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黑龙江医药科学
4&&5年#&月第40卷第$期
分子诊断的策略
吕学诜
佳木斯大学" 黑龙江佳木斯#! $%&&’(
摘要) 分子诊断是以*通过检查人体内源基因或外源! 病原体(基因的存在-缺陷或+, -. +, 或蛋白质分子为诊断材料" 表达异常" 对人体状态或疾病作出特异性诊断的方法和过程/本文从0个方面阐述了分子诊断的策略/把握分子诊断的策略有也有利于进一步发挥分子诊断在临床医学中的作用" 更有利于明确分子诊断学的发展利于巩固目前分子诊断学的研究成果" 方向/
关键词) 分子诊断1*+, 1. +,
中图分类号) %%文献标识码) #&&23&#&%! 4&&5(&$3&&%53&6. , 文章编号) 分子诊断! 是以*诊断/因此" 这类疾病的基因诊断应用性极强" 在严格掌握质(789:; ? @=A B 8C @C +, -. +, 或蛋白质分子为诊断材料" 通过检查人体内源基因或外源! 病原体(基因的存在-缺陷或表达异常" 对人体状态或疾病作出特异蛋性诊断的方法和过程/随着人类基因组计划和后基因组! 白质组(计划的实施" 分子诊断学得到了进一步的完善和成使实验室诊断已经远远熟/分子生物学与现代医学的结合"
超出了单纯辅助临床诊断的范围" 在疾病的预防-预后的判健康状况的评价以及疾病预测等领域" 正断和疗效的监测-发挥着越来越大的作用/可以毫不夸张地说) 分子诊断是具有划时代意义的检测手段" 必将对医学的发展产生重大影现在分子诊断已经成为衡量一个国家和地区整体医疗水响/
平的重要指标/此时" 慎密地思考-分析和总结一下分子诊断有利于巩的基本策略是至关重要的/把握分子诊断的策略" 也有利于进一步发挥分子诊固目前分子诊断学的研究成果"
断在临床医学中的作用" 更有利于明确分子诊断学的发展方向/
#分子诊断必须遵循实验诊断学的基本原则
医学诊断学是研究诊断疾病的基本原则和方法的科学" 作为实验室诊断的一个新的分支DD 分子诊断也应该时时即在实验室内对人体的送检材遵循实验诊断学的基本原则/
料! 包括*进行检测分析" 从而对疾病的+, -. +, 和蛋白质(病因-病原-病情等做出鉴别-认定和解释" 为临床医生准确分析病情-探讨疾病的发生和发展提供验证临床印象诊断-虽然" 分子诊断还被运用到耐药性的检测-疗效客观的依据/
监控-卫生防疫-健康检查-疾病预测和个体化治疗等方面" 但是" 分子诊断仍然要遵循上述实验诊断学的基本原则/分子诊断技术的开发" 蕴藏着巨大的商机" 因此" 为了安全-有效和合法开展分子诊断的研究及应用" 还应积极实施专利法/
采用不同的分子4针对不同类型的疾病及其可能的病因" 诊断策略和方法
病毒-支原体-衣原体-寄生虫等感染性疾病是由细菌-病原体侵入机体而引起的" 以前对于这些病原体多采用微生物学-免疫学和血液学相关手段进行检测" 但是这些方法受不易早期诊断/随着各种病原体基灵敏度和特异性的限制"
因结构的阐明" 利用分子诊断技术早期-快速-敏感-特异地成为可能/应用分子检测感染性病原体本身! . +, 或*+, (
不仅可以对微生物感染做出技术直接测定这些病原体基因"
确诊" 也能诊断出带菌! 毒(者或潜在性感染" 还可以对感染对于感染性疾病的性病原体进行分型和耐药性监测/因此"
分子诊断检测对象主要包括感染性病毒-细菌-寄生虫-支原体-衣原体等在人体内存在的外源性生物*从原+, 或. +, /这类检测一般根据已知外源*采理上讲" +, 或. +, 顺序" 用E 简便而准确的F . 或. G 3E F . 的方法就可以进行快速-控的前提下" 可在临床广泛运用/其诊断策略可以分为以下
两种) 一是一般性检出策略" 即只需要提供是否有某种病原体的感染1二是完整检出策略" 即不仅对病原体做出诊断" 还要进行分型! 包括亚型(和耐药性方面的检测/所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变有关" 对遗传性疾病进行分子诊断有两种策略可供选择) 疾病基因突变H 直接诊断策略!
即直接揭示导致遗传性疾病发生的各种的*" +, 序列分析(遗传缺陷1除了疾病基因突变的*I 间接诊断策略! +, 序列
即在先证者中确定具有遗传缺分析以外的其他诊断方法("
陷的染色体-相关基因的等位基因型和单倍体型等" 然后在相关基该家系其他成员中寻找被检者是否也有这条染色体-因的等位基因型和单倍体型等/此外" 根据遗传病风险评估"
开展产前基因! 直接或间接(诊断是预防遗传病-控制人口质量的好办法/导致恶性肿瘤发生的原因" 有内源性和外源性两种因素/内源性因素" 是机体内部结构和功能的改变" 如遗传-免疫缺陷-代谢异常等1外源性因素" 是指自然界中各种
致癌因素" 即环境因素/肿瘤的发生发展是多因素相互协同的结果" 而基因水平的异常是其中关键的原因" 因此" 从这个意义上说" 肿瘤是一种基因性疾病/目前肿瘤的分子诊断可以采取三种策略) H 检测肿瘤相关基因1I 检测肿瘤相关病毒的基因1实质上" 提供肿瘤相关基因的J 检测肿瘤标志物/信息可以归为直接诊断" 而针对肿瘤相关病毒基因或肿瘤标志物进行检测则主要属于间接诊断/
6根据基因检测的目的开展不同层次的分子诊断
分子诊断的基本策略是与疾病产生的原因密切联系的/人类疾病的原因包括内因和外因两大类" 内因主要指遗传因素" 如基因结构-基因表达状况的改变" 其中基因结构的改变包括点突变-插入-缺失-重排-易位-基因结构多态性变异-前病毒插入等1外因是指外在的环境因素" 如生活方式-工作环境-精神状况和各种感染性病原体的侵入等/根据基因诊断的目的" 有五种基本方法可供选择/6K #染色体分析
可对大片段*+, 检测除了用传统细胞遗传学技术外" 用更为先进的染色体分析技术" 例如荧光原位杂交! " L 9:C ; :B ; :@B C @M @? @Q =M @8B R S T U (技术" 用黏粒
细菌人工染色体! ! (-" ; 8C 7@? P =; M :>@=9=>M @L @; @=9; N >878C 87:C 或酵母人工染色体! (" V , F O :=C M=>M @L @; @=9; N >878C 87:C 作为探针则能够得到非常稳定的杂交效果/而比较基(W , F
因组杂交! 技术可" ; 87X =>=M @Y :A:B 87@;N O P >@? @Q =M @8B F Z U (以部分弥补上述技术的缺陷" 克服它所提供的信息仅限于探针所覆盖的区域/6K 4*+, 含量测定
*+, 含量测定也是*+, 分析的一项内容/携带多种基
, *\\U &, *H $-, @X F G ; Y $) Z G %$) TF #G 5G $F%$#4X %6T%5[Y Q /]-B 因! 包括调控生长和凋亡的基因" 异常改变的细胞常常含异常数量的核#这可以用流式细胞术检测’相对于正常细$%&胞的#可能提示某条染色体增加&#$%指数" $%含量变化! 或丢失! 非整倍体" 或额外的整套染色体! 多倍体" 的存在’&此外&组织的细胞#$%含量谱可反映细胞周期(与) *期细胞的比例&在某些肿瘤中! 如乳腺癌" 如果该比例高则提示较差的预后’
+, +基因突变的检测
如果致病基因的某种突变与发病具有直接的因果关系&检测这种基因突变作诊断依据是最理想的’对致病基因已经完全了解或部分了解&分子机制完全清楚或部分清楚但已有规律可循的&直接检测和分析突变是分子诊断最有力和最准V 9W V
的片段缺失通常用(-. /0123印迹杂交分析或456检测’9环境基因组研究成果是分子诊断的重要基础
营养状况7年龄7各种环境和个人类的许多疾病与遗传7
体发育时段等因素有关&对于大多数慢性疾病而言&只有阐才有可能对其病因学有彻明其遗传基础与环境因素的贡献&
底的了解’人们越来越深刻地认识到遗传背景是显著影响疾病易感性的重要因素&尤其是环境诱发的慢性疾病如肿瘤7哮喘7糖尿病7心血管病和神经退行性疾病与遗传因素密切从结构与功能上充分认识不同个体环境相关疾相关’因此&
寻找相关易感基因&是现代病的易感性与遗传背景的差异&
分子医学面临的极大挑战’=H H I 年启动了环境基因组计划是全球第一个以遗传! &" F ) 413J K 2-3L 13/M B N 13-L 1O 2-P 1Q /
确的方法’由于一种基因可以有不同突变类型&故有必要对被检测个体制定一个合理方便的策略’通常#$%大片段的缺失往往涉及多个基因而导致多种临床表型混合存在’因此&对较大的片段缺失除了染色体分析外&通常用(-. /0123印迹杂交分析或456检测’小片段的插入和缺失7点突变的检测&主要是因为致病基因可在任何位点上产生突变&使同一疾病有不同的突变类型&由于456技术的出现&利用已知基因序列设计引物&直接检测所观察对象的有无已变得非常方便’而运用456结合单链构象多态性的分析方法!
4568((54" 则能灵敏地检测单个点突变’基因突变检测虽然有直接的优点&但由于目前大多数致病基因并未克隆出来&有些致病基因虽知其染色体上的大概位置&但对其确切基因结构和分子机制却知之甚少’因此&许多疾病不能采用突变检测途径’
+, 9基因连锁分析
由于同一染色体上相邻近的基因一起被遗传而相互存在连锁关系&对于还没有被鉴定但是至少被定位于特定染色体区域的致病基因应该进行连锁分析’只要鉴定与致病基因相连锁的有关基因的存在与否&就可以判断受检者是否带有致病基因’可以采用分子多态标记追踪的方法在一个家族中进行突变等位基因的分离’这类分析不仅要收集先证者的#$%样品&
而且还要收集两至三代中受累和未受累的家族成员的#$%样品’为了能够将因为交换而产生的错误结果减少到最小&多态标志距离致病基因必须足够近! 或者位于基因之内" ’经典的连锁分析主要使用限制性片段长度多态性! 6:; 4" 为遗传标志&进行家系分析’近年来&(&因此#$%标记的连锁分析通常是可靠的’为了确保连锁分析基因诊断的正确性&需要在检测基因或位点附近两侧寻找*?+个遗传标志&这样就可以通过单体型分析&防止由于重组而造成的偏差’+, @检测基因表达状态
分子诊断不仅可以检测基因的结构异常&而且可以检测基因表达状态&而基因表达状况改变则包括转录产物的结构或表达量的异常’
也就是说&除了直接检测基因外&还可以选择6$%为材料&利用逆转录4567实时荧光定量456
7$-2/01238A B -/7基因芯片等技术检测基因表达是否异常C 也可以选择蛋白质为材料&利用D1E /1238A B -/7蛋白组织化学染色7F ; G (%和蛋白质芯片等技术检测基因表达是否异常’通常#$%大片段的缺失往往涉及多个基因而导致多种临床表型混合存在&除了可用细胞遗传学或染色体分析外&较大
多态性为切入点的大规模人类功能基因组学系统研究&可以说是第二代人类基因组计划’按照F ) 4的安排&人类基因的再测序7功能变异分析和动物模型构建的三个阶段与分子诊断一样均要依赖于高通量分子检测手段&而F ) 4的成果势必成为分子诊断的重要基础’所以&必须加强F ) 4与分子诊断的关连和相互配合&分子诊断要随时吸取F ) 4的研究成果’@充分发挥分子诊断在克服耐药性治疗和研究中不可替代的作用
耐药性! 21E K E /M 3Q 1" 又称抗药性&是微生物对抗微生物药物的相对抗性’耐药性分为R 固有耐药性7获得耐药性7多重耐药性以及交叉耐药性’科学家们发现细菌对抗菌药物耐药&
可能是自发的&也可能是通过突变&突变是发生在细菌基因上的变化’这类变化让细菌获得对抗抗菌药物的能力&使抗菌药物活性减弱&
甚至失活’而更重要的是耐药菌能够通过繁殖&
把耐药基因不仅可垂直传给子代&还可在不同微生物的种属间进行水平传播&使多种细菌对不同类的抗菌药物产生多重耐药&从而给临床治疗带来重重困难’尽管影响细菌耐药性的因素很多&避免细菌耐药是一个十分复杂的问题&
但是&无论是在微生物耐药性机制的研究中&还是在维持抗菌药物的有用性和开发新抗菌药物的研究中&克服微生物耐药性的临床治疗中都需要利用分子诊断技术作出及时的检测’
同理&尽管肿瘤耐药性的发生机制十分复杂&至今还未了解其本质’但是&大家比较公认是&化疗失败主要与癌细胞对化疗药物具有或产生了耐药性或多药耐药性! L . B /K O B 1S 2. N21E K E /M 3Q 1&T#6" 有关&现已发现了多种与T#6相关的
分子或基因’毫无疑问&
要想在肿瘤耐药性的研究中有所突破&必须充分发挥分子诊断的不可替代的作用’
U 发挥分子诊断在疾病预测7
预防和个体化治疗中的作用由于基因的个体差异&每个人对某种食物的反应是不一样的&
这就会造成人们吃同一种食物但出现的后果却可能有很大差别’营养基因组学是研究营养摄入和人类独特遗传密码的关系的科学&是生物技术7基因组学7医学和营养学等领域的专家共同研究创造的新的健康研究领域’基因检测是一种预防医学手段&
在健康检查中通过基因检测&可以提早发现某个体是否携带某些易感基因型&是否容易得老年痴呆症7心血管疾病7癌症等&然后选择不同的药物进行个性化医疗’
有些医院或基因公司开始在健康检查中为顾客提供疾病风险预测! 包括多基因遗传疾病和肿瘤类疾病" 7临床药物适治性预测或营养基因检测’现代医学除了注重预防和传统治疗外&正向着安全有效和药物的经济治疗方向发展’药物基因组学! 40M 2L M Q -N 13-L K Q E " 是研究基因突变与药效关系&从基因入手设计药物治疗方案的研究&为临床个体化用药开辟了一个新的途径’药物基因组学不是研究疾病的遗传因素&而是探讨药物作用的遗传分布&以满足临床需要’遗传多样
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性对个体差异! 临床症状的长短" 费用和临床治疗的疗效等有决定性作用#药物基因组学要求药物的生产考虑到药物投放地区人群中有关的等位基因的频率! 医疗处方也将因人而药物基因组学研究的主要策略包括选择药异而趋向个人化#
物起效" 活化" 排泄等相关过程的候选基因进行研究! 鉴定基因序列的变异#这些变异既可以在生化水平进行研究! 估计也可以在人群中进行研究! 用统它们在药物作用中的意义!
计学原理分析基因突变与药效的关系#从以上分析可以看出! 分子诊断在疾病预测" 预防和个体化治疗中的作用将越来越重要#
快速" 准确" 无仪器化的分子检测方法$极力开发简单"
现代医学的检验实验室无论是独立存在的! 还是作为医都是一个拥有大量高新复杂仪器疗保健单位中的一个部门!
设备的实体部门! 而且都配备训练有素的专业技术人员! 这物力的设置! 体现了现代医学检验实验室运作中的些人力"
也说明了现代医学检验在医学实践中的重复杂性和精密性#
要作用#但是! 大量高新复杂仪器设备和专业技术人员的配置! 无形中也给患者增加了沉重的经济负担#世界卫生组织生物伦理合作中心%&’() *+, -) . /0(1-234-. 3’2
的调查报告指出? 的5’) ) -6’(-. 3215, 2. , (7’(83’, . /39:医疗研究资金只用于解决世界人口中@>? 的人的健康问题#近年来生物技术研究成果与日俱增! 而且广泛应用于医学实践! 可是! 大多数生物技术研究都以发达国家为优先! 只有为数不多的几项研究成果已证明! 可以用于改善发展中国家的根据专家委员会投票决定的十项对发展中国家最医疗条件#
重要的生物技术的投票结果来看! 改进分子检测技术! 开发A 获得C 名列第一#世界卫低价简单的传染病诊断试剂B D D 票! 生组织热带病研究培训特别项目的宗旨定为
断试剂标准EE 理想的诊断试剂%;
文单词的第一个字母连接起来就是I L L Q V Y ]EE 确信无疑#随着人类基因组计划的完成和国际+-O ^-O 计划的实施! 为研究特定疾病与遗传变异之间的关系奠定了坚实的基础#我国目前的生物医学研究存在诸多误区! 急需加强大规
黑龙江医药科学
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推动预测" 预防和个体化%医学新时模前瞻性队列研究! _; ‘代的到来#而这正是分子诊断技术大显身手的大好时机#为了应对生物恐怖的威胁! 急需开发有中国特色的低价" 简单" 快速的基因诊断试剂#根据以上精神! 研究开发低价" 简单" 快速" 准确" 无仪器化的分子检测方法迫在眉睫#D 必须十分关注分子诊断中的医学伦理和生物安全问题
由于分子诊断技术的快速发展和社会意识的进步! 使用基因诊人体组织进行诊断和分析研究正在变得越来越复杂#断的结果可能使日益扩充的生物数据库中容纳大量与个体关于疾病易感性" 药物基因组学" 营养基因组有潜在关联的!
学和其他生物学信息#当使用存档组织样品和生物信息进行分析研究和验证时! 患者或组织样品和生物信息的提供者的组织样品和生物隐私以及知情同意的问题应该被认真考虑#
信息的使用必须在相应的医学伦理机构和研究评审机构的依照已经建立的制度或指南进行处理#以基因诊断指导下!
处理和保存过程中的生物安全为目的的人体生物样品收集"
问题同样必须被高度重视! 必须按制度或指南进行处理#另外需要注意的是! 生物安全问题不仅局限于感染性疾病! 隐藏于其他疾病生物样品中的潜在危险因素亦不容忽视#=加强基因诊断技术的质量控制
当分子生物学技术或方法用于基因诊断时! 必须置于临使用质量认证的试剂盒是临床实床实验室的质量控制之下#
验室常规检测的通用做法#也就是说! 在一种检测方法正式使用之前! 必须首先从理论和临床的角度对其做出评估! 然许多分子检测方法还没有通后制定专门的技术规范#然而!
过评估或质量认证之前! 就在不同的实验室内以各自的方式操作#因此! 对这些检测的质量控制应该引起特别重视#质量这包括了对从事控制的另一个重要方面是操作的熟练程度!
分子检测的工作人员的资格认证等#总之! 质量控制应该贯彻于基因诊断的任何一个环节! 从被测样品的临床收集" 实制备" 检测分析! 一直到对结果的解释和发送报验室运送"
告#让我们共同努力! 把握分子诊断的策略! 为分子诊断学的为中国和所有发展中国家基层医疗单位开发出更多的繁荣!
简单" 快速" 准确" 无仪器化的分子诊断试剂作出应有低价" 的贡献#
参考文献%略;
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分子诊断的策略
作者：
作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
吕学诜， L(U) Xue-shen
佳木斯大学,黑龙江,佳木斯,154007黑龙江医药科学
HEILONGJIANG MEDICINE AND PHARMACY2006，29(5)0次
1.期刊论文 孙毅. SUN Yi DNA分子诊断技术应用研究进展 -科技情报开发与经济2006,16(22)
介绍了DNA的多态性及其在医学、植物育种、破案等方面的应用,论述了DNA在各应用领域的研究进展,对其未来发展进行了展望.
2.学位论文 王芳 宫颈癌患者血液微转移的分子诊断及其临床意义 2007
本文研究目的：研究宫颈癌患者血清中HPV DNA的检测，初步探讨血清HPV DNA与宫颈癌复发转移及预后的关系。
研究方法：应用PCR检测宫颈癌63例，宫颈原位癌13例，子宫良性病变15例，宫颈炎症12例患者血清中HPV 16/18 DNA，分析比较宫颈癌组与其余各组中血清.HPV DNA检出率及宫颈癌组血清HPV DNA的检出率与患者临床病理特征的相关性。
研究结果：血清HPV DNA在宫颈癌组，宫颈原位癌组，子宫良性病变组，宫颈炎症组中的检出率分别是63.49％(40/63)，7.69％(1/13)，0％(0/15)，0％(0/12)：其中HPV 16 DNA在四组的检出率分别为
52.38％(33/63)，7.69％(1/13)，0％(0/15)，0％(0/12)；HPV 18 DNA在宫颈癌组的检出率为11.1％(7/63)，其余各组均为0％。血清HPV DNA在宫颈癌组中检出率明显高于对照组，具有统计学意义(P
研究结论：在宫颈癌患者血清中可以检测到HPV DNA。与其他三组相比，宫颈癌组血清HPVDNA的检出率更高，并且HPV16的检出率高于HPV18的检出率。宫颈癌患者的年龄、肿瘤大小、病理类型与血清HPV DNA的表达无明显相关性，而宫颈癌不同临床分期，淋巴结是否转移者其血清HPV DNA的检出率有差别，具有统计学意义(P
3.期刊论文 黄梁浒. 黄惠娟. 杨渤生. 涂向东. 曾健. 李慧忠. 辛娜兰. 兰风华. HUANG Liang-hu. HUANG Hui-juan. YANG Bo-sheng. TU Xiang-dong. ZENG Jian. LI Hui-zhong. XIN Na. LAN Feng-hua 肾上腺脑白质营养不良的产前分子诊断 -中华医学遗传学杂志2005,22(6)
目的对2名来自不同家系的肾上腺脑白质营养不良携带者所怀胎儿进行产前分子诊断.方法在采用STR位点分析方法排除母体基因组DNA污染后,应用扩增阻滞突变系统和DNA斑点杂交的方法对胎儿1羊水基因组DNA进行检测,应用PCR-RFLP和DNA序列测定对胎儿2羊水基因组DNA进行分析.结果在针对R617G突变的扩增阻滞突变系统中,当使用突变引物时,从胎儿1羊水DNA、胎儿1母亲基因组DNA均扩增出185bp的预期特异性条带,而胎儿1父亲和对照则未扩出.在斑点杂交反应中,应用R617G突变型探针时,只有胎儿1羊水细胞及其母亲外周血基因组DNA出现特异性显色斑点.在第2个家系中,先用PCR扩增出横跨P534R突变位点的基因组DNA片段(506bp),应用HaeⅡ酶切此产物,胎儿2以及其父亲、无关对照均未见切割,其母亲的部分产物被切割成396bp和110bp两个片段.对此PCR产物进行DNA序列测定,未在胎儿2中检测出P534R突变.结论 胎儿1带R617G突变,为肾上腺脑白质营养不良半合子;胎儿2不带P534R突变,为正常半合子.
4.学位论文 王树林 生物子序列频数分布与肿瘤亚型分类模型研究 2007
生物信息的爆炸式增长吸引了大量科研人员加入到生物信息学研究领域，使得生物信息学很快成为全球关注与研究的焦点。我们主要研究了生物信息学中的两个基本问题： (1)关于k-长DNA子序列在基因组全序列中出现频数的分布问题； (2)关于基于基因表达谱的肿瘤分子诊断问题。对于这两个问题的研究，都取得了非常好的实验结果，具有理论和现实意义，有助于生物信息学的发展。针对问题一，分别从DNA序列的可视化表示、k-长DNA子序列出现频数分布及其计数算法三个方面展开研究。针对问题二，分别从肿瘤特征抽取和信息基因选择两个方面研究了肿瘤亚型分类模型。 DNA序列可视化表示对于研究其结构与功能具有至关重要的意义，它有助于重复子序列的识别、内含子与外显子的区分以及DNA序列进化等方面的研究。我们首先综述性研究了几种DNA序列的可视化表示方法，比较了生成DNA序列分形图像的Hao方法与经典的混沌游戏表示方法的异同点，讨论了禁止子序列中回文子序列情况，阐述了迭代函数系统产生分形吸引子的数学机理，详细介绍了根据Moore自动机与迭代函数系统定义的混沌自动机，并研究了以DNA序列驱动混沌自动机产生分形图像的方法，提出DNA序列三联密码子的分形图像表示方法，并对其进行了初步分析研究，提出进一步需要解决的问题。
我们在生成DNA序列分形图像的Hao方法的基础上进一步提出一种能够直观显示k-长DNA子序列频数分布差异性的三维频数分布图生成方法，其优点是能够更加直观地观察k-长DNA子序列频数分布。然后把三维频数分布图转化为我们提出的一维对数频谱图，突出显示了频数分布的局部特征，并以一维对数频谱图为依据提出k-长DNA子序列频数区划分准则，详细研究了甚高频数区的n阶零间隔现象，发现并论证了n阶零间隔分布就是基因组进化过程所留痕迹的有力证据，并给出一维对数频谱图特征的生物学解释。实验发现许多DNA序列频数概率分布近似服从非中心F分布，这个新发现有一定的普适性；对于分布呈多峰现象的DNA序列，可采用多个非中心F分布的叠加来拟合。在比较了非中心F分布与Gamma分布后，提出一种结合二者在拟合方面具有互补优势的新分布，实验证明这种新分布能够更好地吻合实际DNA序列的频数分布。然后研究了两种最特异出现频数(最高出现频数与出现频数为1的k-长DNA子序列个数)与k值的关系，发现不同物种的这两种关系具有良好的一致性，比如发现k-长DNA子序列最高出现频数与k值的关系与指数概率分布函数只相差一个常数因子。最后探讨了DNA序列的进化模型。
因为现实世界中的基因组规模非常大，所以对k-长DNA子序列的出现频数进行计数并不是一件容易的事。我们提出并研究了k-长DNA子序列在
．DNA全序列中出现频数的计数问题，设计并实现了k-长DNA子序列内部计数算法和外部计数算法。该算法通过一个哈希函数把k-长DNA子序列映射为整数关键字从而把k-长DNA子序列出现频数的计数问题转化为整数关键字的重复计数问题，使得能够利用经典B树算法来解决频数计数问题，并针对待解问题的特点提出三种改进措施以进一步提高算法的性能。基于基因表达谱的肿瘤亚型分类方法有望成为临床医学上一种快速有效的肿瘤分子诊断方法，但由于目前肿瘤基因表达谱样本集存在维数过高、样本量很小以及噪音很大等特点，使得选择肿瘤信息基因或从基因表达谱中抽取肿瘤分类特征成为一件有挑战性的工作。国内外专家学者对肿瘤分类问题己开展了广泛深入的研究。我们在总结肿瘤分类研究成果的基础上概括出基于基因表达谱的肿瘤分类过程模型，阐述了分类过程模型的关键环节及其常用方法，提出肿瘤分类过程模型的分类方法，并过程模型比较了前人的研究成果，指出目前肿瘤分类研究中存在的问题。
针对肿瘤特征抽取问题，设计了六种方法以获得肿瘤分类特征，分别是：1)主成份分析方法PCA，2)因子分析方法FA，3)独立分量分析方法
ICA，4)小波包分解方法WPD，5)基于离散余弦变换(DCT)的PCA方法，6)基于离散Fourier变换(DFT)的PCA方法。实验采用两种肿瘤样本集(结肠癌和急性白血病样本集)验证了这六种方法的有效性。实验结果表明，所提出的方法不仅分类性能好而且各有其特点，都能在保持较高的分类准确率前提下大幅地降低基因表达谱数据维数。在分类性能方面，基于DCT变换的PCA方法是一个比较理想的数据降维方法，对于结肠癌组织样本，交叉验证识别准确率高达96.77％，而对于急性白血病组织样本，其准确率高达100％。因子分析方法和独立分量分析方法有助于分析样本集的结构特征，实验发现只需少量的因子或独立分量就可以获得很高的分类性能，由此推测，只需3～4个肿瘤信息基因就可以获得很高的分类性能的假设，为设计优秀的肿瘤信息
基因选择算法提供了先验知识。
尽管采用肿瘤特征抽取方法获得了好的实验结果，但是肿瘤信息基因选择仍是必不可少的工作。从基因表达谱的成千上万个基因中选择尽可能多的、分类能力尽可能强而基因数量却尽可能少的信息基因子集是一个挑战性工作。在没有先验知识的情况下，在如此大的基因空间中进行穷尽搜索是不可能的事情。为此我们提出了两类近似算法来解决肿瘤信息基因的选择问题。一类是采用经典粗糙集模型和邻域粗糙集模型的属性约简算法进行信息基因选择的方法。由于采用经典粗糙集模型的属性约简算法需要对数据进行离散化处理而导致信息损失，致使选出的肿瘤信息基因分类性能不高。为避免这个问题，我们又以邻域粗糙集模型的属性约简算法FARNeM(forward attribute reduction based on neighborhood model)为基础，设计了十一种信息基因选择算法以解决肿瘤亚型分类问题。实验结果表明，该方法能够快速搜索到分类准确率更高的信息基因子集。为提高NEC(neighborhoodclassifier)分类器在样本不均衡时的分类性能，对NEC分类器进行改进提出了一种适合于样本不均衡数据集的加权邻域分类器；同时我们还把适合于多分类问题的特征选择算法Simba(iterative search margin based algorithm)引入到肿瘤分类领域中，以丰富肿瘤信息基因选择方法的多样性；为增加分类模型的可信度提出一种基于邻域粗糙集模型的概率神经网络集成方法对肿瘤样本集进行分类；为实用的肿瘤分子诊断软件研制奠定了基础。 另一类是根据获得的肿瘤基因表达谱样本集的结构特征提出的以支持向量机分类器为评估准则的肿瘤信息基因启发式宽度优先搜索算法，其优点是能够同时搜索到基因数量尽可能少而分类能力尽可能强的多个肿瘤信息基因子集。实验采用了三种肿瘤样本集验证了这种分类算法的可行性和有效性。对于急性白血病组织样本集，只需2个信息基因就能获得100％的4-折交叉验证分类准确率(共发现14个这样的两基因子集)；而对于难以分类的结肠癌组织样本集，只需4个信息基因就可获得100％的4.折交叉验证分类准确率(共发现7个这样的四基因子集)；对于小圆蓝细胞肿瘤(Small RoundBlue Cells Tumor，SRBCT)数据集，同样只需4个信息基因就能获得100％的4-折交叉验证分类准确率(共发现504个这样的四基因子集)；实验结果与我们的预测假设十分吻合。与国内外其它优秀的肿瘤分类算法相比，我们的实验结果在综合分类性能方面超过目前所有已知的分类算法。为更加客观地评价肿瘤分类模型的分类性能，我们提出一种能够消除肿瘤样本集的不同划分对分类性能造成影响的一种称之为全折交叉验证的方法，实验证明这是一种更加客观反映分类性能的评估方法；同时针对多肿瘤亚型样本集提出一种推断肿瘤亚型相关信息基因的方法。
5.期刊论文 周逢仓. 金明 肿瘤的分子诊断及其研究进展(综述) -安徽卫生职业技术学院学报2003,2(1)
肿瘤的发生从遗传学角度上来说是一种基因病.在分子水平上,肿瘤的发生常涉及多基因参与,是一个多阶段、多 步骤的复杂的生物学过程.而肿瘤分子诊断则是伴随细胞分子生物学理论和技术迅速发展而产生的一种新型诊断 技术,并已日趋完善,尤其是 DNA芯片技术、 DNA生物传感技术的研究,其前景更是令人瞩目的.可以预见,随着肿 瘤分子诊断水平的提高,人类将最终认清肿瘤的本质并攻克肿瘤.
6.期刊论文 张咸宁. 郭俊明. Zhang Xian-ning. Guo Jun-ming 分子诊断的现状和未来 -自然杂志2001,23(6)
2001年2月12日人类基因组DNA全序列数据的公布,标志着现代医学的发展已逐步进入"基因组医学"时代.基因组医学对疾病诊治的首要贡献是"预测医学"或"分子诊断",即在婴幼儿时期以及个体发病前期进行基因筛查,以识别出疾病基因或发病风险基因的携带者,从而采取有效的预防和治疗措施.
7.学位论文 曾健 脊肌萎缩症的分子诊断新方法研究 2008
进行性近端型脊髓性肌肉萎缩症,简称脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一组常见的常染色体隐性遗传病,其在活婴中的发病率约为1/10000,人群中携带者频率约为1/50。该病以脊髓前角运动神经元变性为特征,有时也可累及脑干运动神经元。临床上主要表现为下运动神经元性、进行性、对称性肌无力和萎缩,近端重于远端,下肢重于上肢。根据SMA发病年龄和病程的不同将其分为三型:I型、II型和Ⅲ型。该病的疾病基因为SMN1基因(survival motor neuron gene 1),定位于5号染色体长臂1区(5q11.2～13.3),于1995年被克隆,含9个外显子,编码一个由294个氨基酸残基组成、分子量为38kD的SMN蛋白。同时被克隆的还有该病的修饰基因SMN2。SMN1和SMN2高度同源：在编码区只有1个碱基的差别(位于第7外显子)。
研究表明,在约95％的SMA患者存在SMN1基因第7外显子的纯合缺失,因此,利用PCR-RFLP法检测第7外显子纯合性缺失成为SMA临床分子诊断和产前分子诊断的首选。
本研究的第一部分建立了两种比常规PCR-RFLP法更快速省时的缺失检测方法,即全血直接PCR-RFLP法和位点特异性PCR法,对14例SMA患者的SMN1基因第7外显子进行纯合性缺失检测,并将结果与常规PCR-RFLP法检测结果相比较。结果显示,全血直接PCR-RFLP法和位点特异性PCR法检测结果与常规PCR-RFLP法检测结果一致,证明这两种方法均是检测SMN1基因是否纯合缺失的快速而准确的新方法。
本研究的第二部分对11个SMA家系的13个胎儿进行产前诊断,并提出了一套新的SMA产前分子诊断方案。这套方案为：超声监视下行羊膜穿刺术,抽取羊水30-40ml,离心收取羊水沉渣,直接从沉渣中提取胎儿基因组DNA和/或从培养后羊水细胞中提取胎儿基因组DNA;采用STR位点检测法排除母体基因组DNA污染；采用常规PCR-RFLP和位点特异性PCR两种方法检测胎儿SMN1基因第7外显子的缺失情况。结果显示,各胎儿均未见羊水DNA受母体DNA污染迹象。在常规PCR-RFLP中,胎儿A,C,D,E-2,F-1,F-2,I,J和K的PCR产物(189bp)仅有部分可被Dra I切割,而胎儿B,E-1,G和H的PCR产物全部被Dra I切割。在位点特异性PCR中,胎儿A,C,D,E-2,F-1,F-2,I,J和K既有SMN1、也有SMN2的第7外显子的扩增产物,而胎儿B,E-1,G和H只有SMN2第7外显子的扩增产物。以上结果说明,胎儿A,C,D,E-2,F-1,F-2,I,J和K不存在纯合性SMN1基因第7外显子缺失；其余胎儿(胎儿B,E-1,G和H)则存在纯合性SMN1基因第7外显子缺失。由于针对检测SMN1纯合缺失的PCR-RFLP法和位点特异性PCR法无法区分杂合性缺失患者、SMA携带者以及正常个体,故需引入定量技术对SMN基因拷贝数作定量分析。
本研究的第三部分探讨多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术在SMA的分子诊断尤其是SMN基因拷贝数定量中的应用。从13例SMA患者、31名患者父母、10例胎儿羊水标本和50名正常人中提取基因组DNA,应用MLPA技术进行分析,同时也行常规PCR-RFLP和位点特异性PCR分析。MLPA对SMN1基因拷贝数的分析结果显示,13例患者均呈纯合缺失,与常规PCR-RFLP和位点特异性PCR结果一致；31名患者父母中除2名拷贝数为2外,其余29名均为1;50名正常人中除1名为1和1名为3外,其余48名均为2;10例胎儿中2例存在纯合缺失,与常规PCR-RFLP和位点特异性PCR.结果一致,5例为1,3例为2;对于SMN2基因,13例患者中2例拷贝数为2,8例为3,3例为4;31名患者父母中5名为1拷贝,12名为2,14名为3;50名正常人中2名纯合缺失,6名为1,42名为2;10例胎儿中9例为2,1例为3。以上结果表明MLPA不仅能检测SMN1基因的纯合缺失,而且还能对SMN1和SMN2基因的拷贝数进行定量分析,是一种准确可靠的SMA分子诊断新方法。 研究表明,在约5％的SMA患者中存在SMN1基因的点突变,因此,如果患者临床表现比较典型,但未能检出SMN1第7外显子的纯合缺失,应考虑其存在SMN1基因点突变的可能。
本研究的第四部分对1例SMA患者及其家系成员的SMN1基因进行了点突变分析,并建立一套完整的SMN1点突变检测体系。这套体系采用MLPA技术、RT-PCR及T克隆-测序技术对患者SMN基因进行拷贝数分析和点突变的鉴定,应用MLPA和针对点突变区域(SMN基因组第5外显子)的PCR-直接测序法对患者父母SMN基因进行拷贝数分析和点突变的证实。结果显示,患者具有1个拷贝的SMN1基因和1个拷贝的SMN2基因,在这个SMN1基因第230位密码子上存在1个未见报道的错义突变S230L,即TCA→TTA;患者父亲具有2个SMN1和2个SMN2拷贝,其中一个SMN1基因存在S230L突变；患者母亲具有1个SMN1拷贝,而SMN2基因是纯合缺失的。在这部分研究中,我们发现了1个新的SMN1基因点突变,即S230L,并准确分析了此患者家系各成员的SMN基因型,为这个家系的遗传咨询提供了完整可靠的依据,并为未来的产前分子诊断工作打下了重要的基础。
总之,本研究建立了一套完整SMA分子诊断体系,它包括SMA的临床快速分子诊断和产前分子诊断,又包括SMN基因的缺失检测、剂量分析以及点突变检测,这套广泛深入的SMA分子诊断体系为SMA家系提供了最为完整的遗传评估。
8.期刊论文 张维莉. 梅长林. 孙田美. 张殿勇. 张树忠. 吴玉梅. 汤兵. 戴兵 基因扫描微卫星DNA进行常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿前诊断 -第二军医大学学报2003,24(1)
目的:利用与多囊肾病PKD1基因紧密连锁的微卫星DNA,通过家系连锁分析,进行常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)的囊肿前诊断,为临床分子诊断奠定基础.方法:采用PCR-基因扫描的方法,对4个ADPKD家系共39人进行连锁分析.结果:通过连锁分析,发现4个家系中1名16岁个体为PKD1突变携带者,处于囊肿发生前期.结论:基因扫描微卫星DNA是一种快速、准确的基因分型方法,可用于ADPKD的囊肿前诊断.
9.学位论文 黄梁浒 肾上腺脑白质营养不良蛋白的原核表达和肾上腺脑白质营养不良的分子诊断研究 2004
本研究利用分子克隆技术,从正常人外周血提取总RNA,反转录成cDNA.以cDNA为模板,进行PCR扩增,应用限制性内切酶和连接酶,将该基因的ATP结合区编码序列导入GST融合表达载体(pGEX-4T-2),构建ATP结合区的原核重组表达载体,并在E.coli BL21中表达.结果得到高表达的融合蛋白,经10﹪SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹鉴定,证实该蛋白为ATP结合区的融合蛋白.将纯化后的融合蛋白作为免疫原,免疫家兔并制备抗ATP结合区的抗血清.本研究先后接诊了4个ALD家系,分别从cDNA和基因组DNA两条途径为4个ALD家系进行分子诊断.采用长链RT-PCR技术,从患者及其母亲外周血提取总RNA并合成cDNA,以cDNA为模板,分4个片段扩增致病基因编码区,将纯化后的PCR产物直接测序,找出基因突变的位点.同时应用限制性内切酶酶切分析、PCR产物直接测序或扩增阻滞突变系统分析方法,分析发病家系成员的基因组DNA,以证实所发现的突变.在检出并证实ALD家系3的基因突变位点后,本研究还对该家系进行了ALD的产前分子诊断.在妇产科医师的配合下,抽取ALD携带者的羊水,提取羊水细胞基因组DNA,证实排除母体细胞基因组DNA的污染后,应用扩增
阻滞突变系统和DNA斑点杂交的方法,对胎儿羊水细胞基因组DNA进行检测.结果发现:在扩增阻滞突变系统中,胎儿羊水细胞、胎儿父母、无关对照的正常引物,均扩增出185bp的条带,而羊水细胞、胎儿母亲的突变引物,均扩增出特异性条带.斑点杂交试验亦显示,只有胎儿羊水细胞及其母基因组DNA的突变型探针显色.因此,确定胎儿羊水中检出一个相同的ABCD1基因突变(R617G).
10.期刊论文 黄朝晖. 杜祥. HUANG Zhao-hui. DU Xiang DNA甲基化在肿瘤无创性分子诊断中的研究进展 -中国癌症杂志2009,19(3)
DNA甲基化是真核细胞基因组最常见的一种表观遗传学修饰.DNA甲基化异常在肿瘤的发生、发展过程中扮演重要角色.研究显示DNA甲基化是一类潜力很大的肿瘤标志物.肿瘤特异性的DNA甲基化标志物可从肿瘤患者血清/血浆、尿液、粪便和支气管肺泡灌洗液中检出,为进行肿瘤无创性诊断DNA甲基化检测提供了新思路.本文对DNA甲基化在恶性肿瘤早期诊断的研究进展作一综述.
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黑龙江医药科学
4&&5年#&月第40卷第$期
分子诊断的策略
吕学诜
佳木斯大学" 黑龙江佳木斯#! $%&&’(
摘要) 分子诊断是以*通过检查人体内源基因或外源! 病原体(基因的存在-缺陷或+, -. +, 或蛋白质分子为诊断材料" 表达异常" 对人体状态或疾病作出特异性诊断的方法和过程/本文从0个方面阐述了分子诊断的策略/把握分子诊断的策略有也有利于进一步发挥分子诊断在临床医学中的作用" 更有利于明确分子诊断学的发展利于巩固目前分子诊断学的研究成果" 方向/
关键词) 分子诊断1*+, 1. +,
中图分类号) %%文献标识码) #&&23&#&%! 4&&5(&$3&&%53&6. , 文章编号) 分子诊断! 是以*诊断/因此" 这类疾病的基因诊断应用性极强" 在严格掌握质(789:; ? @=A B 8C @C +, -. +, 或蛋白质分子为诊断材料" 通过检查人体内源基因或外源! 病原体(基因的存在-缺陷或表达异常" 对人体状态或疾病作出特异蛋性诊断的方法和过程/随着人类基因组计划和后基因组! 白质组(计划的实施" 分子诊断学得到了进一步的完善和成使实验室诊断已经远远熟/分子生物学与现代医学的结合"
超出了单纯辅助临床诊断的范围" 在疾病的预防-预后的判健康状况的评价以及疾病预测等领域" 正断和疗效的监测-发挥着越来越大的作用/可以毫不夸张地说) 分子诊断是具有划时代意义的检测手段" 必将对医学的发展产生重大影现在分子诊断已经成为衡量一个国家和地区整体医疗水响/
平的重要指标/此时" 慎密地思考-分析和总结一下分子诊断有利于巩的基本策略是至关重要的/把握分子诊断的策略" 也有利于进一步发挥分子诊固目前分子诊断学的研究成果"
断在临床医学中的作用" 更有利于明确分子诊断学的发展方向/
#分子诊断必须遵循实验诊断学的基本原则
医学诊断学是研究诊断疾病的基本原则和方法的科学" 作为实验室诊断的一个新的分支DD 分子诊断也应该时时即在实验室内对人体的送检材遵循实验诊断学的基本原则/
料! 包括*进行检测分析" 从而对疾病的+, -. +, 和蛋白质(病因-病原-病情等做出鉴别-认定和解释" 为临床医生准确分析病情-探讨疾病的发生和发展提供验证临床印象诊断-虽然" 分子诊断还被运用到耐药性的检测-疗效客观的依据/
监控-卫生防疫-健康检查-疾病预测和个体化治疗等方面" 但是" 分子诊断仍然要遵循上述实验诊断学的基本原则/分子诊断技术的开发" 蕴藏着巨大的商机" 因此" 为了安全-有效和合法开展分子诊断的研究及应用" 还应积极实施专利法/
采用不同的分子4针对不同类型的疾病及其可能的病因" 诊断策略和方法
病毒-支原体-衣原体-寄生虫等感染性疾病是由细菌-病原体侵入机体而引起的" 以前对于这些病原体多采用微生物学-免疫学和血液学相关手段进行检测" 但是这些方法受不易早期诊断/随着各种病原体基灵敏度和特异性的限制"
因结构的阐明" 利用分子诊断技术早期-快速-敏感-特异地成为可能/应用分子检测感染性病原体本身! . +, 或*+, (
不仅可以对微生物感染做出技术直接测定这些病原体基因"
确诊" 也能诊断出带菌! 毒(者或潜在性感染" 还可以对感染对于感染性疾病的性病原体进行分型和耐药性监测/因此"
分子诊断检测对象主要包括感染性病毒-细菌-寄生虫-支原体-衣原体等在人体内存在的外源性生物*从原+, 或. +, /这类检测一般根据已知外源*采理上讲" +, 或. +, 顺序" 用E 简便而准确的F . 或. G 3E F . 的方法就可以进行快速-控的前提下" 可在临床广泛运用/其诊断策略可以分为以下
两种) 一是一般性检出策略" 即只需要提供是否有某种病原体的感染1二是完整检出策略" 即不仅对病原体做出诊断" 还要进行分型! 包括亚型(和耐药性方面的检测/所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突变有关" 对遗传性疾病进行分子诊断有两种策略可供选择) 疾病基因突变H 直接诊断策略!
即直接揭示导致遗传性疾病发生的各种的*" +, 序列分析(遗传缺陷1除了疾病基因突变的*I 间接诊断策略! +, 序列
即在先证者中确定具有遗传缺分析以外的其他诊断方法("
陷的染色体-相关基因的等位基因型和单倍体型等" 然后在相关基该家系其他成员中寻找被检者是否也有这条染色体-因的等位基因型和单倍体型等/此外" 根据遗传病风险评估"
开展产前基因! 直接或间接(诊断是预防遗传病-控制人口质量的好办法/导致恶性肿瘤发生的原因" 有内源性和外源性两种因素/内源性因素" 是机体内部结构和功能的改变" 如遗传-免疫缺陷-代谢异常等1外源性因素" 是指自然界中各种
致癌因素" 即环境因素/肿瘤的发生发展是多因素相互协同的结果" 而基因水平的异常是其中关键的原因" 因此" 从这个意义上说" 肿瘤是一种基因性疾病/目前肿瘤的分子诊断可以采取三种策略) H 检测肿瘤相关基因1I 检测肿瘤相关病毒的基因1实质上" 提供肿瘤相关基因的J 检测肿瘤标志物/信息可以归为直接诊断" 而针对肿瘤相关病毒基因或肿瘤标志物进行检测则主要属于间接诊断/
6根据基因检测的目的开展不同层次的分子诊断
分子诊断的基本策略是与疾病产生的原因密切联系的/人类疾病的原因包括内因和外因两大类" 内因主要指遗传因素" 如基因结构-基因表达状况的改变" 其中基因结构的改变包括点突变-插入-缺失-重排-易位-基因结构多态性变异-前病毒插入等1外因是指外在的环境因素" 如生活方式-工作环境-精神状况和各种感染性病原体的侵入等/根据基因诊断的目的" 有五种基本方法可供选择/6K #染色体分析
可对大片段*+, 检测除了用传统细胞遗传学技术外" 用更为先进的染色体分析技术" 例如荧光原位杂交! " L 9:C ; :B ; :@B C @M @? @Q =M @8B R S T U (技术" 用黏粒
细菌人工染色体! ! (-" ; 8C 7@? P =; M :>@=9=>M @L @; @=9; N >878C 87:C 或酵母人工染色体! (" V , F O :=C M=>M @L @; @=9; N >878C 87:C 作为探针则能够得到非常稳定的杂交效果/而比较基(W , F
因组杂交! 技术可" ; 87X =>=M @Y :A:B 87@;N O P >@? @Q =M @8B F Z U (以部分弥补上述技术的缺陷" 克服它所提供的信息仅限于探针所覆盖的区域/6K 4*+, 含量测定
*+, 含量测定也是*+, 分析的一项内容/携带多种基
, *\\U &, *H $-, @X F G ; Y $) Z G %$) TF #G 5G $F%$#4X %6T%5[Y Q /]-B 因! 包括调控生长和凋亡的基因" 异常改变的细胞常常含异常数量的核#这可以用流式细胞术检测’相对于正常细$%&胞的#可能提示某条染色体增加&#$%指数" $%含量变化! 或丢失! 非整倍体" 或额外的整套染色体! 多倍体" 的存在’&此外&组织的细胞#$%含量谱可反映细胞周期(与) *期细胞的比例&在某些肿瘤中! 如乳腺癌" 如果该比例高则提示较差的预后’
+, +基因突变的检测
如果致病基因的某种突变与发病具有直接的因果关系&检测这种基因突变作诊断依据是最理想的’对致病基因已经完全了解或部分了解&分子机制完全清楚或部分清楚但已有规律可循的&直接检测和分析突变是分子诊断最有力和最准V 9W V
的片段缺失通常用(-. /0123印迹杂交分析或456检测’9环境基因组研究成果是分子诊断的重要基础
营养状况7年龄7各种环境和个人类的许多疾病与遗传7
体发育时段等因素有关&对于大多数慢性疾病而言&只有阐才有可能对其病因学有彻明其遗传基础与环境因素的贡献&
底的了解’人们越来越深刻地认识到遗传背景是显著影响疾病易感性的重要因素&尤其是环境诱发的慢性疾病如肿瘤7哮喘7糖尿病7心血管病和神经退行性疾病与遗传因素密切从结构与功能上充分认识不同个体环境相关疾相关’因此&
寻找相关易感基因&是现代病的易感性与遗传背景的差异&
分子医学面临的极大挑战’=H H I 年启动了环境基因组计划是全球第一个以遗传! &" F ) 413J K 2-3L 13/M B N 13-L 1O 2-P 1Q /
确的方法’由于一种基因可以有不同突变类型&故有必要对被检测个体制定一个合理方便的策略’通常#$%大片段的缺失往往涉及多个基因而导致多种临床表型混合存在’因此&对较大的片段缺失除了染色体分析外&通常用(-. /0123印迹杂交分析或456检测’小片段的插入和缺失7点突变的检测&主要是因为致病基因可在任何位点上产生突变&使同一疾病有不同的突变类型&由于456技术的出现&利用已知基因序列设计引物&直接检测所观察对象的有无已变得非常方便’而运用456结合单链构象多态性的分析方法!
4568((54" 则能灵敏地检测单个点突变’基因突变检测虽然有直接的优点&但由于目前大多数致病基因并未克隆出来&有些致病基因虽知其染色体上的大概位置&但对其确切基因结构和分子机制却知之甚少’因此&许多疾病不能采用突变检测途径’
+, 9基因连锁分析
由于同一染色体上相邻近的基因一起被遗传而相互存在连锁关系&对于还没有被鉴定但是至少被定位于特定染色体区域的致病基因应该进行连锁分析’只要鉴定与致病基因相连锁的有关基因的存在与否&就可以判断受检者是否带有致病基因’可以采用分子多态标记追踪的方法在一个家族中进行突变等位基因的分离’这类分析不仅要收集先证者的#$%样品&
而且还要收集两至三代中受累和未受累的家族成员的#$%样品’为了能够将因为交换而产生的错误结果减少到最小&多态标志距离致病基因必须足够近! 或者位于基因之内" ’经典的连锁分析主要使用限制性片段长度多态性! 6:; 4" 为遗传标志&进行家系分析’近年来&(&因此#$%标记的连锁分析通常是可靠的’为了确保连锁分析基因诊断的正确性&需要在检测基因或位点附近两侧寻找*?+个遗传标志&这样就可以通过单体型分析&防止由于重组而造成的偏差’+, @检测基因表达状态
分子诊断不仅可以检测基因的结构异常&而且可以检测基因表达状态&而基因表达状况改变则包括转录产物的结构或表达量的异常’
也就是说&除了直接检测基因外&还可以选择6$%为材料&利用逆转录4567实时荧光定量456
7$-2/01238A B -/7基因芯片等技术检测基因表达是否异常C 也可以选择蛋白质为材料&利用D1E /1238A B -/7蛋白组织化学染色7F ; G (%和蛋白质芯片等技术检测基因表达是否异常’通常#$%大片段的缺失往往涉及多个基因而导致多种临床表型混合存在&除了可用细胞遗传学或染色体分析外&较大
多态性为切入点的大规模人类功能基因组学系统研究&可以说是第二代人类基因组计划’按照F ) 4的安排&人类基因的再测序7功能变异分析和动物模型构建的三个阶段与分子诊断一样均要依赖于高通量分子检测手段&而F ) 4的成果势必成为分子诊断的重要基础’所以&必须加强F ) 4与分子诊断的关连和相互配合&分子诊断要随时吸取F ) 4的研究成果’@充分发挥分子诊断在克服耐药性治疗和研究中不可替代的作用
耐药性! 21E K E /M 3Q 1" 又称抗药性&是微生物对抗微生物药物的相对抗性’耐药性分为R 固有耐药性7获得耐药性7多重耐药性以及交叉耐药性’科学家们发现细菌对抗菌药物耐药&
可能是自发的&也可能是通过突变&突变是发生在细菌基因上的变化’这类变化让细菌获得对抗抗菌药物的能力&使抗菌药物活性减弱&
甚至失活’而更重要的是耐药菌能够通过繁殖&
把耐药基因不仅可垂直传给子代&还可在不同微生物的种属间进行水平传播&使多种细菌对不同类的抗菌药物产生多重耐药&从而给临床治疗带来重重困难’尽管影响细菌耐药性的因素很多&避免细菌耐药是一个十分复杂的问题&
但是&无论是在微生物耐药性机制的研究中&还是在维持抗菌药物的有用性和开发新抗菌药物的研究中&克服微生物耐药性的临床治疗中都需要利用分子诊断技术作出及时的检测’
同理&尽管肿瘤耐药性的发生机制十分复杂&至今还未了解其本质’但是&大家比较公认是&化疗失败主要与癌细胞对化疗药物具有或产生了耐药性或多药耐药性! L . B /K O B 1S 2. N21E K E /M 3Q 1&T#6" 有关&现已发现了多种与T#6相关的
分子或基因’毫无疑问&
要想在肿瘤耐药性的研究中有所突破&必须充分发挥分子诊断的不可替代的作用’
U 发挥分子诊断在疾病预测7
预防和个体化治疗中的作用由于基因的个体差异&每个人对某种食物的反应是不一样的&
这就会造成人们吃同一种食物但出现的后果却可能有很大差别’营养基因组学是研究营养摄入和人类独特遗传密码的关系的科学&是生物技术7基因组学7医学和营养学等领域的专家共同研究创造的新的健康研究领域’基因检测是一种预防医学手段&
在健康检查中通过基因检测&可以提早发现某个体是否携带某些易感基因型&是否容易得老年痴呆症7心血管疾病7癌症等&然后选择不同的药物进行个性化医疗’
有些医院或基因公司开始在健康检查中为顾客提供疾病风险预测! 包括多基因遗传疾病和肿瘤类疾病" 7临床药物适治性预测或营养基因检测’现代医学除了注重预防和传统治疗外&正向着安全有效和药物的经济治疗方向发展’药物基因组学! 40M 2L M Q -N 13-L K Q E " 是研究基因突变与药效关系&从基因入手设计药物治疗方案的研究&为临床个体化用药开辟了一个新的途径’药物基因组学不是研究疾病的遗传因素&而是探讨药物作用的遗传分布&以满足临床需要’遗传多样
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性对个体差异! 临床症状的长短" 费用和临床治疗的疗效等有决定性作用#药物基因组学要求药物的生产考虑到药物投放地区人群中有关的等位基因的频率! 医疗处方也将因人而药物基因组学研究的主要策略包括选择药异而趋向个人化#
物起效" 活化" 排泄等相关过程的候选基因进行研究! 鉴定基因序列的变异#这些变异既可以在生化水平进行研究! 估计也可以在人群中进行研究! 用统它们在药物作用中的意义!
计学原理分析基因突变与药效的关系#从以上分析可以看出! 分子诊断在疾病预测" 预防和个体化治疗中的作用将越来越重要#
快速" 准确" 无仪器化的分子检测方法$极力开发简单"
现代医学的检验实验室无论是独立存在的! 还是作为医都是一个拥有大量高新复杂仪器疗保健单位中的一个部门!
设备的实体部门! 而且都配备训练有素的专业技术人员! 这物力的设置! 体现了现代医学检验实验室运作中的些人力"
也说明了现代医学检验在医学实践中的重复杂性和精密性#
要作用#但是! 大量高新复杂仪器设备和专业技术人员的配置! 无形中也给患者增加了沉重的经济负担#世界卫生组织生物伦理合作中心%&’() *+, -) . /0(1-234-. 3’2
的调查报告指出? 的5’) ) -6’(-. 3215, 2. , (7’(83’, . /39:医疗研究资金只用于解决世界人口中@>? 的人的健康问题#近年来生物技术研究成果与日俱增! 而且广泛应用于医学实践! 可是! 大多数生物技术研究都以发达国家为优先! 只有为数不多的几项研究成果已证明! 可以用于改善发展中国家的根据专家委员会投票决定的十项对发展中国家最医疗条件#
重要的生物技术的投票结果来看! 改进分子检测技术! 开发A 获得C 名列第一#世界卫低价简单的传染病诊断试剂B D D 票! 生组织热带病研究培训特别项目的宗旨定为
断试剂标准EE 理想的诊断试剂%;
文单词的第一个字母连接起来就是I L L Q V Y ]EE 确信无疑#随着人类基因组计划的完成和国际+-O ^-O 计划的实施! 为研究特定疾病与遗传变异之间的关系奠定了坚实的基础#我国目前的生物医学研究存在诸多误区! 急需加强大规
黑龙江医药科学
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推动预测" 预防和个体化%医学新时模前瞻性队列研究! _; ‘代的到来#而这正是分子诊断技术大显身手的大好时机#为了应对生物恐怖的威胁! 急需开发有中国特色的低价" 简单" 快速的基因诊断试剂#根据以上精神! 研究开发低价" 简单" 快速" 准确" 无仪器化的分子检测方法迫在眉睫#D 必须十分关注分子诊断中的医学伦理和生物安全问题
由于分子诊断技术的快速发展和社会意识的进步! 使用基因诊人体组织进行诊断和分析研究正在变得越来越复杂#断的结果可能使日益扩充的生物数据库中容纳大量与个体关于疾病易感性" 药物基因组学" 营养基因组有潜在关联的!
学和其他生物学信息#当使用存档组织样品和生物信息进行分析研究和验证时! 患者或组织样品和生物信息的提供者的组织样品和生物隐私以及知情同意的问题应该被认真考虑#
信息的使用必须在相应的医学伦理机构和研究评审机构的依照已经建立的制度或指南进行处理#以基因诊断指导下!
处理和保存过程中的生物安全为目的的人体生物样品收集"
问题同样必须被高度重视! 必须按制度或指南进行处理#另外需要注意的是! 生物安全问题不仅局限于感染性疾病! 隐藏于其他疾病生物样品中的潜在危险因素亦不容忽视#=加强基因诊断技术的质量控制
当分子生物学技术或方法用于基因诊断时! 必须置于临使用质量认证的试剂盒是临床实床实验室的质量控制之下#
验室常规检测的通用做法#也就是说! 在一种检测方法正式使用之前! 必须首先从理论和临床的角度对其做出评估! 然许多分子检测方法还没有通后制定专门的技术规范#然而!
过评估或质量认证之前! 就在不同的实验室内以各自的方式操作#因此! 对这些检测的质量控制应该引起特别重视#质量这包括了对从事控制的另一个重要方面是操作的熟练程度!
分子检测的工作人员的资格认证等#总之! 质量控制应该贯彻于基因诊断的任何一个环节! 从被测样品的临床收集" 实制备" 检测分析! 一直到对结果的解释和发送报验室运送"
告#让我们共同努力! 把握分子诊断的策略! 为分子诊断学的为中国和所有发展中国家基层医疗单位开发出更多的繁荣!
简单" 快速" 准确" 无仪器化的分子诊断试剂作出应有低价" 的贡献#
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分子诊断的策略
作者：
作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
吕学诜， L(U) Xue-shen
佳木斯大学,黑龙江,佳木斯,154007黑龙江医药科学
HEILONGJIANG MEDICINE AND PHARMACY2006，29(5)0次
1.期刊论文 孙毅. SUN Yi DNA分子诊断技术应用研究进展 -科技情报开发与经济2006,16(22)
介绍了DNA的多态性及其在医学、植物育种、破案等方面的应用,论述了DNA在各应用领域的研究进展,对其未来发展进行了展望.
2.学位论文 王芳 宫颈癌患者血液微转移的分子诊断及其临床意义 2007
本文研究目的：研究宫颈癌患者血清中HPV DNA的检测，初步探讨血清HPV DNA与宫颈癌复发转移及预后的关系。
研究方法：应用PCR检测宫颈癌63例，宫颈原位癌13例，子宫良性病变15例，宫颈炎症12例患者血清中HPV 16/18 DNA，分析比较宫颈癌组与其余各组中血清.HPV DNA检出率及宫颈癌组血清HPV DNA的检出率与患者临床病理特征的相关性。
研究结果：血清HPV DNA在宫颈癌组，宫颈原位癌组，子宫良性病变组，宫颈炎症组中的检出率分别是63.49％(40/63)，7.69％(1/13)，0％(0/15)，0％(0/12)：其中HPV 16 DNA在四组的检出率分别为
52.38％(33/63)，7.69％(1/13)，0％(0/15)，0％(0/12)；HPV 18 DNA在宫颈癌组的检出率为11.1％(7/63)，其余各组均为0％。血清HPV DNA在宫颈癌组中检出率明显高于对照组，具有统计学意义(P
研究结论：在宫颈癌患者血清中可以检测到HPV DNA。与其他三组相比，宫颈癌组血清HPVDNA的检出率更高，并且HPV16的检出率高于HPV18的检出率。宫颈癌患者的年龄、肿瘤大小、病理类型与血清HPV DNA的表达无明显相关性，而宫颈癌不同临床分期，淋巴结是否转移者其血清HPV DNA的检出率有差别，具有统计学意义(P
3.期刊论文 黄梁浒. 黄惠娟. 杨渤生. 涂向东. 曾健. 李慧忠. 辛娜兰. 兰风华. HUANG Liang-hu. HUANG Hui-juan. YANG Bo-sheng. TU Xiang-dong. ZENG Jian. LI Hui-zhong. XIN Na. LAN Feng-hua 肾上腺脑白质营养不良的产前分子诊断 -中华医学遗传学杂志2005,22(6)
目的对2名来自不同家系的肾上腺脑白质营养不良携带者所怀胎儿进行产前分子诊断.方法在采用STR位点分析方法排除母体基因组DNA污染后,应用扩增阻滞突变系统和DNA斑点杂交的方法对胎儿1羊水基因组DNA进行检测,应用PCR-RFLP和DNA序列测定对胎儿2羊水基因组DNA进行分析.结果在针对R617G突变的扩增阻滞突变系统中,当使用突变引物时,从胎儿1羊水DNA、胎儿1母亲基因组DNA均扩增出185bp的预期特异性条带,而胎儿1父亲和对照则未扩出.在斑点杂交反应中,应用R617G突变型探针时,只有胎儿1羊水细胞及其母亲外周血基因组DNA出现特异性显色斑点.在第2个家系中,先用PCR扩增出横跨P534R突变位点的基因组DNA片段(506bp),应用HaeⅡ酶切此产物,胎儿2以及其父亲、无关对照均未见切割,其母亲的部分产物被切割成396bp和110bp两个片段.对此PCR产物进行DNA序列测定,未在胎儿2中检测出P534R突变.结论 胎儿1带R617G突变,为肾上腺脑白质营养不良半合子;胎儿2不带P534R突变,为正常半合子.
4.学位论文 王树林 生物子序列频数分布与肿瘤亚型分类模型研究 2007
生物信息的爆炸式增长吸引了大量科研人员加入到生物信息学研究领域，使得生物信息学很快成为全球关注与研究的焦点。我们主要研究了生物信息学中的两个基本问题： (1)关于k-长DNA子序列在基因组全序列中出现频数的分布问题； (2)关于基于基因表达谱的肿瘤分子诊断问题。对于这两个问题的研究，都取得了非常好的实验结果，具有理论和现实意义，有助于生物信息学的发展。针对问题一，分别从DNA序列的可视化表示、k-长DNA子序列出现频数分布及其计数算法三个方面展开研究。针对问题二，分别从肿瘤特征抽取和信息基因选择两个方面研究了肿瘤亚型分类模型。 DNA序列可视化表示对于研究其结构与功能具有至关重要的意义，它有助于重复子序列的识别、内含子与外显子的区分以及DNA序列进化等方面的研究。我们首先综述性研究了几种DNA序列的可视化表示方法，比较了生成DNA序列分形图像的Hao方法与经典的混沌游戏表示方法的异同点，讨论了禁止子序列中回文子序列情况，阐述了迭代函数系统产生分形吸引子的数学机理，详细介绍了根据Moore自动机与迭代函数系统定义的混沌自动机，并研究了以DNA序列驱动混沌自动机产生分形图像的方法，提出DNA序列三联密码子的分形图像表示方法，并对其进行了初步分析研究，提出进一步需要解决的问题。
我们在生成DNA序列分形图像的Hao方法的基础上进一步提出一种能够直观显示k-长DNA子序列频数分布差异性的三维频数分布图生成方法，其优点是能够更加直观地观察k-长DNA子序列频数分布。然后把三维频数分布图转化为我们提出的一维对数频谱图，突出显示了频数分布的局部特征，并以一维对数频谱图为依据提出k-长DNA子序列频数区划分准则，详细研究了甚高频数区的n阶零间隔现象，发现并论证了n阶零间隔分布就是基因组进化过程所留痕迹的有力证据，并给出一维对数频谱图特征的生物学解释。实验发现许多DNA序列频数概率分布近似服从非中心F分布，这个新发现有一定的普适性；对于分布呈多峰现象的DNA序列，可采用多个非中心F分布的叠加来拟合。在比较了非中心F分布与Gamma分布后，提出一种结合二者在拟合方面具有互补优势的新分布，实验证明这种新分布能够更好地吻合实际DNA序列的频数分布。然后研究了两种最特异出现频数(最高出现频数与出现频数为1的k-长DNA子序列个数)与k值的关系，发现不同物种的这两种关系具有良好的一致性，比如发现k-长DNA子序列最高出现频数与k值的关系与指数概率分布函数只相差一个常数因子。最后探讨了DNA序列的进化模型。
因为现实世界中的基因组规模非常大，所以对k-长DNA子序列的出现频数进行计数并不是一件容易的事。我们提出并研究了k-长DNA子序列在
．DNA全序列中出现频数的计数问题，设计并实现了k-长DNA子序列内部计数算法和外部计数算法。该算法通过一个哈希函数把k-长DNA子序列映射为整数关键字从而把k-长DNA子序列出现频数的计数问题转化为整数关键字的重复计数问题，使得能够利用经典B树算法来解决频数计数问题，并针对待解问题的特点提出三种改进措施以进一步提高算法的性能。基于基因表达谱的肿瘤亚型分类方法有望成为临床医学上一种快速有效的肿瘤分子诊断方法，但由于目前肿瘤基因表达谱样本集存在维数过高、样本量很小以及噪音很大等特点，使得选择肿瘤信息基因或从基因表达谱中抽取肿瘤分类特征成为一件有挑战性的工作。国内外专家学者对肿瘤分类问题己开展了广泛深入的研究。我们在总结肿瘤分类研究成果的基础上概括出基于基因表达谱的肿瘤分类过程模型，阐述了分类过程模型的关键环节及其常用方法，提出肿瘤分类过程模型的分类方法，并过程模型比较了前人的研究成果，指出目前肿瘤分类研究中存在的问题。
针对肿瘤特征抽取问题，设计了六种方法以获得肿瘤分类特征，分别是：1)主成份分析方法PCA，2)因子分析方法FA，3)独立分量分析方法
ICA，4)小波包分解方法WPD，5)基于离散余弦变换(DCT)的PCA方法，6)基于离散Fourier变换(DFT)的PCA方法。实验采用两种肿瘤样本集(结肠癌和急性白血病样本集)验证了这六种方法的有效性。实验结果表明，所提出的方法不仅分类性能好而且各有其特点，都能在保持较高的分类准确率前提下大幅地降低基因表达谱数据维数。在分类性能方面，基于DCT变换的PCA方法是一个比较理想的数据降维方法，对于结肠癌组织样本，交叉验证识别准确率高达96.77％，而对于急性白血病组织样本，其准确率高达100％。因子分析方法和独立分量分析方法有助于分析样本集的结构特征，实验发现只需少量的因子或独立分量就可以获得很高的分类性能，由此推测，只需3～4个肿瘤信息基因就可以获得很高的分类性能的假设，为设计优秀的肿瘤信息
基因选择算法提供了先验知识。
尽管采用肿瘤特征抽取方法获得了好的实验结果，但是肿瘤信息基因选择仍是必不可少的工作。从基因表达谱的成千上万个基因中选择尽可能多的、分类能力尽可能强而基因数量却尽可能少的信息基因子集是一个挑战性工作。在没有先验知识的情况下，在如此大的基因空间中进行穷尽搜索是不可能的事情。为此我们提出了两类近似算法来解决肿瘤信息基因的选择问题。一类是采用经典粗糙集模型和邻域粗糙集模型的属性约简算法进行信息基因选择的方法。由于采用经典粗糙集模型的属性约简算法需要对数据进行离散化处理而导致信息损失，致使选出的肿瘤信息基因分类性能不高。为避免这个问题，我们又以邻域粗糙集模型的属性约简算法FARNeM(forward attribute reduction based on neighborhood model)为基础，设计了十一种信息基因选择算法以解决肿瘤亚型分类问题。实验结果表明，该方法能够快速搜索到分类准确率更高的信息基因子集。为提高NEC(neighborhoodclassifier)分类器在样本不均衡时的分类性能，对NEC分类器进行改进提出了一种适合于样本不均衡数据集的加权邻域分类器；同时我们还把适合于多分类问题的特征选择算法Simba(iterative search margin based algorithm)引入到肿瘤分类领域中，以丰富肿瘤信息基因选择方法的多样性；为增加分类模型的可信度提出一种基于邻域粗糙集模型的概率神经网络集成方法对肿瘤样本集进行分类；为实用的肿瘤分子诊断软件研制奠定了基础。 另一类是根据获得的肿瘤基因表达谱样本集的结构特征提出的以支持向量机分类器为评估准则的肿瘤信息基因启发式宽度优先搜索算法，其优点是能够同时搜索到基因数量尽可能少而分类能力尽可能强的多个肿瘤信息基因子集。实验采用了三种肿瘤样本集验证了这种分类算法的可行性和有效性。对于急性白血病组织样本集，只需2个信息基因就能获得100％的4-折交叉验证分类准确率(共发现14个这样的两基因子集)；而对于难以分类的结肠癌组织样本集，只需4个信息基因就可获得100％的4.折交叉验证分类准确率(共发现7个这样的四基因子集)；对于小圆蓝细胞肿瘤(Small RoundBlue Cells Tumor，SRBCT)数据集，同样只需4个信息基因就能获得100％的4-折交叉验证分类准确率(共发现504个这样的四基因子集)；实验结果与我们的预测假设十分吻合。与国内外其它优秀的肿瘤分类算法相比，我们的实验结果在综合分类性能方面超过目前所有已知的分类算法。为更加客观地评价肿瘤分类模型的分类性能，我们提出一种能够消除肿瘤样本集的不同划分对分类性能造成影响的一种称之为全折交叉验证的方法，实验证明这是一种更加客观反映分类性能的评估方法；同时针对多肿瘤亚型样本集提出一种推断肿瘤亚型相关信息基因的方法。
5.期刊论文 周逢仓. 金明 肿瘤的分子诊断及其研究进展(综述) -安徽卫生职业技术学院学报2003,2(1)
肿瘤的发生从遗传学角度上来说是一种基因病.在分子水平上,肿瘤的发生常涉及多基因参与,是一个多阶段、多 步骤的复杂的生物学过程.而肿瘤分子诊断则是伴随细胞分子生物学理论和技术迅速发展而产生的一种新型诊断 技术,并已日趋完善,尤其是 DNA芯片技术、 DNA生物传感技术的研究,其前景更是令人瞩目的.可以预见,随着肿 瘤分子诊断水平的提高,人类将最终认清肿瘤的本质并攻克肿瘤.
6.期刊论文 张咸宁. 郭俊明. Zhang Xian-ning. Guo Jun-ming 分子诊断的现状和未来 -自然杂志2001,23(6)
2001年2月12日人类基因组DNA全序列数据的公布,标志着现代医学的发展已逐步进入"基因组医学"时代.基因组医学对疾病诊治的首要贡献是"预测医学"或"分子诊断",即在婴幼儿时期以及个体发病前期进行基因筛查,以识别出疾病基因或发病风险基因的携带者,从而采取有效的预防和治疗措施.
7.学位论文 曾健 脊肌萎缩症的分子诊断新方法研究 2008
进行性近端型脊髓性肌肉萎缩症,简称脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一组常见的常染色体隐性遗传病,其在活婴中的发病率约为1/10000,人群中携带者频率约为1/50。该病以脊髓前角运动神经元变性为特征,有时也可累及脑干运动神经元。临床上主要表现为下运动神经元性、进行性、对称性肌无力和萎缩,近端重于远端,下肢重于上肢。根据SMA发病年龄和病程的不同将其分为三型:I型、II型和Ⅲ型。该病的疾病基因为SMN1基因(survival motor neuron gene 1),定位于5号染色体长臂1区(5q11.2～13.3),于1995年被克隆,含9个外显子,编码一个由294个氨基酸残基组成、分子量为38kD的SMN蛋白。同时被克隆的还有该病的修饰基因SMN2。SMN1和SMN2高度同源：在编码区只有1个碱基的差别(位于第7外显子)。
研究表明,在约95％的SMA患者存在SMN1基因第7外显子的纯合缺失,因此,利用PCR-RFLP法检测第7外显子纯合性缺失成为SMA临床分子诊断和产前分子诊断的首选。
本研究的第一部分建立了两种比常规PCR-RFLP法更快速省时的缺失检测方法,即全血直接PCR-RFLP法和位点特异性PCR法,对14例SMA患者的SMN1基因第7外显子进行纯合性缺失检测,并将结果与常规PCR-RFLP法检测结果相比较。结果显示,全血直接PCR-RFLP法和位点特异性PCR法检测结果与常规PCR-RFLP法检测结果一致,证明这两种方法均是检测SMN1基因是否纯合缺失的快速而准确的新方法。
本研究的第二部分对11个SMA家系的13个胎儿进行产前诊断,并提出了一套新的SMA产前分子诊断方案。这套方案为：超声监视下行羊膜穿刺术,抽取羊水30-40ml,离心收取羊水沉渣,直接从沉渣中提取胎儿基因组DNA和/或从培养后羊水细胞中提取胎儿基因组DNA;采用STR位点检测法排除母体基因组DNA污染；采用常规PCR-RFLP和位点特异性PCR两种方法检测胎儿SMN1基因第7外显子的缺失情况。结果显示,各胎儿均未见羊水DNA受母体DNA污染迹象。在常规PCR-RFLP中,胎儿A,C,D,E-2,F-1,F-2,I,J和K的PCR产物(189bp)仅有部分可被Dra I切割,而胎儿B,E-1,G和H的PCR产物全部被Dra I切割。在位点特异性PCR中,胎儿A,C,D,E-2,F-1,F-2,I,J和K既有SMN1、也有SMN2的第7外显子的扩增产物,而胎儿B,E-1,G和H只有SMN2第7外显子的扩增产物。以上结果说明,胎儿A,C,D,E-2,F-1,F-2,I,J和K不存在纯合性SMN1基因第7外显子缺失；其余胎儿(胎儿B,E-1,G和H)则存在纯合性SMN1基因第7外显子缺失。由于针对检测SMN1纯合缺失的PCR-RFLP法和位点特异性PCR法无法区分杂合性缺失患者、SMA携带者以及正常个体,故需引入定量技术对SMN基因拷贝数作定量分析。
本研究的第三部分探讨多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术在SMA的分子诊断尤其是SMN基因拷贝数定量中的应用。从13例SMA患者、31名患者父母、10例胎儿羊水标本和50名正常人中提取基因组DNA,应用MLPA技术进行分析,同时也行常规PCR-RFLP和位点特异性PCR分析。MLPA对SMN1基因拷贝数的分析结果显示,13例患者均呈纯合缺失,与常规PCR-RFLP和位点特异性PCR结果一致；31名患者父母中除2名拷贝数为2外,其余29名均为1;50名正常人中除1名为1和1名为3外,其余48名均为2;10例胎儿中2例存在纯合缺失,与常规PCR-RFLP和位点特异性PCR.结果一致,5例为1,3例为2;对于SMN2基因,13例患者中2例拷贝数为2,8例为3,3例为4;31名患者父母中5名为1拷贝,12名为2,14名为3;50名正常人中2名纯合缺失,6名为1,42名为2;10例胎儿中9例为2,1例为3。以上结果表明MLPA不仅能检测SMN1基因的纯合缺失,而且还能对SMN1和SMN2基因的拷贝数进行定量分析,是一种准确可靠的SMA分子诊断新方法。 研究表明,在约5％的SMA患者中存在SMN1基因的点突变,因此,如果患者临床表现比较典型,但未能检出SMN1第7外显子的纯合缺失,应考虑其存在SMN1基因点突变的可能。
本研究的第四部分对1例SMA患者及其家系成员的SMN1基因进行了点突变分析,并建立一套完整的SMN1点突变检测体系。这套体系采用MLPA技术、RT-PCR及T克隆-测序技术对患者SMN基因进行拷贝数分析和点突变的鉴定,应用MLPA和针对点突变区域(SMN基因组第5外显子)的PCR-直接测序法对患者父母SMN基因进行拷贝数分析和点突变的证实。结果显示,患者具有1个拷贝的SMN1基因和1个拷贝的SMN2基因,在这个SMN1基因第230位密码子上存在1个未见报道的错义突变S230L,即TCA→TTA;患者父亲具有2个SMN1和2个SMN2拷贝,其中一个SMN1基因存在S230L突变；患者母亲具有1个SMN1拷贝,而SMN2基因是纯合缺失的。在这部分研究中,我们发现了1个新的SMN1基因点突变,即S230L,并准确分析了此患者家系各成员的SMN基因型,为这个家系的遗传咨询提供了完整可靠的依据,并为未来的产前分子诊断工作打下了重要的基础。
总之,本研究建立了一套完整SMA分子诊断体系,它包括SMA的临床快速分子诊断和产前分子诊断,又包括SMN基因的缺失检测、剂量分析以及点突变检测,这套广泛深入的SMA分子诊断体系为SMA家系提供了最为完整的遗传评估。
8.期刊论文 张维莉. 梅长林. 孙田美. 张殿勇. 张树忠. 吴玉梅. 汤兵. 戴兵 基因扫描微卫星DNA进行常染色体显性遗传性多囊肾病囊肿前诊断 -第二军医大学学报2003,24(1)
目的:利用与多囊肾病PKD1基因紧密连锁的微卫星DNA,通过家系连锁分析,进行常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)的囊肿前诊断,为临床分子诊断奠定基础.方法:采用PCR-基因扫描的方法,对4个ADPKD家系共39人进行连锁分析.结果:通过连锁分析,发现4个家系中1名16岁个体为PKD1突变携带者,处于囊肿发生前期.结论:基因扫描微卫星DNA是一种快速、准确的基因分型方法,可用于ADPKD的囊肿前诊断.
9.学位论文 黄梁浒 肾上腺脑白质营养不良蛋白的原核表达和肾上腺脑白质营养不良的分子诊断研究 2004
本研究利用分子克隆技术,从正常人外周血提取总RNA,反转录成cDNA.以cDNA为模板,进行PCR扩增,应用限制性内切酶和连接酶,将该基因的ATP结合区编码序列导入GST融合表达载体(pGEX-4T-2),构建ATP结合区的原核重组表达载体,并在E.coli BL21中表达.结果得到高表达的融合蛋白,经10﹪SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹鉴定,证实该蛋白为ATP结合区的融合蛋白.将纯化后的融合蛋白作为免疫原,免疫家兔并制备抗ATP结合区的抗血清.本研究先后接诊了4个ALD家系,分别从cDNA和基因组DNA两条途径为4个ALD家系进行分子诊断.采用长链RT-PCR技术,从患者及其母亲外周血提取总RNA并合成cDNA,以cDNA为模板,分4个片段扩增致病基因编码区,将纯化后的PCR产物直接测序,找出基因突变的位点.同时应用限制性内切酶酶切分析、PCR产物直接测序或扩增阻滞突变系统分析方法,分析发病家系成员的基因组DNA,以证实所发现的突变.在检出并证实ALD家系3的基因突变位点后,本研究还对该家系进行了ALD的产前分子诊断.在妇产科医师的配合下,抽取ALD携带者的羊水,提取羊水细胞基因组DNA,证实排除母体细胞基因组DNA的污染后,应用扩增
阻滞突变系统和DNA斑点杂交的方法,对胎儿羊水细胞基因组DNA进行检测.结果发现:在扩增阻滞突变系统中,胎儿羊水细胞、胎儿父母、无关对照的正常引物,均扩增出185bp的条带,而羊水细胞、胎儿母亲的突变引物,均扩增出特异性条带.斑点杂交试验亦显示,只有胎儿羊水细胞及其母基因组DNA的突变型探针显色.因此,确定胎儿羊水中检出一个相同的ABCD1基因突变(R617G).
10.期刊论文 黄朝晖. 杜祥. HUANG Zhao-hui. DU Xiang DNA甲基化在肿瘤无创性分子诊断中的研究进展 -中国癌症杂志2009,19(3)
DNA甲基化是真核细胞基因组最常见的一种表观遗传学修饰.DNA甲基化异常在肿瘤的发生、发展过程中扮演重要角色.研究显示DNA甲基化是一类潜力很大的肿瘤标志物.肿瘤特异性的DNA甲基化标志物可从肿瘤患者血清/血浆、尿液、粪便和支气管肺泡灌洗液中检出,为进行肿瘤无创性诊断DNA甲基化检测提供了新思路.本文对DNA甲基化在恶性肿瘤早期诊断的研究进展作一综述.
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