性，便于酶和底物的分离，但是会造成酶量的损失，使酶活力降低。所以需要寻求一种能提高酶结合率的固定方法。本实验仅单纯的对游离酶和固定酶的酶活进行了比较，还可以设计系列实验对固定酶的其它性质如最适温度，最适PH等进行研究。
致谢：感谢队友们的合作以及易喻老师的耐心指导！
参考文献：
[1]固定化酶的制备及应用 [期刊论文] 李彦锋, 李军荣, 伏莲娣, LI Yan-feng, Li Jun-rong, FU Lian-di - 《高分子通报》2001年2期
[2]黑曲霉果胶酯酶固定化前后酶学性质比较研究 [期刊论文] 张庆坤, LEI Ji, 付亚敏, FAN Yang, 刘刚, ZHANG Qing-kun, LEI Ji, FU Ya-min, FAN Yang, LIU Gang - 《食品工业科技》2008年7期
固定化酶制备及酶活力测定
实验者：张玲玲 绿药1班 [1**********]6 同组者：金雨馨、管青青
实验日期：2015/3/13 报告完成日期：2015/3/20
实验指导：易喻
摘要：酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的
催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。
关键词：固定化酶 酶活力 包埋法
Abstract：Enzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity.
前言：酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区
域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。 测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。
正文：
1.实验过程
1.1试剂与仪器
1.1.1试剂
①海藻酸钠、3.0%氯化钙 ②碱性蛋白酶（1.0mg/mL） ③福林试剂
④1%酪蛋白溶液 ⑤PH10缓冲液 ⑥标准酪氨酸溶液
⑦0.4mol/L碳酸钠溶液，0.4mol/L三氯醋酸溶液 1.1.2仪器 ①磁力搅拌器 ②恒温水浴锅 ③注射器
④烧杯（100mL,500mL） ⑤布氏漏斗 ⑥分析天平 ⑦容量瓶 ⑧移液管
⑨721分光光度计
1.2操作步骤
1.2.1酶的固定化
称取1.00g海藻酸钠于盛有30mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷却至38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20mL。
用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200mL3.0％氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤2-3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。 1.2.1酶活力的测定
1.2.1.1制备酪氨酸标准曲线
(1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（见下表） (2) 在上述7支试管中，分别加入，于40℃水浴中保温15 min，取出后，加入0.4 mol/L三氯醋酸3 mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。 (3)分别吸取滤液1mL放入另7支试管中，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL蒸馏水，充分摇匀。 (4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm处测定光密度。 (5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
试管编号
0 1 2 3 4 5 6
酪氨酸含量 （μg ）
0 100 200 300 400 500 600
1㎎/mL酪氨酸 标准溶液（mL）
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
蒸馏水 ( mL ) 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4
1.2.2固定化酶活力测定
上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10缓冲液的三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40℃水浴保温15min后，取3 mL置于试管中，加3 mL
三氯醋酸溶液。对照管为1 mL缓冲液＋1 mL蛋白酶液＋3 mL三氯醋酸溶液＋1 mL 1%酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40℃水浴保温15min。
摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1mL，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试剂1 mL，充分摇匀，于40℃水浴保温15min，然后每管各加入3 mL蒸馏水，摇匀。用721型分光光度计在波长680 nm处，以对照管为对照，测定吸光值。
2.结果与讨论
2.1结果
2.1.1酪氨酸标准曲线的绘制
表2-1酪氨酸含量与吸光度关系表
舍去与拟合直线差距较大的点（500,0.563），再次拟合，得到的标准曲线线性较好。
y=0.001x+0.0051
2.1.2酶活力的测定
本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：
1克碱性蛋白酶粉在pH 10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位（U）。
本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算： 每克碱性蛋白酶的活力单位 = m / t ×f
m： 样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg）； t： 酶促反应的时间（15 min）；
f： 酶的稀释倍数，本实验中f = 1000
表2-4固定酶与游离酶活力的测定比较表
2.2讨论
2.2.1标准曲线的分析
2
图2-2为将实验测得的六组数据绘制的标准曲线，拟合得到的R＜0.99，线性关系不是很理想，因此舍去了偏离直线较远的点（500，0.563）,得到图2-3，线性关系良好。部分数据与直线偏离较远，可能是由于比色皿没有洗干净,水浴保温时每管的水浴时间不一样等其它原因。标准曲线是为了计算酪氨酸含量的，标准曲线越标准，计算出来的数据才有意义，如果线性不好的话，会对结果造成影响。
2.2.2酶活力的分析
表2-4为酶活力的测定以及比较。由表中数据分析得：固定酶的酶活力要低于游离酶的酶活力，说明在酶固定的过程中有部分酶的损失。并且从表中可发现相同酶的两组OD值还是有差距的，尤其是游离酶的两组实验数据的差距比较大，可能是在实验的过程中保温时间控制的不好，没有及时加入三氯醋酸。实验结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。
3.注意事项与心得总结
3.1注意事项
①酶液与加热溶解的海藻酸钠混合时，海藻酸钠溶液一定要冷却至40℃以下后再加入酶液，以免高温导致碱性蛋白酶酶失活。
②固定化酶颗粒制备中，海藻酸钠－酶混合物向CaCl2溶液滴加的速度不要过快，混合物要呈颗粒进入CaCl2溶液，以免形成念珠状颗粒。
③在制备酶活力测定的空白对照时要先加入三氯醋酸使酶失活，再加入酪蛋白溶液，顺序不可以颠倒。
④在酶活力测定是要严格控制水浴保温的时间一致，控制变量，减少实验误差。
3.2心得总结
本实验通过包埋法进行了固定化酶的制备及固定酶与游离酶的酶活力比较，发现固定酶虽然能够增强酶的稳定性，便于酶和底物的分离，但是会造成酶量的损失，使酶活力降低。所以需要寻求一种能提高酶结合率的固定方法。本实验仅单纯的对游离酶和固定酶的酶活进行了比较，还可以设计系列实验对固定酶的其它性质如最适温度，最适PH等进行研究。
致谢：感谢队友们的合作以及易喻老师的耐心指导！
参考文献：
[1]固定化酶的制备及应用 [期刊论文] 李彦锋, 李军荣, 伏莲娣, LI Yan-feng, Li Jun-rong, FU Lian-di - 《高分子通报》2001年2期
[2]黑曲霉果胶酯酶固定化前后酶学性质比较研究 [期刊论文] 张庆坤, LEI Ji, 付亚敏, FAN Yang, 刘刚, ZHANG Qing-kun, LEI Ji, FU Ya-min, FAN Yang, LIU Gang - 《食品工业科技》2008年7期