22卷5期2006年9月生 物 工 程 学 报Chinese Jou rnal o f Biotechnology Vol. 22 No. 5
September 2006
鸡A 干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究
Cloning, Prokaryotic Expression of Chicken Interferon_A Gene and Study on Antiviral Effect of Recombinant Chicken Interferon_A
韦 琴, 彭贵青, 金梅林, 朱裕东, 周红波, 郭红燕, 陈焕春
*
WEI Qin, PENG Gui_Qing,JIN Mei_Lin , ZH U Yu_Dong,Z HOU Hong_Bo,GUO Hong_Yan and CHEN Huan_Chun
华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物病毒室, 武汉 430070
Lab o f Anima l Virus , StateK e y Laboratory o f Ag ricu ltu ral Mic robiology , Hua zh on g Agricul tu ra l Un ive rsity , Wuh an 430070, Ch in a
*
摘 要 通过PCR 从三黄肉鸡的肝脏基因组中扩增了鸡A 干扰素(ChIFN_A ) 全长基因。序列分析表明ChIFN_A 基因全长582bp, 亚克隆其成熟蛋白编码基因(489bp) , 利用基因重组技术构建了E . coli P pE T_28a(+) _IFN A , 使IFN_A 置于pET_28a的T7启动子下游并同6@His(多聚组氨酸标签) _Tag 融合。经酶切鉴定, DNA 测序证实重组质粒构建正确; 将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) , IPTG 诱导表达, SDS _PAGE,Western _blot分析证实表达出22kD 左右的融合蛋白, 表达的蛋白以不溶性的包涵体形式存在并且具有良好的免疫学活性。提纯的包涵体纯度可达70%以上, 用镍亲和层析方法纯化蛋白则可达到95%。经透析复性后的蛋白在鸡胚成纤维细胞上能够抑制H9N2禽流感病毒的复制。鸡胚试验中重组干扰素抗病毒效果好:在H9N2禽流感病毒攻毒组中, 能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2L g; 重组干扰素对新城疫病毒复制也有一定的抑制能力, 延迟该病毒复制时间为12h 至48h; 雏鸡试验表明重组干扰素也能较好地抵抗H9N2禽流感病毒对雏鸡的感染。两组试验均表明, 亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20倍左右。关键词 ChIFN_A 基因, 抗病毒效果, H9N2禽流感病毒, 新城疫病毒
中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号1000-3061(2006) 05-0737-07
Abstract The full le ngth of c hicken inte rferon alpha (ChIFN_A ) gene was amplified by the polymerase chain reaction(PCR) from total live r geno me of Sanhuang meat_chicken and sequenced. The a mplified gene was about 582bp. The coding region for mature protein (489bp) was subcloned into pET_28a(+). The recombinant plasmid pET_28a(+) _IFN A was ide ntified by enzy me digestion and DNA sequencing. Da ta of SDS_PAGE and Western_blotindic ated that a 22kD fusion protein was e xpressed in the for m of inclusion bodie s with good immunity. The purity of inclusion bodies was above 70%and tha t of protein purified by nickel affinity chromatography was 95%.The recombinant protein c ould inhibit H9N2avian influenza virus (H9N2AIV) replication on chick e mbryo fibroblast. 2L g of rec ombinant IF N_A c ould c ompletely protect Chick e mbryo from H9N2AI V infection. The recombinant I FN_A can also delay Ne wcastle disease virus (NDV) replica t ion on chick embryo for 12~48h. Chicken administered recombinant IF N_A can resist the H9N2AI V infection. The bioac t ivities of reco mbinant I FN_A purifie d by affinity c hroma tograph we re 20times higher than that of inclusion bodies. Key words chicken IFN_A gene, antiviral effec t, H9N2AI V, NDV
Received:April 24, 2006; Accepted:May 26, 2006.
*Corresponding author. Tel :86_27_87282608;E_mail:wei@webmail. hzau. edu. cn
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Chinese J ournal o f Biotechnology 生物工程学报 2006, Vol 122, No 15
我国是最大的养禽国, 然而病毒病一直困扰着我国养禽业, 造成养禽业巨大的经济损失。目前一些禽类病毒性疾病仍然缺乏有效的治疗手段。化学
药物的使用易造成耐药性, 而且容易引起动物体内药物残留, 影响人类健康; 疫苗的研制则须考虑病毒变异和多样性。干扰素则是通过对自身免疫系统的调节来达到抗病毒的目的, 没有耐药性和药物残留的风险, 并且以其广谱的抗病毒活性, 受到了广泛的亲睐。
干扰素(Interferon, IFN) 是一类能诱导动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子, 具有抑制病毒繁殖、调节机体免疫反应的功能。IFN 基因分为Ñ型和Ò型, Ñ型IFN 又分为A 和B 等型, 均为无内含子的单拷贝或多拷贝基因。A 干扰素(IFN_A ) 是由能在脊椎动物的各种类型的细胞增殖的病毒诱导白细胞产生的, 其主要活性是抗病毒。鸡A 干扰素(ChI FN_A ) 全基因为582个碱基, 编码193个氨基酸, 其中前31个氨基酸为信号肽, 后162个氨基酸为成熟蛋白, 蛋白分子量约为19kD 。1994年, Sekellick
[2]
[1]
SPF 雏鸡由购买的SPF 鸡胚孵化。
2 方法
211 引物设计
根据NCBI 上基因序列号为AB021154的鸡I FN_A 基因序列, 设计两对引物, 分别用于鸡IFN_A 全基因(P1和P2) 的克隆和去掉信号肽的成熟蛋白编码基因的亚克隆(P3和P4) , 由宝生物工程公司合成, 其序列如下:
P1:5c _CCATGGCTGTGCC TGC AAGCCC AC AGC _3c 引入酶切位点Nco Ñ;
P2:5c _TTGTCGACC TAAGTGCGCGTGTTGC CTG T_3c 引入酶切位点Sal Ñ; P3:5c _TTGAATTCTGC AACCACC TTCGC CCCCAG_3c , 引入酶切位点Eco R Ñ; P4与P2同。
212 基因组DNA 的提取
参照5分子克隆实验指南6从三黄肉鸡肝组织中提取基因组DNA 。
213 基因克隆和测序
以三黄肉鸡鸡肝细胞基因组为模板, PCR 反应系统包括模板1L g, 上下游引物各50mmol P L, 总体积为20L L 。反应条件为:94e 、4min, 1个循环; 94e 、1min, 55e 、1min, 72e 、1min, 30循环; 最后72e 延伸10min 。鸡I FN_A 成熟蛋白编码基因的亚克隆反应条件同上, 引物为P3和P4。PCR 产物经110%琼脂糖凝胶电泳, 回收489bp 处DNA 带, 纯化后连pMD18_T 载体, 转化大肠杆菌D H5A 感受态细胞, 选单个菌落酶切鉴定, 阳性质粒命名为pIFN_A 并送TaKaRa 生物工程公司测序。214 重组表达质粒的构建
PCR 产物经Eco R1、Sal Ñ双酶切回收, 连pE T_28a(+) 载体。构建重组表达质粒pE T_28aIFNA 并转化大肠杆菌DH5A 感受态细胞, 氨苄青霉素抗性筛选, 酶切鉴定。
215 重组表达质粒的转化和鉴定
将pET_28aIFN A 重组子转化B L21(DE3) 感受态细胞, 氨苄青霉素抗性筛选, Eco R Ñ、Sal Ñ双酶切, 证明插入片段为目的基因。
216 在大肠杆菌中的表达
将鉴定好的pET_28aIFNA P B L21(DE3) 经氨苄青霉素抗性筛选为阳性后再接种于液体LB 培养基, 37e 震荡培养, OD 值为016时加IPTG 至终浓度为P L 等首次成功克隆和表达了ChIFN_A 基因, 并进行了
[3,4]
结构分析。Sick 等也报道了红色原鸡IFNA1、I FNA2和IFNA3基因序列并广泛开展了ChIFN_A 生物学功能的研究。本研究克隆和表达了ChIFN_A , 并实现了蛋白的高效表达和纯化, 在鸡胚试验和雏鸡试验中探讨了重组干扰素抗禽类病毒的活性, 为新型抗病毒生物制剂的研制奠定了基础。
1 材料
111 菌种与病毒
E . coli P DH5A 、B L21(DE3) 为本室保存, 鸡H9N2亚型禽流感病毒由本室分离并保存, 经国家流感中心鉴定为H9N2亚型。新城疫病毒为本室分离并保存。
112 质粒及相关试剂
pE T_28a (+) 均由本室保存, pMD_18T购自TaKa Ra 公司, 限制酶Eco R Ñ、Nco Ñ、Sal Ñ及T4DNA 连接酶等为Ta KaRa 产品。DNA 片段快速回收试剂盒购于北京原平皓生物技术公司。HisBind Kit 购于Nova gen 公司。其他试剂均为分析纯试剂。113 血清和酶标抗体
兔抗鸡IFN_A 多抗血清由本室制备, HRP 抗兔二抗为华美公司产品。114 SPF 鸡胚及雏鸡
,
韦 琴等:鸡A 干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究
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之后, 离心收集菌体, SDS_PAGE分析, 确定最佳诱导时间。
217 SDS_PAGE
参照5分子克隆实验指南6, 采用12%的分离胶鉴定表达产物。
218 表达产物Western _blot鉴定
将SDS_PAGE凝胶电泳的蛋白带通过半干法转移至硝酸纤维膜上, 用含015%B SA 的TSBT 封闭2h, 兔抗鸡IFN_A 多抗作为一抗, 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔I gG 为二抗, DAB 作为底物进行显色。219 表达蛋白的纯化
21911 提取包涵体法:将诱导表达3h 的细菌培养物8000r P min 离心8min, 弃上清, 沉淀用缓冲液A (1P 10体积) 重悬, 超声波破碎。8000r P min 离心10min, 弃上清, 沉淀用PBS 洗涤2次, 加1917mL 缓冲液A 及013mL 20%SKL 贮存液, 剧烈搅动, 使其溶解, 静置30min 至2h, 4e 12000r P min 离心10min, 弃沉淀, 取上清。用PBS 稀释蛋白质浓度至1mg P mL, 内加终浓度为012%的PEG4000与1mmol P L 氧化型B 还原型谷胱甘肽(摩尔比为1B 4) 帮助变性的肽键依天然构象复性, 用大于20倍体积的PBS 共装入透析袋, 4e 磁力搅拌器搅拌透析复性, 每5h 换液一次, 换液6次后收集蛋白液, 分装-20e 保存。21912 镍亲和层析法:将诱导表达的细菌进行超声波裂解后以镍亲和层析柱纯化回收目的蛋白。方法按HisBind Kit 说明书操作并参照文献[6]。2110 重组鸡A 干扰素的抗病毒效果分析
211011 细胞病变抑制法分析干扰素抗病毒活性:将鸡胚成纤维细胞接种于96孔细胞培养板, 在37e , 5%CO 2的饱和二氧化碳水汽培养箱中培养到细胞长成单层。每列加入4倍系列稀释的重组干扰素, 各100L L P 孔, 同时设病毒对照和细胞对照, 培养24h 后, 每孔加入维持液(含015%胰酶) 稀释的H9N2禽流感病毒(100TCID 50) , 最后一列加维持液作为细胞对照。24h 后开始观察细胞病变。211012 鸡胚试验分析干扰素抗病毒效果:设计两个攻毒组, H9N2禽流感病毒攻毒组(group 1) 和新城疫病毒攻毒组(group 2) 。试验对象:9日龄鸡胚。具体方法:给与不同剂量的干扰素使鸡胚建立抗病毒状态, 在包涵体蛋白组中, 设5L g, 10L g, 20L g, 40L g, 80L g, 160L g 和3204L g 蛋白组及空白对照组共8组, 每组6枚; 在亲和层析纯化蛋白组中, 设015L g, 1L g, 2L g, 4L g 和8L g 蛋白组及空白对照组共6
组每([7-11]
[5]
EID 50) , 逐日观察鸡胚死亡情况。
211013 雏鸡试验分析干扰素抗病毒效果:设计一个攻毒组:H9N2禽流感病毒攻毒组(group 3) 。试验对象:2日龄雏鸡。在包涵体蛋白组中, 设10L g,
20L g, 40L g 和80L g 蛋白组及空白对照组共5组, 每组5只; 在亲和层析纯化蛋白组中, 设1L g, 2L g, 4L g 和8L g 蛋白组及空白对照组共5组, 每组5只。接种病毒200L L(100个LD 50) 。试验方法同211012。
3 结果
311 鸡IFN _A 的克隆及亚克隆
以鸡肝细胞基因组DNA 为模板, 按上述方法进行扩增, PC R 扩增产物经018%琼脂糖凝胶电泳后, 约在582bp 有一条特异带; 去掉信号肽的IFN_A 基因PCR 扩增产物为489bp(图1) , 两者均与预期片段大小相符。克隆序列全长582bp, 编码193个氨基酸, 其中成熟蛋白含162个氨基酸, 有4个糖基结合位点。核苷酸序列与GenBank 上基因序列号为AB021154的鸡的IFN_A 基因序列同源性为99%, 氨基酸序列同源性为98%。
图1 鸡A 干扰素基因亚克隆的扩增结果Fig. 1 Identificati on of subcloning PCR productions
1:DNA marker D L2000; 2:Negative control; 3:s ubcloning PCR produc t (489bp) .
PCR 回收产物与pMD18_T 载体连接后, 转化大肠杆菌D H5A 感受态细胞, 挑单个菌落提取质粒后, 用Eco R Ñ和Sal Ñ酶切, 得到216kb 和495bp 两条带与预期结果一致, 表明已将目的基因成功地克隆到pMD18_T 载体中(图2) 。
312 表达质粒pET28a_IFNA 的鉴定
PCR 回收产物与pE T_28a载体连接后, 转化大DH5A ,
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图4 Bl21P pET28a_IFNA SDS _PAGE及Western _blot分析
Fig. 4 SDS_PAGEanalysis of pE T28a_IFN A
图2 pMD_IFN A 的酶切鉴定
Fig. 2 Identification of recombinant plasmid p MD_IFNA
1:DNA marker (DL2000) ; 2:pMD _IFNA P Sal Ñ+Eco R Ñ; 3:D NA marker (DL15000).
expressed in BL21
1:sa mple of BL21P pET_28a_IFNA induced by IPTG for 0h; 2:sample of Bl21P pET28a_IFNA i nduced by IP TG for 1h, 3:s ample of Bl21P pET28a_IFN A i nduced by IPTG for 2h, 4:sample of Bl21P pET28a_IFNA induced by IP TG for 3h; M :protei n marker.
组质粒, 用Sal Ñ和Eco R Ñ酶切, 得到513kb 和
495bp 两条带与预期结果一致(图3) , 表明目的基因已成功地克隆到pET_28a载体中, 命名为pET28a_I FN A
。
度为70%以上, 蛋白含量为48811mg P L(图5A) ; 表达产物经过进一步纯化, 镍亲和层析后透析复性, 纯度
可达95%, 蛋白含量为9614mg P L(图5B) 。
图5 Bl21P pE T28a_IFN A 表达产物提纯的包涵体以及用镍亲和层析纯化的蛋白SDS_PAGE分析
图3 pE T28a_IFNA 重组质粒的双酶切鉴定Fig. 3 Identification of recombinan t plasmid pE T28a_IFNA
1:DNA marker (D L15000); 2:pET28a_IFNA P Sal Ñ+Eco R Ñ; 3:D NA marker (D L2000) .
Fig. 5 SDS _PAGEanalysis of pE T_28aP IFN A inclusionbodies and
the expressions purified by Ni 2+affini ty chromatograp h
1:sample of BL21P pET_28ai nduced by IPTG; 2:sample of BL21P pET_28a_IF N A i nduced by IPTG; 3:inclusi onbodies; 4:the expres sions purified by Ni 2+affinity c hromatograph; M:protein marker.
313 IF N_A 的表达及Western_blot鉴定
SDS_PAGE检测结果显示, 在22kD 处有有一条明显蛋白表达带, 占菌体总蛋白的23%, 并且表达产物主要为不溶性的包涵体。鸡IFN_A 蛋白约19kD, 与载体上一段氨基酸表达的蛋白融合后约为
22kD, 并且表达蛋白最佳诱导时间为3h(图4A) 。经Western_blot分析确证表达产物有良好的免疫学活性(图4B) 。
314 IF N_A 蛋白的纯化
315 鸡重组A 干扰素的抗病毒效果分析
31511 细胞病变抑制法分析干扰素抗病毒活性:在鸡胚成纤维细胞上分析经镍亲和层析透析复性的重组干扰素蛋白抗病毒活性, 结果显示空白对照孔
6
细胞生长良好, 阳性对照孔细胞病变严重, 4稀释后所加的细胞孔生长状态良好, 4稀释后所加的细胞孔25%的病变, 4稀释后所加的细胞孔80%的病变。证明重组干扰素能够抑制H9N2禽流感病毒的8
7
韦 琴等:鸡A 干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究
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31512 鸡胚试验分析干扰素抗病毒效果:(1)H9N2禽流感病毒攻毒组(图6group 1) :
攻毒后48h 对照组鸡胚全部死亡。
在包涵体蛋白试验组中:攻毒后48h 给与10L g 和20L g 蛋白组鸡胚也全部死亡, 给与40L g 、80L g 及160L g 蛋白组存活率为100%, 给与320L g 蛋白组存活率为50%, 其中给与160L g 蛋白组抗病毒活性相对最高, 鸡胚孵出率为3313%。
在亲和层析纯化蛋白试验组中:攻毒后48h 所有组的存活率为100%, 给与1L g 蛋白组鸡胚孵出率为50%, 给与2L g 、4L g 及8L g 蛋白组孵出率均为100%。表明重组干扰素对H9N2禽流感病毒有100%的抵抗能力, 能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2L g 。(2) 新城疫病毒攻毒组(图6group 2) :
攻毒后72h 对照组鸡胚全部死亡。
在包涵体蛋白试验组中:攻毒后72h 给与10L g 、20L g 、40L g 蛋白组鸡胚也全部死亡, 给与80L g 及160L g 蛋白组存活率为50%, 给与320L g 蛋白组存活率为1617%。
在亲和层析纯化蛋白试验组中:攻毒后72h 所有的组均有存活率, 其中给与8L g 蛋白组鸡胚存活率为100%。由于所用的新城疫病毒致病性很强, 攻毒后96h 所有组鸡胚均死亡。表明重组鸡干扰素在鸡胚内能够延迟和减少该新城疫病毒(NDV)的后代病毒增殖, 延迟时间为12h 至48h 。
以鸡胚的存活率对攻毒后的时间作曲线, 分析干扰素抗病毒效果, 如图(8) 所示。两组试验均表明, 在鸡胚存活率相同的情况下, 亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20(160L g:8L g)
倍左右。
图6 pET28a_IFNA 对鸡胚攻毒(H9N2禽流感病毒和新城疫病毒) 后的保护率Fi g. 6 Efficacy of pE T28a_IFNA resistant to H9N2AIV and NDV on chick embryo
group1:the group challenged with H9N2AIV on chick embryo; group2:the group challenged w i th NDV on chick e mbryo. a:the hours of the chicken break out from chick embryo pos t challenged.
31513 雏鸡试验分析干扰素抗病毒效果
H9N2禽流感病毒攻毒组(图7group 3) :攻毒后108h 对照组雏鸡全部死亡。在包涵体蛋白试验组中:攻毒后108h, 给与10L g, 20L g 蛋白组雏鸡存活率分别为80%和60%, 给与40L g 蛋白以上组存活率为100%。在亲和层析纯化蛋白试验组中:攻毒后108h, 给与1L g 蛋白组雏鸡存活率为40%, 给与2L g 蛋白组雏鸡存活率为80%, 给与4L g 蛋白以上组雏鸡存以雏鸡的存活率对攻毒后的时间作曲线, 分析干扰素抗病毒效果, 如图(10) 所示。试验表明, 在雏鸡存活率相同的情况下, 亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20(80L g:4L g) 倍左右。
4 讨论
由于鸡A 干扰素属于Ñ型干扰素, 由不含内含子的多拷贝基因编码, 因此本研究直接以鸡肝基因组DNA 为模板克隆出了鸡A 干扰素基因, 省去了从
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Chinese J ournal o f Biotechnology 生物工程学报 2006, Vol 122, No 15
图7 pET28a_IFNA 对雏鸡攻毒(H9N2禽流感病毒) 后的保护率Fig. 7 Efficacy of pE T28a_IFNA resistant to H9N2AIV on chicken
G roup 3:the group challenged with H9N2AIV on chicken.
冗。
本研究中的鸡A 干扰素全长基因与GenBank 上登录号为AB021154的鸡A 干扰素序列的同源性为
99%, 与登录号为X84764的鸭干扰素相同部位基因同源性为75%, 说明该基因相对保守。在分析其序列时发现大肠杆菌稀有密码子在本基因开放读码框中不多见, Arg 稀有密码子CGG 仅有两个, AGA 、AGG 、CGA 则没有, 因此推测本研究中目的基因曾不表达和密码子偏爱性无关。本研究曾采用两种原核表达载体pE T_28a载体和pGEX_KG 载体表达干扰素全长基因, 均没有获得表达, 将干扰素基因的信号肽缺失掉, 结果在Bl21P pET_28a中获得高效表达, 在Bl21P pGE X_KG 中没有得到表达, 这表明信号肽在表达中起到了负面作用, 可能是信号肽往往带有疏水性蛋白, 不利于外源基因在原核中的表达, 并且不同的载体系统会影响干扰素基因的表达。
金属离子亲和层析技术的最大优点在于利用它可以从粗提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质, 具有高收率、高纯度、能保持生物大分子天然状态等优点, 广泛的应用于生物大分子的分离纯化。本研究表达的融合蛋白带有6@His (多聚组氨酸标签) , 这一供电子的氨基酸残基十分有利于目的蛋白与固定化金属离子Ni 结合, 从而可以将目的蛋白分离纯化。本研究采用的是透析复性, 研究表明蛋白浓度对复性影响很大, 包涵体蛋白在透析的过程中, 蛋白浓度过高容易发生沉淀, 把复性浓度调到011~015mg P m L 时, 蛋白沉淀很少, 复性效果好。总的来说, 镍亲和层析纯化的蛋白纯度较高, 可以达到95%, 生物活性也相对较高, 但是相对提取包涵体法, 对试验试剂和材料要求较高, 操作方法相对繁杂; 试验证明提取包涵体法获得的重组干2+
两种方法各有优势, 操作起来可以根据根据实际情况各取所需。
9日龄鸡胚试验中显示, 干扰素蛋白含量在一定的范围内有很好的抗H9N2禽流感病毒效果, 且试验重复性好, 抗病毒活性随着蛋白含量的增加而增高; 在H9N2禽流感病毒攻毒组中, 能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2L g, 表明干扰素抵抗H9N2禽流感病毒能力强。在9日龄鸡胚H9N2禽流感病毒攻毒组和新城疫病毒攻毒组两组试验中, 我们发现给与320L g 包涵体蛋白组对鸡胚保护率均有所降低, 这说明蛋白含量过高会对机体产生副作用, 影响存活率。雏鸡试验中也显示了其良好的抗H9N2禽流感病毒作用。鸡胚和雏鸡两组试验均表明亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20倍左右, 表明蛋白纯度越高, 活性越好。
本研究成功地表达和纯化了干扰素, 表达的重组干扰素抗病毒生物活性高, 对H9N2禽流感病毒有100%的抵抗能力, 对新城疫病毒的复制也有一定的抑制能力, 显示了其良好的抗病毒活性, 为新型广谱抗病毒生物制剂的研制和干扰素的大批量生产奠定了基础。
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(上接第719页) 314 中英文摘要
中文摘要应简洁明确, 而英文摘要则可比中文摘要详尽些, 内容上不必完全对应。本刊非常重视英文摘要的写作, 具体要求如下:
31411 字数:综述性文章要求不少于200words, 学术性文章要求200~400words 。
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31413 写法:
1) 最好用重要的事实开头, 避免用第一人称或辅助从句开头。2) 用过去时态叙述作者工作, 用现在时态叙述作者结论。3) 关键词应明确、具体, 一些模糊、笼统的词语最好不用, 如基因、表达, ,
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22卷5期2006年9月生 物 工 程 学 报Chinese Jou rnal o f Biotechnology Vol. 22 No. 5
September 2006
鸡A 干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究
Cloning, Prokaryotic Expression of Chicken Interferon_A Gene and Study on Antiviral Effect of Recombinant Chicken Interferon_A
韦 琴, 彭贵青, 金梅林, 朱裕东, 周红波, 郭红燕, 陈焕春
*
WEI Qin, PENG Gui_Qing,JIN Mei_Lin , ZH U Yu_Dong,Z HOU Hong_Bo,GUO Hong_Yan and CHEN Huan_Chun
华中农业大学农业微生物学国家重点实验室动物病毒室, 武汉 430070
Lab o f Anima l Virus , StateK e y Laboratory o f Ag ricu ltu ral Mic robiology , Hua zh on g Agricul tu ra l Un ive rsity , Wuh an 430070, Ch in a
*
摘 要 通过PCR 从三黄肉鸡的肝脏基因组中扩增了鸡A 干扰素(ChIFN_A ) 全长基因。序列分析表明ChIFN_A 基因全长582bp, 亚克隆其成熟蛋白编码基因(489bp) , 利用基因重组技术构建了E . coli P pE T_28a(+) _IFN A , 使IFN_A 置于pET_28a的T7启动子下游并同6@His(多聚组氨酸标签) _Tag 融合。经酶切鉴定, DNA 测序证实重组质粒构建正确; 将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) , IPTG 诱导表达, SDS _PAGE,Western _blot分析证实表达出22kD 左右的融合蛋白, 表达的蛋白以不溶性的包涵体形式存在并且具有良好的免疫学活性。提纯的包涵体纯度可达70%以上, 用镍亲和层析方法纯化蛋白则可达到95%。经透析复性后的蛋白在鸡胚成纤维细胞上能够抑制H9N2禽流感病毒的复制。鸡胚试验中重组干扰素抗病毒效果好:在H9N2禽流感病毒攻毒组中, 能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2L g; 重组干扰素对新城疫病毒复制也有一定的抑制能力, 延迟该病毒复制时间为12h 至48h; 雏鸡试验表明重组干扰素也能较好地抵抗H9N2禽流感病毒对雏鸡的感染。两组试验均表明, 亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20倍左右。关键词 ChIFN_A 基因, 抗病毒效果, H9N2禽流感病毒, 新城疫病毒
中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号1000-3061(2006) 05-0737-07
Abstract The full le ngth of c hicken inte rferon alpha (ChIFN_A ) gene was amplified by the polymerase chain reaction(PCR) from total live r geno me of Sanhuang meat_chicken and sequenced. The a mplified gene was about 582bp. The coding region for mature protein (489bp) was subcloned into pET_28a(+). The recombinant plasmid pET_28a(+) _IFN A was ide ntified by enzy me digestion and DNA sequencing. Da ta of SDS_PAGE and Western_blotindic ated that a 22kD fusion protein was e xpressed in the for m of inclusion bodie s with good immunity. The purity of inclusion bodies was above 70%and tha t of protein purified by nickel affinity chromatography was 95%.The recombinant protein c ould inhibit H9N2avian influenza virus (H9N2AIV) replication on chick e mbryo fibroblast. 2L g of rec ombinant IF N_A c ould c ompletely protect Chick e mbryo from H9N2AI V infection. The recombinant I FN_A can also delay Ne wcastle disease virus (NDV) replica t ion on chick embryo for 12~48h. Chicken administered recombinant IF N_A can resist the H9N2AI V infection. The bioac t ivities of reco mbinant I FN_A purifie d by affinity c hroma tograph we re 20times higher than that of inclusion bodies. Key words chicken IFN_A gene, antiviral effec t, H9N2AI V, NDV
Received:April 24, 2006; Accepted:May 26, 2006.
*Corresponding author. Tel :86_27_87282608;E_mail:wei@webmail. hzau. edu. cn
738
Chinese J ournal o f Biotechnology 生物工程学报 2006, Vol 122, No 15
我国是最大的养禽国, 然而病毒病一直困扰着我国养禽业, 造成养禽业巨大的经济损失。目前一些禽类病毒性疾病仍然缺乏有效的治疗手段。化学
药物的使用易造成耐药性, 而且容易引起动物体内药物残留, 影响人类健康; 疫苗的研制则须考虑病毒变异和多样性。干扰素则是通过对自身免疫系统的调节来达到抗病毒的目的, 没有耐药性和药物残留的风险, 并且以其广谱的抗病毒活性, 受到了广泛的亲睐。
干扰素(Interferon, IFN) 是一类能诱导动物细胞产生多种广谱抗病毒蛋白的细胞因子, 具有抑制病毒繁殖、调节机体免疫反应的功能。IFN 基因分为Ñ型和Ò型, Ñ型IFN 又分为A 和B 等型, 均为无内含子的单拷贝或多拷贝基因。A 干扰素(IFN_A ) 是由能在脊椎动物的各种类型的细胞增殖的病毒诱导白细胞产生的, 其主要活性是抗病毒。鸡A 干扰素(ChI FN_A ) 全基因为582个碱基, 编码193个氨基酸, 其中前31个氨基酸为信号肽, 后162个氨基酸为成熟蛋白, 蛋白分子量约为19kD 。1994年, Sekellick
[2]
[1]
SPF 雏鸡由购买的SPF 鸡胚孵化。
2 方法
211 引物设计
根据NCBI 上基因序列号为AB021154的鸡I FN_A 基因序列, 设计两对引物, 分别用于鸡IFN_A 全基因(P1和P2) 的克隆和去掉信号肽的成熟蛋白编码基因的亚克隆(P3和P4) , 由宝生物工程公司合成, 其序列如下:
P1:5c _CCATGGCTGTGCC TGC AAGCCC AC AGC _3c 引入酶切位点Nco Ñ;
P2:5c _TTGTCGACC TAAGTGCGCGTGTTGC CTG T_3c 引入酶切位点Sal Ñ; P3:5c _TTGAATTCTGC AACCACC TTCGC CCCCAG_3c , 引入酶切位点Eco R Ñ; P4与P2同。
212 基因组DNA 的提取
参照5分子克隆实验指南6从三黄肉鸡肝组织中提取基因组DNA 。
213 基因克隆和测序
以三黄肉鸡鸡肝细胞基因组为模板, PCR 反应系统包括模板1L g, 上下游引物各50mmol P L, 总体积为20L L 。反应条件为:94e 、4min, 1个循环; 94e 、1min, 55e 、1min, 72e 、1min, 30循环; 最后72e 延伸10min 。鸡I FN_A 成熟蛋白编码基因的亚克隆反应条件同上, 引物为P3和P4。PCR 产物经110%琼脂糖凝胶电泳, 回收489bp 处DNA 带, 纯化后连pMD18_T 载体, 转化大肠杆菌D H5A 感受态细胞, 选单个菌落酶切鉴定, 阳性质粒命名为pIFN_A 并送TaKaRa 生物工程公司测序。214 重组表达质粒的构建
PCR 产物经Eco R1、Sal Ñ双酶切回收, 连pE T_28a(+) 载体。构建重组表达质粒pE T_28aIFNA 并转化大肠杆菌DH5A 感受态细胞, 氨苄青霉素抗性筛选, 酶切鉴定。
215 重组表达质粒的转化和鉴定
将pET_28aIFN A 重组子转化B L21(DE3) 感受态细胞, 氨苄青霉素抗性筛选, Eco R Ñ、Sal Ñ双酶切, 证明插入片段为目的基因。
216 在大肠杆菌中的表达
将鉴定好的pET_28aIFNA P B L21(DE3) 经氨苄青霉素抗性筛选为阳性后再接种于液体LB 培养基, 37e 震荡培养, OD 值为016时加IPTG 至终浓度为P L 等首次成功克隆和表达了ChIFN_A 基因, 并进行了
[3,4]
结构分析。Sick 等也报道了红色原鸡IFNA1、I FNA2和IFNA3基因序列并广泛开展了ChIFN_A 生物学功能的研究。本研究克隆和表达了ChIFN_A , 并实现了蛋白的高效表达和纯化, 在鸡胚试验和雏鸡试验中探讨了重组干扰素抗禽类病毒的活性, 为新型抗病毒生物制剂的研制奠定了基础。
1 材料
111 菌种与病毒
E . coli P DH5A 、B L21(DE3) 为本室保存, 鸡H9N2亚型禽流感病毒由本室分离并保存, 经国家流感中心鉴定为H9N2亚型。新城疫病毒为本室分离并保存。
112 质粒及相关试剂
pE T_28a (+) 均由本室保存, pMD_18T购自TaKa Ra 公司, 限制酶Eco R Ñ、Nco Ñ、Sal Ñ及T4DNA 连接酶等为Ta KaRa 产品。DNA 片段快速回收试剂盒购于北京原平皓生物技术公司。HisBind Kit 购于Nova gen 公司。其他试剂均为分析纯试剂。113 血清和酶标抗体
兔抗鸡IFN_A 多抗血清由本室制备, HRP 抗兔二抗为华美公司产品。114 SPF 鸡胚及雏鸡
,
韦 琴等:鸡A 干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究
739
之后, 离心收集菌体, SDS_PAGE分析, 确定最佳诱导时间。
217 SDS_PAGE
参照5分子克隆实验指南6, 采用12%的分离胶鉴定表达产物。
218 表达产物Western _blot鉴定
将SDS_PAGE凝胶电泳的蛋白带通过半干法转移至硝酸纤维膜上, 用含015%B SA 的TSBT 封闭2h, 兔抗鸡IFN_A 多抗作为一抗, 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔I gG 为二抗, DAB 作为底物进行显色。219 表达蛋白的纯化
21911 提取包涵体法:将诱导表达3h 的细菌培养物8000r P min 离心8min, 弃上清, 沉淀用缓冲液A (1P 10体积) 重悬, 超声波破碎。8000r P min 离心10min, 弃上清, 沉淀用PBS 洗涤2次, 加1917mL 缓冲液A 及013mL 20%SKL 贮存液, 剧烈搅动, 使其溶解, 静置30min 至2h, 4e 12000r P min 离心10min, 弃沉淀, 取上清。用PBS 稀释蛋白质浓度至1mg P mL, 内加终浓度为012%的PEG4000与1mmol P L 氧化型B 还原型谷胱甘肽(摩尔比为1B 4) 帮助变性的肽键依天然构象复性, 用大于20倍体积的PBS 共装入透析袋, 4e 磁力搅拌器搅拌透析复性, 每5h 换液一次, 换液6次后收集蛋白液, 分装-20e 保存。21912 镍亲和层析法:将诱导表达的细菌进行超声波裂解后以镍亲和层析柱纯化回收目的蛋白。方法按HisBind Kit 说明书操作并参照文献[6]。2110 重组鸡A 干扰素的抗病毒效果分析
211011 细胞病变抑制法分析干扰素抗病毒活性:将鸡胚成纤维细胞接种于96孔细胞培养板, 在37e , 5%CO 2的饱和二氧化碳水汽培养箱中培养到细胞长成单层。每列加入4倍系列稀释的重组干扰素, 各100L L P 孔, 同时设病毒对照和细胞对照, 培养24h 后, 每孔加入维持液(含015%胰酶) 稀释的H9N2禽流感病毒(100TCID 50) , 最后一列加维持液作为细胞对照。24h 后开始观察细胞病变。211012 鸡胚试验分析干扰素抗病毒效果:设计两个攻毒组, H9N2禽流感病毒攻毒组(group 1) 和新城疫病毒攻毒组(group 2) 。试验对象:9日龄鸡胚。具体方法:给与不同剂量的干扰素使鸡胚建立抗病毒状态, 在包涵体蛋白组中, 设5L g, 10L g, 20L g, 40L g, 80L g, 160L g 和3204L g 蛋白组及空白对照组共8组, 每组6枚; 在亲和层析纯化蛋白组中, 设015L g, 1L g, 2L g, 4L g 和8L g 蛋白组及空白对照组共6
组每([7-11]
[5]
EID 50) , 逐日观察鸡胚死亡情况。
211013 雏鸡试验分析干扰素抗病毒效果:设计一个攻毒组:H9N2禽流感病毒攻毒组(group 3) 。试验对象:2日龄雏鸡。在包涵体蛋白组中, 设10L g,
20L g, 40L g 和80L g 蛋白组及空白对照组共5组, 每组5只; 在亲和层析纯化蛋白组中, 设1L g, 2L g, 4L g 和8L g 蛋白组及空白对照组共5组, 每组5只。接种病毒200L L(100个LD 50) 。试验方法同211012。
3 结果
311 鸡IFN _A 的克隆及亚克隆
以鸡肝细胞基因组DNA 为模板, 按上述方法进行扩增, PC R 扩增产物经018%琼脂糖凝胶电泳后, 约在582bp 有一条特异带; 去掉信号肽的IFN_A 基因PCR 扩增产物为489bp(图1) , 两者均与预期片段大小相符。克隆序列全长582bp, 编码193个氨基酸, 其中成熟蛋白含162个氨基酸, 有4个糖基结合位点。核苷酸序列与GenBank 上基因序列号为AB021154的鸡的IFN_A 基因序列同源性为99%, 氨基酸序列同源性为98%。
图1 鸡A 干扰素基因亚克隆的扩增结果Fig. 1 Identificati on of subcloning PCR productions
1:DNA marker D L2000; 2:Negative control; 3:s ubcloning PCR produc t (489bp) .
PCR 回收产物与pMD18_T 载体连接后, 转化大肠杆菌D H5A 感受态细胞, 挑单个菌落提取质粒后, 用Eco R Ñ和Sal Ñ酶切, 得到216kb 和495bp 两条带与预期结果一致, 表明已将目的基因成功地克隆到pMD18_T 载体中(图2) 。
312 表达质粒pET28a_IFNA 的鉴定
PCR 回收产物与pE T_28a载体连接后, 转化大DH5A ,
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图4 Bl21P pET28a_IFNA SDS _PAGE及Western _blot分析
Fig. 4 SDS_PAGEanalysis of pE T28a_IFN A
图2 pMD_IFN A 的酶切鉴定
Fig. 2 Identification of recombinant plasmid p MD_IFNA
1:DNA marker (DL2000) ; 2:pMD _IFNA P Sal Ñ+Eco R Ñ; 3:D NA marker (DL15000).
expressed in BL21
1:sa mple of BL21P pET_28a_IFNA induced by IPTG for 0h; 2:sample of Bl21P pET28a_IFNA i nduced by IP TG for 1h, 3:s ample of Bl21P pET28a_IFN A i nduced by IPTG for 2h, 4:sample of Bl21P pET28a_IFNA induced by IP TG for 3h; M :protei n marker.
组质粒, 用Sal Ñ和Eco R Ñ酶切, 得到513kb 和
495bp 两条带与预期结果一致(图3) , 表明目的基因已成功地克隆到pET_28a载体中, 命名为pET28a_I FN A
。
度为70%以上, 蛋白含量为48811mg P L(图5A) ; 表达产物经过进一步纯化, 镍亲和层析后透析复性, 纯度
可达95%, 蛋白含量为9614mg P L(图5B) 。
图5 Bl21P pE T28a_IFN A 表达产物提纯的包涵体以及用镍亲和层析纯化的蛋白SDS_PAGE分析
图3 pE T28a_IFNA 重组质粒的双酶切鉴定Fig. 3 Identification of recombinan t plasmid pE T28a_IFNA
1:DNA marker (D L15000); 2:pET28a_IFNA P Sal Ñ+Eco R Ñ; 3:D NA marker (D L2000) .
Fig. 5 SDS _PAGEanalysis of pE T_28aP IFN A inclusionbodies and
the expressions purified by Ni 2+affini ty chromatograp h
1:sample of BL21P pET_28ai nduced by IPTG; 2:sample of BL21P pET_28a_IF N A i nduced by IPTG; 3:inclusi onbodies; 4:the expres sions purified by Ni 2+affinity c hromatograph; M:protein marker.
313 IF N_A 的表达及Western_blot鉴定
SDS_PAGE检测结果显示, 在22kD 处有有一条明显蛋白表达带, 占菌体总蛋白的23%, 并且表达产物主要为不溶性的包涵体。鸡IFN_A 蛋白约19kD, 与载体上一段氨基酸表达的蛋白融合后约为
22kD, 并且表达蛋白最佳诱导时间为3h(图4A) 。经Western_blot分析确证表达产物有良好的免疫学活性(图4B) 。
314 IF N_A 蛋白的纯化
315 鸡重组A 干扰素的抗病毒效果分析
31511 细胞病变抑制法分析干扰素抗病毒活性:在鸡胚成纤维细胞上分析经镍亲和层析透析复性的重组干扰素蛋白抗病毒活性, 结果显示空白对照孔
6
细胞生长良好, 阳性对照孔细胞病变严重, 4稀释后所加的细胞孔生长状态良好, 4稀释后所加的细胞孔25%的病变, 4稀释后所加的细胞孔80%的病变。证明重组干扰素能够抑制H9N2禽流感病毒的8
7
韦 琴等:鸡A 干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒效果研究
741
31512 鸡胚试验分析干扰素抗病毒效果:(1)H9N2禽流感病毒攻毒组(图6group 1) :
攻毒后48h 对照组鸡胚全部死亡。
在包涵体蛋白试验组中:攻毒后48h 给与10L g 和20L g 蛋白组鸡胚也全部死亡, 给与40L g 、80L g 及160L g 蛋白组存活率为100%, 给与320L g 蛋白组存活率为50%, 其中给与160L g 蛋白组抗病毒活性相对最高, 鸡胚孵出率为3313%。
在亲和层析纯化蛋白试验组中:攻毒后48h 所有组的存活率为100%, 给与1L g 蛋白组鸡胚孵出率为50%, 给与2L g 、4L g 及8L g 蛋白组孵出率均为100%。表明重组干扰素对H9N2禽流感病毒有100%的抵抗能力, 能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2L g 。(2) 新城疫病毒攻毒组(图6group 2) :
攻毒后72h 对照组鸡胚全部死亡。
在包涵体蛋白试验组中:攻毒后72h 给与10L g 、20L g 、40L g 蛋白组鸡胚也全部死亡, 给与80L g 及160L g 蛋白组存活率为50%, 给与320L g 蛋白组存活率为1617%。
在亲和层析纯化蛋白试验组中:攻毒后72h 所有的组均有存活率, 其中给与8L g 蛋白组鸡胚存活率为100%。由于所用的新城疫病毒致病性很强, 攻毒后96h 所有组鸡胚均死亡。表明重组鸡干扰素在鸡胚内能够延迟和减少该新城疫病毒(NDV)的后代病毒增殖, 延迟时间为12h 至48h 。
以鸡胚的存活率对攻毒后的时间作曲线, 分析干扰素抗病毒效果, 如图(8) 所示。两组试验均表明, 在鸡胚存活率相同的情况下, 亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20(160L g:8L g)
倍左右。
图6 pET28a_IFNA 对鸡胚攻毒(H9N2禽流感病毒和新城疫病毒) 后的保护率Fi g. 6 Efficacy of pE T28a_IFNA resistant to H9N2AIV and NDV on chick embryo
group1:the group challenged with H9N2AIV on chick embryo; group2:the group challenged w i th NDV on chick e mbryo. a:the hours of the chicken break out from chick embryo pos t challenged.
31513 雏鸡试验分析干扰素抗病毒效果
H9N2禽流感病毒攻毒组(图7group 3) :攻毒后108h 对照组雏鸡全部死亡。在包涵体蛋白试验组中:攻毒后108h, 给与10L g, 20L g 蛋白组雏鸡存活率分别为80%和60%, 给与40L g 蛋白以上组存活率为100%。在亲和层析纯化蛋白试验组中:攻毒后108h, 给与1L g 蛋白组雏鸡存活率为40%, 给与2L g 蛋白组雏鸡存活率为80%, 给与4L g 蛋白以上组雏鸡存以雏鸡的存活率对攻毒后的时间作曲线, 分析干扰素抗病毒效果, 如图(10) 所示。试验表明, 在雏鸡存活率相同的情况下, 亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20(80L g:4L g) 倍左右。
4 讨论
由于鸡A 干扰素属于Ñ型干扰素, 由不含内含子的多拷贝基因编码, 因此本研究直接以鸡肝基因组DNA 为模板克隆出了鸡A 干扰素基因, 省去了从
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Chinese J ournal o f Biotechnology 生物工程学报 2006, Vol 122, No 15
图7 pET28a_IFNA 对雏鸡攻毒(H9N2禽流感病毒) 后的保护率Fig. 7 Efficacy of pE T28a_IFNA resistant to H9N2AIV on chicken
G roup 3:the group challenged with H9N2AIV on chicken.
冗。
本研究中的鸡A 干扰素全长基因与GenBank 上登录号为AB021154的鸡A 干扰素序列的同源性为
99%, 与登录号为X84764的鸭干扰素相同部位基因同源性为75%, 说明该基因相对保守。在分析其序列时发现大肠杆菌稀有密码子在本基因开放读码框中不多见, Arg 稀有密码子CGG 仅有两个, AGA 、AGG 、CGA 则没有, 因此推测本研究中目的基因曾不表达和密码子偏爱性无关。本研究曾采用两种原核表达载体pE T_28a载体和pGEX_KG 载体表达干扰素全长基因, 均没有获得表达, 将干扰素基因的信号肽缺失掉, 结果在Bl21P pET_28a中获得高效表达, 在Bl21P pGE X_KG 中没有得到表达, 这表明信号肽在表达中起到了负面作用, 可能是信号肽往往带有疏水性蛋白, 不利于外源基因在原核中的表达, 并且不同的载体系统会影响干扰素基因的表达。
金属离子亲和层析技术的最大优点在于利用它可以从粗提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质, 具有高收率、高纯度、能保持生物大分子天然状态等优点, 广泛的应用于生物大分子的分离纯化。本研究表达的融合蛋白带有6@His (多聚组氨酸标签) , 这一供电子的氨基酸残基十分有利于目的蛋白与固定化金属离子Ni 结合, 从而可以将目的蛋白分离纯化。本研究采用的是透析复性, 研究表明蛋白浓度对复性影响很大, 包涵体蛋白在透析的过程中, 蛋白浓度过高容易发生沉淀, 把复性浓度调到011~015mg P m L 时, 蛋白沉淀很少, 复性效果好。总的来说, 镍亲和层析纯化的蛋白纯度较高, 可以达到95%, 生物活性也相对较高, 但是相对提取包涵体法, 对试验试剂和材料要求较高, 操作方法相对繁杂; 试验证明提取包涵体法获得的重组干2+
两种方法各有优势, 操作起来可以根据根据实际情况各取所需。
9日龄鸡胚试验中显示, 干扰素蛋白含量在一定的范围内有很好的抗H9N2禽流感病毒效果, 且试验重复性好, 抗病毒活性随着蛋白含量的增加而增高; 在H9N2禽流感病毒攻毒组中, 能保护鸡胚并使其孵出率达到100%的重组干扰素最小蛋白含量为2L g, 表明干扰素抵抗H9N2禽流感病毒能力强。在9日龄鸡胚H9N2禽流感病毒攻毒组和新城疫病毒攻毒组两组试验中, 我们发现给与320L g 包涵体蛋白组对鸡胚保护率均有所降低, 这说明蛋白含量过高会对机体产生副作用, 影响存活率。雏鸡试验中也显示了其良好的抗H9N2禽流感病毒作用。鸡胚和雏鸡两组试验均表明亲和层析纯化蛋白是包涵体蛋白活性的20倍左右, 表明蛋白纯度越高, 活性越好。
本研究成功地表达和纯化了干扰素, 表达的重组干扰素抗病毒生物活性高, 对H9N2禽流感病毒有100%的抵抗能力, 对新城疫病毒的复制也有一定的抑制能力, 显示了其良好的抗病毒活性, 为新型广谱抗病毒生物制剂的研制和干扰素的大批量生产奠定了基础。
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31413 写法:
1) 最好用重要的事实开头, 避免用第一人称或辅助从句开头。2) 用过去时态叙述作者工作, 用现在时态叙述作者结论。3) 关键词应明确、具体, 一些模糊、笼统的词语最好不用, 如基因、表达, ,
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