维生素B2生理功能和目前的状况
2004-10-24 10:16
1928年，研究证实，维生素B复合物受热失去抗脚气病的功能以后，还存在着促进生长的特性，这种可促进生长的对热稳定的物质被人们称为维生素B2。后来有发现，这种对热稳定的物质是由好几种维生素组成的。1932年，德国科学家Warburg和Christian发现了可促进细胞生长的活性物质——黄蛋白素。后经分析发现，这种物质由两部分组成，其中一种成分是蛋白质成分，另一部分为具有黄绿色荧光的色素，成为黄素。1933年Kuhn从牛奶中分离出了纯维生素B2，1935年又确定了其结构并合成了它。由于其分子中含有1个五碳糖核糖，故被命名为核黄素。
一．维生素B2的化学性质
维生素B分子是有异咯嗪与核糖所组成，纯维生素B2为黄棕色针状晶体，味苦，几乎无气味。它微溶于水而不溶于丙酮、苯、氯仿和乙醚等有机溶剂。在水中，他会发出略带黄色的荧光。
二．维生素B2在体内的吸收和代谢
维生素B2主要由胃肠的上部吸收，其吸收量有一定的限度，人一次最多摄入量为40mg。摄入量为40mg以下时，其吸收量随摄入量的增加而增加。若超过40mg即使增加剂量，其吸收率也不会下降而呈饱和状态。与膳食一起摄入的B2其吸收率大约在60%，而单维生素B2则仅有15%被吸收，而且老年人要比年轻人吸收的多。
维生素B2的排泄途径主要通过尿液，也有部分通粪便排泄（主要指没被吸收的食物中所含的维生素B2）。维生素B2的排泄量与其摄入的量有关，摄入量增加，经尿液排泄的量也增加，反之，则降低。所有哺乳动物均可由其乳汁分泌维生素B2。
三．维生素B2的生理功能
维生素B2在机体的生物氧化的过程中起递氢的作用。维生素B2在黄素激酶催化下与ATP作用转化为黄素单核苷酸（FMN），又在黄素腺嘌呤二核苷酸过磷酸化酶的作用下经ATP磷酸化形成黄素嘌呤二核苷酸(FAD),它们都是多种酶的辅酶，对机体物质与能量代谢的意义十分重大。
维生素B2为碳水化合物，氨基酸和脂肪酸的代谢所必不可少。一些黄素蛋白，例如在三羧酸循环中极为重要的琥珀酸脱氢酶。另一些黄素蛋白作为烟酰胺核苷酸系统和细胞色素之间的连接物，是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸磷酸重新氧化的氢受体。
维生素B2是许多氧化酶系统的辅酶。黄嘌呤氧化酶参与了肝脏中黄嘌呤转变为尿酸的过程，其分子中含有非血红素铁和钼，以FAD为辅基，作用于醛和N-杂环的底物，具有双重的专一性。能将包刮维生素A在内的许多醛氧化为相应的羧酸。氨基酸氧化酶能将α-氨基酸氧化为亚氨基酸，进而分解为氨和酮酸。存在于肝脏和肾脏国的D-氨其酸氧化酶以FAD为辅基，催化非天然的D-氨基酸的氧化脱氢，其底物还包刮甘氨酸、D-乳酸、L-脯氨酸。L-氨基酸氧化酶是连接FMN的酶，存在于肾脏，对天然的L-氨基酸有有普遍的特异性。以上这些酶又与激素密切相关，并且维生素B2也参与了叶酸转化为各种辅酶及其存储在人体的过程，这些叶酸辅酶为合成脱氧核糖核酸所必需。因此可以肯定的认为，维生素B2对细胞的增殖及机体的生长起着间接的作用。如果没有维生素B2，那细胞的生长就会停滞。
维生素B2还有许多同系物，它们具有不同的生物活性。有的同系物具有的活性相当于维生素B2的15%，有的对其有拮抗作用，还有的可代替一部分天然维生素B2。
四．生素B2与疾病的关系
由于我国人民膳食结构的特点，维生素B2缺乏在我国一直是一种常见的缺乏病。1982年全国营养调查表明，维生素B2缺乏病的患病率为5.0%，我国成人每日维生素B2的摄入量一
般为0.7mg左右，仅为供给量的一半，体内维生素B2储存的量经常处于不足状态，因此也易出现缺乏症状。
人类缺乏维生素B2的表现形式主要有以下方面：
（1）口角炎 口角乳白、裂开、出血、结痂。
（2）唇炎 初期，唇粘膜水肿、皲裂、直纹增加。严重时，唇黏膜萎缩。
（3）舌炎 舌中部出现红斑，边缘清楚，舌尖部蕈状乳头和后部的轮廓乳头肥大，引起舌肿胀，呈青紫色，并出现皱摺和裂纹。长期缺乏可引起中部萎缩，包刮乳头消失和舌列席加深。
（4）阴囊炎 阴囊皮肤出现渗液、糜烂、脱屑、结痂、皲裂及合并感染，另外还会有浸润、增厚及皱摺深厚等变化，可分为干性、湿性和化脓性3种。女子可能会有阴瘙痒、阴唇皮炎和白带过多等。
（5）皮肤 表现为脂溢性皮炎，长发于皮脂腺分泌旺盛处，如鼻沟、脸颊眉间、胸部及身体各皱摺处等。
（6）眼 视力模糊，角膜充血，血管增生，眼睛怕光、发红发痒、流泪易疲劳。
肿瘤与缺乏维生素B2密切相关，摄入足够的维生素B2，具有防癌变的作用。经研究表明，维生素B2缺乏时，癌症的发病率比正常人要高。
动物实验表明，即使维生素B2的摄入量达30g/kg（体重），也不会是大鼠中毒，其腹腔注射的LD50为560mg/kg。因此，维生素B2的毒性是极低的，但这也并不意味着滥用维生素B2有任何好处。
六.维生素B2的生产
维生素B2的制备有化学合成和微生物合成两种方法，但相对来说，微生物法更有前景。Takeda,Hoffmann-La Roche及BASF等大多数生产厂家用化学合成方法来合成维生素B2，且工艺路线基本相同BASF和Coors Biotech已能用微生物法来生产，且其分离和纯化工艺发展很快，利用微生物法生产实用级的维生素B2已不在困难。
(一)化学合成法制备维生素B2
将D-核糖与3，4-二甲基苯胺缩合，在氢化还原得一仲胺此仲胺与苯氯化重氮化物反应，生成一种偶氮染料化合物——3，4二甲基-6-苯偶氮-D –核糖胺最后与巴比妥酸在乙酸存在下缩合即可得到维生素B2。此维生素B2的生产工艺已经实现工业化生产，其产率可达95.3%，纯度达96.8%。其中合成所用的D-核糖目前是以D-葡萄糖为原料，经芽孢杆菌属细菌发酵而成的，它代替了原先用D-葡萄糖经4步反应合成D-核糖的方法。因为后者需要用到钠汞齐，从而带来了很严重的环境污染问题。
化学法合成维生素B2可以利用传统的分批反应的设备，但在纯化精制阶段，偶氮燃料中间物和维生素B2均会生成细小晶体，给有效地过滤和洗涤带来了较大的困难。同时由于这2种化合物的颜色都比较深，也使工厂的车间管理较困难。
（二）微生物法合成维生素B2
维生素B2的微生物发酵生产采用三级发酵法。将在25℃培养成熟的维生素B2产生菌的斜面孢子用无菌水制成孢子悬浮液，接种于种子培养基中培养（30+℃），30~40h），最后将二级发酵液移种至三级发酵罐发酵（30+℃，160h），得到维生素B2发酵液。
工业上使用的维生素B2的产生菌主要有阿氏假囊酵母（Eremotecium ashbyii）和棉病囊菌（Ashbya gossypii）2种菌。经过菌种改良后，维生素B2生产的最高水平可达到10000U/ml.
第二节 主要维生素及辅酶类药物生产工艺
一、核黄素
1．核黄素的发现
1928年，研究证实，维生素B复合物受热丧失抗脚气病特性(维生素B1被破坏)以后，还存在着促进生长的特性。这种可促进生长的对热稳定的物质被人们称为维生素B2。后来又发现，这种对热稳定物质是由几种维生素组成的。1932年，德国科学家Warburg和Christian发现了可促进细胞生长的活性物质——黄素蛋白(实际上是酵母水溶液中提出的黄色酶)。后来分析发现，这种物质由两部分组成，其中一部分是蛋白质成分，另一部分为具有黄绿色荧光的色素，称为黄素。1933年Kuhn及其同事从蛋中分离出来一种黄色的，具强烈的黄绿色荧光的化合物，称为蛋黄素(Ovoflvavin )，另外一些工作者则由乳品，乳清及肝中将它们分离出来。1935年他们又确定了维生素B2的结构并合成了它。由于其分子中含有1个五碳糖核糖，故被命名为核黄素。
2．核黄素的结构特点
核黄素又名维生素B2，维生素G或乳黄素，是一种人体必需的一种维生素，为水溶性B族维生素。它是核醇与7,8-二甲基异咯嗪的缩合物，在化学上定名为7,8-二甲基-10- (D-1-核糖酰)－异咯嗪，是一种平面结构，天然核黄素的结构有很大不同。
核黄素的分子式为C17H20NO6，结构式如图9-1。在核黄素分子中一部分是具有黄绿色的异咯嗪族黄色素，在第7和8的位置上各有一甲基；另有一部分是戊糖基，与第10位置的氮原子相连，作为整个分子的侧链部分。如果去掉这两个甲基所得的化合物，具有毒性，侧链如不是戊糖基则无维生素的功效。
CH2OH
(CHOH)3
2CHCH3NN
ON
图9-1 核黄素的结构式
3．核黄素的理化性质
核黄素为黄褐色或橙黄色针状结晶粉末，味微苦，几乎无气味，它微溶于水，几乎不溶于乙醇和氯仿，也不溶于丙酮，乙醚和苯。在水溶液中它会发出略带绿色的黄色荧光。核黄素在240℃变暗色，其熔点为275～282℃，并在此温度下被破坏。
核黄素在干燥状态下性质稳定。在中性和酸性溶液中，核黄素对热稳定，120℃下加热lh也仅有少量破坏，但在碱性溶液中加热则容易被破坏，降解为无生物活性的光黄素(Lumiflavin )。核黄素对大多数氧化剂(如过氧化氢)稳定，但可被铬酸和高锰酸钾所氧化。游离核黄素对光很敏感，在光照尤其是紫外线照射下，极易引起不可逆分解而被破坏，且被破坏速度随温度和pH升高而加速。但大多数食物中的核黄素是以结合形式(与磷酸，蛋白质等结合成复合化合物)存在的。此种结合型的维生素B2对光比较稳定。
4．核黄素的生理功能
⑴ 作为辅酶和辅助因子
核黄素的主要生理功能是构成黄素酶的辅酶。己知黄素酶有100多种。其中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)是最重要的两种辅酶形式。FMN和FAD是多种酶的辅酶，在生物氧化过程中起传递氢的作用。此外，这两种辅酶在蛋白质、糖、脂类和核酸代谢中也具有重要作用。
FMN和FAD与蛋白质紧密结合后形成黄素蛋白，并作为机体的递氢体参与机体的生物氧化过程。最重要的黄素蛋白包括有:NADH脱氢酶(以FMN为辅基)、琥珀酸脱氢酶、酰基辅酶A脱氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶(参与形成丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶复合体系)。此外，还有D-氨基酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、乳清酸还原酶、醛氧化酶等。核黄素及其辅酶衍生物和所有其他组织黄素均为异咯嗪类(Isoslloxazines )，其代谢转化关系见图9-2。
黄素激酶 FAD合成酶 转化
PO4 焦磷酸化酶 3-
图9-2 核黄素及其辅酶在机体内的转化关系
⑵ 增强机体免疫力
核黄素作为许多酶的辅助因子参与机体代谢，通过影响机体对养分的吸收与利用，从而间接参与免疫细胞增殖、分化和DNA、 RNA及抗体的合成等。超氧化物是白细胞杀菌功能中的必需因子，核黄素作为一种酶的作用与产生超氧化物(O)的NAPDH活性有关。研究小鼠发现，核黄素通过刺激产生中性白细胞，增强了抗各种感染的非特异宿主防御机理，并可增强中性白细胞的功能，提高非特异性免疫能力，在一定程度上还能增强特异性免疫功能。Satoshi等首次给牛肌肉注射核黄素(10mg/kg)不仅增加了中性白细胞的数目，而且增强了中性白细胞NBT还原活性以及对金黄色葡萄球菌的吞噬活性。 2-
⑶ 防止细胞脂质过氧化
动物机体内谷胱甘肽还原酶(GSH)在清除自由基、修复抗氧化损伤和维持细胞的结构方面都起着重要的作用。核黄素作为GSH的辅基成分，参与维持细胞内还原型谷光甘肽的浓度。据研究表明，核黄素缺乏，大鼠晶状体脂质过氧化增强，谷光甘肽氧化还原循环和抗氧化防御机制受损，而补充核黄素能减轻维持晶状体透明的GSH和蛋白质的氧化损伤。
⑷ 影响铁代谢
铁吸收进入小肠粘膜后，首先与铁蛋白结合，形成铁蛋白，贮存于粘膜细胞中，机体需要时，铁就从铁蛋白中释放出来，与运铁蛋白结合，进入血液循环，运往需要铁的组织。机体核黄素的缺乏，可能导致小肠粘膜NADH-FNN氧化还原酶(即铁蛋白还原酶)活力降低，其辅酶为FMN，机体的FMN来源于核黄素，该酶可将结合型的铁蛋白中的三价铁还原为游离型的二价铁，因此其活性降低，将影响肠粘膜中铁蛋白中铁
的动员，使结合于铁蛋白中的三价铁不能释放入血液。如果这一解释能进一步得到证实，则核黄素缺乏在实际上并不影响铁的吸收，而是影响其吸收后粘膜贮存的水平，使进入血循环的铁减少。
⑸ 抗肿瘤作用
核黄素依赖的谷光甘肽还原酶对还原型谷光甘肽(GSH)的再生起重要作用，而GSH作为还原剂有利于GSH-Px清除过氧化物，并作为亲核试剂与细胞色素P450代谢活化的亲电子性致癌物结合后一起排出体外，避免终致癌物与DNA结合发生甲基化，从而保护细胞内大分子免受损伤;同时核黄素作为各种黄素酶辅基的构成组分参与某些致癌物的代谢，核黄素缺乏可影响间接致癌物的体内解毒。
此外，核黄素还是一种重要的光敏化剂和潜在的光核酸酶。正是由于核黄素具有广泛的生理功能。因此，世界卫生组织(WHO)将其列为评价人体生长发育和营养状况的六大指标之一，建议人类的核黄素营养需求为0.3～1.8mg/kg，而动物饲料中为1～4mg/kg。
5．核黄素的应用
⑴ 核黄素在疾病治疗中的应用
微生物(如细菌、真菌)和高等植物可以合成核黄素，而动物(如畜禽)和人类则不能合成，必须从食物中摄取。人体缺乏核黄素数周后，会出现核黄素缺乏病的症状，如舌炎、口角炎、阴囊炎等。近年来研究表明，核黄素在防癌，降血脂，改善心功能和防治缺铁性贫血上也有较广泛的应用。
① 核黄素与心血管疾病
近年来，核黄素在心血管疾病防治中的作用己日益引起人们的关注。有研究显示，核黄素有降血脂、抗血小板聚集、抑制脂质过氧化等作用，这些都是高血压并发症相关的危险因素。
② 核黄素与缺铁性贫血
人群调查证实，核黄素缺乏者的平均血红蛋白量与血清铁蛋白(SF)浓度均低于正常者，且其贫血率及缺铁率高于核黄素营养状况正常者。核黄素的缺乏造成贮铁量减少而导致缺铁性贫血发生率增加，严重影响健康。
③ 核黄素与肿瘤
大量的流行病学和动物实验资料表明，核黄素等微量营养素具有防癌和抗癌作用。近年来有研究发现，核黄素缺乏时可促进亚硝胺等对大鼠的致癌作用，而补充核黄素后则可减少或抑制其致癌作用。
④ 核黄素与代谢疾病
核黄素是黄素酶辅基的主要组成部分，参与体内的能量代谢。新近的药理学研究表明，核黄素在多种能量代谢障碍疾病的治疗中具有重要作用。如在治疗线粒体功能障碍疾病中显示了很好的效果，而且对先天性乳酸中毒症也有一定的冶疗作用。
⑵ 核黄素在畜禽饲养中的应用
核黄素是动物体自身不能合成的低分子有机化合物，具有多种生理功能。畜禽等在使用现代配方饲料进行高密度养殖时，必须添加核黄素，否则也容易出现核黄素缺乏症状，影响畜禽的生长发育。大量研究表明，核黄素能够促进动物生长，提高动物的生产及耐寒能力，但动物体内不能储存相当数量的核黄素，所以就有必要在日粮中添加核黄素。因此，在动物饲料工业中核黄素作为添加剂，有广泛的应用前景。
6．核黄素的生产方法
核黄素较早就实现了商业化生产，国际上生产核黄素的工艺方法主要有四种:抽提法、化学合成法、半微生物发酵半化学合成法、微生物发酵法。应用较多的主要有两种，一种是化学合成法，主要用来生产医用核黄素；另一种是微生物发酵法，主要用来生产饲用核黄素。而后者是近些年来发展起来的一种十分经济有效的方法，而且从目前看，发酵法生产核黄素有可能通过后处理工序的强化达到医药标准而扩大其应用范围。
核黄素化学合成开始于D-核糖与3,4-二甲苯胺缩合，再氢化还原得一仲胺；此仲胺与苯氮化重氮化物反应，生成一种偶氮染料化合物——3,4-二甲基-6-苯偶氮-D-核糖胺；最后与巴比妥酸(丙二苯酰脲)在乙酸存在下缩合即可得到核黄素。化学法合成核黄素可以利用传统的分批反应设备，但在纯化精制阶段，偶氮染料中间物和核黄素均会生成细小的晶体，给有效地过滤和洗涤带来较大的困难。而且其反应步骤多、工艺长、回收率低、成本高(要用到较贵的起始反应物D-核糖)、能耗大，因此远不能满足工业需求，正逐渐被微生物发酵法所取代。
7.核黄素的微生物发酵法
微生物发酵法属于生物化学过程，利用的是可再生能源，废物排放量少，生产成本低，是目前国际上倍受推崇的核黄素生产方法。最初利用微生物发酵法进行核黄素商业化生产的是一株梭状芽抱杆菌
(Clostridium acetobutylicum )，由于当时发酵技术及菌种选育技术非常落后，因此核黄素产量很低。1965年有三家公司(Commercial Solvent，Grain Processing Corporation , Premier Malt Products)开始利用微生物发酵法对核黄素进行大规模商业化生产。但好景不长，三年后三家公司都相继停产，其原因是核黄素的量太低，根本无法与化学合成法竞争。
1974年微生物发酵法重新被Merck公司所采用。他们利用棉病阿舒囊霉(Ashbya gossypii )作为生产菌株，从中摸索出了许多发酵技术，并通过诱变育种技术获得了一些核黄素高产菌株。从此微生物发酵法获得了长足的发展。当时常用的两个核黄素高产突变菌株为A.gossypii和E.ashbyii，其产量达到15g/L。在随后的一段时期内国际上一些知名公司也开始采用微生物发酵法进行核黄素的生产。1990德国的BASF公司尝试使用A.gossypii作为生产菌株进行核黄素的商业化生产。经过6年的发展，他们最终用微生物发酵法完全取代了化学合成法。与此同时美国的Coors也开发出了一株核黄素高产菌株(C.famata )，据称其核黄素产量可达20g/L。后来该菌株被美国的ADM公司所采用。2000年瑞士的Roche公司决定采用美国Omnigene公司开发的一株核黄素高产枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)作为生产菌株，预计核黄素年产量可达3000吨。与化学合成法相比，可使成本降低一半。
微生物发酵法与化学合成法相比也存在着某些缺点和不足，例如:在核黄素的后期加工处理过程中，核黄素的分离纯化比较困难，很难制得高纯度的核黄素。但是随着核黄素分离纯化技术的不断改进，微生物发酵法将以其环保、节能、低成本等优点最终取代化学合成法。
⑴ 核黄素的生产菌种
利用微生物发酵法，可以代谢产生核黄素的微生物很多，细菌方面有枯草芽孢杆菌(Bacillus
subtilis )、棒状杆菌(Corynebacterium )、分枝杆菌(Mycobacterium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、气杆菌(Areobacter)、梭状芽抱杆菌(Clostridium)、丙酮丁醇梭菌（Clostridum acetobutylicum)等。真菌方面有根霉(Rhizopus)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、棉病阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、季氏假丝酵母(Candida guillermonda)、阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、假丝酵母(Candida flaveri)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。但是真正用于核黄素工业化生产的菌种却很有限，如表9-2。
表9-2 核黄素工业生产中的常用微生物菌种
Species
阿氏假囊酵母
假丝酵母
酿酒酵母
棉病阿舒囊霉
枯草芽孢杆菌
丙酮丁醇梭菌 Scientific name Classification Yeast Yeast Yeast Fungus Bacterium Bacterium Eremothecium ashbyii Candida flaveri Saccharomyces cerevisiae Ashbya gossypii Bacillus subtilis Clostridum acetobutylicum
⑵ 核黄素的生物合成途径
核黄素是异咯嗪的衍生物，在异咯嗪环的6,7位上有两个甲基，9位N上连着一个核糖醇。关于核黄素的生物合成过程，不同种类的生物中并不完全相同。目前对大肠杆菌、枯草芽饱杆菌以及一些酵母中的核黄素合成途径了解得比较清楚。在阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)发酵过程中，核黄素是一种重要的次级代谢产物，其合成与积累是一个复杂的代谢过程。菌体通过Embdem-Mogerhof-Parnas pathway (EMP途径)和Hexose monophosphate pathway (HMP途径)，形成复杂的代谢流。在EMP途径中菌体降解葡萄糖为丙酮酸同时产生能量ATP，而HMP途径是菌体核黄素生物合成的主干代谢流，因此适当调整菌体代谢中EMP途径与HMP途径碳架物质流的比例，即适当加大HMP途径碳架物质与能量的代谢流，将很可能有利于核黄素的过量合成。研究表明，甲酸酯、C02与甘氨酸都加入核黄素分子中，并由这些物质出发经过嘌呤成为核黄素，而且己证明GTP是核黄素的真正前体。若以葡萄糖为出发底物，整个合成代谢途径可分成9个阶段：
a.由葡萄糖出发，经HMP途径生成5-磷酸核搪，在焦磷酸激酶的催化下与ATP作用，生成5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)；
b.PRPP在PRPP转酰胺酶的作用下生成5-磷酸核糖基胺(PRA)；
c. PRA经过一系列反应生成肌苷酸(IMP)；
d. IMP经过一系列反应生成鸟苷三磷酸(GTP)；
e. GTP在GTP环解酶的作用下裂解，生成2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶(HTP)，同时失去磷酸核糖； f. HTP与核糖醇CDP作用，生成2,5-二氨基-6-羟基-4-核糖基氨基嘧啶(DHRAP)和CDP；
g. DHRAP放出NH3，生成5-氨基-2,6-二羟基-4-核糖基氨基嘧啶(ADRAP)；
h. ADRAP与3-羟基丁酮缩合，生成6,7-二甲基-8-核醇基-二氧四氢嘧啶(DMRL)。
i. 最后，DMRL在核黄素合成酶的作用下，形成核黄素(riboflavin)。
⑶ 发酵工艺条件及其控制方法
① 核黄素发酵培养基
碳源 培养基可采用葡萄糖、蔗糖、淀粉及糖蜜等碳源，但各种碳源的发酵效果不同。其中以葡萄糖的转化率较高，但是菌体受高浓度葡萄糖的反馈抑制，普通菌株葡萄糖浓度一般不超过2％。蔗糖转化率也较高，而且菌体能够耐受高浓度的蔗糖。糖蜜的成分很复杂，除了蔗糖之外，还有其它糖类及矿物质，营养丰富，所以糖蜜的转化率最高，而且价格便宜，但是糖蜜浓度高了对菌体也会有抑制，因此在工业发酵中应当采用流加补糖的方式。菌体可以利用淀粉作为碳源，但效率不如蔗糖高，这可能与生产核黄素的菌株的淀粉水解酶的活性较低有关。
氮源 在生产核黄素发酵过程中，营养丰富的有机氮源能够满足生产菌株对生长因子的需要。同时由于核黄素分子中含有4个N原子，所以培养基中氮源的充足供给对核黄素发酵有重要影响。氮源不足必然使核黄素的合成受到抑制。常用的有机氮源，如酵母粉、酵母抽提物、酵母膏等酵母系列产品，除了含有丰富的氮源物质外，还含有维生素、有机酸、无机盐等多种营养成分，既能够满足细胞的氮源需要，也能满足细胞对生长因子的需要。
无机盐及微量元素 无机盐对核黄素的生产有较大影响。硫酸镁是己糖激酶、丙酮酸激酶等多种酶的激活剂，培养基中Mg浓度在0.05％左右效果较好。适量磷酸盐加入可以促进菌体生长，但磷酸盐过量会象葡萄糖一样抑制代谢产物的合成，比如抑制代谢产物前体的形成，阻遏代谢产物合成中某些关键酶的合成等。一般磷酸盐浓度宜控制在0.4％以下，多了只长菌体，且抑制了GTP的合成，使核黄素产量降低。 2+
微量元素对核黄素的生产有一定的影响。铁离子是过氧化酶、过氧化物酶、细胞色素、细胞色素酶的组成部分。缺铁时，这些酶的合成就要受到影响；而铁含量过多时，这些酶的合成就会受到抑制，结果细胞弱小，单位低。钙离子是淀粉酶、蛋白酶等酶的激活剂，其对发酵有降低膜的透性，及调节酸碱度等作用。钾离子是磷酸核糖甲酰甘氨咪唑合成酶、丙酮酸激酶等酶的激活剂，并控制原生质胶态和细胞质膜透性。一般情况下培养基中酵母粉、酵母膏、玉米粉等氮源中含有足够的微量元素已经能较好的满足菌体的需要。
② 发酵条件对核黄素生产的影响
接种量的影响 接种量是指接入的培养液与待接种的液体培养基的体积比。采用稍大的接种量，缩短了迟滞期，能明显缩短培养时间。大量接入培养成熟的种子，会使菌体很快进入对数生长期，缩短生长过程的迟滞期，因而缩短了发酵周期，有利提高核黄素发酵生产率。并且还有利于阻止染菌的进一步发展。但如果接种量过大，移入的代谢废物必然较多，菌体生长会受代谢废物的干扰而减慢，菌体提前衰老，导致最终菌体细胞浓度下降，从而影响发酵水平。一般建议核黄素生产过程中接种量在5％~7%之间。
温度的影响 温度会影响菌体的生长速率、生化反应速率、扩散速率、酶的活力与稳定性、基质的吸收与利用等。在核黄素发酵过程中，发酵温度在39～41℃时产量较高，主要因为GTP环水解酶Ⅱ作用的最佳温度为42℃。但温度过高，酶容易失活。
溶氧的影响 充足的供氧对于菌体生长和核黄素代谢很重要，一般情况下，核黄素的生产过程对氧的要求较高，所以应在发酵过程中进行充分的供氧。
初始pH值的影响 初始pH值对发酵影响很大，pH变化会引起各种酶活力的改变，影响菌对基质代谢的速度，甚至改变菌的代谢途径及细胞结构。一般在酸性环境下菌体不产核黄素，这主要是因为菌体的核黄素合成酶在pH为8.4时活力最高。核黄素生产菌对碱性条件有很高的耐受力，在pH＝9的基质中仍能生长，并且菌体自身代谢可以调节pH值。但是菌体的蔗糖水解酶和糖酵解酶系的活性一般，在中性或偏酸性条件下活性较高，所以综合各种酶的影响，在培养基中pH值一般控制在7～8之间为宜。可以通过流加氨水、调节补糖的速度或加入缓冲溶液来控制。
⑷ 提取与纯化
发酵液中核黄素浓度很低，仅0.6～0.8％，而且成分复杂，尤其是细菌发酵液，其通常有糖、蛋白质、菌体及菌体碎片及预处理时加入的物质（如硅藻土等杂质），因此从中提取核黄素比较困难。目前核黄素的提取方法重要有两大类：碱溶法、酸解法。
① 碱溶法
属于较传统的方法(Morehouse，1958）,其步骤为：a 加热，调节pH＝4～5；b 加入碱使发酵液中的核黄素溶解后，过滤细胞；c 加入NaS2O3还原核黄素，调节pH＝5.8使其沉淀后，过滤出核黄素晶体；d 调节pH＝9.5，再次溶解核黄素沉淀；e 在碱性条件下加氧化剂氧化核黄素；f 调节pH＝5.8时，再次沉淀核黄素；g 核黄素沉淀与母液分离。由于这个方法有两个步骤涉及到加碱溶解，所以又称二次碱溶。这个方法适用于核黄素含量大于1g/L的发酵液，产品纯度可达到87％以上。而根据Morehouse法衍生的其他加碱提取核黄素方法均称碱溶法。
② 酸解法
1996年欧洲专利介绍了酸解法提取核黄素的工艺，其步骤如下：
a．将发酵液于50～70℃下加热45min，杀死菌体，降低液体的粘度；
b. 对加热后的发酵液在2500g下进行离心2～3次，使密度较大的核黄素晶体颗粒与较轻的生物质和无机盐分离；
c. 核黄素悬浮液在0.1％～0.2％的硫酸或盐酸中，加热至80℃以上保持8～16小时，降解其中残余的蛋白质和核酸分子；
d. 酸解后的核黄素溶液中的杂质已经大大减少，可用过滤和洗脱进行分离，所得的晶体纯度可达到99％。
酸解法虽然所得产品的纯度高，但消耗大量酸和热量，成本比前种方法高。
二、维生素B12
1．维生素B12概述
1926 年，G.R.Minot 和W.B.Murphy 发现用肝脏抽提物可以治疗人类恶性贫血病。这一发现使他们获得了l934年诺贝尔医学奖。l948 年E.L.Ricke和L.Smith从肝脏提取物中分离出结晶维生素B12。
维生素B12又称氰钴胺素，属于B族维生素之一，是一种由微生物合成动物必需的维生素。它主要存在于动物性食品如内脏、肝、肾和猪心等，瘦肉、鱼、牛乳以及蛋黄中也存在维生素B12 ；植物中不含维生素B12；放线菌、人和动物的肠道菌能合成维生素B12。动物所需的VB12 主要靠从食物中摄取，或吸收肠道微生物产生的VB12。但是人类只能从食物中获得VB12；因为人体肠道微生物合成的VB12不能被人体吸收。
由于动物组织中VB12 含量很低，没有商业性生产价值，化学合成也不可能，因为VB12 结构复杂，合成VB12 需要70步反应。第一次大批量获得VB12 是从生产抗生素如链霉素、氯霉素、新霉素等发酵液中分离得到的一种副产品，其含量约1mg/L。随着对VB12 需求的增加，选育出VB12 的高产菌株成为必然要求。目前，工业化生产VB12 已全部采用发酵工艺。
维生素B12 作为一种人体和动物必需的维生素，其独特的功能性及其复杂的结构和产生条件决定了其较为苛刻的生产条件，正是这种不易获得性使其价格非常昂贵。
多年来人们一直在尝试通过化学合成的途径来降低维生素B12 的成本。但由于其庞大而复杂的结构，虽在近些年已获得某些方面的成功，但同时使化学家们陷入了新的困境：副产物太多，难以提纯。于是，人们又重新审视维生素B12 的生产方法，再次将重点转向发酵法生产。能产生维生素B12 的菌种较多，但由于其作为次级代谢产物，始终在发酵水平没有新的突破。在国内，仅近年才出现了两个生产厂家，但其年产量与庞大的国内需求市场相比微不足道。因此，在国内实现维生素B12 的低成本化将会有巨大的市场潜力。
2．维生素B12的结构
维生素B12 是自然界中存在的结构最为复杂的小分子化合物之一。它是含三价钴的多环系化合物，基本结构是钴啉，由四个四氢吡咯环组成，它与卟啉环的区别在于A环和D环之间缺少一个环桥。VB12 经验式为C63H38O14N14PCo。从结构式中可以看出，钴胺酰胺上的核糖C-1位上连接一个异环基团，即5,6-二甲基苯并咪唑。该基团上另外一个氮原子又与钴形成配位键。含有其它异环基团的VB12 类似物(用嘌呤或苯并咪唑替代5,6-二甲基苯并咪唑),可由微生物转化或在培养基中添加这些物质产生。与5,6-二甲基苯并咪唑相
比,其他取代基团取代后形成的VB12 衍生物,在脊脊动物体内生理作用较低。嘌呤碱基取代的VB12 衍生物在人体内无效。
图9-3 维生素B12的结构
3．维生素B12的理化性质
维生素B12又称钴胺素，是B族维生素之一，为深红色针状结晶或结晶粉末，无一定熔点，在300至320℃分解；无臭无味，溶于水、乙醇和丙酮，不溶于氯仿、丙酮和乙醚。其水溶液为中性，具左旋光性，在波长278、 361和548nm处有最大吸收。维生素B12的结构性质相当稳定，在弱酸性溶液和中性溶液中耐热，pH值3以下和9以上则易分解，日光、氧化剂和还原剂均能破坏维生素B12的活性。
4．维生素B12的生物合成途径
维生素B12存在于动物性食品中，植物中不含维生素B12，而且其合成只限于在原核生物界中某些成员，放线菌、人和动物的肠道菌也能合成维生素B12。
维生素B12的生物学功能和从头合成途径已经被阐明。其合成分别由呼吸链中的C5和C4途径开始，生成主要中间代谢物5-氨基酮戊酸(5-ALA)、uroporphyrinogenⅢ和前钴琳环-2，在前钴琳环-2处分支成好氧
途径和厌氧途径。好氧途径需要ATP并生成副产物乙酸，厌氧途径不需ATP并生成副产物乙醛。最后好氧和厌氧两个分支都会生成腺苷钴琳胺酸，最终合成腺苷钴胺素。
5．维生素B12的生产技术
⑴ 维生素B12的来源
维生素B12的来源主要有以下三种:① 从污泥和下水道中提取，但由此获得的维生素B12并不能直接进入食品或药品级产品，通常只局限于饲料添加剂；② 从工业废液中提取，如酒精、丙酮、丁醇、造纸及乳制品工业废液，柠檬酸发酵后的废液等都是生产维生素B12的原料，生产上一般是用抗菌素工业废液，绝大多数是从链霉素废液中提取，近年来又发现庆大霉素发酵液中含维生素B12较高；③微生物纯种发酵，如丙酸菌发酵、巨大芽抱杆菌生产以及采用转基因的E.coli发酵生产维生素B12。
⑵ 维生素B12的合成方法
维生素B12是自然界己知结构中较复杂的非聚合有机化合物，其化学合成总共有70个合成步骤，这种高度复杂性使得工业生产成本太高，所以迄今尚无法借助化学手段来实际工业化生产B12；因为只有微生物能进行维生素B12的生物合成。
当今工业生产维生素B12常用随机诱变的方法获得高产菌株然后利用微生物发酵法生产B12。常用的诱变剂是紫外线和亚硝基胍，同时选择有效的突变，例如产量、遗传稳定性、合适的生长速度以及对培养基中有毒物质的抗性等。
⑶ 维生素B12的生产菌种
能够产生维生素B12的微生物主要为放线菌和细菌。放线菌中链霉菌属的主要有：Aureo -faciens(金色链霉菌)，Griseus(灰色链霉菌)；细菌主要包括有:Aerobacter aerogenes(好氧产气杆菌)，Bacillus megatherium(巨大芽孢杆菌)，Escherichia coli(大肠埃希氏菌)，Propionibacterium freudenreichii(菲氏丙酸杆菌)，Propionibacterium shermanii(谢氏丙酸杆菌)等。另外，米根霉的一些种也可合成维生素B12。
早期人们是从天然肥料或土壤中分离出能产生维生素B12的菌株。如1991年Inoue等从海底沉积物中分离出一种厌氧型乙酸杆菌属菌株，可以产生胞内维生素B12；1992年Kojima等从土壤样品中分离到能够消解异丙醇并产生维生素B12的微生物。
不同菌合成维生素B12的能力也不同，因为Propionibacterium shermanii和Pseudomonas
denitrificans高产维生素B12的能力及其快速的生长能力，如今，这两种菌被广泛用于工业生产维生素B12。
一般常用Propionibacterium shermanii，这个菌株被美国食品和药品组织认为是安全菌株，另外丙酸菌发酵还具备多种优点：① 培养基在发酵过程中，产生丙酸使得培养基pH值下降，从而避免杂菌的污染；② 丙酸菌常采用厌氧发酵，勿需设计供氧系统和搅拌系统，可减少设备投入和节约能耗；③ 发酵过程中能产生丙酸钙，而丙酸钙通常是用作防腐添加剂的，从而可以进一步减少染菌的可能。
表9-3列举了不同的菌种，不同的发酵工艺，其合成维生素B12的能力也不同。其中，Propionibacterium freudenreichii和Propionibacterium shermanii是目前国际上常用的工业生产菌株，其维生素B12的产量也相对较高。
表9-3 不同菌种合成维生素B12能力的比较
Species B12(mg/L)
206.0
135.0
60.0
60.0
18.0
16.5
11.5
6.0
4.5
3.6
3.2 Propionibacterium freudenreichii Rhodopseudomonas protamicus Propionibacterium shermanii Pseudomonas denitrifcans Nocardia rugosa Rhizobium cobalaminogenium Micromonospora sp. Streptomyces olivaceus Nocardia gardneri Butyribacterium methylotrophicum Pseudomonas sp.
Arthrobacter hyalinus 1.1
6.维生素B12的发酵工艺
⑴ 二步发酵工艺
二步发酵工艺主要围绕着减少生物合成过程的自抑制作用和维持较高微生物细胞浓度这两方面展开工作。
所有的Propionibacterium在低浓度溶解氧的发酵条件下可以高产维生素B12,在厌氧条件下，
Propionibacterium发酵生成胞内维生素B12同时也生成胞外产物——丙酸和乙酸，副产物丙酸的累积会抑制Propionibacterium细胞的生长；然而，作为维生素B12前体物的5,6-二甲基苯丙咪唑（DMBI）的合成却需要氧，另外，在有氧条件下，丙酸才能够被分解掉。显然，只有及时消除发酵体系中不断增多的丙酸，才能推动维生素B12生物合成反应的有效进行。因此Propioni -bacterium的发酵分成两个阶段:前三天厌氧发酵，以提高细胞生长速率，此时生成维生素B12的前体谷胺酰氨；接着好氧培养1至3天，以分解丙酸，并让细菌合成DMBI然后与钴胺素连接。
在Propionibacterium的发酵过程中，丙酸的产量占总发酵液的10%，又为了使pH值保持在7，所以，中和代谢过程中积累的丙酸是发酵的一个关键所在，工业生产常采用添加氨水等碱性物质及通入少量氧气来减少这种影响。
⑵ 混合培养
近年来有报道在混合体系中加入可以吞噬或消耗丙酸的微生物，直接减弱丙酸的抑制作用，达到高产维生素B12之目的。Miyano等将Propionibacterium与Ralstonia eutropha（真氧产气杆菌)混合发酵，后者可以利用前者生成的丙酸混合培养的维生素B12的产量达到19mg/L。
7．维生素B12的提取与测定技术
⑴ 提取技术
对于维生素B12的提取，不断有新的方法提出，主要有溶剂提取法、离子交换树脂法、醋酸缓冲液法、Na2HPO4加压提取法〔U.S.P标准法)和KCN煮沸法等，现在常用KCN煮沸法。
① 有机溶剂提取
采用两相混合溶剂，可简单地纯化和提取维生素B12，常用的溶剂为苯甲醇和水的混合溶液，基本过程如下:
发酵液→吸附(活性碳)→洗脱(吡啶)→浓缩→层析(A12O3)→洗脱(甲醇)→收集红色液→浓缩→结晶。 ② 离子交换树脂提取
随着离子交换柱在工业上的广泛应用，人们尝试用阴阳离子交换树来进行维生素B12的提取，过程如下所示:
发酵液→阳离子树脂(Lonac C-240)→阴离子树脂(LonacAC-300)→蒸馏水冲洗→收集红色液体部分→浓缩→冷冻干燥。
③ 醋酸缓冲液法
本方法只适用于实验室小规模生产维生素B12。基本过程如下:
发酵液→离心收集菌体→lmol/L pH4.5醋酸缓冲液→高压高温破碎细胞。
最后在540nm下测吸光值。
④ Na2HP04加压提取法(U.S.P标准法)
该方法是美国药典中提取维生素B12的标准方法，其提取液由1.3%NaH2P03, 1.2%柠檬酸和1%Na2S205(偏重亚硫酸钠)配制而成。在样品中加入该提取液，匀浆或超声波破碎样品细胞。高温加热后离心，取上清液，加入对氨基苯磺酸和H202，于330nm波长下测其吸光值。
⑤ KCN煮沸法
KCN煮沸法是目前最常用的一种提取维生素B12的方法，工业化大生产维生素B12的时候也是用该法进行提取最后得到氰钴胺素。该方法利用-CN基团取代与钴原子中心结合的X基团而得到的性状稳定的维生素B12。
Taylor等1952年报道的一种测定维生素B12的方法，用1%KCN高温高压提取之后，加入Na2S04，经过苯甲醇、氯仿和水多次萃取之后，一部分调pH值为11，另一部分待测液调pH值为5至6，于580nm下测定其一氰和二氰形式的吸光值。
⑵ 测定方法
① 比色测定法
本法是药物样品中维生素B12 测定的常用方法。其原理是样品经浓硫酸和高氯酸消化后，样液中的钴与M-二-(α-吡啶酮)-α-吡啶联腙生成钴的红色化合物，可以进行比色测定，再从钴的含量换算成维生素B12 的含量。
② 离子交换测定法
药物中的维生素B12 可以从弱酸性阳离子交换树脂中得到，分离洗脱下来。例如桔子酱中的维生素B12 通过Florisi土为吸咐剂进行层析分离后，在530nm波长处测定其含量。
③ 原子吸收法
维生素B12 的分子中含有钴原子占维生素B12 35%，采用原子吸收分光光度法可以测定其中的钴含量，再换算成维生素B12 含量。在测定药品中维生素B12 时，可以直接将药品的溶液吸入原子分光光度计中测定。
④ 微生物法
微生物法是国家标准GB/T5413.14-1997婴幼儿配方食品和乳粉中维生素B12的测定方法，用来鉴定菌株维生素B12产力的试验菌种通常采Lactobacillus Leichmannii（莱士曼氏乳酸杆菌)和Escherichia coli(大肠埃希氏菌)，这两种菌对维生素B12的存在具有极高灵敏性，能够定量测出样品中维生素B12的含量。
⑤ 高效液相色谱法
利用高效液相色谱(HPLC)可以精确的检测维生素B12含量，排除维生素B12结构类似物的影响。 ⑥ 薄层层析法
食品检测中常用薄层层析法来鉴定维生素B12，鉴于维生素B12本身有颜色，所以在适当的浓度下并不用显色剂就能直接观察，常用的展开剂为冰醋酸-丙酮-苯-甲醇(5:5:70:20)。
虽然薄层层析较之其他层析法具有设备简单、可用腐蚀性显色剂、展层时间短以及灵敏度高等优点，但是对于维生素B12这种复杂结构的化合物，并不是常用的分析方法，并且不易于检测出微量的维生素B12
维酶素
Weimeisu
Vitacoenzyme
本品系黄豆渣经阿氏假囊酵母菌（Eremothecium ashbyii Guilliermond）经固体发酵后制得的复合物。按干燥品计算，每1g含维生素B2（C17H20N4O6）不得少于4.0mg。
【性状】本品为黄色至棕黄色粉末，有特臭，味微苦。
【鉴别】（1）取含量测定项下溶液，在透射光下检视显淡黄色，并有强烈的黄绿色荧光。将溶液分为3份：于第一份中加稀盐酸溶液，荧光即消失；于第二份中加入氢氧化钠试液适量，荧光亦消失；于第三份中加连二亚硫酸钠结晶少许，摇匀后，黄色消退，荧光亦消失。
（2）取本品细粉0.1g，加水5ml，振摇10分钟，滤过，滤液加茚三酮2mg，置水浴中加热，溶液显蓝紫色。
【检查】 干燥失重 取本品，在105℃干燥3小时，减失重量不得过5.0%(中国药典2000年版二部附录Ⅷ L)。
炽灼残渣 不得过7.0% (中国药典2000年版二部附录Ⅷ N )。
重金属 取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查（中国药典2000年版二部附录 Ⅷ H 第二法），含重金属不得过百万分之二十。
微生物限度 取本品，依法检查（中国药典2000年版二部附录Ⅺ J及2002年增补本）。不得检出活螨；每1克中不得检出大肠杆菌；每1克中含细菌数不得超过1000个，含霉菌数不得超过100个。
【含量测定】避光操作。
对照品溶液的制备 精密称取在105℃ 干燥2小时的维生素B2对照品50mg，
置500ml棕色量瓶中，加0.02mol/L醋酸溶液适量，置水浴中加热1小时，并时时振摇，使维生素B2溶解，放冷至室温，用0.02mol/L醋酸溶液稀释至刻度，
摇匀，精密量取15ml，置100ml 量瓶中，用0.02 mol /L 醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含维生素B215μg的溶液。
供试品溶液的制备 取本品研细，精密称取适量（约相当于维生素B2 3.0mg）,
置250ml量瓶中，加0.02mol/L醋酸溶液适量,置水浴中加热1小时,使维生素B2溶解,放冷至室温,用0.02mol/L醋酸溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,
取续滤液备用。
测定法 取对照品溶液与供试品溶液，以0.02mol/L醋酸溶液作空白,照分光光度法(中国药典2000年版二部附录Ⅳ A ),在444nm波长处分别测定吸收度,各加入连二亚硫酸钠结晶约3mg,稍加振摇,混匀，在1～6分钟内测定最低的吸收度，以前后两次的吸收度差值计算含量。
【类别】维生素与辅酶类药。
【贮藏】密封，凉暗处保存。
【制剂】（1）维酶素片（2）维酶素胶囊。
【有效期】暂定2年。
低强度超声波刺激对阿氏假囊酵母细胞次生代谢的影响
一定强度的超声波能够促进细胞的生长和代谢，细胞膜是抑制微生物次生代谢产物产量的主要原因。以阿氏假囊酵母(E．ashbyii)为实验材料，选择功率6W、频率24kHz的超声加载于摇瓶发酵过程中，检测了加载对菌丝体干重和核黄素分泌的变化情况。结果表明，一定强度的超声间断加载对E．ashbyii的生长有一定的促进作用，并使核黄素的开始分泌时间从96h缩短到60h；同时发现，发酵96h后加载，能有效提高核黄素的产量至0．346mg／L，非常显著地高于对照组；发酵后的104～112h是超声处理的最佳时间段，为维持较高的产率，需每隔1．5h再次超声处理。
饲料添加剂原料的生产方法
山东农业大学 杨在宾
饲料添加剂种类繁多，性质各异。从化学结构上讲，有结构简单的无机化合物，还有结构复杂的大分子有机化合物；在化学性质上，有些稳定性强，有一些则易氧化，易吸水，易变性等。酶、激素、微生态制剂属于生物活性物质，生产、使用、保存都需要特殊工艺。微量元素添加剂，如硫酸亚铁，生产工艺简单，普通化工技术即可完成；而氨基酸工业、抗生素的合成则属于跨学科、跨行业的工业化大生产。综合饲料添加剂原料的生产方法和工艺要求，目前普遍应用的是化学法、发酵法、提取法和基因工程技术等。
第一节 化 学 法
化学法是指用化学工程生产各种产品的工艺方法。化学工程则是研究化学工业与其他过程工业生产过程中所进行的化学过程、物理过程及其所用设备设计与操作和优化共同规律的一门工程学科。在饲料工业中应用化学工程技术，可以快速、安全、经济地生产价格低、质量高的饲料添加剂原料。在饲料添加剂原料中，很多生产过程都是用化学法来完成的，如各种微量元素添加剂，某些饲料改良剂以及大部分维生素。
一、饲料添加剂原料生产中应用的化学工程技术
与生产其它化学产品一样，饲料添加剂原料的化学法生产也涉及无机化工、石油化工、精细化工、高分子化工和生物化工等主要类型。
石油化工和高分子化工：为饲料添加剂原料生产提供初级原料，如烟酸生产需要的3-甲基吡啶和2-甲基-5-乙基吡啶，维生素B6生产需要的氯乙酸等。
无机化工：最早用于各种酸、碱的生产。在合成氨基础上，饲料用尿素的生产是无机化工在饲料添加剂原料生产中的用途之一。
精细化工：是饲料添加剂原料化学法生产的主要途径。其生产设备小、效率高、操作控制方便、适应性强、能一器多用、采用间歇操作。大部分维生素、微量元素添加剂原料都是精细化工产品。
生物化工：最早用于有机化合物合成。在饲料添加剂方面，可用于饲料改良剂和维生素生产，如柠檬酸、乳酸等；后来应用于某些抗生素添加剂的合成，如喹乙醇等。目前，生物化工已与发酵工程和基因工程结合，进入新的发展阶段，用于抗生素、烟酸，甚至氨基酸的合成工业。
二、常用饲料添加剂原料化学法生产
（一）用化学法生产的饲料添加剂 饲料添加剂原料中，能用化学法生产的添加剂种类很多，所有矿物质添加剂、大部分维生素和饲料改良剂都是用化学法生产的。表2-1列出了能用化学法生产的维生素原料。
（二）化学法生产工艺示例
1．烟酸化学法生产的典型生产工艺 烟酸的生产工艺是化学法生产维生素的典型工艺。
首先是2-甲基-5-乙基吡啶和硝酸混合，进入反应器，反应后产物经膨胀分成两相。液相经脱水后进入结晶器，分出的二氧化氮气体进入吸收器与水反应生成硝酸，回收再利用。从结晶器出来的粗烟酸硝酸盐经离心机与水分开，分离的固体经溶解、中和后制成烟酸，经结晶、离心、干燥、过筛得烟酸产品。该法的特点是生产规模大，技术成熟，产品纯度高，原料价廉易得，生产成本低。
2．硫酸亚铁化学法生产工艺 用废铁和硫酸反应生产硫酸亚铁是微量元素酸解法生产的典型方法，其简单工艺流程如图2-2。整个工艺过程分酸解、过滤、结晶、干燥等过程。该法工艺简单，设备投资少，适合于中小型企业。
3．尿素生产工艺 尿素的生产方法是用无机化工进行化学合成饲料添加剂的典型方法。其原料只用液氨和二氧化碳，生产中只涉及气液相非催化反应。反
应过程比较简单，中间产物只有氨基甲酸铵，产物只有尿素和水，不需要复杂的工艺过程。
第二节 发 酵 法
一、添加剂原料微生物发酵法生产的发展历程
与其它微生物发酵工程生产领域一样，当今饲料添加剂所涉及的微生物发酵生产技术都起源于天然发酵技术，如酿酒、制酱、奶酪等。整个20世纪是微生物发酵工程技术迅速发展的100年。1905年开始利用纯粹培养发酵技术，以固体培养基分离培养微生物，建立了酒精、酵母、淀粉酶等产品的制造工艺。1929年青霉素的发现、化学工程和酶化学的进步，形成了微生物深层发酵技术，从而使抗生素、有机酸、维生素、酶制剂、激素等的工业化生产成为现实。20世纪50年代，生物化学和微生物遗传学在发酵工程中的应用，实现了应用微生物代谢控制发酵技术工业化生产氨基酸的新工艺。60年代，随着石油微生物研究的进展，发现了微生物非碳水化合物原料的发酵技术，从而开始利用石油化工产品、污水、废弃物生产单细胞蛋白质，实现了微生物发酵工程资源开发与环境保护的综合利用。进入70年代后，随着分子生物学、细胞工程、酶工程、分子育种等的发展，建立了应用生物工程和生物技术生产酶、干扰素、激素等的现代化工艺。至此，微生物发酵工程已经成为饲料添加剂原料生产的主要途径。
二、微生物发酵工程特点
在发酵生产的过程中，发酵工业不断结合了生物化学、微生物学、化学等学科，特别是近20年来迅速吸纳了基因工程、细胞工程、固定化、连续化等新技术，使微生物发酵工程技术应用领域不断扩大和充实。目前公认的发酵工程的定义为：利用微生物的某种特性，通过现代工程技术手段进行工业化规模生产的技术。它主要包括工业生产菌菌种的选育、最佳发酵条件的选择和控制、生物反应器（发酵罐）的设计和产品的分离、提取和精制等过程。
饲料添加剂微生物发酵工程生产与化学工程生产相比有以下特点。
1.微生物一般特点 微生物个体小、结构简单、常用于发酵工业的细菌、放线菌和部分真菌都是单细胞。其特点如下。第一，繁殖快。一般细菌在最适条件下每20分钟就能繁殖一代。一个细胞，在不受任何影响的条件下24小时可繁殖到4万亿亿个。微生物这种强大的繁殖能力就使利用微生物进行发酵工程工业化生产成为现实。如在酵母生产中，利用石油为原料，通过微生物发酵生产菌体蛋白，其合成速度比植物快500倍，比动物快2000倍。第二，易于变异。由于微生物个体小、结构简单、代谢旺盛、繁殖快，因此容易受到环境条件变化的影响，引起遗传性变异。在实际应用中，人为利用各种物理、化学因素等处理微生物，可以使微生物发生变异，为有益微生物良种选育提供方便。第三，易于培养。微生物中大多数种类，都能用人工的方法，采用各种发酵形式（液体的或固体的）进行发酵，生产各种微生物产品，因此易于工厂化和商业化生产。
2.生物学特性 发酵工程是以微生物细胞来催化的，发酵过程中所有中间步骤都在细胞中进行，不象化学工业生产那样需要经过几个中间产物的步骤。发酵
生产中采用生物催化剂，实行一步生产法，利用微生物特异性代谢反应比化学合成更易于生产所需要的产物。有很多用化学方法不能生产的复杂化合物，用微生物工程方法来合成却很容易。
3.生产安全、能源消耗低 微生物具有比任何高等动物和植物都快得多的生长速度。同时生产条件为常温常压条件，不象化学法生产那样需要高温高压条件。因此，发酵法生产安全性能好，能源消耗低。
4.原料便宜、易于选材 发酵工业需要的主要原料都是农产品、副产品、工业废弃物，其最大的特点是再生性强，在短时间内即能重复生产。而化学生产多采用石油、煤、天然气等不可再生的原料，生产中常受到自然资源的限制。
5.投资少，成本低 发酵工程生产中的多步反应都是以生命体的自然调节方式进行的，一系列的反应过程都在生物反应器（发酵罐）中进行。同一种设备具有多种用途，菌种和发酵原料一改变，即可生产多种发酵产品。
6.有利于环保 发酵工程的生物过程都具有高度专一性，可人工控制产物的形成。在减少副产物产生的同时，发酵工程产品可以是微生物菌体、酵母等，其中富含微生物蛋白、维生素、酶等，对动物营养价值全面。因此，一般发酵工程生产时，除特殊产品外，有害物质产生少，生产安全性强。而化学工程大多数的生产工艺都可产生不同程度的有害副产物。
发酵工程生产的缺点是发酵产物的浓度低，并且有较多的异构体，提取、纯化和精制的工艺比较复杂，同时成本较高。除此之外，发酵废液、废渣的处理不当会污染环境，如抗生素粉渣处理不当会造成敏感菌株的耐药性等。
三、微生物发酵与饲料添加剂原料生产
（一）微生物发酵在饲料添加剂工业中的应用 微生物在饲料添加剂原料生产中应用极为广泛，生产中，利用不同菌种，选用不同原料，控制一定发酵条件，结合一定代谢控制发酵技术，即可实现某种添加剂的工业化生产。在微生物发酵工程中，能生产的发酵产品数量达一千多种，但目前应用的饲料添加剂主要是以下三类产物。
1．利用微生物菌种和内含物 各种微生物本身是一个生命体，菌种内包含着微生物生长繁殖所需要的一切营养素，除含有丰富的蛋白质以外，还含有油脂、维生素等。在人工控制的条件下，利用农副产品、有机废水或石油制品等为原料可生产大量饲用酵母蛋白。通过饲用菌种培养发酵、过滤、吸附、提取等工艺可生产维生素B2、B12等。
2．利用微生物产生的酶 微生物发酵的基础是细胞内产生的大量代谢酶，在人工控制下，可从发酵液中提取生产各种酶。酶制剂的生产已成为微生物发酵工程的又一重要用途。目前，在生产中广泛应用的由微生物发酵生产的酶有二十多种。饲料添加剂用的大多数酶是微生物发酵工程产品，如纤维水解酶、淀粉酶、蛋白酶等。
3．利用微生物的某些代谢产物 人工控制微生物发酵过程，使某种中间代谢产物大量积累，经提炼加工制成添加剂，如柠檬酸、氨基酸等。绝大多数抗生素也是微生物代谢中产生的代谢产物。
（二）用于添加剂生产的微生物 可用于生产饲料添加剂的微生物主要有三大类，细菌和放线菌、酵母菌和霉菌。它们与饲料添加剂生产的关系见表2—2。
四、微生物发酵生产添加剂原料的工艺
（一）微生物代谢规律
1．合成代谢 微生物从体外吸收各种营养物质，在细胞内各种酶的催化下，生成各种复杂的有机物质，为个体的生长、发育、繁殖提供物质基础。在合成代谢中，微生物可以吸收有机物或者由CO2合成各种碳水化合物构成细胞壁的结构物质或成为细胞内的贮存物质，利用有机酸或无机酸等合成脂类，构成细胞膜，吸收氮素与有机酸合成氨基酸。饲料添加剂原料的微生物工程生产过程当中，通过人工控制合成代谢的某一过程，从而导致某种中间产物的大量积累，达到规模化生产的目的。如：赖氨酸，Vc，有机酸的生产等。
除此之外，微生物的合成代谢中，还有一些结构复杂的物质积累于细胞内或者分泌于细胞外，它们对生产菌的生理功能尚不清楚。由于这些物质独立于细胞之外，非微生物生活所必需，是微生物细胞正常代谢途径不畅通时增加的支路代谢而产生的物质，往往是微生物的次生代谢产物。微生物发酵工程法生产抗生素、生长激素、某些色素等都属于微生物的次生
代谢产物。
2．微生物的分解代谢 是细胞内的碳水化合物、脂肪、蛋白质等大分子化合物，在一系列酶促反应下分解的过程。三大物质分解代谢过程同动物体内基本一致。碳水化合物可进行无氧条件下的酵解，此过程属于不完全分解，可以形成各种中间产物，如各种有机酸等；也可以在有氧的条件下彻底氧化分解，人工控制发酵的过程，也可以得到不同的中间发酵产物。
（二）微生物的生长规律 微生物在适宜的条件下，不断从周围环境中吸收营养物质转化为构成细胞物质的组分和结构，使个体细胞质量增加和体积增加，称为生长。根据细菌生长繁殖速度的不同可分为四个时期。
1．滞留适应期 细菌接种到新的培养基中，一般不立即进行繁殖，需要经一段时间自身调整，诱导合成必需的酶、辅酶或合成某些中间代谢产物。此时，细胞重量增加，体积增大，但不分裂繁殖，细胞长轴伸长，如巨大芽孢杆菌的长度从3.4m增长到9.1m～19.8m，细胞质均匀，DNA含量高。这个时期的长短自几分钟至几个小时，因菌种﹑菌龄和培养条件不同而异。
2．对数生长期 这个时期细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，所有新分裂形成的细胞生活旺盛，繁殖的细胞数按几何级数增加，即1→2→4→8…，若用指数形式表示为20→21→22→23…2n，这里的n就是细菌分裂代数，也就是1个细菌繁殖n代后产生了2n个细
3．稳定期 又称最高生长期，在一定容积的培养基中，由于经细菌对数生长期的旺盛菌。此时期细菌数的对数与培养时间成直线关系。 生长后，某些营养物质被消耗，有害代谢物质积累以及pH、氧化还原电位、无机离子浓度等的变化，限制了菌体继续高速度增殖。初期细菌分裂间隔的时间开始延长，曲线上升逐渐缓慢。随后部分细胞停止分裂，少数细胞开始死亡，使新增殖的细胞数与老细胞死亡数几乎相等，处于动态平衡，细菌数达到最高水平，接着死亡数超过新增殖数，曲线出现下降趋势。这时，细胞内开始积累贮藏物质，大多数芽孢细菌在此时形成芽孢。同时，发酵液中菌体代谢产物的积累逐渐增多，此时期是发酵目的物（如抗生素等）生成的重要阶段。
4．衰亡期 稳定期后，环境变得更不适合于细菌的生长，细胞生活力衰退，死亡率增加，以致死亡数大大超过新生数，细菌总数急剧下降。此时期细胞常出现多形态的畸形以及液泡，革兰氏染色阳性菌常变成革兰氏染色阴性菌。许多菌在衰亡期后期常产生自溶现象，使工业生产中后处理过滤困难。
（三）微生物发酵的培养方法
1．连续培养 在一恒定的培养容器的流动系统中，以一定流动速度不断补充入新的营养物质，同时以相同的速度排出培养物（包括菌体及代谢产物），使流动系统内的液量，细胞数量和营养状态维持恒定，使培养的微生物处于对数生长期的时间继续延长下去，这种方法称连续培养。
2．同步培养 在细菌分批培养中，其群体能以一定速率生长，但所有的细菌并非同时分裂，即培养液中的细胞并不处于同一生长阶段，其生理状态和代谢活动也不完全一样。因此，如果以群体测定结果的平均值来代表单个细胞的生长和生理特性是不符合实际的。一般研究细菌的生理、生化和性状难以用单个细胞进行，必须用群体，往往把
群体内的细胞分裂同步化，这种培养法叫同步培养法。利用同步培养技术使它们处于同一生长阶段，使所有的细胞都能同时分裂，这种生长方法叫同步生长。
同步培养法有两种，即筛选法和诱导法。
（1）筛选法 又称淘析法，主要有过滤法、区带密度梯度离心法和膜洗脱法等。过滤法是将微生物细胞用滤器过滤，让处于细胞周期较早阶段的小细胞通过，收集这些细胞，转入新鲜培养基中，即能获得同步细胞。区带密度梯度离心法是将随机生长的细胞悬浮置于蔗糖梯度溶液表面，然后离心，不同生长周期的细胞由于体积和质量大小不同，沉降系数不同，同一生长周期的细胞就聚集在离心液的一个区带上，小细胞在上，大细胞在下。这方法可便于收集处于较早周期的小细胞，本法已成功地应用于芽殖和裂殖酵母、大肠杆菌等细胞的同步培养。膜洗脱法是根据某些滤膜可以吸附与该滤膜相反的电荷的细胞而设计的，可获得比上述两法数量更大，同步性更高的细胞。
（2）诱导法 诱导法是利用一些生理学手段强制微生物达到同步生长的目的。分化学诱导和物理诱导两种方法。化学诱导是采用停止或限制供给微生物细胞分裂所必需的某种养料的方法使所有的细胞都进入临分裂状态（但不分裂），然后在某一时刻恢复供给细胞分裂所必需的养分，就能诱导出同步细胞群体。物理诱导是利用某些物理因子，使处于即将分裂的细胞的代谢活动受到控制，从而使细胞在分裂阶段前停止，以求得以后分裂的同步。例如温度，就是基于细胞周期不同，相对地对温度的敏感性也不同。其它物理因子如光脉冲（对光合微生物）、χ射线等也能诱导同步生长。
（四）微生物发酵的工艺过程 微生物发酵的全部生产过程大致可以分为四个阶段，即：菌种阶段、种子扩大培养阶段、发酵阶段和提炼阶段。
1．菌种阶段 菌种阶段首先应做好菌种的保藏，防止其优良性状的衰退，同时要防止杂菌的污染。将砂土管或斜面保存的原始菌种接入斜面，进行活化，再进一步进行种子扩大培养。培养的方法分：液体震荡培养、表面培养和固体培养等。要求培养出生产性能优良，并具有一定数量健壮的种子（菌体或孢子）。
2．种子扩大培养阶段 将斜面或摇瓶培养好的种子接入种子罐。根据发酵罐的大小，所需种子的数量，有时采用一级，有时采用二级。采用二级时即在种子罐与发酵罐之间加入一只繁殖罐。一般要求的种子液量为发酵液总量的5%～10%。种子扩大培养阶段的主要目的是繁殖大量的菌体，而不是要求产生大量的目的产物。因此，在选择培养基以及控制培养条件等方面都要围绕此目的来进行。一般要求种子培养基的营养成分比较丰富，有利于菌的生长繁殖。但同时又必需注意种子培养基的成分不能与发酵液的成分相差太大，否则当种子接入发酵培养基后将会影响菌的生长和代谢。
3．发酵阶段 发酵阶段是微生物发酵的主要阶段。在此阶段前期继续进行菌的生长繁殖，后期主要是产生和积累所需的微生物产物。因此，必需严格控制好各项发酵条件，使菌体有一定量的生长繁殖，但又必需注意防止菌体繁殖过量，影响目的产物的产生和积累。当然以菌体为目的产物的发酵则要求菌生长繁殖越多越好。在生产中，必需掌握菌的生长规律，控制好发酵条件，使菌体生长健壮，具有一定数量同时又能产生最大量的目的产物。
4．提炼阶段 提炼阶段的任务是将发酵产物进行加工处理，以获得所需的产品。
加工处理的方法很多，根据所需产品的不同而采取不同方法。如蒸馏喷雾干燥、离子交换过滤、盐析、分子筛等。
第三节
在饲料添加剂中，营养性添加剂、中草药添加剂和饲料改良剂等添加剂存在于天然饲料或动植物体内，如维生素A，在鱼类肝脏中含量很高；维生素E在棉籽油、花生油等植物油中含量很高。这类添加剂以及中草药添加剂有效成分的浓缩，均可采用分离提取的方法从天然物中获得。另一方面，无论是用化学工程、发酵工程或基因工程生产添加剂，都是先制得粗品或初级产品，然后采取一系列物理或化学方法进行纯化和分离。因此，分离提取技术是每一种饲料添加剂原料所必须的方法和步骤。
一、天然物中饲料添加剂有效成分提取与分离
（一）提取方法
1．溶剂萃取法
（1）选择溶剂的理论依据
1）溶剂的极性 溶剂按其极性大小可分为亲水性溶剂和亲脂性溶剂，亲水性越强的溶剂，极性越大。常用于提取天然物中化学成分的溶剂，按其亲水性强弱顺序表示如下：
水＞甲醇＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞苯＞石油醚
2）化学成分的极性 天然物中化学成分也可分为亲水性和亲脂性成分。成分的分子越小，取代基越强，极性基的数目越多，则亲水性越强，如单糖、低聚糖等；反之称为亲脂性成分。天然物成分中常见的一些功能基因，其极性大小顺序如下：
-COOH＞-OH＞-NH2＞-SH＞-CHO＞C=O＞-COOR＞-OCH3＞-CH=CH-＞-CH2-CH2-
3）相似相溶原理 不同溶剂和化学成分均具有一定程度的亲水性或亲脂性，亲水性成分易溶于水或亲水性溶剂，难溶于亲脂性溶剂，亲脂性成分则易溶于亲脂性溶剂。
（2）提取方法
1）浸渍法 用适当的溶剂在常温或温热（60℃～80℃）的情况下浸渍以溶出其中成分。本法适用于有效成分遇热易破坏及含多量淀粉、树胶、果胶、粘液质的天然物的提取。但浸出率较差，特别是用水为溶剂，其提取液易于发霉变质，须注意加入适量防霉剂。
2）回流提取法 如用易挥发的有机溶剂加热提取天然物中成分时，则需采用回流提取法以减少溶剂损耗，提高浸出效率。但遇热易破坏的成分不宜用此法。
3）连续提取法为了弥补回流提取中需要溶剂量大，操作较烦的不足，可采用连续提取法。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。此法提取液受热时间长，因此对受热易分解的成分不易用此法。
2．水蒸汽蒸馏法 此法只适用于具有挥发性的、能随水蒸汽蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。此类成分的沸点多在100℃以上，并在100℃左右有一定的蒸汽压。天然物中的挥发油、某些小分子化合物的提取可采用水蒸汽蒸馏。
（二）各种分离纯化方法
1．两相溶剂萃取法 利用混合物中的成分在两种不混溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的方法，包括简单萃取法和连续萃取法。
2．结晶法 利用相对纯度较大的混合物中各组分在溶剂中的溶解度不同，使欲分离的物质达到过饱和状态而结晶析出，从而达到分离或精制的目的。结晶溶剂、合适的温度、适当的时间是结晶的三个重要条件，其中最重要的是选择合适的溶剂。所选择的溶剂应对欲分 分 离 提取
离的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热时都不溶或易溶。
3．沉淀法 在天然物提取液中加入某种试剂，使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质。
4．盐析法 在天然物中提取液中加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，使某种水溶性成分在水中的溶解度降低，析出沉淀。或溶解度降低后易被与水不相混溶的溶剂萃取出来，从而达到与水溶性大的杂质分离。常用的无机盐试剂有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁等。
5．分馏法 是利用混合物中各组分的沸点不同，因而在分馏过程中产生蒸汽压的高低差别而得以分离的方法。
6．色谱法 是分离化学成分的有效方法。用一般方法难以分离的化合物，借助于色谱法的分离，一般能得到单体成分。层析法种类很多，包括吸附层析法、分配层析法、离子交换层析法等。
二、化工或生物发酵制品的提取与分离
（一）粉碎 将固体原料、中间产品或成品进行破碎或磨成细粉末，称之为粉碎。常用粉碎方法如下：
1．粗碎 处理直径为40mm～1500mm的原料，所得成品直径为5mm～50mm。如生产磷酸氢钙。
2．中碎和细碎 处理直径为5mm～50mm的原料，所得成品直径约为0.1mm-5mm。如用铁矿石生产硫酸亚铁。
3．磨碎或研碎 处理直径为2mm～5mm的原料，所得成品直径约0.1mm。某些特殊粉碎可处理直径为0.2mm的原料，所得成品可细至0.01μm，如各种制成品的粉碎。
（二）结晶与重结晶 结晶是指物质从溶液或气体中析出结晶体的过程，然后再经过滤或离心方法将结晶体从溶液中分离出来。重结晶是依据不同的物质溶解度的差异原理，制备固体化学品，滤除机械杂质的重要方法。重结晶方法具有操作简单、效果明显、设备通用性强等特点，采用的溶剂可以是单一溶剂，也可以是复合溶剂。在工业生产过程中，可在液相中反应生成产物后，以浓缩、结晶、母液再浓缩、结晶的工艺过程获得最高生产效率和最高产品质量。各种方法生产微量元素添加剂时，必须经过结晶工艺。氨基酸从发酵液中的提取和精制常采用重结晶法。
（三）萃取 有时称提取或浸提，它是借助与溶液不相混溶的有机溶剂，从溶液的若干组分中，提取出一个组分的过程。加入的溶剂叫萃取剂，萃取后的液体需要再经过蒸发或蒸馏、结晶、干燥等方法进行分离。
（四）离子交换及吸附 离子交换及吸附是深度提纯和制备某些制剂的方法。具有操作简单、不易引入杂质、效率高等特点，是获得饲料添加剂精品的有效手段。在生产中，可应用的离子交换材料多为带有官能团的高分子材料，如离子交换树脂、离子交换薄膜、离子交换纤维等。近年来，分子筛等新型吸附材料在饲料添加剂生产中的广泛应用，为精制提纯工艺提供了捷径，如马杜拉霉素的精制等。
（五）过滤 其原理是使液体通过过滤介质的细孔，而固体颗粒不能通过，被过滤介质所阻流而得到分离。简易的过滤是通过―过滤筛‖进行。过滤几乎应用于所有饲料添加剂原料的生产工艺中。
（六）蒸发浓缩 溶质不能挥发，而溶剂能挥发的溶液，可采用蒸发浓缩的工艺使有效成分浓度提高。蒸发浓缩可采用高温加热、常温或低温真空方法。如马杜拉霉素生产工艺中几乎采用真空浓缩或干燥。
（七）脱色 大部分添加剂粗品制成后，都要进行脱色处理以获得优质的商业化产品。常用的脱色剂有木炭、活性炭、骨炭、亚硫酸、高锰酸钾等。脱色方法有两种，一是直接将
脱色剂与需要脱色处理的产品混合，搅拌均匀，一定时间后分离即可；二是将活性炭等固体脱色剂作为过滤介质放在过滤容器中或过滤管中，使液体通过而脱色。目前工业化生产饲料添加剂原料多采用活性炭脱色，如氨基酸、酸化剂等。
（八）离心分离 利用旋转产生的离心力，将液体中的颗粒分离出来达到分离提纯目的。离心分离也是饲料添加剂生产中普遍应用的生产工艺。
以柠檬酸为例：用发酵法生产柠檬酸工艺中，制得的发酵液中除含有水分外，尚有淀粉残渣和其它有机酸等杂质，故应提纯分离。
第四节
基因技术是利用生物有机体或其组成部分发展新产品、新工艺的一种技术体系，一般包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程四个方面。基因工程主要涉及一般生物类型所共有的遗传物质——核酸的分离纯化、体外剪切、拼接重组及扩增与表达等技术。细胞工程则包括一切生物类型的基本单位——细胞的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞质乃至染色体与细胞器的繁殖与改建等操作技术。酶工程是利用生物有机体内酶所具有的某些特异催化功能，借助固定化技术、生物反应器和生物传感器等新技术、新装置生产特定产品的技术。发酵工程，也称微生物工程，是给微生物提供发酵等条件，利用微生物的代谢转化功能生产目的产物的技术。基因工程和细胞工程技术，可以创造出具有特殊功能，甚至多功能的"工程菌株"。而只有通过酶工程和发酵工程才能生产出一系列产品，在现代生物技术溶和应用中，这四个独立的体系在产业化方面密切结合，相互渗透，共同完成高新技术成果的产业化。并广泛应用于饲料添加剂原料生产中，如氨基酸、抗生素、酸化剂、生物色素等的规模化生产。
一、基因工程的基本方法
基因工程就是在体外或试管中借助于酶促反应，将目的基因或异源DNA片段与适当的载体进行重组，造成杂种DNA分子。然后再将这些杂种DNA分子输入到受体细胞（微生物）内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞内表达，产生出人们所需的产物，或创造新的生物类型。这种获得新功能的微生物称为"工程菌"。这一技术在美国于1973年首次获得成功，并于1981年首次形成基因工程制品——牛生长激素和人胰岛素等，开始投放市场。从此基因工程技术在全球范围内展开了广泛开发研究，并逐步应用于生产实践。
利用基因工程育种，将不同来源的基因在体外经重组和改造后，引入微生物细胞获得工程菌。然后应用微生物发酵工程技术大批量生产饲料添加剂，如激素、酶、抗生素、氨基酸。这一技术已经成为生物技术开发的热门技术。
基因工程的主要技术操作包括：目的基因分离、目的基因与载体基因相结合、重组DNA分子进入受体细胞和改造新获得的DNA，并使重组体最终特性化，成为"工程菌"。
1.目的基因的分离 把所要的目的基因（即具有遗传信息的DNA片段）从供体细胞中提取出来，或人工合成出来。
2.目的基因与载体相结合 用同一种限制性内切酶处理目的基因和基因载体，可以形成相同的粘性末端，然后将外源目的基因和载体DNA混合，再添加DNA连接酶，在一定条件下，便可以使目的基因与载体通过"退火"和连接的步骤而形成重组体DNA。
3. 重组体DNA进入受体 重组体DNA通过再次转化，转入到适宜的宿主细胞，并在其中进行复制、表达，产生人类所需要的产物，通过筛选，便可获得具有工业生产价值的―工程菌‖。 基因工程技术的应用
二、基因工程技术应用
利用基因工程技术，获得具有特殊功能的―工程菌‖，进而通过发酵工程技术，工业化生产饲料添加剂，是新世纪解决资源不足、降低生产成本、提高产品质量的最新途径。经过基因工程技术的发展，以及与发酵工程、化学工程等的结合，很多饲料添加剂的生产已经进入新的时代。
1.用基因工程生产高性能、高效能的酶制剂 以往工业上生产的酶是以自然界存在的微生物产生具有高性能的自然酶为基础。现通过基因工程技术，可以使在其他通常难于培养的微生物中少量存在的酶，用经选择在廉价原料中容易培养并且发酵液中容易纯化酶的宿主微生物来生产；也可使从动物植物中提取的酶的生产不依赖于动物植物组织，如小牛凝乳酶已可用发酵法生产。对一些存在于性能不佳或产毒素致病的微生物中存在的优良性能酶，可将酶基因转移到安全宿主中。通过基因工程技术可在生物体间转移基因，而且还可以修饰结构基因，从而使生产过程易进行，并可按应用要求剪接得到具有特有性能的酶。
如，目前应用DAN重组技术已建立了丝氨酸和色氨酸合成酶工程菌，通过这种工程菌组装的生物反应器可以用甘氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸，再由丝氨酸和吲哚转化生成色氨酸。
由以上实例可知，应用基因重组技术，通过基因扩增和增强表达，就可建立表达酶制剂的基因工程菌和基因工程细胞，从而进一步构建成新一代的生物催化剂——固定化工程菌和固定化工程细胞。可以预见，基因工程将会生产出许多高性能高效能的酶制剂，从而导致酶在许多应用领域中取得更大突破。
2.基因工程在氨基酸合成中的应用 自20世纪70年代后期以来，氨基酸生产菌的育种工作就开始运用细胞内基因重组技术和重组DNA技术，提高了育种的有效率和新菌株的产酸水平。运用细胞内基因重组的细胞工程技术主要采用以下两种方法。
（1）细胞融合技术 研究发现，由乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）野生型菌株经多次诱变处理，虽可得到以葡萄糖为原料高收率的生产赖氨酸的突变株，但这种突变株的赖氨酸生产收率与糖消耗速度之间成反比关系。为了解决这一矛盾，它们将赖氨酸收率高、糖耗速度慢，具有α-氨基乙酸-L-半胱氨酸耐性（AECr）标记的生产菌，与糖耗速度快、不产赖氨酸、具有德夸菌素耐性（DECr）和酮丙二酸耐性（KMr）的突变株进行细胞融合，结果获得同时具有AECr、DECr和KMr特性的融合株。新株的耗糖速度由亲株的0.13g葡萄糖/（h·g）干菌体提高到0.4g/（h·g），使整个发酵时间缩短三分之一，而赖氨酸产量仍保持亲株的较高水平。
（2）转导技术 Kisumi在精氨酸生产菌育种中从野生型粘质沙雷氏菌（Settatia marcescens）Sr41获得一种代谢调节变异株RA4240，而PA1379菌株则是从同一野生菌获得的具有精氨酸合成酶而精氨酸分解能力缺损的双重变异株。通过溶原菌体Ps20将RA4240的argA基因和PA1379菌株中的LysA基因同时转导，得到一株具有上述三种变异性状的组合株AT404，其精氨酸产量达25.2g/L。由于转导方法可以定向育种，因此该技术在工业微生物领域中正得到广泛研究。
在氨基酸生产菌的育种上，应用基因工程技术的原理是，用DNA限制性内切酶把氨基酸生物合成系中的关键酶基因（DNA）从生产菌染色体上切下来，再用连接酶将它连接到载体（质粒）的DNA上，然后通过转化、转导、感染、结合等方法把复合质粒的遗传物质传递到DNA受体菌中进行无性繁殖（称之为克隆）。随着质粒拷贝数的增加，酶基因扩增，关键酶的活性提高，目的氨基酸的合成能力加强，因而使产酸量提高，在色氨酸、苏氨酸、
赖氨酸和L-脯氨酸等生产菌的育种上，以及可以利用C1化合物或纤维素为原料的基因工程菌的培育上均运用过基因工程技术。但遗传工程在氨基酸生产育种工作中的运用尚处于萌芽阶段，而且只是在少数几种氨基酸的育种上进行了探索，取得了一定成绩，离工业生产应用还有一段距离。
3.基因工程在生长促进剂生产中的应用 随着生命科学的迅速发展，分子生物学和基因工程技术已逐步成为主要药物和生长促进剂发现、设计和发展的基础。近10年来，一批新型药物已陆续投入商品化生产（见表2—3），具有最广阔商业化生产前景的领域，将包括抗生素、调节蛋白质、激素等治疗性药物生物技术。α—干扰素、生长激素等转基因产品正在应用于畜牧生产中。通过基因工程技术生产高效、低成本的各种促生长剂也将很快进入商业化生产阶段。
本 章 小 结
饲料添加剂原料的生产方法有化学法、发酵法、提取法和基因工程技术。化学法是指用化学工程生产各种产品的工艺方法。添加剂原料中所有矿物质、大部分维生素和饲料改良剂都是由化学法生产的。烟酸酸生产工艺是化学法生产维生素的典型工艺；废铁和硫酸反应生产硫酸亚铁是微量元素酸解法生产的代表性方法；尿素生产是用无机化工进行化学合成原料的方法。
发酵法又称生物法，历经100多年，已成为饲料添加剂原料生产的主要方法。可用于添加剂原料生产的微生物包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等。发酵法具有生产安全性能好、能耗低、原料便宜、投资少、成本低、有利于环保等优点，但也有发酵产物浓度低、有较多异构体、提取纯化精制工艺较复杂等缺点。微生物发酵的培养方法有连续培养和同步培养，其工艺过程可分为菌种阶段、种子扩大阶段和提取阶段。分离提取用于添加剂有效成分的浓缩。天然物中有效成分的提取和分离与化工或生物发酵制品中有效成分的提取和分离工艺略有不同。
基因工程技术是利用生物有机体或其组成部分发展新产品、新工艺的一种技术体系，包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程四个方面。基因工程技术的基本步骤包括：目的基因的分离、目的基因与载体基因的结合、重组DNA导入受体细胞并特性化表达，最终获得具有新功能的工程菌。基因工程技术现主要用于高性能、高效能酶制剂的生产、氨基酸的合成、生长促进剂如抗生素、激素等治疗药物的生产。
维生素B2生理功能和目前的状况
2004-10-24 10:16
1928年，研究证实，维生素B复合物受热失去抗脚气病的功能以后，还存在着促进生长的特性，这种可促进生长的对热稳定的物质被人们称为维生素B2。后来有发现，这种对热稳定的物质是由好几种维生素组成的。1932年，德国科学家Warburg和Christian发现了可促进细胞生长的活性物质——黄蛋白素。后经分析发现，这种物质由两部分组成，其中一种成分是蛋白质成分，另一部分为具有黄绿色荧光的色素，成为黄素。1933年Kuhn从牛奶中分离出了纯维生素B2，1935年又确定了其结构并合成了它。由于其分子中含有1个五碳糖核糖，故被命名为核黄素。
一．维生素B2的化学性质
维生素B分子是有异咯嗪与核糖所组成，纯维生素B2为黄棕色针状晶体，味苦，几乎无气味。它微溶于水而不溶于丙酮、苯、氯仿和乙醚等有机溶剂。在水中，他会发出略带黄色的荧光。
二．维生素B2在体内的吸收和代谢
维生素B2主要由胃肠的上部吸收，其吸收量有一定的限度，人一次最多摄入量为40mg。摄入量为40mg以下时，其吸收量随摄入量的增加而增加。若超过40mg即使增加剂量，其吸收率也不会下降而呈饱和状态。与膳食一起摄入的B2其吸收率大约在60%，而单维生素B2则仅有15%被吸收，而且老年人要比年轻人吸收的多。
维生素B2的排泄途径主要通过尿液，也有部分通粪便排泄（主要指没被吸收的食物中所含的维生素B2）。维生素B2的排泄量与其摄入的量有关，摄入量增加，经尿液排泄的量也增加，反之，则降低。所有哺乳动物均可由其乳汁分泌维生素B2。
三．维生素B2的生理功能
维生素B2在机体的生物氧化的过程中起递氢的作用。维生素B2在黄素激酶催化下与ATP作用转化为黄素单核苷酸（FMN），又在黄素腺嘌呤二核苷酸过磷酸化酶的作用下经ATP磷酸化形成黄素嘌呤二核苷酸(FAD),它们都是多种酶的辅酶，对机体物质与能量代谢的意义十分重大。
维生素B2为碳水化合物，氨基酸和脂肪酸的代谢所必不可少。一些黄素蛋白，例如在三羧酸循环中极为重要的琥珀酸脱氢酶。另一些黄素蛋白作为烟酰胺核苷酸系统和细胞色素之间的连接物，是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和还原型烟酰腺嘌呤二核苷酸磷酸重新氧化的氢受体。
维生素B2是许多氧化酶系统的辅酶。黄嘌呤氧化酶参与了肝脏中黄嘌呤转变为尿酸的过程，其分子中含有非血红素铁和钼，以FAD为辅基，作用于醛和N-杂环的底物，具有双重的专一性。能将包刮维生素A在内的许多醛氧化为相应的羧酸。氨基酸氧化酶能将α-氨基酸氧化为亚氨基酸，进而分解为氨和酮酸。存在于肝脏和肾脏国的D-氨其酸氧化酶以FAD为辅基，催化非天然的D-氨基酸的氧化脱氢，其底物还包刮甘氨酸、D-乳酸、L-脯氨酸。L-氨基酸氧化酶是连接FMN的酶，存在于肾脏，对天然的L-氨基酸有有普遍的特异性。以上这些酶又与激素密切相关，并且维生素B2也参与了叶酸转化为各种辅酶及其存储在人体的过程，这些叶酸辅酶为合成脱氧核糖核酸所必需。因此可以肯定的认为，维生素B2对细胞的增殖及机体的生长起着间接的作用。如果没有维生素B2，那细胞的生长就会停滞。
维生素B2还有许多同系物，它们具有不同的生物活性。有的同系物具有的活性相当于维生素B2的15%，有的对其有拮抗作用，还有的可代替一部分天然维生素B2。
四．生素B2与疾病的关系
由于我国人民膳食结构的特点，维生素B2缺乏在我国一直是一种常见的缺乏病。1982年全国营养调查表明，维生素B2缺乏病的患病率为5.0%，我国成人每日维生素B2的摄入量一
般为0.7mg左右，仅为供给量的一半，体内维生素B2储存的量经常处于不足状态，因此也易出现缺乏症状。
人类缺乏维生素B2的表现形式主要有以下方面：
（1）口角炎 口角乳白、裂开、出血、结痂。
（2）唇炎 初期，唇粘膜水肿、皲裂、直纹增加。严重时，唇黏膜萎缩。
（3）舌炎 舌中部出现红斑，边缘清楚，舌尖部蕈状乳头和后部的轮廓乳头肥大，引起舌肿胀，呈青紫色，并出现皱摺和裂纹。长期缺乏可引起中部萎缩，包刮乳头消失和舌列席加深。
（4）阴囊炎 阴囊皮肤出现渗液、糜烂、脱屑、结痂、皲裂及合并感染，另外还会有浸润、增厚及皱摺深厚等变化，可分为干性、湿性和化脓性3种。女子可能会有阴瘙痒、阴唇皮炎和白带过多等。
（5）皮肤 表现为脂溢性皮炎，长发于皮脂腺分泌旺盛处，如鼻沟、脸颊眉间、胸部及身体各皱摺处等。
（6）眼 视力模糊，角膜充血，血管增生，眼睛怕光、发红发痒、流泪易疲劳。
肿瘤与缺乏维生素B2密切相关，摄入足够的维生素B2，具有防癌变的作用。经研究表明，维生素B2缺乏时，癌症的发病率比正常人要高。
动物实验表明，即使维生素B2的摄入量达30g/kg（体重），也不会是大鼠中毒，其腹腔注射的LD50为560mg/kg。因此，维生素B2的毒性是极低的，但这也并不意味着滥用维生素B2有任何好处。
六.维生素B2的生产
维生素B2的制备有化学合成和微生物合成两种方法，但相对来说，微生物法更有前景。Takeda,Hoffmann-La Roche及BASF等大多数生产厂家用化学合成方法来合成维生素B2，且工艺路线基本相同BASF和Coors Biotech已能用微生物法来生产，且其分离和纯化工艺发展很快，利用微生物法生产实用级的维生素B2已不在困难。
(一)化学合成法制备维生素B2
将D-核糖与3，4-二甲基苯胺缩合，在氢化还原得一仲胺此仲胺与苯氯化重氮化物反应，生成一种偶氮染料化合物——3，4二甲基-6-苯偶氮-D –核糖胺最后与巴比妥酸在乙酸存在下缩合即可得到维生素B2。此维生素B2的生产工艺已经实现工业化生产，其产率可达95.3%，纯度达96.8%。其中合成所用的D-核糖目前是以D-葡萄糖为原料，经芽孢杆菌属细菌发酵而成的，它代替了原先用D-葡萄糖经4步反应合成D-核糖的方法。因为后者需要用到钠汞齐，从而带来了很严重的环境污染问题。
化学法合成维生素B2可以利用传统的分批反应的设备，但在纯化精制阶段，偶氮燃料中间物和维生素B2均会生成细小晶体，给有效地过滤和洗涤带来了较大的困难。同时由于这2种化合物的颜色都比较深，也使工厂的车间管理较困难。
（二）微生物法合成维生素B2
维生素B2的微生物发酵生产采用三级发酵法。将在25℃培养成熟的维生素B2产生菌的斜面孢子用无菌水制成孢子悬浮液，接种于种子培养基中培养（30+℃），30~40h），最后将二级发酵液移种至三级发酵罐发酵（30+℃，160h），得到维生素B2发酵液。
工业上使用的维生素B2的产生菌主要有阿氏假囊酵母（Eremotecium ashbyii）和棉病囊菌（Ashbya gossypii）2种菌。经过菌种改良后，维生素B2生产的最高水平可达到10000U/ml.
第二节 主要维生素及辅酶类药物生产工艺
一、核黄素
1．核黄素的发现
1928年，研究证实，维生素B复合物受热丧失抗脚气病特性(维生素B1被破坏)以后，还存在着促进生长的特性。这种可促进生长的对热稳定的物质被人们称为维生素B2。后来又发现，这种对热稳定物质是由几种维生素组成的。1932年，德国科学家Warburg和Christian发现了可促进细胞生长的活性物质——黄素蛋白(实际上是酵母水溶液中提出的黄色酶)。后来分析发现，这种物质由两部分组成，其中一部分是蛋白质成分，另一部分为具有黄绿色荧光的色素，称为黄素。1933年Kuhn及其同事从蛋中分离出来一种黄色的，具强烈的黄绿色荧光的化合物，称为蛋黄素(Ovoflvavin )，另外一些工作者则由乳品，乳清及肝中将它们分离出来。1935年他们又确定了维生素B2的结构并合成了它。由于其分子中含有1个五碳糖核糖，故被命名为核黄素。
2．核黄素的结构特点
核黄素又名维生素B2，维生素G或乳黄素，是一种人体必需的一种维生素，为水溶性B族维生素。它是核醇与7,8-二甲基异咯嗪的缩合物，在化学上定名为7,8-二甲基-10- (D-1-核糖酰)－异咯嗪，是一种平面结构，天然核黄素的结构有很大不同。
核黄素的分子式为C17H20NO6，结构式如图9-1。在核黄素分子中一部分是具有黄绿色的异咯嗪族黄色素，在第7和8的位置上各有一甲基；另有一部分是戊糖基，与第10位置的氮原子相连，作为整个分子的侧链部分。如果去掉这两个甲基所得的化合物，具有毒性，侧链如不是戊糖基则无维生素的功效。
CH2OH
(CHOH)3
2CHCH3NN
ON
图9-1 核黄素的结构式
3．核黄素的理化性质
核黄素为黄褐色或橙黄色针状结晶粉末，味微苦，几乎无气味，它微溶于水，几乎不溶于乙醇和氯仿，也不溶于丙酮，乙醚和苯。在水溶液中它会发出略带绿色的黄色荧光。核黄素在240℃变暗色，其熔点为275～282℃，并在此温度下被破坏。
核黄素在干燥状态下性质稳定。在中性和酸性溶液中，核黄素对热稳定，120℃下加热lh也仅有少量破坏，但在碱性溶液中加热则容易被破坏，降解为无生物活性的光黄素(Lumiflavin )。核黄素对大多数氧化剂(如过氧化氢)稳定，但可被铬酸和高锰酸钾所氧化。游离核黄素对光很敏感，在光照尤其是紫外线照射下，极易引起不可逆分解而被破坏，且被破坏速度随温度和pH升高而加速。但大多数食物中的核黄素是以结合形式(与磷酸，蛋白质等结合成复合化合物)存在的。此种结合型的维生素B2对光比较稳定。
4．核黄素的生理功能
⑴ 作为辅酶和辅助因子
核黄素的主要生理功能是构成黄素酶的辅酶。己知黄素酶有100多种。其中黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)是最重要的两种辅酶形式。FMN和FAD是多种酶的辅酶，在生物氧化过程中起传递氢的作用。此外，这两种辅酶在蛋白质、糖、脂类和核酸代谢中也具有重要作用。
FMN和FAD与蛋白质紧密结合后形成黄素蛋白，并作为机体的递氢体参与机体的生物氧化过程。最重要的黄素蛋白包括有:NADH脱氢酶(以FMN为辅基)、琥珀酸脱氢酶、酰基辅酶A脱氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶(参与形成丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶复合体系)。此外，还有D-氨基酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、乳清酸还原酶、醛氧化酶等。核黄素及其辅酶衍生物和所有其他组织黄素均为异咯嗪类(Isoslloxazines )，其代谢转化关系见图9-2。
黄素激酶 FAD合成酶 转化
PO4 焦磷酸化酶 3-
图9-2 核黄素及其辅酶在机体内的转化关系
⑵ 增强机体免疫力
核黄素作为许多酶的辅助因子参与机体代谢，通过影响机体对养分的吸收与利用，从而间接参与免疫细胞增殖、分化和DNA、 RNA及抗体的合成等。超氧化物是白细胞杀菌功能中的必需因子，核黄素作为一种酶的作用与产生超氧化物(O)的NAPDH活性有关。研究小鼠发现，核黄素通过刺激产生中性白细胞，增强了抗各种感染的非特异宿主防御机理，并可增强中性白细胞的功能，提高非特异性免疫能力，在一定程度上还能增强特异性免疫功能。Satoshi等首次给牛肌肉注射核黄素(10mg/kg)不仅增加了中性白细胞的数目，而且增强了中性白细胞NBT还原活性以及对金黄色葡萄球菌的吞噬活性。 2-
⑶ 防止细胞脂质过氧化
动物机体内谷胱甘肽还原酶(GSH)在清除自由基、修复抗氧化损伤和维持细胞的结构方面都起着重要的作用。核黄素作为GSH的辅基成分，参与维持细胞内还原型谷光甘肽的浓度。据研究表明，核黄素缺乏，大鼠晶状体脂质过氧化增强，谷光甘肽氧化还原循环和抗氧化防御机制受损，而补充核黄素能减轻维持晶状体透明的GSH和蛋白质的氧化损伤。
⑷ 影响铁代谢
铁吸收进入小肠粘膜后，首先与铁蛋白结合，形成铁蛋白，贮存于粘膜细胞中，机体需要时，铁就从铁蛋白中释放出来，与运铁蛋白结合，进入血液循环，运往需要铁的组织。机体核黄素的缺乏，可能导致小肠粘膜NADH-FNN氧化还原酶(即铁蛋白还原酶)活力降低，其辅酶为FMN，机体的FMN来源于核黄素，该酶可将结合型的铁蛋白中的三价铁还原为游离型的二价铁，因此其活性降低，将影响肠粘膜中铁蛋白中铁
的动员，使结合于铁蛋白中的三价铁不能释放入血液。如果这一解释能进一步得到证实，则核黄素缺乏在实际上并不影响铁的吸收，而是影响其吸收后粘膜贮存的水平，使进入血循环的铁减少。
⑸ 抗肿瘤作用
核黄素依赖的谷光甘肽还原酶对还原型谷光甘肽(GSH)的再生起重要作用，而GSH作为还原剂有利于GSH-Px清除过氧化物，并作为亲核试剂与细胞色素P450代谢活化的亲电子性致癌物结合后一起排出体外，避免终致癌物与DNA结合发生甲基化，从而保护细胞内大分子免受损伤;同时核黄素作为各种黄素酶辅基的构成组分参与某些致癌物的代谢，核黄素缺乏可影响间接致癌物的体内解毒。
此外，核黄素还是一种重要的光敏化剂和潜在的光核酸酶。正是由于核黄素具有广泛的生理功能。因此，世界卫生组织(WHO)将其列为评价人体生长发育和营养状况的六大指标之一，建议人类的核黄素营养需求为0.3～1.8mg/kg，而动物饲料中为1～4mg/kg。
5．核黄素的应用
⑴ 核黄素在疾病治疗中的应用
微生物(如细菌、真菌)和高等植物可以合成核黄素，而动物(如畜禽)和人类则不能合成，必须从食物中摄取。人体缺乏核黄素数周后，会出现核黄素缺乏病的症状，如舌炎、口角炎、阴囊炎等。近年来研究表明，核黄素在防癌，降血脂，改善心功能和防治缺铁性贫血上也有较广泛的应用。
① 核黄素与心血管疾病
近年来，核黄素在心血管疾病防治中的作用己日益引起人们的关注。有研究显示，核黄素有降血脂、抗血小板聚集、抑制脂质过氧化等作用，这些都是高血压并发症相关的危险因素。
② 核黄素与缺铁性贫血
人群调查证实，核黄素缺乏者的平均血红蛋白量与血清铁蛋白(SF)浓度均低于正常者，且其贫血率及缺铁率高于核黄素营养状况正常者。核黄素的缺乏造成贮铁量减少而导致缺铁性贫血发生率增加，严重影响健康。
③ 核黄素与肿瘤
大量的流行病学和动物实验资料表明，核黄素等微量营养素具有防癌和抗癌作用。近年来有研究发现，核黄素缺乏时可促进亚硝胺等对大鼠的致癌作用，而补充核黄素后则可减少或抑制其致癌作用。
④ 核黄素与代谢疾病
核黄素是黄素酶辅基的主要组成部分，参与体内的能量代谢。新近的药理学研究表明，核黄素在多种能量代谢障碍疾病的治疗中具有重要作用。如在治疗线粒体功能障碍疾病中显示了很好的效果，而且对先天性乳酸中毒症也有一定的冶疗作用。
⑵ 核黄素在畜禽饲养中的应用
核黄素是动物体自身不能合成的低分子有机化合物，具有多种生理功能。畜禽等在使用现代配方饲料进行高密度养殖时，必须添加核黄素，否则也容易出现核黄素缺乏症状，影响畜禽的生长发育。大量研究表明，核黄素能够促进动物生长，提高动物的生产及耐寒能力，但动物体内不能储存相当数量的核黄素，所以就有必要在日粮中添加核黄素。因此，在动物饲料工业中核黄素作为添加剂，有广泛的应用前景。
6．核黄素的生产方法
核黄素较早就实现了商业化生产，国际上生产核黄素的工艺方法主要有四种:抽提法、化学合成法、半微生物发酵半化学合成法、微生物发酵法。应用较多的主要有两种，一种是化学合成法，主要用来生产医用核黄素；另一种是微生物发酵法，主要用来生产饲用核黄素。而后者是近些年来发展起来的一种十分经济有效的方法，而且从目前看，发酵法生产核黄素有可能通过后处理工序的强化达到医药标准而扩大其应用范围。
核黄素化学合成开始于D-核糖与3,4-二甲苯胺缩合，再氢化还原得一仲胺；此仲胺与苯氮化重氮化物反应，生成一种偶氮染料化合物——3,4-二甲基-6-苯偶氮-D-核糖胺；最后与巴比妥酸(丙二苯酰脲)在乙酸存在下缩合即可得到核黄素。化学法合成核黄素可以利用传统的分批反应设备，但在纯化精制阶段，偶氮染料中间物和核黄素均会生成细小的晶体，给有效地过滤和洗涤带来较大的困难。而且其反应步骤多、工艺长、回收率低、成本高(要用到较贵的起始反应物D-核糖)、能耗大，因此远不能满足工业需求，正逐渐被微生物发酵法所取代。
7.核黄素的微生物发酵法
微生物发酵法属于生物化学过程，利用的是可再生能源，废物排放量少，生产成本低，是目前国际上倍受推崇的核黄素生产方法。最初利用微生物发酵法进行核黄素商业化生产的是一株梭状芽抱杆菌
(Clostridium acetobutylicum )，由于当时发酵技术及菌种选育技术非常落后，因此核黄素产量很低。1965年有三家公司(Commercial Solvent，Grain Processing Corporation , Premier Malt Products)开始利用微生物发酵法对核黄素进行大规模商业化生产。但好景不长，三年后三家公司都相继停产，其原因是核黄素的量太低，根本无法与化学合成法竞争。
1974年微生物发酵法重新被Merck公司所采用。他们利用棉病阿舒囊霉(Ashbya gossypii )作为生产菌株，从中摸索出了许多发酵技术，并通过诱变育种技术获得了一些核黄素高产菌株。从此微生物发酵法获得了长足的发展。当时常用的两个核黄素高产突变菌株为A.gossypii和E.ashbyii，其产量达到15g/L。在随后的一段时期内国际上一些知名公司也开始采用微生物发酵法进行核黄素的生产。1990德国的BASF公司尝试使用A.gossypii作为生产菌株进行核黄素的商业化生产。经过6年的发展，他们最终用微生物发酵法完全取代了化学合成法。与此同时美国的Coors也开发出了一株核黄素高产菌株(C.famata )，据称其核黄素产量可达20g/L。后来该菌株被美国的ADM公司所采用。2000年瑞士的Roche公司决定采用美国Omnigene公司开发的一株核黄素高产枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)作为生产菌株，预计核黄素年产量可达3000吨。与化学合成法相比，可使成本降低一半。
微生物发酵法与化学合成法相比也存在着某些缺点和不足，例如:在核黄素的后期加工处理过程中，核黄素的分离纯化比较困难，很难制得高纯度的核黄素。但是随着核黄素分离纯化技术的不断改进，微生物发酵法将以其环保、节能、低成本等优点最终取代化学合成法。
⑴ 核黄素的生产菌种
利用微生物发酵法，可以代谢产生核黄素的微生物很多，细菌方面有枯草芽孢杆菌(Bacillus
subtilis )、棒状杆菌(Corynebacterium )、分枝杆菌(Mycobacterium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、气杆菌(Areobacter)、梭状芽抱杆菌(Clostridium)、丙酮丁醇梭菌（Clostridum acetobutylicum)等。真菌方面有根霉(Rhizopus)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、棉病阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、季氏假丝酵母(Candida guillermonda)、阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)、假丝酵母(Candida flaveri)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。但是真正用于核黄素工业化生产的菌种却很有限，如表9-2。
表9-2 核黄素工业生产中的常用微生物菌种
Species
阿氏假囊酵母
假丝酵母
酿酒酵母
棉病阿舒囊霉
枯草芽孢杆菌
丙酮丁醇梭菌 Scientific name Classification Yeast Yeast Yeast Fungus Bacterium Bacterium Eremothecium ashbyii Candida flaveri Saccharomyces cerevisiae Ashbya gossypii Bacillus subtilis Clostridum acetobutylicum
⑵ 核黄素的生物合成途径
核黄素是异咯嗪的衍生物，在异咯嗪环的6,7位上有两个甲基，9位N上连着一个核糖醇。关于核黄素的生物合成过程，不同种类的生物中并不完全相同。目前对大肠杆菌、枯草芽饱杆菌以及一些酵母中的核黄素合成途径了解得比较清楚。在阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii)发酵过程中，核黄素是一种重要的次级代谢产物，其合成与积累是一个复杂的代谢过程。菌体通过Embdem-Mogerhof-Parnas pathway (EMP途径)和Hexose monophosphate pathway (HMP途径)，形成复杂的代谢流。在EMP途径中菌体降解葡萄糖为丙酮酸同时产生能量ATP，而HMP途径是菌体核黄素生物合成的主干代谢流，因此适当调整菌体代谢中EMP途径与HMP途径碳架物质流的比例，即适当加大HMP途径碳架物质与能量的代谢流，将很可能有利于核黄素的过量合成。研究表明，甲酸酯、C02与甘氨酸都加入核黄素分子中，并由这些物质出发经过嘌呤成为核黄素，而且己证明GTP是核黄素的真正前体。若以葡萄糖为出发底物，整个合成代谢途径可分成9个阶段：
a.由葡萄糖出发，经HMP途径生成5-磷酸核搪，在焦磷酸激酶的催化下与ATP作用，生成5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)；
b.PRPP在PRPP转酰胺酶的作用下生成5-磷酸核糖基胺(PRA)；
c. PRA经过一系列反应生成肌苷酸(IMP)；
d. IMP经过一系列反应生成鸟苷三磷酸(GTP)；
e. GTP在GTP环解酶的作用下裂解，生成2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶(HTP)，同时失去磷酸核糖； f. HTP与核糖醇CDP作用，生成2,5-二氨基-6-羟基-4-核糖基氨基嘧啶(DHRAP)和CDP；
g. DHRAP放出NH3，生成5-氨基-2,6-二羟基-4-核糖基氨基嘧啶(ADRAP)；
h. ADRAP与3-羟基丁酮缩合，生成6,7-二甲基-8-核醇基-二氧四氢嘧啶(DMRL)。
i. 最后，DMRL在核黄素合成酶的作用下，形成核黄素(riboflavin)。
⑶ 发酵工艺条件及其控制方法
① 核黄素发酵培养基
碳源 培养基可采用葡萄糖、蔗糖、淀粉及糖蜜等碳源，但各种碳源的发酵效果不同。其中以葡萄糖的转化率较高，但是菌体受高浓度葡萄糖的反馈抑制，普通菌株葡萄糖浓度一般不超过2％。蔗糖转化率也较高，而且菌体能够耐受高浓度的蔗糖。糖蜜的成分很复杂，除了蔗糖之外，还有其它糖类及矿物质，营养丰富，所以糖蜜的转化率最高，而且价格便宜，但是糖蜜浓度高了对菌体也会有抑制，因此在工业发酵中应当采用流加补糖的方式。菌体可以利用淀粉作为碳源，但效率不如蔗糖高，这可能与生产核黄素的菌株的淀粉水解酶的活性较低有关。
氮源 在生产核黄素发酵过程中，营养丰富的有机氮源能够满足生产菌株对生长因子的需要。同时由于核黄素分子中含有4个N原子，所以培养基中氮源的充足供给对核黄素发酵有重要影响。氮源不足必然使核黄素的合成受到抑制。常用的有机氮源，如酵母粉、酵母抽提物、酵母膏等酵母系列产品，除了含有丰富的氮源物质外，还含有维生素、有机酸、无机盐等多种营养成分，既能够满足细胞的氮源需要，也能满足细胞对生长因子的需要。
无机盐及微量元素 无机盐对核黄素的生产有较大影响。硫酸镁是己糖激酶、丙酮酸激酶等多种酶的激活剂，培养基中Mg浓度在0.05％左右效果较好。适量磷酸盐加入可以促进菌体生长，但磷酸盐过量会象葡萄糖一样抑制代谢产物的合成，比如抑制代谢产物前体的形成，阻遏代谢产物合成中某些关键酶的合成等。一般磷酸盐浓度宜控制在0.4％以下，多了只长菌体，且抑制了GTP的合成，使核黄素产量降低。 2+
微量元素对核黄素的生产有一定的影响。铁离子是过氧化酶、过氧化物酶、细胞色素、细胞色素酶的组成部分。缺铁时，这些酶的合成就要受到影响；而铁含量过多时，这些酶的合成就会受到抑制，结果细胞弱小，单位低。钙离子是淀粉酶、蛋白酶等酶的激活剂，其对发酵有降低膜的透性，及调节酸碱度等作用。钾离子是磷酸核糖甲酰甘氨咪唑合成酶、丙酮酸激酶等酶的激活剂，并控制原生质胶态和细胞质膜透性。一般情况下培养基中酵母粉、酵母膏、玉米粉等氮源中含有足够的微量元素已经能较好的满足菌体的需要。
② 发酵条件对核黄素生产的影响
接种量的影响 接种量是指接入的培养液与待接种的液体培养基的体积比。采用稍大的接种量，缩短了迟滞期，能明显缩短培养时间。大量接入培养成熟的种子，会使菌体很快进入对数生长期，缩短生长过程的迟滞期，因而缩短了发酵周期，有利提高核黄素发酵生产率。并且还有利于阻止染菌的进一步发展。但如果接种量过大，移入的代谢废物必然较多，菌体生长会受代谢废物的干扰而减慢，菌体提前衰老，导致最终菌体细胞浓度下降，从而影响发酵水平。一般建议核黄素生产过程中接种量在5％~7%之间。
温度的影响 温度会影响菌体的生长速率、生化反应速率、扩散速率、酶的活力与稳定性、基质的吸收与利用等。在核黄素发酵过程中，发酵温度在39～41℃时产量较高，主要因为GTP环水解酶Ⅱ作用的最佳温度为42℃。但温度过高，酶容易失活。
溶氧的影响 充足的供氧对于菌体生长和核黄素代谢很重要，一般情况下，核黄素的生产过程对氧的要求较高，所以应在发酵过程中进行充分的供氧。
初始pH值的影响 初始pH值对发酵影响很大，pH变化会引起各种酶活力的改变，影响菌对基质代谢的速度，甚至改变菌的代谢途径及细胞结构。一般在酸性环境下菌体不产核黄素，这主要是因为菌体的核黄素合成酶在pH为8.4时活力最高。核黄素生产菌对碱性条件有很高的耐受力，在pH＝9的基质中仍能生长，并且菌体自身代谢可以调节pH值。但是菌体的蔗糖水解酶和糖酵解酶系的活性一般，在中性或偏酸性条件下活性较高，所以综合各种酶的影响，在培养基中pH值一般控制在7～8之间为宜。可以通过流加氨水、调节补糖的速度或加入缓冲溶液来控制。
⑷ 提取与纯化
发酵液中核黄素浓度很低，仅0.6～0.8％，而且成分复杂，尤其是细菌发酵液，其通常有糖、蛋白质、菌体及菌体碎片及预处理时加入的物质（如硅藻土等杂质），因此从中提取核黄素比较困难。目前核黄素的提取方法重要有两大类：碱溶法、酸解法。
① 碱溶法
属于较传统的方法(Morehouse，1958）,其步骤为：a 加热，调节pH＝4～5；b 加入碱使发酵液中的核黄素溶解后，过滤细胞；c 加入NaS2O3还原核黄素，调节pH＝5.8使其沉淀后，过滤出核黄素晶体；d 调节pH＝9.5，再次溶解核黄素沉淀；e 在碱性条件下加氧化剂氧化核黄素；f 调节pH＝5.8时，再次沉淀核黄素；g 核黄素沉淀与母液分离。由于这个方法有两个步骤涉及到加碱溶解，所以又称二次碱溶。这个方法适用于核黄素含量大于1g/L的发酵液，产品纯度可达到87％以上。而根据Morehouse法衍生的其他加碱提取核黄素方法均称碱溶法。
② 酸解法
1996年欧洲专利介绍了酸解法提取核黄素的工艺，其步骤如下：
a．将发酵液于50～70℃下加热45min，杀死菌体，降低液体的粘度；
b. 对加热后的发酵液在2500g下进行离心2～3次，使密度较大的核黄素晶体颗粒与较轻的生物质和无机盐分离；
c. 核黄素悬浮液在0.1％～0.2％的硫酸或盐酸中，加热至80℃以上保持8～16小时，降解其中残余的蛋白质和核酸分子；
d. 酸解后的核黄素溶液中的杂质已经大大减少，可用过滤和洗脱进行分离，所得的晶体纯度可达到99％。
酸解法虽然所得产品的纯度高，但消耗大量酸和热量，成本比前种方法高。
二、维生素B12
1．维生素B12概述
1926 年，G.R.Minot 和W.B.Murphy 发现用肝脏抽提物可以治疗人类恶性贫血病。这一发现使他们获得了l934年诺贝尔医学奖。l948 年E.L.Ricke和L.Smith从肝脏提取物中分离出结晶维生素B12。
维生素B12又称氰钴胺素，属于B族维生素之一，是一种由微生物合成动物必需的维生素。它主要存在于动物性食品如内脏、肝、肾和猪心等，瘦肉、鱼、牛乳以及蛋黄中也存在维生素B12 ；植物中不含维生素B12；放线菌、人和动物的肠道菌能合成维生素B12。动物所需的VB12 主要靠从食物中摄取，或吸收肠道微生物产生的VB12。但是人类只能从食物中获得VB12；因为人体肠道微生物合成的VB12不能被人体吸收。
由于动物组织中VB12 含量很低，没有商业性生产价值，化学合成也不可能，因为VB12 结构复杂，合成VB12 需要70步反应。第一次大批量获得VB12 是从生产抗生素如链霉素、氯霉素、新霉素等发酵液中分离得到的一种副产品，其含量约1mg/L。随着对VB12 需求的增加，选育出VB12 的高产菌株成为必然要求。目前，工业化生产VB12 已全部采用发酵工艺。
维生素B12 作为一种人体和动物必需的维生素，其独特的功能性及其复杂的结构和产生条件决定了其较为苛刻的生产条件，正是这种不易获得性使其价格非常昂贵。
多年来人们一直在尝试通过化学合成的途径来降低维生素B12 的成本。但由于其庞大而复杂的结构，虽在近些年已获得某些方面的成功，但同时使化学家们陷入了新的困境：副产物太多，难以提纯。于是，人们又重新审视维生素B12 的生产方法，再次将重点转向发酵法生产。能产生维生素B12 的菌种较多，但由于其作为次级代谢产物，始终在发酵水平没有新的突破。在国内，仅近年才出现了两个生产厂家，但其年产量与庞大的国内需求市场相比微不足道。因此，在国内实现维生素B12 的低成本化将会有巨大的市场潜力。
2．维生素B12的结构
维生素B12 是自然界中存在的结构最为复杂的小分子化合物之一。它是含三价钴的多环系化合物，基本结构是钴啉，由四个四氢吡咯环组成，它与卟啉环的区别在于A环和D环之间缺少一个环桥。VB12 经验式为C63H38O14N14PCo。从结构式中可以看出，钴胺酰胺上的核糖C-1位上连接一个异环基团，即5,6-二甲基苯并咪唑。该基团上另外一个氮原子又与钴形成配位键。含有其它异环基团的VB12 类似物(用嘌呤或苯并咪唑替代5,6-二甲基苯并咪唑),可由微生物转化或在培养基中添加这些物质产生。与5,6-二甲基苯并咪唑相
比,其他取代基团取代后形成的VB12 衍生物,在脊脊动物体内生理作用较低。嘌呤碱基取代的VB12 衍生物在人体内无效。
图9-3 维生素B12的结构
3．维生素B12的理化性质
维生素B12又称钴胺素，是B族维生素之一，为深红色针状结晶或结晶粉末，无一定熔点，在300至320℃分解；无臭无味，溶于水、乙醇和丙酮，不溶于氯仿、丙酮和乙醚。其水溶液为中性，具左旋光性，在波长278、 361和548nm处有最大吸收。维生素B12的结构性质相当稳定，在弱酸性溶液和中性溶液中耐热，pH值3以下和9以上则易分解，日光、氧化剂和还原剂均能破坏维生素B12的活性。
4．维生素B12的生物合成途径
维生素B12存在于动物性食品中，植物中不含维生素B12，而且其合成只限于在原核生物界中某些成员，放线菌、人和动物的肠道菌也能合成维生素B12。
维生素B12的生物学功能和从头合成途径已经被阐明。其合成分别由呼吸链中的C5和C4途径开始，生成主要中间代谢物5-氨基酮戊酸(5-ALA)、uroporphyrinogenⅢ和前钴琳环-2，在前钴琳环-2处分支成好氧
途径和厌氧途径。好氧途径需要ATP并生成副产物乙酸，厌氧途径不需ATP并生成副产物乙醛。最后好氧和厌氧两个分支都会生成腺苷钴琳胺酸，最终合成腺苷钴胺素。
5．维生素B12的生产技术
⑴ 维生素B12的来源
维生素B12的来源主要有以下三种:① 从污泥和下水道中提取，但由此获得的维生素B12并不能直接进入食品或药品级产品，通常只局限于饲料添加剂；② 从工业废液中提取，如酒精、丙酮、丁醇、造纸及乳制品工业废液，柠檬酸发酵后的废液等都是生产维生素B12的原料，生产上一般是用抗菌素工业废液，绝大多数是从链霉素废液中提取，近年来又发现庆大霉素发酵液中含维生素B12较高；③微生物纯种发酵，如丙酸菌发酵、巨大芽抱杆菌生产以及采用转基因的E.coli发酵生产维生素B12。
⑵ 维生素B12的合成方法
维生素B12是自然界己知结构中较复杂的非聚合有机化合物，其化学合成总共有70个合成步骤，这种高度复杂性使得工业生产成本太高，所以迄今尚无法借助化学手段来实际工业化生产B12；因为只有微生物能进行维生素B12的生物合成。
当今工业生产维生素B12常用随机诱变的方法获得高产菌株然后利用微生物发酵法生产B12。常用的诱变剂是紫外线和亚硝基胍，同时选择有效的突变，例如产量、遗传稳定性、合适的生长速度以及对培养基中有毒物质的抗性等。
⑶ 维生素B12的生产菌种
能够产生维生素B12的微生物主要为放线菌和细菌。放线菌中链霉菌属的主要有：Aureo -faciens(金色链霉菌)，Griseus(灰色链霉菌)；细菌主要包括有:Aerobacter aerogenes(好氧产气杆菌)，Bacillus megatherium(巨大芽孢杆菌)，Escherichia coli(大肠埃希氏菌)，Propionibacterium freudenreichii(菲氏丙酸杆菌)，Propionibacterium shermanii(谢氏丙酸杆菌)等。另外，米根霉的一些种也可合成维生素B12。
早期人们是从天然肥料或土壤中分离出能产生维生素B12的菌株。如1991年Inoue等从海底沉积物中分离出一种厌氧型乙酸杆菌属菌株，可以产生胞内维生素B12；1992年Kojima等从土壤样品中分离到能够消解异丙醇并产生维生素B12的微生物。
不同菌合成维生素B12的能力也不同，因为Propionibacterium shermanii和Pseudomonas
denitrificans高产维生素B12的能力及其快速的生长能力，如今，这两种菌被广泛用于工业生产维生素B12。
一般常用Propionibacterium shermanii，这个菌株被美国食品和药品组织认为是安全菌株，另外丙酸菌发酵还具备多种优点：① 培养基在发酵过程中，产生丙酸使得培养基pH值下降，从而避免杂菌的污染；② 丙酸菌常采用厌氧发酵，勿需设计供氧系统和搅拌系统，可减少设备投入和节约能耗；③ 发酵过程中能产生丙酸钙，而丙酸钙通常是用作防腐添加剂的，从而可以进一步减少染菌的可能。
表9-3列举了不同的菌种，不同的发酵工艺，其合成维生素B12的能力也不同。其中，Propionibacterium freudenreichii和Propionibacterium shermanii是目前国际上常用的工业生产菌株，其维生素B12的产量也相对较高。
表9-3 不同菌种合成维生素B12能力的比较
Species B12(mg/L)
206.0
135.0
60.0
60.0
18.0
16.5
11.5
6.0
4.5
3.6
3.2 Propionibacterium freudenreichii Rhodopseudomonas protamicus Propionibacterium shermanii Pseudomonas denitrifcans Nocardia rugosa Rhizobium cobalaminogenium Micromonospora sp. Streptomyces olivaceus Nocardia gardneri Butyribacterium methylotrophicum Pseudomonas sp.
Arthrobacter hyalinus 1.1
6.维生素B12的发酵工艺
⑴ 二步发酵工艺
二步发酵工艺主要围绕着减少生物合成过程的自抑制作用和维持较高微生物细胞浓度这两方面展开工作。
所有的Propionibacterium在低浓度溶解氧的发酵条件下可以高产维生素B12,在厌氧条件下，
Propionibacterium发酵生成胞内维生素B12同时也生成胞外产物——丙酸和乙酸，副产物丙酸的累积会抑制Propionibacterium细胞的生长；然而，作为维生素B12前体物的5,6-二甲基苯丙咪唑（DMBI）的合成却需要氧，另外，在有氧条件下，丙酸才能够被分解掉。显然，只有及时消除发酵体系中不断增多的丙酸，才能推动维生素B12生物合成反应的有效进行。因此Propioni -bacterium的发酵分成两个阶段:前三天厌氧发酵，以提高细胞生长速率，此时生成维生素B12的前体谷胺酰氨；接着好氧培养1至3天，以分解丙酸，并让细菌合成DMBI然后与钴胺素连接。
在Propionibacterium的发酵过程中，丙酸的产量占总发酵液的10%，又为了使pH值保持在7，所以，中和代谢过程中积累的丙酸是发酵的一个关键所在，工业生产常采用添加氨水等碱性物质及通入少量氧气来减少这种影响。
⑵ 混合培养
近年来有报道在混合体系中加入可以吞噬或消耗丙酸的微生物，直接减弱丙酸的抑制作用，达到高产维生素B12之目的。Miyano等将Propionibacterium与Ralstonia eutropha（真氧产气杆菌)混合发酵，后者可以利用前者生成的丙酸混合培养的维生素B12的产量达到19mg/L。
7．维生素B12的提取与测定技术
⑴ 提取技术
对于维生素B12的提取，不断有新的方法提出，主要有溶剂提取法、离子交换树脂法、醋酸缓冲液法、Na2HPO4加压提取法〔U.S.P标准法)和KCN煮沸法等，现在常用KCN煮沸法。
① 有机溶剂提取
采用两相混合溶剂，可简单地纯化和提取维生素B12，常用的溶剂为苯甲醇和水的混合溶液，基本过程如下:
发酵液→吸附(活性碳)→洗脱(吡啶)→浓缩→层析(A12O3)→洗脱(甲醇)→收集红色液→浓缩→结晶。 ② 离子交换树脂提取
随着离子交换柱在工业上的广泛应用，人们尝试用阴阳离子交换树来进行维生素B12的提取，过程如下所示:
发酵液→阳离子树脂(Lonac C-240)→阴离子树脂(LonacAC-300)→蒸馏水冲洗→收集红色液体部分→浓缩→冷冻干燥。
③ 醋酸缓冲液法
本方法只适用于实验室小规模生产维生素B12。基本过程如下:
发酵液→离心收集菌体→lmol/L pH4.5醋酸缓冲液→高压高温破碎细胞。
最后在540nm下测吸光值。
④ Na2HP04加压提取法(U.S.P标准法)
该方法是美国药典中提取维生素B12的标准方法，其提取液由1.3%NaH2P03, 1.2%柠檬酸和1%Na2S205(偏重亚硫酸钠)配制而成。在样品中加入该提取液，匀浆或超声波破碎样品细胞。高温加热后离心，取上清液，加入对氨基苯磺酸和H202，于330nm波长下测其吸光值。
⑤ KCN煮沸法
KCN煮沸法是目前最常用的一种提取维生素B12的方法，工业化大生产维生素B12的时候也是用该法进行提取最后得到氰钴胺素。该方法利用-CN基团取代与钴原子中心结合的X基团而得到的性状稳定的维生素B12。
Taylor等1952年报道的一种测定维生素B12的方法，用1%KCN高温高压提取之后，加入Na2S04，经过苯甲醇、氯仿和水多次萃取之后，一部分调pH值为11，另一部分待测液调pH值为5至6，于580nm下测定其一氰和二氰形式的吸光值。
⑵ 测定方法
① 比色测定法
本法是药物样品中维生素B12 测定的常用方法。其原理是样品经浓硫酸和高氯酸消化后，样液中的钴与M-二-(α-吡啶酮)-α-吡啶联腙生成钴的红色化合物，可以进行比色测定，再从钴的含量换算成维生素B12 的含量。
② 离子交换测定法
药物中的维生素B12 可以从弱酸性阳离子交换树脂中得到，分离洗脱下来。例如桔子酱中的维生素B12 通过Florisi土为吸咐剂进行层析分离后，在530nm波长处测定其含量。
③ 原子吸收法
维生素B12 的分子中含有钴原子占维生素B12 35%，采用原子吸收分光光度法可以测定其中的钴含量，再换算成维生素B12 含量。在测定药品中维生素B12 时，可以直接将药品的溶液吸入原子分光光度计中测定。
④ 微生物法
微生物法是国家标准GB/T5413.14-1997婴幼儿配方食品和乳粉中维生素B12的测定方法，用来鉴定菌株维生素B12产力的试验菌种通常采Lactobacillus Leichmannii（莱士曼氏乳酸杆菌)和Escherichia coli(大肠埃希氏菌)，这两种菌对维生素B12的存在具有极高灵敏性，能够定量测出样品中维生素B12的含量。
⑤ 高效液相色谱法
利用高效液相色谱(HPLC)可以精确的检测维生素B12含量，排除维生素B12结构类似物的影响。 ⑥ 薄层层析法
食品检测中常用薄层层析法来鉴定维生素B12，鉴于维生素B12本身有颜色，所以在适当的浓度下并不用显色剂就能直接观察，常用的展开剂为冰醋酸-丙酮-苯-甲醇(5:5:70:20)。
虽然薄层层析较之其他层析法具有设备简单、可用腐蚀性显色剂、展层时间短以及灵敏度高等优点，但是对于维生素B12这种复杂结构的化合物，并不是常用的分析方法，并且不易于检测出微量的维生素B12
维酶素
Weimeisu
Vitacoenzyme
本品系黄豆渣经阿氏假囊酵母菌（Eremothecium ashbyii Guilliermond）经固体发酵后制得的复合物。按干燥品计算，每1g含维生素B2（C17H20N4O6）不得少于4.0mg。
【性状】本品为黄色至棕黄色粉末，有特臭，味微苦。
【鉴别】（1）取含量测定项下溶液，在透射光下检视显淡黄色，并有强烈的黄绿色荧光。将溶液分为3份：于第一份中加稀盐酸溶液，荧光即消失；于第二份中加入氢氧化钠试液适量，荧光亦消失；于第三份中加连二亚硫酸钠结晶少许，摇匀后，黄色消退，荧光亦消失。
（2）取本品细粉0.1g，加水5ml，振摇10分钟，滤过，滤液加茚三酮2mg，置水浴中加热，溶液显蓝紫色。
【检查】 干燥失重 取本品，在105℃干燥3小时，减失重量不得过5.0%(中国药典2000年版二部附录Ⅷ L)。
炽灼残渣 不得过7.0% (中国药典2000年版二部附录Ⅷ N )。
重金属 取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查（中国药典2000年版二部附录 Ⅷ H 第二法），含重金属不得过百万分之二十。
微生物限度 取本品，依法检查（中国药典2000年版二部附录Ⅺ J及2002年增补本）。不得检出活螨；每1克中不得检出大肠杆菌；每1克中含细菌数不得超过1000个，含霉菌数不得超过100个。
【含量测定】避光操作。
对照品溶液的制备 精密称取在105℃ 干燥2小时的维生素B2对照品50mg，
置500ml棕色量瓶中，加0.02mol/L醋酸溶液适量，置水浴中加热1小时，并时时振摇，使维生素B2溶解，放冷至室温，用0.02mol/L醋酸溶液稀释至刻度，
摇匀，精密量取15ml，置100ml 量瓶中，用0.02 mol /L 醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含维生素B215μg的溶液。
供试品溶液的制备 取本品研细，精密称取适量（约相当于维生素B2 3.0mg）,
置250ml量瓶中，加0.02mol/L醋酸溶液适量,置水浴中加热1小时,使维生素B2溶解,放冷至室温,用0.02mol/L醋酸溶液稀释至刻度,摇匀,滤过,弃去初滤液,
取续滤液备用。
测定法 取对照品溶液与供试品溶液，以0.02mol/L醋酸溶液作空白,照分光光度法(中国药典2000年版二部附录Ⅳ A ),在444nm波长处分别测定吸收度,各加入连二亚硫酸钠结晶约3mg,稍加振摇,混匀，在1～6分钟内测定最低的吸收度，以前后两次的吸收度差值计算含量。
【类别】维生素与辅酶类药。
【贮藏】密封，凉暗处保存。
【制剂】（1）维酶素片（2）维酶素胶囊。
【有效期】暂定2年。
低强度超声波刺激对阿氏假囊酵母细胞次生代谢的影响
一定强度的超声波能够促进细胞的生长和代谢，细胞膜是抑制微生物次生代谢产物产量的主要原因。以阿氏假囊酵母(E．ashbyii)为实验材料，选择功率6W、频率24kHz的超声加载于摇瓶发酵过程中，检测了加载对菌丝体干重和核黄素分泌的变化情况。结果表明，一定强度的超声间断加载对E．ashbyii的生长有一定的促进作用，并使核黄素的开始分泌时间从96h缩短到60h；同时发现，发酵96h后加载，能有效提高核黄素的产量至0．346mg／L，非常显著地高于对照组；发酵后的104～112h是超声处理的最佳时间段，为维持较高的产率，需每隔1．5h再次超声处理。
饲料添加剂原料的生产方法
山东农业大学 杨在宾
饲料添加剂种类繁多，性质各异。从化学结构上讲，有结构简单的无机化合物，还有结构复杂的大分子有机化合物；在化学性质上，有些稳定性强，有一些则易氧化，易吸水，易变性等。酶、激素、微生态制剂属于生物活性物质，生产、使用、保存都需要特殊工艺。微量元素添加剂，如硫酸亚铁，生产工艺简单，普通化工技术即可完成；而氨基酸工业、抗生素的合成则属于跨学科、跨行业的工业化大生产。综合饲料添加剂原料的生产方法和工艺要求，目前普遍应用的是化学法、发酵法、提取法和基因工程技术等。
第一节 化 学 法
化学法是指用化学工程生产各种产品的工艺方法。化学工程则是研究化学工业与其他过程工业生产过程中所进行的化学过程、物理过程及其所用设备设计与操作和优化共同规律的一门工程学科。在饲料工业中应用化学工程技术，可以快速、安全、经济地生产价格低、质量高的饲料添加剂原料。在饲料添加剂原料中，很多生产过程都是用化学法来完成的，如各种微量元素添加剂，某些饲料改良剂以及大部分维生素。
一、饲料添加剂原料生产中应用的化学工程技术
与生产其它化学产品一样，饲料添加剂原料的化学法生产也涉及无机化工、石油化工、精细化工、高分子化工和生物化工等主要类型。
石油化工和高分子化工：为饲料添加剂原料生产提供初级原料，如烟酸生产需要的3-甲基吡啶和2-甲基-5-乙基吡啶，维生素B6生产需要的氯乙酸等。
无机化工：最早用于各种酸、碱的生产。在合成氨基础上，饲料用尿素的生产是无机化工在饲料添加剂原料生产中的用途之一。
精细化工：是饲料添加剂原料化学法生产的主要途径。其生产设备小、效率高、操作控制方便、适应性强、能一器多用、采用间歇操作。大部分维生素、微量元素添加剂原料都是精细化工产品。
生物化工：最早用于有机化合物合成。在饲料添加剂方面，可用于饲料改良剂和维生素生产，如柠檬酸、乳酸等；后来应用于某些抗生素添加剂的合成，如喹乙醇等。目前，生物化工已与发酵工程和基因工程结合，进入新的发展阶段，用于抗生素、烟酸，甚至氨基酸的合成工业。
二、常用饲料添加剂原料化学法生产
（一）用化学法生产的饲料添加剂 饲料添加剂原料中，能用化学法生产的添加剂种类很多，所有矿物质添加剂、大部分维生素和饲料改良剂都是用化学法生产的。表2-1列出了能用化学法生产的维生素原料。
（二）化学法生产工艺示例
1．烟酸化学法生产的典型生产工艺 烟酸的生产工艺是化学法生产维生素的典型工艺。
首先是2-甲基-5-乙基吡啶和硝酸混合，进入反应器，反应后产物经膨胀分成两相。液相经脱水后进入结晶器，分出的二氧化氮气体进入吸收器与水反应生成硝酸，回收再利用。从结晶器出来的粗烟酸硝酸盐经离心机与水分开，分离的固体经溶解、中和后制成烟酸，经结晶、离心、干燥、过筛得烟酸产品。该法的特点是生产规模大，技术成熟，产品纯度高，原料价廉易得，生产成本低。
2．硫酸亚铁化学法生产工艺 用废铁和硫酸反应生产硫酸亚铁是微量元素酸解法生产的典型方法，其简单工艺流程如图2-2。整个工艺过程分酸解、过滤、结晶、干燥等过程。该法工艺简单，设备投资少，适合于中小型企业。
3．尿素生产工艺 尿素的生产方法是用无机化工进行化学合成饲料添加剂的典型方法。其原料只用液氨和二氧化碳，生产中只涉及气液相非催化反应。反
应过程比较简单，中间产物只有氨基甲酸铵，产物只有尿素和水，不需要复杂的工艺过程。
第二节 发 酵 法
一、添加剂原料微生物发酵法生产的发展历程
与其它微生物发酵工程生产领域一样，当今饲料添加剂所涉及的微生物发酵生产技术都起源于天然发酵技术，如酿酒、制酱、奶酪等。整个20世纪是微生物发酵工程技术迅速发展的100年。1905年开始利用纯粹培养发酵技术，以固体培养基分离培养微生物，建立了酒精、酵母、淀粉酶等产品的制造工艺。1929年青霉素的发现、化学工程和酶化学的进步，形成了微生物深层发酵技术，从而使抗生素、有机酸、维生素、酶制剂、激素等的工业化生产成为现实。20世纪50年代，生物化学和微生物遗传学在发酵工程中的应用，实现了应用微生物代谢控制发酵技术工业化生产氨基酸的新工艺。60年代，随着石油微生物研究的进展，发现了微生物非碳水化合物原料的发酵技术，从而开始利用石油化工产品、污水、废弃物生产单细胞蛋白质，实现了微生物发酵工程资源开发与环境保护的综合利用。进入70年代后，随着分子生物学、细胞工程、酶工程、分子育种等的发展，建立了应用生物工程和生物技术生产酶、干扰素、激素等的现代化工艺。至此，微生物发酵工程已经成为饲料添加剂原料生产的主要途径。
二、微生物发酵工程特点
在发酵生产的过程中，发酵工业不断结合了生物化学、微生物学、化学等学科，特别是近20年来迅速吸纳了基因工程、细胞工程、固定化、连续化等新技术，使微生物发酵工程技术应用领域不断扩大和充实。目前公认的发酵工程的定义为：利用微生物的某种特性，通过现代工程技术手段进行工业化规模生产的技术。它主要包括工业生产菌菌种的选育、最佳发酵条件的选择和控制、生物反应器（发酵罐）的设计和产品的分离、提取和精制等过程。
饲料添加剂微生物发酵工程生产与化学工程生产相比有以下特点。
1.微生物一般特点 微生物个体小、结构简单、常用于发酵工业的细菌、放线菌和部分真菌都是单细胞。其特点如下。第一，繁殖快。一般细菌在最适条件下每20分钟就能繁殖一代。一个细胞，在不受任何影响的条件下24小时可繁殖到4万亿亿个。微生物这种强大的繁殖能力就使利用微生物进行发酵工程工业化生产成为现实。如在酵母生产中，利用石油为原料，通过微生物发酵生产菌体蛋白，其合成速度比植物快500倍，比动物快2000倍。第二，易于变异。由于微生物个体小、结构简单、代谢旺盛、繁殖快，因此容易受到环境条件变化的影响，引起遗传性变异。在实际应用中，人为利用各种物理、化学因素等处理微生物，可以使微生物发生变异，为有益微生物良种选育提供方便。第三，易于培养。微生物中大多数种类，都能用人工的方法，采用各种发酵形式（液体的或固体的）进行发酵，生产各种微生物产品，因此易于工厂化和商业化生产。
2.生物学特性 发酵工程是以微生物细胞来催化的，发酵过程中所有中间步骤都在细胞中进行，不象化学工业生产那样需要经过几个中间产物的步骤。发酵
生产中采用生物催化剂，实行一步生产法，利用微生物特异性代谢反应比化学合成更易于生产所需要的产物。有很多用化学方法不能生产的复杂化合物，用微生物工程方法来合成却很容易。
3.生产安全、能源消耗低 微生物具有比任何高等动物和植物都快得多的生长速度。同时生产条件为常温常压条件，不象化学法生产那样需要高温高压条件。因此，发酵法生产安全性能好，能源消耗低。
4.原料便宜、易于选材 发酵工业需要的主要原料都是农产品、副产品、工业废弃物，其最大的特点是再生性强，在短时间内即能重复生产。而化学生产多采用石油、煤、天然气等不可再生的原料，生产中常受到自然资源的限制。
5.投资少，成本低 发酵工程生产中的多步反应都是以生命体的自然调节方式进行的，一系列的反应过程都在生物反应器（发酵罐）中进行。同一种设备具有多种用途，菌种和发酵原料一改变，即可生产多种发酵产品。
6.有利于环保 发酵工程的生物过程都具有高度专一性，可人工控制产物的形成。在减少副产物产生的同时，发酵工程产品可以是微生物菌体、酵母等，其中富含微生物蛋白、维生素、酶等，对动物营养价值全面。因此，一般发酵工程生产时，除特殊产品外，有害物质产生少，生产安全性强。而化学工程大多数的生产工艺都可产生不同程度的有害副产物。
发酵工程生产的缺点是发酵产物的浓度低，并且有较多的异构体，提取、纯化和精制的工艺比较复杂，同时成本较高。除此之外，发酵废液、废渣的处理不当会污染环境，如抗生素粉渣处理不当会造成敏感菌株的耐药性等。
三、微生物发酵与饲料添加剂原料生产
（一）微生物发酵在饲料添加剂工业中的应用 微生物在饲料添加剂原料生产中应用极为广泛，生产中，利用不同菌种，选用不同原料，控制一定发酵条件，结合一定代谢控制发酵技术，即可实现某种添加剂的工业化生产。在微生物发酵工程中，能生产的发酵产品数量达一千多种，但目前应用的饲料添加剂主要是以下三类产物。
1．利用微生物菌种和内含物 各种微生物本身是一个生命体，菌种内包含着微生物生长繁殖所需要的一切营养素，除含有丰富的蛋白质以外，还含有油脂、维生素等。在人工控制的条件下，利用农副产品、有机废水或石油制品等为原料可生产大量饲用酵母蛋白。通过饲用菌种培养发酵、过滤、吸附、提取等工艺可生产维生素B2、B12等。
2．利用微生物产生的酶 微生物发酵的基础是细胞内产生的大量代谢酶，在人工控制下，可从发酵液中提取生产各种酶。酶制剂的生产已成为微生物发酵工程的又一重要用途。目前，在生产中广泛应用的由微生物发酵生产的酶有二十多种。饲料添加剂用的大多数酶是微生物发酵工程产品，如纤维水解酶、淀粉酶、蛋白酶等。
3．利用微生物的某些代谢产物 人工控制微生物发酵过程，使某种中间代谢产物大量积累，经提炼加工制成添加剂，如柠檬酸、氨基酸等。绝大多数抗生素也是微生物代谢中产生的代谢产物。
（二）用于添加剂生产的微生物 可用于生产饲料添加剂的微生物主要有三大类，细菌和放线菌、酵母菌和霉菌。它们与饲料添加剂生产的关系见表2—2。
四、微生物发酵生产添加剂原料的工艺
（一）微生物代谢规律
1．合成代谢 微生物从体外吸收各种营养物质，在细胞内各种酶的催化下，生成各种复杂的有机物质，为个体的生长、发育、繁殖提供物质基础。在合成代谢中，微生物可以吸收有机物或者由CO2合成各种碳水化合物构成细胞壁的结构物质或成为细胞内的贮存物质，利用有机酸或无机酸等合成脂类，构成细胞膜，吸收氮素与有机酸合成氨基酸。饲料添加剂原料的微生物工程生产过程当中，通过人工控制合成代谢的某一过程，从而导致某种中间产物的大量积累，达到规模化生产的目的。如：赖氨酸，Vc，有机酸的生产等。
除此之外，微生物的合成代谢中，还有一些结构复杂的物质积累于细胞内或者分泌于细胞外，它们对生产菌的生理功能尚不清楚。由于这些物质独立于细胞之外，非微生物生活所必需，是微生物细胞正常代谢途径不畅通时增加的支路代谢而产生的物质，往往是微生物的次生代谢产物。微生物发酵工程法生产抗生素、生长激素、某些色素等都属于微生物的次生
代谢产物。
2．微生物的分解代谢 是细胞内的碳水化合物、脂肪、蛋白质等大分子化合物，在一系列酶促反应下分解的过程。三大物质分解代谢过程同动物体内基本一致。碳水化合物可进行无氧条件下的酵解，此过程属于不完全分解，可以形成各种中间产物，如各种有机酸等；也可以在有氧的条件下彻底氧化分解，人工控制发酵的过程，也可以得到不同的中间发酵产物。
（二）微生物的生长规律 微生物在适宜的条件下，不断从周围环境中吸收营养物质转化为构成细胞物质的组分和结构，使个体细胞质量增加和体积增加，称为生长。根据细菌生长繁殖速度的不同可分为四个时期。
1．滞留适应期 细菌接种到新的培养基中，一般不立即进行繁殖，需要经一段时间自身调整，诱导合成必需的酶、辅酶或合成某些中间代谢产物。此时，细胞重量增加，体积增大，但不分裂繁殖，细胞长轴伸长，如巨大芽孢杆菌的长度从3.4m增长到9.1m～19.8m，细胞质均匀，DNA含量高。这个时期的长短自几分钟至几个小时，因菌种﹑菌龄和培养条件不同而异。
2．对数生长期 这个时期细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，所有新分裂形成的细胞生活旺盛，繁殖的细胞数按几何级数增加，即1→2→4→8…，若用指数形式表示为20→21→22→23…2n，这里的n就是细菌分裂代数，也就是1个细菌繁殖n代后产生了2n个细
3．稳定期 又称最高生长期，在一定容积的培养基中，由于经细菌对数生长期的旺盛菌。此时期细菌数的对数与培养时间成直线关系。 生长后，某些营养物质被消耗，有害代谢物质积累以及pH、氧化还原电位、无机离子浓度等的变化，限制了菌体继续高速度增殖。初期细菌分裂间隔的时间开始延长，曲线上升逐渐缓慢。随后部分细胞停止分裂，少数细胞开始死亡，使新增殖的细胞数与老细胞死亡数几乎相等，处于动态平衡，细菌数达到最高水平，接着死亡数超过新增殖数，曲线出现下降趋势。这时，细胞内开始积累贮藏物质，大多数芽孢细菌在此时形成芽孢。同时，发酵液中菌体代谢产物的积累逐渐增多，此时期是发酵目的物（如抗生素等）生成的重要阶段。
4．衰亡期 稳定期后，环境变得更不适合于细菌的生长，细胞生活力衰退，死亡率增加，以致死亡数大大超过新生数，细菌总数急剧下降。此时期细胞常出现多形态的畸形以及液泡，革兰氏染色阳性菌常变成革兰氏染色阴性菌。许多菌在衰亡期后期常产生自溶现象，使工业生产中后处理过滤困难。
（三）微生物发酵的培养方法
1．连续培养 在一恒定的培养容器的流动系统中，以一定流动速度不断补充入新的营养物质，同时以相同的速度排出培养物（包括菌体及代谢产物），使流动系统内的液量，细胞数量和营养状态维持恒定，使培养的微生物处于对数生长期的时间继续延长下去，这种方法称连续培养。
2．同步培养 在细菌分批培养中，其群体能以一定速率生长，但所有的细菌并非同时分裂，即培养液中的细胞并不处于同一生长阶段，其生理状态和代谢活动也不完全一样。因此，如果以群体测定结果的平均值来代表单个细胞的生长和生理特性是不符合实际的。一般研究细菌的生理、生化和性状难以用单个细胞进行，必须用群体，往往把
群体内的细胞分裂同步化，这种培养法叫同步培养法。利用同步培养技术使它们处于同一生长阶段，使所有的细胞都能同时分裂，这种生长方法叫同步生长。
同步培养法有两种，即筛选法和诱导法。
（1）筛选法 又称淘析法，主要有过滤法、区带密度梯度离心法和膜洗脱法等。过滤法是将微生物细胞用滤器过滤，让处于细胞周期较早阶段的小细胞通过，收集这些细胞，转入新鲜培养基中，即能获得同步细胞。区带密度梯度离心法是将随机生长的细胞悬浮置于蔗糖梯度溶液表面，然后离心，不同生长周期的细胞由于体积和质量大小不同，沉降系数不同，同一生长周期的细胞就聚集在离心液的一个区带上，小细胞在上，大细胞在下。这方法可便于收集处于较早周期的小细胞，本法已成功地应用于芽殖和裂殖酵母、大肠杆菌等细胞的同步培养。膜洗脱法是根据某些滤膜可以吸附与该滤膜相反的电荷的细胞而设计的，可获得比上述两法数量更大，同步性更高的细胞。
（2）诱导法 诱导法是利用一些生理学手段强制微生物达到同步生长的目的。分化学诱导和物理诱导两种方法。化学诱导是采用停止或限制供给微生物细胞分裂所必需的某种养料的方法使所有的细胞都进入临分裂状态（但不分裂），然后在某一时刻恢复供给细胞分裂所必需的养分，就能诱导出同步细胞群体。物理诱导是利用某些物理因子，使处于即将分裂的细胞的代谢活动受到控制，从而使细胞在分裂阶段前停止，以求得以后分裂的同步。例如温度，就是基于细胞周期不同，相对地对温度的敏感性也不同。其它物理因子如光脉冲（对光合微生物）、χ射线等也能诱导同步生长。
（四）微生物发酵的工艺过程 微生物发酵的全部生产过程大致可以分为四个阶段，即：菌种阶段、种子扩大培养阶段、发酵阶段和提炼阶段。
1．菌种阶段 菌种阶段首先应做好菌种的保藏，防止其优良性状的衰退，同时要防止杂菌的污染。将砂土管或斜面保存的原始菌种接入斜面，进行活化，再进一步进行种子扩大培养。培养的方法分：液体震荡培养、表面培养和固体培养等。要求培养出生产性能优良，并具有一定数量健壮的种子（菌体或孢子）。
2．种子扩大培养阶段 将斜面或摇瓶培养好的种子接入种子罐。根据发酵罐的大小，所需种子的数量，有时采用一级，有时采用二级。采用二级时即在种子罐与发酵罐之间加入一只繁殖罐。一般要求的种子液量为发酵液总量的5%～10%。种子扩大培养阶段的主要目的是繁殖大量的菌体，而不是要求产生大量的目的产物。因此，在选择培养基以及控制培养条件等方面都要围绕此目的来进行。一般要求种子培养基的营养成分比较丰富，有利于菌的生长繁殖。但同时又必需注意种子培养基的成分不能与发酵液的成分相差太大，否则当种子接入发酵培养基后将会影响菌的生长和代谢。
3．发酵阶段 发酵阶段是微生物发酵的主要阶段。在此阶段前期继续进行菌的生长繁殖，后期主要是产生和积累所需的微生物产物。因此，必需严格控制好各项发酵条件，使菌体有一定量的生长繁殖，但又必需注意防止菌体繁殖过量，影响目的产物的产生和积累。当然以菌体为目的产物的发酵则要求菌生长繁殖越多越好。在生产中，必需掌握菌的生长规律，控制好发酵条件，使菌体生长健壮，具有一定数量同时又能产生最大量的目的产物。
4．提炼阶段 提炼阶段的任务是将发酵产物进行加工处理，以获得所需的产品。
加工处理的方法很多，根据所需产品的不同而采取不同方法。如蒸馏喷雾干燥、离子交换过滤、盐析、分子筛等。
第三节
在饲料添加剂中，营养性添加剂、中草药添加剂和饲料改良剂等添加剂存在于天然饲料或动植物体内，如维生素A，在鱼类肝脏中含量很高；维生素E在棉籽油、花生油等植物油中含量很高。这类添加剂以及中草药添加剂有效成分的浓缩，均可采用分离提取的方法从天然物中获得。另一方面，无论是用化学工程、发酵工程或基因工程生产添加剂，都是先制得粗品或初级产品，然后采取一系列物理或化学方法进行纯化和分离。因此，分离提取技术是每一种饲料添加剂原料所必须的方法和步骤。
一、天然物中饲料添加剂有效成分提取与分离
（一）提取方法
1．溶剂萃取法
（1）选择溶剂的理论依据
1）溶剂的极性 溶剂按其极性大小可分为亲水性溶剂和亲脂性溶剂，亲水性越强的溶剂，极性越大。常用于提取天然物中化学成分的溶剂，按其亲水性强弱顺序表示如下：
水＞甲醇＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞苯＞石油醚
2）化学成分的极性 天然物中化学成分也可分为亲水性和亲脂性成分。成分的分子越小，取代基越强，极性基的数目越多，则亲水性越强，如单糖、低聚糖等；反之称为亲脂性成分。天然物成分中常见的一些功能基因，其极性大小顺序如下：
-COOH＞-OH＞-NH2＞-SH＞-CHO＞C=O＞-COOR＞-OCH3＞-CH=CH-＞-CH2-CH2-
3）相似相溶原理 不同溶剂和化学成分均具有一定程度的亲水性或亲脂性，亲水性成分易溶于水或亲水性溶剂，难溶于亲脂性溶剂，亲脂性成分则易溶于亲脂性溶剂。
（2）提取方法
1）浸渍法 用适当的溶剂在常温或温热（60℃～80℃）的情况下浸渍以溶出其中成分。本法适用于有效成分遇热易破坏及含多量淀粉、树胶、果胶、粘液质的天然物的提取。但浸出率较差，特别是用水为溶剂，其提取液易于发霉变质，须注意加入适量防霉剂。
2）回流提取法 如用易挥发的有机溶剂加热提取天然物中成分时，则需采用回流提取法以减少溶剂损耗，提高浸出效率。但遇热易破坏的成分不宜用此法。
3）连续提取法为了弥补回流提取中需要溶剂量大，操作较烦的不足，可采用连续提取法。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。此法提取液受热时间长，因此对受热易分解的成分不易用此法。
2．水蒸汽蒸馏法 此法只适用于具有挥发性的、能随水蒸汽蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。此类成分的沸点多在100℃以上，并在100℃左右有一定的蒸汽压。天然物中的挥发油、某些小分子化合物的提取可采用水蒸汽蒸馏。
（二）各种分离纯化方法
1．两相溶剂萃取法 利用混合物中的成分在两种不混溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的方法，包括简单萃取法和连续萃取法。
2．结晶法 利用相对纯度较大的混合物中各组分在溶剂中的溶解度不同，使欲分离的物质达到过饱和状态而结晶析出，从而达到分离或精制的目的。结晶溶剂、合适的温度、适当的时间是结晶的三个重要条件，其中最重要的是选择合适的溶剂。所选择的溶剂应对欲分 分 离 提取
离的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热时都不溶或易溶。
3．沉淀法 在天然物提取液中加入某种试剂，使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质。
4．盐析法 在天然物中提取液中加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，使某种水溶性成分在水中的溶解度降低，析出沉淀。或溶解度降低后易被与水不相混溶的溶剂萃取出来，从而达到与水溶性大的杂质分离。常用的无机盐试剂有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁等。
5．分馏法 是利用混合物中各组分的沸点不同，因而在分馏过程中产生蒸汽压的高低差别而得以分离的方法。
6．色谱法 是分离化学成分的有效方法。用一般方法难以分离的化合物，借助于色谱法的分离，一般能得到单体成分。层析法种类很多，包括吸附层析法、分配层析法、离子交换层析法等。
二、化工或生物发酵制品的提取与分离
（一）粉碎 将固体原料、中间产品或成品进行破碎或磨成细粉末，称之为粉碎。常用粉碎方法如下：
1．粗碎 处理直径为40mm～1500mm的原料，所得成品直径为5mm～50mm。如生产磷酸氢钙。
2．中碎和细碎 处理直径为5mm～50mm的原料，所得成品直径约为0.1mm-5mm。如用铁矿石生产硫酸亚铁。
3．磨碎或研碎 处理直径为2mm～5mm的原料，所得成品直径约0.1mm。某些特殊粉碎可处理直径为0.2mm的原料，所得成品可细至0.01μm，如各种制成品的粉碎。
（二）结晶与重结晶 结晶是指物质从溶液或气体中析出结晶体的过程，然后再经过滤或离心方法将结晶体从溶液中分离出来。重结晶是依据不同的物质溶解度的差异原理，制备固体化学品，滤除机械杂质的重要方法。重结晶方法具有操作简单、效果明显、设备通用性强等特点，采用的溶剂可以是单一溶剂，也可以是复合溶剂。在工业生产过程中，可在液相中反应生成产物后，以浓缩、结晶、母液再浓缩、结晶的工艺过程获得最高生产效率和最高产品质量。各种方法生产微量元素添加剂时，必须经过结晶工艺。氨基酸从发酵液中的提取和精制常采用重结晶法。
（三）萃取 有时称提取或浸提，它是借助与溶液不相混溶的有机溶剂，从溶液的若干组分中，提取出一个组分的过程。加入的溶剂叫萃取剂，萃取后的液体需要再经过蒸发或蒸馏、结晶、干燥等方法进行分离。
（四）离子交换及吸附 离子交换及吸附是深度提纯和制备某些制剂的方法。具有操作简单、不易引入杂质、效率高等特点，是获得饲料添加剂精品的有效手段。在生产中，可应用的离子交换材料多为带有官能团的高分子材料，如离子交换树脂、离子交换薄膜、离子交换纤维等。近年来，分子筛等新型吸附材料在饲料添加剂生产中的广泛应用，为精制提纯工艺提供了捷径，如马杜拉霉素的精制等。
（五）过滤 其原理是使液体通过过滤介质的细孔，而固体颗粒不能通过，被过滤介质所阻流而得到分离。简易的过滤是通过―过滤筛‖进行。过滤几乎应用于所有饲料添加剂原料的生产工艺中。
（六）蒸发浓缩 溶质不能挥发，而溶剂能挥发的溶液，可采用蒸发浓缩的工艺使有效成分浓度提高。蒸发浓缩可采用高温加热、常温或低温真空方法。如马杜拉霉素生产工艺中几乎采用真空浓缩或干燥。
（七）脱色 大部分添加剂粗品制成后，都要进行脱色处理以获得优质的商业化产品。常用的脱色剂有木炭、活性炭、骨炭、亚硫酸、高锰酸钾等。脱色方法有两种，一是直接将
脱色剂与需要脱色处理的产品混合，搅拌均匀，一定时间后分离即可；二是将活性炭等固体脱色剂作为过滤介质放在过滤容器中或过滤管中，使液体通过而脱色。目前工业化生产饲料添加剂原料多采用活性炭脱色，如氨基酸、酸化剂等。
（八）离心分离 利用旋转产生的离心力，将液体中的颗粒分离出来达到分离提纯目的。离心分离也是饲料添加剂生产中普遍应用的生产工艺。
以柠檬酸为例：用发酵法生产柠檬酸工艺中，制得的发酵液中除含有水分外，尚有淀粉残渣和其它有机酸等杂质，故应提纯分离。
第四节
基因技术是利用生物有机体或其组成部分发展新产品、新工艺的一种技术体系，一般包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程四个方面。基因工程主要涉及一般生物类型所共有的遗传物质——核酸的分离纯化、体外剪切、拼接重组及扩增与表达等技术。细胞工程则包括一切生物类型的基本单位——细胞的离体培养、繁殖、再生、融合以及细胞核、细胞质乃至染色体与细胞器的繁殖与改建等操作技术。酶工程是利用生物有机体内酶所具有的某些特异催化功能，借助固定化技术、生物反应器和生物传感器等新技术、新装置生产特定产品的技术。发酵工程，也称微生物工程，是给微生物提供发酵等条件，利用微生物的代谢转化功能生产目的产物的技术。基因工程和细胞工程技术，可以创造出具有特殊功能，甚至多功能的"工程菌株"。而只有通过酶工程和发酵工程才能生产出一系列产品，在现代生物技术溶和应用中，这四个独立的体系在产业化方面密切结合，相互渗透，共同完成高新技术成果的产业化。并广泛应用于饲料添加剂原料生产中，如氨基酸、抗生素、酸化剂、生物色素等的规模化生产。
一、基因工程的基本方法
基因工程就是在体外或试管中借助于酶促反应，将目的基因或异源DNA片段与适当的载体进行重组，造成杂种DNA分子。然后再将这些杂种DNA分子输入到受体细胞（微生物）内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞内表达，产生出人们所需的产物，或创造新的生物类型。这种获得新功能的微生物称为"工程菌"。这一技术在美国于1973年首次获得成功，并于1981年首次形成基因工程制品——牛生长激素和人胰岛素等，开始投放市场。从此基因工程技术在全球范围内展开了广泛开发研究，并逐步应用于生产实践。
利用基因工程育种，将不同来源的基因在体外经重组和改造后，引入微生物细胞获得工程菌。然后应用微生物发酵工程技术大批量生产饲料添加剂，如激素、酶、抗生素、氨基酸。这一技术已经成为生物技术开发的热门技术。
基因工程的主要技术操作包括：目的基因分离、目的基因与载体基因相结合、重组DNA分子进入受体细胞和改造新获得的DNA，并使重组体最终特性化，成为"工程菌"。
1.目的基因的分离 把所要的目的基因（即具有遗传信息的DNA片段）从供体细胞中提取出来，或人工合成出来。
2.目的基因与载体相结合 用同一种限制性内切酶处理目的基因和基因载体，可以形成相同的粘性末端，然后将外源目的基因和载体DNA混合，再添加DNA连接酶，在一定条件下，便可以使目的基因与载体通过"退火"和连接的步骤而形成重组体DNA。
3. 重组体DNA进入受体 重组体DNA通过再次转化，转入到适宜的宿主细胞，并在其中进行复制、表达，产生人类所需要的产物，通过筛选，便可获得具有工业生产价值的―工程菌‖。 基因工程技术的应用
二、基因工程技术应用
利用基因工程技术，获得具有特殊功能的―工程菌‖，进而通过发酵工程技术，工业化生产饲料添加剂，是新世纪解决资源不足、降低生产成本、提高产品质量的最新途径。经过基因工程技术的发展，以及与发酵工程、化学工程等的结合，很多饲料添加剂的生产已经进入新的时代。
1.用基因工程生产高性能、高效能的酶制剂 以往工业上生产的酶是以自然界存在的微生物产生具有高性能的自然酶为基础。现通过基因工程技术，可以使在其他通常难于培养的微生物中少量存在的酶，用经选择在廉价原料中容易培养并且发酵液中容易纯化酶的宿主微生物来生产；也可使从动物植物中提取的酶的生产不依赖于动物植物组织，如小牛凝乳酶已可用发酵法生产。对一些存在于性能不佳或产毒素致病的微生物中存在的优良性能酶，可将酶基因转移到安全宿主中。通过基因工程技术可在生物体间转移基因，而且还可以修饰结构基因，从而使生产过程易进行，并可按应用要求剪接得到具有特有性能的酶。
如，目前应用DAN重组技术已建立了丝氨酸和色氨酸合成酶工程菌，通过这种工程菌组装的生物反应器可以用甘氨酸和甲醛为原料制造丝氨酸，再由丝氨酸和吲哚转化生成色氨酸。
由以上实例可知，应用基因重组技术，通过基因扩增和增强表达，就可建立表达酶制剂的基因工程菌和基因工程细胞，从而进一步构建成新一代的生物催化剂——固定化工程菌和固定化工程细胞。可以预见，基因工程将会生产出许多高性能高效能的酶制剂，从而导致酶在许多应用领域中取得更大突破。
2.基因工程在氨基酸合成中的应用 自20世纪70年代后期以来，氨基酸生产菌的育种工作就开始运用细胞内基因重组技术和重组DNA技术，提高了育种的有效率和新菌株的产酸水平。运用细胞内基因重组的细胞工程技术主要采用以下两种方法。
（1）细胞融合技术 研究发现，由乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）野生型菌株经多次诱变处理，虽可得到以葡萄糖为原料高收率的生产赖氨酸的突变株，但这种突变株的赖氨酸生产收率与糖消耗速度之间成反比关系。为了解决这一矛盾，它们将赖氨酸收率高、糖耗速度慢，具有α-氨基乙酸-L-半胱氨酸耐性（AECr）标记的生产菌，与糖耗速度快、不产赖氨酸、具有德夸菌素耐性（DECr）和酮丙二酸耐性（KMr）的突变株进行细胞融合，结果获得同时具有AECr、DECr和KMr特性的融合株。新株的耗糖速度由亲株的0.13g葡萄糖/（h·g）干菌体提高到0.4g/（h·g），使整个发酵时间缩短三分之一，而赖氨酸产量仍保持亲株的较高水平。
（2）转导技术 Kisumi在精氨酸生产菌育种中从野生型粘质沙雷氏菌（Settatia marcescens）Sr41获得一种代谢调节变异株RA4240，而PA1379菌株则是从同一野生菌获得的具有精氨酸合成酶而精氨酸分解能力缺损的双重变异株。通过溶原菌体Ps20将RA4240的argA基因和PA1379菌株中的LysA基因同时转导，得到一株具有上述三种变异性状的组合株AT404，其精氨酸产量达25.2g/L。由于转导方法可以定向育种，因此该技术在工业微生物领域中正得到广泛研究。
在氨基酸生产菌的育种上，应用基因工程技术的原理是，用DNA限制性内切酶把氨基酸生物合成系中的关键酶基因（DNA）从生产菌染色体上切下来，再用连接酶将它连接到载体（质粒）的DNA上，然后通过转化、转导、感染、结合等方法把复合质粒的遗传物质传递到DNA受体菌中进行无性繁殖（称之为克隆）。随着质粒拷贝数的增加，酶基因扩增，关键酶的活性提高，目的氨基酸的合成能力加强，因而使产酸量提高，在色氨酸、苏氨酸、
赖氨酸和L-脯氨酸等生产菌的育种上，以及可以利用C1化合物或纤维素为原料的基因工程菌的培育上均运用过基因工程技术。但遗传工程在氨基酸生产育种工作中的运用尚处于萌芽阶段，而且只是在少数几种氨基酸的育种上进行了探索，取得了一定成绩，离工业生产应用还有一段距离。
3.基因工程在生长促进剂生产中的应用 随着生命科学的迅速发展，分子生物学和基因工程技术已逐步成为主要药物和生长促进剂发现、设计和发展的基础。近10年来，一批新型药物已陆续投入商品化生产（见表2—3），具有最广阔商业化生产前景的领域，将包括抗生素、调节蛋白质、激素等治疗性药物生物技术。α—干扰素、生长激素等转基因产品正在应用于畜牧生产中。通过基因工程技术生产高效、低成本的各种促生长剂也将很快进入商业化生产阶段。
本 章 小 结
饲料添加剂原料的生产方法有化学法、发酵法、提取法和基因工程技术。化学法是指用化学工程生产各种产品的工艺方法。添加剂原料中所有矿物质、大部分维生素和饲料改良剂都是由化学法生产的。烟酸酸生产工艺是化学法生产维生素的典型工艺；废铁和硫酸反应生产硫酸亚铁是微量元素酸解法生产的代表性方法；尿素生产是用无机化工进行化学合成原料的方法。
发酵法又称生物法，历经100多年，已成为饲料添加剂原料生产的主要方法。可用于添加剂原料生产的微生物包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等。发酵法具有生产安全性能好、能耗低、原料便宜、投资少、成本低、有利于环保等优点，但也有发酵产物浓度低、有较多异构体、提取纯化精制工艺较复杂等缺点。微生物发酵的培养方法有连续培养和同步培养，其工艺过程可分为菌种阶段、种子扩大阶段和提取阶段。分离提取用于添加剂有效成分的浓缩。天然物中有效成分的提取和分离与化工或生物发酵制品中有效成分的提取和分离工艺略有不同。
基因工程技术是利用生物有机体或其组成部分发展新产品、新工艺的一种技术体系，包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程四个方面。基因工程技术的基本步骤包括：目的基因的分离、目的基因与载体基因的结合、重组DNA导入受体细胞并特性化表达，最终获得具有新功能的工程菌。基因工程技术现主要用于高性能、高效能酶制剂的生产、氨基酸的合成、生长促进剂如抗生素、激素等治疗药物的生产。