第34卷
2006年7月 分析化学（FENXIHUAXUE） 评述与进展
ChineseJOurnaIOfAnaIyticaIChemistry 第7期
1030~1034
…… ………………… …… 评述与进展
!"引""言
荧光显微镜在生物学和医学领域已得到了广泛应用，是观测细胞形态、结构和生命现象的有力工［1~6］具。荧光显微镜作为一种必不可少的分析手段，常用于定性观察细胞内部荧光物质的空间分布和强度分布，得到细胞的荧光图像，研究细胞的结构。然而荧光显微镜不能定量给出图像发光的强度数值，无法研究细胞图像发光强度变化不大或荧光物质空间分布变化细微的生理过程。因此，随着生物医学的飞速发展，迫切需要有更高灵敏度，操作更快捷，功能更加完备的仪器来满足生物学和医学研究发展的要求。荧光显微镜与荧光光谱仪耦合而成的系统仪器能够获取显微荧光成像及微区荧光强度、荧光寿命的测定信息。选择荧光探针对被标记物进行特异性标记，荧光探针的亮度即荧光强度可反映被标记物相对含量的多少。荧光显微镜对图像采集后，荧光光谱仪可测量图像的荧光强度，对获取的图像进行荧光强度的定量，为全面分析和研究细胞内部结构提供更加详尽的数据信息。
#"荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统及特点
应用单臂光纤连接荧光显微镜与荧光光谱仪，实现荧光光谱测量和细胞实时成像二维信号的同时采集。以高频脉冲激光器作为激发光源激发显微镜下样品，使之发射出可见范围内的波长，呈现荧光映像。用荧光显微镜的物镜收集信号，通过单臂光纤将耦合好的荧光信号从荧光显微镜传导至荧光光谱仪，记录荧光发射光谱。电感耦合相机（chargedcOupIeddevice，CCD）摄像系统作为光电传感器用于显微镜图像获取技术采集细胞图像，并将图像信号转换成电信号输入计算机进行数据读取及图像处理，获取微区荧光光谱扫描谱图的详细信息，并对图像进行采集、曝光调整、多色彩空间的影像编辑、预定义的影像设置、自动调焦、自动后处理加工调整，获得色彩鲜艳、清晰度高的影像。应用光纤耦合荧光光谱仪与荧光显微镜，配合荧光图像扫描显微荧光光谱及进行微区荧光寿命的测定（超高时间分辨率，可得到复合物中不同组分的荧光寿命），优化升级了作为单一仪器的功能。红敏光电倍增管（PMT）和红外PMT切换使用满足超宽光谱范围探测（200~1700nm），适合从紫外到近红外波段荧光光谱的特性研究，为生物体系中近红外荧光探针的开发应用研究提供了有力的支持。
$"生物分析中的应用
荧光探针是设计用来进行生物标本特定区域内定位或对特定刺激反应的荧光团，可以高度敏感性和选择性的检测复杂生物分子及活细胞中的特定成分。相对于常规荧光检测而言，在近红外光区，生 2005-10-19收稿；2005-11-15接受
本文系教育部优秀人才支持计划（NCET）和国家自然科学基金（NO.20575036，20335030）资助………………… 荧光成像在生物分析中的应用张宁 陈蓁蓁 唐波＊（山东师范大学化学化工与材料科学学院，济南250014）摘 要 荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统可获取显微荧光成像及微区荧光光谱、荧光寿命的测定信息，广泛应用于细胞、组织中蛋白质的结构功能分析，核酸的识别检测，金属离子、自由基的定量测定，以及纳米生物探针的研制等生物分析研究的热点领域。本文引用文献46篇，综述了荧光成像在生物分析中的应用新进展。荧光成像，生物分析，综述关键词 荧光显微镜与荧光光谱仪耦合，
物基体光吸收或荧光强度很小，且致密介质（如组织）的光散射明显降低，激发光的穿透性更强，因而自发荧光的背景干扰显著降低。荧光探针由于其特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的优点，且其测定条件适宜生命体的生理环境而被广泛地应用于生命科学研究领域。设计近红外荧光探针引入组织和细胞，富集在组织和细胞的特定成分中，在荧光显微镜下不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、生物大分子等进行实时观察和检测，配合荧光光谱仪获取荧光图像的量化信息。因此，荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统在生物分析领域中将具有广泛的应用前景。
3.1 蛋白质结构和功能分析及核酸的识别检测
生物体内细胞的生理状态受内部和外部因素的影响，可通过基因表达和后续的蛋白质表达表现出来。因此，蛋白质的结构与功能研究是认识生命过程的关键。活细胞内蛋白质的显微荧光成像分析是
［7~12］［13］生物显微技术的一个重要方面。Dawn等成功设计合成了活细胞中定点标记N端为半胱氨酸
蛋白质的一系列荧光分子探针。这种荧光分子探针利用生理条件下含硫代酸酯的小分子可有效穿过细胞膜与N端为半胱氨酸的蛋白质进行化学选择性反应产生荧光，跟踪检测蛋白质的功能及相互作用。利用荧光显微镜观察了探针标记细胞的显微荧光成像，根据荧光光谱确定探针的发射波长处于近红外波段，适用于活细胞中蛋白质的荧光成像分析检测。
生命活动离不开酶的催化作用，机体内的物质代谢在酶的催化下有条不紊地进行。酶是由活细胞合成的，是能够对特异底物起高效催化作用的蛋白质。基于荧光的酶分析方法随着酶荧光探针的开发得以广泛应用，荧光显微镜常用于检测荧光酶细胞化学的作用。为了研究某些细胞内的生理过程，经
［14］常将荧光共振能量转移（FRET）与荧光显微技术结合起来。Mupam等就通过荧光显微镜、CCD和荧
光光谱仪来进行完整细胞中FRET发生的定位，将细胞内的理化反应研究提高到细胞器的水平。
［15］Chi-wang等利用FRET工作原理设计的荧光探针包括一个对已知蛋白激酶特异性识别的底物结构
域，一个与磷酸化丝氨酸底物结构相结合的磷酸化识别结构域。当底物结构被磷酸化后，分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折叠，探针两端两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量转移。荧光光谱提供分子发生磷酸化前后的荧光强度变化，荧光显微镜获得FRET成像反映供体蛋白与受体蛋白之间的相互作用，做到活细胞内定时、定量、定位地观测蛋白激酶活性变化。
核酸是生命的信息物质，对蛋白质的合成、细胞分裂和复制以及生物遗传起着重要作用。荧光探针技术具备方法简便，灵敏度高等优点，结合荧光显微镜应用于核酸的定量分析、结构及作用机理的研究
［16~21］日益广泛。分子信标作为敏感、特异的核酸探针，通过空间结构改变决定发射荧光特性，实现活
［22~24］细胞中核酸的定位信息采集及定量检测，利用分子信标技术可以对生物大分子在活体内的代谢等
［25］动态过程进行跟踪分析。Santangddo等设计了一对与待测目标mRNA序列互补的新型分子信标，制
成脂质体使之摄入细胞，与目标mRNA杂化时产生FRET，较之单一分子信标有效抑制了主动错误信息的检出，灵敏定量检测目标mRNA。应用显微注射法注入活体细胞获取荧光显微成像，检测荧光强度实时反映活体RNA的代谢转移过程。
3.2 金属离子检测
金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+在生物学结构和活性方面起重要作用。设计荧光探针与金属离子结合，
［26~28］应用荧光显微技术检测细胞内游离金属离子的变化，具有灵敏度高，操作便捷等优点。
Ca2+代谢普遍存在于活细胞，起着调节细胞功能的重要作用。快速、准确测量细胞内游离Ca2+浓
［29］度及其分布，具有重要的分析价值。线粒体具有较高的Ca2+摄取能力，Tadafumi等运用细胞通透性
阳离子荧光探针Rhod-2测定线粒体内Ca2+浓度的瞬变，探寻线粒体Ca2+调节与EB病毒转染淋巴细胞的关系。Ca2+活动引起荧光强度改变，配合荧光显微镜可以清晰观察到胞内Ca2+的浓度分布。Zn2+在
［30］细胞生长、生存中所起到的关键作用已在生物学和生理学中得到认识。Carodyn等设计了定量检测
细胞内游离Zn2+的荧光探针Coumazin-1，通过荧光显微镜对比观察探针标记~dla细胞在Zn2+存在前后时的荧光成像，进一步认识探针的特异性标记作用。荧光仪与荧光显微镜的耦合可以定量测定细胞内Zn2+的浓度并获得形象直观的荧光成像。Mg2+在生命过程中能够促进骨及细胞形成，介导酶反应，参与体内能量代谢，并在能量的输送、储存中起着关键的作用。选择合适的荧光探针分析研究Mg2+具
［31］有重要的现实意义。Kirokazu等设计合成了测定细胞内Mg2+浓度的荧光探针KMG-101、103和104，
量子产率高，荧光信号强。利用荧光显微镜观察细胞内Mg2+的浓度分布，得到满意结果。
!"!#自由基测定
生命活动的代谢过程不断产生各种自由基，超氧阴离子自由基（O2-・）、羟基自由基（OH・）、双氧水（H2O2）、一氧化氮自由基（NO）和脂自由基（ROO・）是具有代表性的重要活性氧自由基。自由基能够介导生命活动的许多重要反应过程，参与细胞免疫功能。但也能够对组织细胞的化学结构发生破坏性修饰，损伤正常组织细胞的形态和膜功能。目前，设计适用于生命体系的红外、近红外自由基捕获剂
［32~33］结合荧光显微技术在线识别检测自由基迅速发展。
［34］Eita等根据光诱导电子转移（PET）理论设计了测定活体器官内NO的近红外荧光探针DAC-P
和DAC-S。当NO存在时，电子的激发使探针分子内给体和受体之间发生电子转移（ET），从而生成不同于初始状态的电荷分离态（CT），探针两态具有可测光物理性能的差别，即可以观察到荧光显著增强的现象。探针成功运用于小鼠肾中NO的测定，荧光显微镜下观察到随着NO浓度的增高，探针标记的小鼠肾细胞荧光明显增强，应用荧光光谱仪扫描得到荧光光谱，发现荧光强度与NO的浓度成线性关
［35］系，进一步证实了此近红外荧光探针应用于检测生物器官内NO的可行性及实用性。Chang等合成
了一种具有高度选择性测定细胞内H2O2的光学探针PF1（Peroxfluor-1），探针自身不发荧光，与H2O2结合产生发光产物荧光素。将活细胞样品用PF1诱导，加入H2O2可直接在荧光显微镜下观察到细胞的荧光成像，证实了探针对H2O2的选择性识别。本课题组合成一种三碳花菁染料，将其用作测定H2O2
［36］的近红外荧光探针，建立了流动注射荧光法测定痕量H2O2的灵敏方法。荧光显微镜与荧光光谱仪
耦合系统将为自由基的活体检测及荧光成像分析提供有力的工具。
本课题组正在开展红外、近红外新型自由基捕获剂和荧光探针的合成、表征工作，研究实时、在线识别检测复杂生命体系中各种自由基的红外、近红外荧光分析过程的新方法。设计合成了选择性测定细胞内H2O2的近红外荧光探针萘荧光素二磺酸酯（NFDS-1），探针自身不发荧光，当与H2O2结合后恢复为荧光物质萘荧光素，产生强烈荧光。运用探针诱导加入H2O2的小鼠腹腔巨噬细胞，获得细胞的显微
［37］荧光成像，证实了探针对H2O2的选择性识别作用。
!"$#纳米生物探针的研制
随着纳米时代的到来，纳米技术结合荧光显微术广泛用于观察活细胞内部的工作情况，探索细胞核内的生命秘密。纳米粒子作为光学探针或传感器用于获取生物大分子信息的研究发展迅速，荧光成
［38~42］像法已发展到量子点荧光成像的水平。
纳米荧光量子点分析技术的提出，在基因和蛋白质分析过程中发挥了重要作用并显示出进一步的应用潜力。尤其在细胞成像方面，通过观察量子点标记分子与其靶分子相互作用的部位，及其在活细胞内的运行轨迹，可能为信号传递的分子机制提供线索，为阐明细胞生长发育的调控及癌变规律提供直观依据，这是目前常用的有机荧光染料无法实现的。半导体量子点作为纳米生物探针具有独特的光谱特性，较高的光化学稳定性，经检测量子点的荧光寿命比普通有机染料分子高，可以采取时间分辨技术检测信号，大幅度降低荧光背景对检测信号的干扰。量子点在追踪多种蛋白质或细胞时，只需要一台荧光
［43］显微镜，即可记录被色彩编码的目标每一分钟间隔的动态并延续数天之久。Bruchez等报道可以通
过静电引力、氢键作用或特异的配体-受体相互作用将生物分子结合在量子点的表面。他们采用两种不同发光的量子点标记3T3小鼠的纤维细胞，即将发射红色荧光的量子点成功标记在F2肌动蛋白丝上，而发射绿光的量子点与尿素和乙酸结合，这样的量子点与细胞核具有高亲和力，并且可以同时在细胞中
［44］观察到红色和绿色的荧光。林章碧等用巯基丙酸修饰CdTe纳米粒子并用它标记了生物分子胰蛋白
酶，研究了标记前后的荧光光谱的变化，证明了光谱的变化是由于CdTe纳米粒子与胰蛋白酶之间的结
［45］合反应引起的。James等制备了在红外区发光的CdHgTe/ZnS核壳材料，并用磷脂囊泡进行包覆。
他们用这种材料成功地标记了活的P815肥大细胞。
一维光学纳米探针借助于共价键或者静电吸引等非共价键作用来识别生物大分子、生命相关离子等目标物质，最终实现与客体的多点、阵列结合，可以对客体进行定性、定量分析；同时，一维光学纳米探
针可以增加与受体分子的结合位点，增强结合的牢固程度。多点识别体系的建立可以大大提高选择性和灵敏度，这就为生物学和医学的研究提供了一种新的途径，研究一维光学纳米探针在上述领域的应用
［46］有着非常重要的科学意义。本课题组制备了高发光、水溶性的一维CdTe量子线与纳米棒，基于静电
通过荧光光谱分析证实了量子线与亲和素相互作用的原理，将合成的CdTe量子线用于亲和素的标记，
分子之间通过静电作用结合，为进一步用量子线标记生物素化蛋白、抗体或DNA奠定了基础。4 结束语
综上所述，荧光成像生物分析的迅速发展，深化了人们在分子水平上对生物化学过程的了解。生化分析仪器在科学发展过程中发挥着巨大作用。荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统广泛适用于细胞生物学、生物化学、生理学、神经生物学、病理学等生物医学研究领域，它能对完整的活细胞和组织或固定的细胞和组织内各种结构进行定性、定量和定位的测量，功能强大，可操作性强，特别在细胞生理过程的定量研究方面具有单一仪器无法比拟的优势。
生命科学研究推动了荧光成像生物分析的进一步发展，其中活细胞单分子行为研究在荧光成像生物分析中的前沿领域。存在于细胞内的单分子，其周围环境十分复杂，这就需要用于细胞内研究的手段有实质性突破。目前有两大问题横亘在新的荧光成像技术探索的道路上：一是细胞在可见光区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖；二是对所研究分子的长期荧光标记观察。这就迫切需要研制开发光稳定性好的近红外荧光探针。预计新一代量子点技术的优势在细胞内单分子研究、高清晰度活细胞成像、长时程观察活细胞迁移方面将发挥巨大的潜力。荧光成像生物分析需要克服诸多技术难点，如细胞背底干扰，标记分子的光漂白时间，标记物对生物分子行为的影响，细胞内单个分子在Z轴方向运动的观察等。解决困难需要致力于改进或创造基本技术，需要硬件及信息技术的支撑、多种技术的联用等。双光子荧光显微技术活体研究神经系统的可塑性是荧光成像技术进步的重大突破。双光子成像的优势是激发波长在近红外区域，可以穿透很厚的标本，而对标本损伤很小，适于活体观察，光漂白作用也小。本课题组正在设计合成适用于生命体系及荧光成像生物分析的近红外分子荧光探针、双光子荧光探针、纳米生物探针，利用荧光探针动态检测活细胞、活组织内的代谢过程，并与其他生物学结合定性、定量地检测组织细胞中的特定成分，对新型药物的开发，肿瘤及自身免疫性疾病的诊断，基因表达，基因诊断等将具有重要的意义。
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RecentApplicationsofFluorescenceImaginginBioanalysis
ZhangNing，ChenZhenzhen，TangBo＊
（CollegeofChemistry，ChemicalEngineeringandMaterialsScience，ShandongNormalUniversity， inan250014）
Abstract Fiuorescencemicroscopyandfiuorescencespectrofiuorimetercoupiingsystemcanacguirefiuores-cenceimagesandmeasurefiuorescencespectrumandfiuorescenceiifetime.Thefunctionsofthecoupiingsystemmakeithavewideappiicationsinactivebioanaiysisresearchfieidsinciudinginvestigationofproteinstructureandfunctioninceiiandtissue，recognitionanddetectionofnucieicacids，guantitativemeasurementsofmetaiiicionsandfreeradicais，etc..Fortysixreferenceswerecitedforreviewingrecentappiicationsoffiuorescenceimaginginbioanaiysis.
Keywords Fiuorescencemicroscopyandfiuorescencespectrofiuorimetercoupiingsystem，fiuorescence
（Received19October2005；accepted15November2005）imaging，bioanaiysis，review
荧光成像在生物分析中的应用
作者：
作者单位：
刊名：
英文刊名：
年，卷(期)：
被引用次数：张宁， 陈蓁蓁， 唐波， Zhang Ning， Chen Zhenzhen， Tang Bo山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南,250014分析化学CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY2006,34(7)2次
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第34卷
2006年7月 分析化学（FENXIHUAXUE） 评述与进展
ChineseJOurnaIOfAnaIyticaIChemistry 第7期
1030~1034
…… ………………… …… 评述与进展
!"引""言
荧光显微镜在生物学和医学领域已得到了广泛应用，是观测细胞形态、结构和生命现象的有力工［1~6］具。荧光显微镜作为一种必不可少的分析手段，常用于定性观察细胞内部荧光物质的空间分布和强度分布，得到细胞的荧光图像，研究细胞的结构。然而荧光显微镜不能定量给出图像发光的强度数值，无法研究细胞图像发光强度变化不大或荧光物质空间分布变化细微的生理过程。因此，随着生物医学的飞速发展，迫切需要有更高灵敏度，操作更快捷，功能更加完备的仪器来满足生物学和医学研究发展的要求。荧光显微镜与荧光光谱仪耦合而成的系统仪器能够获取显微荧光成像及微区荧光强度、荧光寿命的测定信息。选择荧光探针对被标记物进行特异性标记，荧光探针的亮度即荧光强度可反映被标记物相对含量的多少。荧光显微镜对图像采集后，荧光光谱仪可测量图像的荧光强度，对获取的图像进行荧光强度的定量，为全面分析和研究细胞内部结构提供更加详尽的数据信息。
#"荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统及特点
应用单臂光纤连接荧光显微镜与荧光光谱仪，实现荧光光谱测量和细胞实时成像二维信号的同时采集。以高频脉冲激光器作为激发光源激发显微镜下样品，使之发射出可见范围内的波长，呈现荧光映像。用荧光显微镜的物镜收集信号，通过单臂光纤将耦合好的荧光信号从荧光显微镜传导至荧光光谱仪，记录荧光发射光谱。电感耦合相机（chargedcOupIeddevice，CCD）摄像系统作为光电传感器用于显微镜图像获取技术采集细胞图像，并将图像信号转换成电信号输入计算机进行数据读取及图像处理，获取微区荧光光谱扫描谱图的详细信息，并对图像进行采集、曝光调整、多色彩空间的影像编辑、预定义的影像设置、自动调焦、自动后处理加工调整，获得色彩鲜艳、清晰度高的影像。应用光纤耦合荧光光谱仪与荧光显微镜，配合荧光图像扫描显微荧光光谱及进行微区荧光寿命的测定（超高时间分辨率，可得到复合物中不同组分的荧光寿命），优化升级了作为单一仪器的功能。红敏光电倍增管（PMT）和红外PMT切换使用满足超宽光谱范围探测（200~1700nm），适合从紫外到近红外波段荧光光谱的特性研究，为生物体系中近红外荧光探针的开发应用研究提供了有力的支持。
$"生物分析中的应用
荧光探针是设计用来进行生物标本特定区域内定位或对特定刺激反应的荧光团，可以高度敏感性和选择性的检测复杂生物分子及活细胞中的特定成分。相对于常规荧光检测而言，在近红外光区，生 2005-10-19收稿；2005-11-15接受
本文系教育部优秀人才支持计划（NCET）和国家自然科学基金（NO.20575036，20335030）资助………………… 荧光成像在生物分析中的应用张宁 陈蓁蓁 唐波＊（山东师范大学化学化工与材料科学学院，济南250014）摘 要 荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统可获取显微荧光成像及微区荧光光谱、荧光寿命的测定信息，广泛应用于细胞、组织中蛋白质的结构功能分析，核酸的识别检测，金属离子、自由基的定量测定，以及纳米生物探针的研制等生物分析研究的热点领域。本文引用文献46篇，综述了荧光成像在生物分析中的应用新进展。荧光成像，生物分析，综述关键词 荧光显微镜与荧光光谱仪耦合，
物基体光吸收或荧光强度很小，且致密介质（如组织）的光散射明显降低，激发光的穿透性更强，因而自发荧光的背景干扰显著降低。荧光探针由于其特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的优点，且其测定条件适宜生命体的生理环境而被广泛地应用于生命科学研究领域。设计近红外荧光探针引入组织和细胞，富集在组织和细胞的特定成分中，在荧光显微镜下不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、生物大分子等进行实时观察和检测，配合荧光光谱仪获取荧光图像的量化信息。因此，荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统在生物分析领域中将具有广泛的应用前景。
3.1 蛋白质结构和功能分析及核酸的识别检测
生物体内细胞的生理状态受内部和外部因素的影响，可通过基因表达和后续的蛋白质表达表现出来。因此，蛋白质的结构与功能研究是认识生命过程的关键。活细胞内蛋白质的显微荧光成像分析是
［7~12］［13］生物显微技术的一个重要方面。Dawn等成功设计合成了活细胞中定点标记N端为半胱氨酸
蛋白质的一系列荧光分子探针。这种荧光分子探针利用生理条件下含硫代酸酯的小分子可有效穿过细胞膜与N端为半胱氨酸的蛋白质进行化学选择性反应产生荧光，跟踪检测蛋白质的功能及相互作用。利用荧光显微镜观察了探针标记细胞的显微荧光成像，根据荧光光谱确定探针的发射波长处于近红外波段，适用于活细胞中蛋白质的荧光成像分析检测。
生命活动离不开酶的催化作用，机体内的物质代谢在酶的催化下有条不紊地进行。酶是由活细胞合成的，是能够对特异底物起高效催化作用的蛋白质。基于荧光的酶分析方法随着酶荧光探针的开发得以广泛应用，荧光显微镜常用于检测荧光酶细胞化学的作用。为了研究某些细胞内的生理过程，经
［14］常将荧光共振能量转移（FRET）与荧光显微技术结合起来。Mupam等就通过荧光显微镜、CCD和荧
光光谱仪来进行完整细胞中FRET发生的定位，将细胞内的理化反应研究提高到细胞器的水平。
［15］Chi-wang等利用FRET工作原理设计的荧光探针包括一个对已知蛋白激酶特异性识别的底物结构
域，一个与磷酸化丝氨酸底物结构相结合的磷酸化识别结构域。当底物结构被磷酸化后，分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折叠，探针两端两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量转移。荧光光谱提供分子发生磷酸化前后的荧光强度变化，荧光显微镜获得FRET成像反映供体蛋白与受体蛋白之间的相互作用，做到活细胞内定时、定量、定位地观测蛋白激酶活性变化。
核酸是生命的信息物质，对蛋白质的合成、细胞分裂和复制以及生物遗传起着重要作用。荧光探针技术具备方法简便，灵敏度高等优点，结合荧光显微镜应用于核酸的定量分析、结构及作用机理的研究
［16~21］日益广泛。分子信标作为敏感、特异的核酸探针，通过空间结构改变决定发射荧光特性，实现活
［22~24］细胞中核酸的定位信息采集及定量检测，利用分子信标技术可以对生物大分子在活体内的代谢等
［25］动态过程进行跟踪分析。Santangddo等设计了一对与待测目标mRNA序列互补的新型分子信标，制
成脂质体使之摄入细胞，与目标mRNA杂化时产生FRET，较之单一分子信标有效抑制了主动错误信息的检出，灵敏定量检测目标mRNA。应用显微注射法注入活体细胞获取荧光显微成像，检测荧光强度实时反映活体RNA的代谢转移过程。
3.2 金属离子检测
金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+在生物学结构和活性方面起重要作用。设计荧光探针与金属离子结合，
［26~28］应用荧光显微技术检测细胞内游离金属离子的变化，具有灵敏度高，操作便捷等优点。
Ca2+代谢普遍存在于活细胞，起着调节细胞功能的重要作用。快速、准确测量细胞内游离Ca2+浓
［29］度及其分布，具有重要的分析价值。线粒体具有较高的Ca2+摄取能力，Tadafumi等运用细胞通透性
阳离子荧光探针Rhod-2测定线粒体内Ca2+浓度的瞬变，探寻线粒体Ca2+调节与EB病毒转染淋巴细胞的关系。Ca2+活动引起荧光强度改变，配合荧光显微镜可以清晰观察到胞内Ca2+的浓度分布。Zn2+在
［30］细胞生长、生存中所起到的关键作用已在生物学和生理学中得到认识。Carodyn等设计了定量检测
细胞内游离Zn2+的荧光探针Coumazin-1，通过荧光显微镜对比观察探针标记~dla细胞在Zn2+存在前后时的荧光成像，进一步认识探针的特异性标记作用。荧光仪与荧光显微镜的耦合可以定量测定细胞内Zn2+的浓度并获得形象直观的荧光成像。Mg2+在生命过程中能够促进骨及细胞形成，介导酶反应，参与体内能量代谢，并在能量的输送、储存中起着关键的作用。选择合适的荧光探针分析研究Mg2+具
［31］有重要的现实意义。Kirokazu等设计合成了测定细胞内Mg2+浓度的荧光探针KMG-101、103和104，
量子产率高，荧光信号强。利用荧光显微镜观察细胞内Mg2+的浓度分布，得到满意结果。
!"!#自由基测定
生命活动的代谢过程不断产生各种自由基，超氧阴离子自由基（O2-・）、羟基自由基（OH・）、双氧水（H2O2）、一氧化氮自由基（NO）和脂自由基（ROO・）是具有代表性的重要活性氧自由基。自由基能够介导生命活动的许多重要反应过程，参与细胞免疫功能。但也能够对组织细胞的化学结构发生破坏性修饰，损伤正常组织细胞的形态和膜功能。目前，设计适用于生命体系的红外、近红外自由基捕获剂
［32~33］结合荧光显微技术在线识别检测自由基迅速发展。
［34］Eita等根据光诱导电子转移（PET）理论设计了测定活体器官内NO的近红外荧光探针DAC-P
和DAC-S。当NO存在时，电子的激发使探针分子内给体和受体之间发生电子转移（ET），从而生成不同于初始状态的电荷分离态（CT），探针两态具有可测光物理性能的差别，即可以观察到荧光显著增强的现象。探针成功运用于小鼠肾中NO的测定，荧光显微镜下观察到随着NO浓度的增高，探针标记的小鼠肾细胞荧光明显增强，应用荧光光谱仪扫描得到荧光光谱，发现荧光强度与NO的浓度成线性关
［35］系，进一步证实了此近红外荧光探针应用于检测生物器官内NO的可行性及实用性。Chang等合成
了一种具有高度选择性测定细胞内H2O2的光学探针PF1（Peroxfluor-1），探针自身不发荧光，与H2O2结合产生发光产物荧光素。将活细胞样品用PF1诱导，加入H2O2可直接在荧光显微镜下观察到细胞的荧光成像，证实了探针对H2O2的选择性识别。本课题组合成一种三碳花菁染料，将其用作测定H2O2
［36］的近红外荧光探针，建立了流动注射荧光法测定痕量H2O2的灵敏方法。荧光显微镜与荧光光谱仪
耦合系统将为自由基的活体检测及荧光成像分析提供有力的工具。
本课题组正在开展红外、近红外新型自由基捕获剂和荧光探针的合成、表征工作，研究实时、在线识别检测复杂生命体系中各种自由基的红外、近红外荧光分析过程的新方法。设计合成了选择性测定细胞内H2O2的近红外荧光探针萘荧光素二磺酸酯（NFDS-1），探针自身不发荧光，当与H2O2结合后恢复为荧光物质萘荧光素，产生强烈荧光。运用探针诱导加入H2O2的小鼠腹腔巨噬细胞，获得细胞的显微
［37］荧光成像，证实了探针对H2O2的选择性识别作用。
!"$#纳米生物探针的研制
随着纳米时代的到来，纳米技术结合荧光显微术广泛用于观察活细胞内部的工作情况，探索细胞核内的生命秘密。纳米粒子作为光学探针或传感器用于获取生物大分子信息的研究发展迅速，荧光成
［38~42］像法已发展到量子点荧光成像的水平。
纳米荧光量子点分析技术的提出，在基因和蛋白质分析过程中发挥了重要作用并显示出进一步的应用潜力。尤其在细胞成像方面，通过观察量子点标记分子与其靶分子相互作用的部位，及其在活细胞内的运行轨迹，可能为信号传递的分子机制提供线索，为阐明细胞生长发育的调控及癌变规律提供直观依据，这是目前常用的有机荧光染料无法实现的。半导体量子点作为纳米生物探针具有独特的光谱特性，较高的光化学稳定性，经检测量子点的荧光寿命比普通有机染料分子高，可以采取时间分辨技术检测信号，大幅度降低荧光背景对检测信号的干扰。量子点在追踪多种蛋白质或细胞时，只需要一台荧光
［43］显微镜，即可记录被色彩编码的目标每一分钟间隔的动态并延续数天之久。Bruchez等报道可以通
过静电引力、氢键作用或特异的配体-受体相互作用将生物分子结合在量子点的表面。他们采用两种不同发光的量子点标记3T3小鼠的纤维细胞，即将发射红色荧光的量子点成功标记在F2肌动蛋白丝上，而发射绿光的量子点与尿素和乙酸结合，这样的量子点与细胞核具有高亲和力，并且可以同时在细胞中
［44］观察到红色和绿色的荧光。林章碧等用巯基丙酸修饰CdTe纳米粒子并用它标记了生物分子胰蛋白
酶，研究了标记前后的荧光光谱的变化，证明了光谱的变化是由于CdTe纳米粒子与胰蛋白酶之间的结
［45］合反应引起的。James等制备了在红外区发光的CdHgTe/ZnS核壳材料，并用磷脂囊泡进行包覆。
他们用这种材料成功地标记了活的P815肥大细胞。
一维光学纳米探针借助于共价键或者静电吸引等非共价键作用来识别生物大分子、生命相关离子等目标物质，最终实现与客体的多点、阵列结合，可以对客体进行定性、定量分析；同时，一维光学纳米探
针可以增加与受体分子的结合位点，增强结合的牢固程度。多点识别体系的建立可以大大提高选择性和灵敏度，这就为生物学和医学的研究提供了一种新的途径，研究一维光学纳米探针在上述领域的应用
［46］有着非常重要的科学意义。本课题组制备了高发光、水溶性的一维CdTe量子线与纳米棒，基于静电
通过荧光光谱分析证实了量子线与亲和素相互作用的原理，将合成的CdTe量子线用于亲和素的标记，
分子之间通过静电作用结合，为进一步用量子线标记生物素化蛋白、抗体或DNA奠定了基础。4 结束语
综上所述，荧光成像生物分析的迅速发展，深化了人们在分子水平上对生物化学过程的了解。生化分析仪器在科学发展过程中发挥着巨大作用。荧光显微镜与荧光光谱仪耦合系统广泛适用于细胞生物学、生物化学、生理学、神经生物学、病理学等生物医学研究领域，它能对完整的活细胞和组织或固定的细胞和组织内各种结构进行定性、定量和定位的测量，功能强大，可操作性强，特别在细胞生理过程的定量研究方面具有单一仪器无法比拟的优势。
生命科学研究推动了荧光成像生物分析的进一步发展，其中活细胞单分子行为研究在荧光成像生物分析中的前沿领域。存在于细胞内的单分子，其周围环境十分复杂，这就需要用于细胞内研究的手段有实质性突破。目前有两大问题横亘在新的荧光成像技术探索的道路上：一是细胞在可见光区的自发荧光对标记分子所发信号的掩盖；二是对所研究分子的长期荧光标记观察。这就迫切需要研制开发光稳定性好的近红外荧光探针。预计新一代量子点技术的优势在细胞内单分子研究、高清晰度活细胞成像、长时程观察活细胞迁移方面将发挥巨大的潜力。荧光成像生物分析需要克服诸多技术难点，如细胞背底干扰，标记分子的光漂白时间，标记物对生物分子行为的影响，细胞内单个分子在Z轴方向运动的观察等。解决困难需要致力于改进或创造基本技术，需要硬件及信息技术的支撑、多种技术的联用等。双光子荧光显微技术活体研究神经系统的可塑性是荧光成像技术进步的重大突破。双光子成像的优势是激发波长在近红外区域，可以穿透很厚的标本，而对标本损伤很小，适于活体观察，光漂白作用也小。本课题组正在设计合成适用于生命体系及荧光成像生物分析的近红外分子荧光探针、双光子荧光探针、纳米生物探针，利用荧光探针动态检测活细胞、活组织内的代谢过程，并与其他生物学结合定性、定量地检测组织细胞中的特定成分，对新型药物的开发，肿瘤及自身免疫性疾病的诊断，基因表达，基因诊断等将具有重要的意义。
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Abstract Fiuorescencemicroscopyandfiuorescencespectrofiuorimetercoupiingsystemcanacguirefiuores-cenceimagesandmeasurefiuorescencespectrumandfiuorescenceiifetime.Thefunctionsofthecoupiingsystemmakeithavewideappiicationsinactivebioanaiysisresearchfieidsinciudinginvestigationofproteinstructureandfunctioninceiiandtissue，recognitionanddetectionofnucieicacids，guantitativemeasurementsofmetaiiicionsandfreeradicais，etc..Fortysixreferenceswerecitedforreviewingrecentappiicationsoffiuorescenceimaginginbioanaiysis.
Keywords Fiuorescencemicroscopyandfiuorescencespectrofiuorimetercoupiingsystem，fiuorescence
（Received19October2005；accepted15November2005）imaging，bioanaiysis，review
荧光成像在生物分析中的应用
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被引用次数：张宁， 陈蓁蓁， 唐波， Zhang Ning， Chen Zhenzhen， Tang Bo山东师范大学化学化工与材料科学学院,济南,250014分析化学CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY2006,34(7)2次
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