人工诱导多能干细胞的发展和面临的主要问题
航天航空学院航03班徐越学号_2010011566
诱导性多功能干细胞（iPSC），是通过导入特定基因或基因产物，将体细胞人工诱导成为类似于胚胎干细胞（ESC）的、具有多向分化能力的、可以持续分离生长的多功能干细胞。这项技术由日本京都大学山中伸弥教授在2006年首先提出[1]，因其乐观的应用价值而引起了科学界的广泛关注并迅速发展。这篇文章将就iPS细胞的基本技术、发展及面临的问题等方面做一些综述。
一、历史背景
上世纪八十年代小鼠ESC被成功分离和细胞体内重编程概念的建立，使再生医学得以建立和发展。由于胚胎干细胞有多向分化能力，可以有效修复退化的或是受损的组织，治疗一些疑难杂症。
但是，基于胚胎干细胞的临床治疗面临着两个问题：1）植入异体胚胎干细胞可能导致机体的排异反应；2）每一个用于治疗的胚胎都有潜在发育成个体的能力，涉及到伦理问题。iPS细胞的出现有希望使这两个问题得以解决。
二、技术概述
人工诱导多能干细胞的大致过程是：1）取自体体细胞进行体外培养；2）利用“载体”等方法将特定基因或基因产物转入体细胞；3）用与ES细胞相似的条件进行体外培养；4）利用多能细胞标记等条件筛选出iPS细胞；5）生成嵌合体或诱导培养成组织并进一步应用。
1、 细胞来源
iPS细胞的来源全部取自体细胞。2006年这一概念第一次被提出时，山中伸弥使用的是小鼠表皮成纤维细胞和尾尖成纤维细胞。2007年，成人皮肤成纤维细胞也被成功诱导成iPS细胞。[2]后来的研究中，以成纤维细胞为细胞源最为常见。2008年，从成年小鼠的肝脏和胃细胞诱导iPS细胞也获得了成功。[5]
在小鼠中，最常用的是表皮成纤维细胞和尾尖成纤维细胞，也有神经细胞、肌肉细胞、间充质干细胞等，2009年成熟的B细胞和T细胞也获得成功。人类中新生儿的包皮、口腔黏膜、成人真皮最为常用，角质细胞、间充质细胞、脐带血细胞等也有应用。
有学者证明任意的体细胞都有被诱导成iPS细胞的能力，与细胞种类及人的年龄、性别等没有关系。但是，iPS细胞的诱导产出率和培养方式与细胞种类是有关的。
后来，iPS技术在其他如大鼠、狗、兔子等物种中也获得了成功，有人因而提出了iPS可以保护濒危物种的说法。
2、 细胞因子
传统的iPS技术要在目标细胞中导入四个细胞因子：Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc（即OSKM）。山中伸弥首先筛选出24个与维持ES细胞干性有紧密联系的细胞因子，将它们全部转入体细胞并诱导出iPS细胞，然后进一步减少转入因子的个数，最终确定了必须将以上四个因子同时转入才能成功。
但是，考虑到临床应用前景，四个细胞因子之一的c-Myc作为一个癌症因子，因成瘤性很强而并不友好。2008年，山中伸弥团队通过改进细胞培养条件，在只转入Oct3/4，Sox2，Klf4三个因子的情况下，也得到了iPS细胞，且获得iPS细胞在所有细胞中的比例大大提高，质量也优于转入四个因子的情况。[7]两种iPS细胞植入小鼠体内后，有c-Myc的小鼠有6%死于癌症，而没有c-Myc的小鼠无一死亡。这一方法的唯一问题是c-Myc会使iPS产量大幅提高，该基因的缺失使原本就存在产量不足问题的iPS细胞更难以投入临床应用。
然而，这一问题在今年年初受到了中国一个团队的质疑。他们观察到在敲除了c-Myc后iPS细胞的产量反而提高了。该团队分析认为表观遗传改变要积累到一定程度才能顺利推动基因重编程，之前所认为的c-Myc的缺失导致细胞产量低是因为细胞增殖缓慢，而体细胞一味地增殖会影响表观遗传的改变，反而不利于iPS细胞的生成。因此，对早期体细胞增殖的抑制，可能更利于iPS细胞的产出。[13]
当然细胞培养环境也有影响，有报道称高糖低氧环境更有利于iPS细胞的产生。[8][10] 2011年，美国有学者提出了用miRNA的方法诱导iPS细胞，他们分别对小鼠和人进行了实验，将mir302/367转入体细胞，miRNA可以激活Oct4和Sox2 而无须加入任何的转录因子，同样可以获得iPS细胞，其多能性标记的表达和畸胎瘤的形成等性能都与OSKM获
[11]得的iPS细胞类似，对于小鼠还制成了嵌合体并植入生殖系统。另外他们发现同时加入丙
戌酸钠抑制Hdac2通路，可以更进一步提高iPS细胞产量。
2013年2月，又有德国学者提出只要抑制CD47膜蛋白，而无需其它任何基因或基因
[14]产物同样可以得到iPS细胞。原因是CD47的下调会导致c-Myc表达上升同时调控其它与
干细胞有关的转录因子，从而得到iPS细胞。但该文章中并未提到c-Myc作为癌症基因，其表达量的上调会对机体造成的影响。
另外，近年来也有许多学者找到了一些其它细胞因子来代替OSKM，也有提出用激活wnt通路的方法作为代替的。可见获得iPS细胞的方法也不是唯一的。但总体来说，为获得iPS细胞，各重编程因子的平衡表达对iPS细胞的产出效率和质量很重要。研究表明，Oct3/4会增加重编程效率，而SOX2，Kfl4和c-Myc的高表达则会相对降低重编程效率。
3、 转染方法
经典的iPS转染方法是逆病毒转染，但是逆病毒转染存在的问题是，病毒易导致组织炎症发生从而引发癌变。
后来，山中伸弥团队又分别提出了用腺病毒载体和质粒载体两种转染方法[6]，并证明可以降低癌症的发生率。但质粒载体效率不高，只能通过提高载体量和优化重编程因子来提高iPS产出率。
另外还有一些无转基因iPS方法，例如蛋白转导。有人在大肠杆菌中强制表达聚精氨酸标记的OSKM，将这些蛋白一天四次转入小鼠EF细胞中，30天后也出现了与ES细胞性能类似的iPS细胞，并形成嵌合体植入小鼠体内。
还有人使用一种叫仙台病毒的RNA病毒，这种病毒并不作用于人体，不会引起感染。
4、 iPS细胞的筛选
iPS细胞的筛选标准主要是与ES细胞有相似的性质，包括外形、增值能力、DNA甲基化水平，组蛋白修饰等。有蛋白组学研究证明，iPS细胞与ES细胞类似，含更多与转录调控的蛋白。[9]与之相对比的是成纤维细胞有更多与转运有关的蛋白。
经典的ES细胞标记可以用来筛选iPS，例如NANOG。当然，通过细胞标记识别iPS的方法主要用于小鼠，人的iPS细胞通常从形态上就可以筛选出来，它们排列紧密边缘清晰，而杂细胞通常显得很粗糙。
三、iPS面临的主要问题
目前看来，iPS细胞面临的主要问题有三方面：1）植入体内的可能存在未完全分化的细胞而产生的潜在致瘤性；2）重编码过程速度慢，产率低；3）iPS细胞基因组的完整性。前两个问题相对容易被发现，在上文中也已经提到了一些相关解决方案，下面主要讨论一下第三个问题。
近年来，有研究发现iPS细胞存在一些表观遗传性和基因组的异常[4]，这可能会引起机体对自体细胞诱导的iPS细胞产生排异反应[3]，也有可能导致癌症的发生。因而引起了学界对iPS细胞在重编程过程中保证基因完整性的讨论。主要观点如下：
与传统的细胞有丝分裂一样，重编程中DNA复制过程是DNA损伤的主要来源。细胞的高分裂率会增加DNA损伤的发生，因此细胞培养过程中应控制增殖速度，以利于iPS细胞的获得。
但是，细胞本身有损伤的修复机制，会根据DNA损伤程度选择修复或凋亡。而p53基因在其中起到了非常关键的作用。且多能细胞本身增值较快，对DNA损伤非常敏感，一旦损伤发生，会立即启动p53调控的细胞凋亡程序。一旦p53缺失，有DNA损伤的细胞也会发生重编程，得到的iPS细胞基因组的完整性就会受到影响。
另外，研究发现HDR（同源性诱导修复）是多能干细胞中DNA修复的主要通路，它的特点是需要一条姐妹染色单体与之临时结合才能完成修复。因此，体细胞必须提前激活大量稳定的HDR以保证DNA的损伤修复。
由于iPS细胞基因组完整的重要性，相应的检测方法也随即提出。主要是通过对iPS细胞和ES细胞基因组的比较，例如原位杂交技术、基因芯片技术等。[12]最近又出现了一种叫做下一代基因组序列的方法（next-generation genome squencing），可以测出极微量的基因损伤，精度远优于其它方法。但由于该方法时间长、价格昂贵，尚未大范围应用。
当然，对于以上说法也有一些争议。有学者认为在细胞不断生长的过程中的确有基因突变，但至于是重编码前还是之后有待商榷。他们认为基因突变可能发生在三个阶段：1）重编码过程中；2）细胞早期体外培养过程中；3）突变是体细胞中早先存在的。但这些都只是猜测，还没有确切的证据。
四、小结
总的来说，iPS技术的确是一项开天辟地的成就，为再生医学的发展和疑难杂症的治疗带来的新希望。但是，这项技术离临床治疗还有很长的距离要走，最重要的一点就是要保证细胞的安全性。如果这一问题得以解决，细胞和基因治疗将在为来有更广阔的发展前景。
参考文献：
[1]S.Yamamnaka.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblase cultures bu defined factors.Cell,2006
[2]S. Yamanaka.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell,2007
[3]S. Kaneko. To be immunogenic or not to be that’s the iPSCquention. Cell stem cell,2013
[4]S.M.I.Hussein. Genome damage in induced pluripotent stem cells assessing the mechanisms and their consequences. Bioessays,2012
[5]T.Aoi. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science,2008
[6]K.Okita. Genetation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science,2008
[7]M.Nakagawa. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature biotechnology,2008
[8]Y.Yoshida. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell stem cell,2009
[9]R. Yamana. Rapid and deep profiling of human induced pluripotent stem cell proteome by one-shot nanolc-ms/ms analysis wit meter-scale monolithic silica columns. Journal of proteome,2013
[10]R.Madonna. Glucose metabolism hyperosmotic strss and reprogramming of somatic cells. Molecular biotechnology,2013
[11]F. Anokye-Danso. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell stem cell,2011
[12]Y.Buganim. Single-cell expression analyses during cellular reprogramming reveal an early stochastic and a late hierarchic phase.Cell,2012
[13]Y.Xu. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. JBC,2013
[14]S.Kaur. Thrombospondin-1 signaling through CD47 inhibits self-renewal by regulating c-myc and other stem cell transcription factors. Scientific reports,2013
人工诱导多能干细胞的发展和面临的主要问题
航天航空学院航03班徐越学号_2010011566
诱导性多功能干细胞（iPSC），是通过导入特定基因或基因产物，将体细胞人工诱导成为类似于胚胎干细胞（ESC）的、具有多向分化能力的、可以持续分离生长的多功能干细胞。这项技术由日本京都大学山中伸弥教授在2006年首先提出[1]，因其乐观的应用价值而引起了科学界的广泛关注并迅速发展。这篇文章将就iPS细胞的基本技术、发展及面临的问题等方面做一些综述。
一、历史背景
上世纪八十年代小鼠ESC被成功分离和细胞体内重编程概念的建立，使再生医学得以建立和发展。由于胚胎干细胞有多向分化能力，可以有效修复退化的或是受损的组织，治疗一些疑难杂症。
但是，基于胚胎干细胞的临床治疗面临着两个问题：1）植入异体胚胎干细胞可能导致机体的排异反应；2）每一个用于治疗的胚胎都有潜在发育成个体的能力，涉及到伦理问题。iPS细胞的出现有希望使这两个问题得以解决。
二、技术概述
人工诱导多能干细胞的大致过程是：1）取自体体细胞进行体外培养；2）利用“载体”等方法将特定基因或基因产物转入体细胞；3）用与ES细胞相似的条件进行体外培养；4）利用多能细胞标记等条件筛选出iPS细胞；5）生成嵌合体或诱导培养成组织并进一步应用。
1、 细胞来源
iPS细胞的来源全部取自体细胞。2006年这一概念第一次被提出时，山中伸弥使用的是小鼠表皮成纤维细胞和尾尖成纤维细胞。2007年，成人皮肤成纤维细胞也被成功诱导成iPS细胞。[2]后来的研究中，以成纤维细胞为细胞源最为常见。2008年，从成年小鼠的肝脏和胃细胞诱导iPS细胞也获得了成功。[5]
在小鼠中，最常用的是表皮成纤维细胞和尾尖成纤维细胞，也有神经细胞、肌肉细胞、间充质干细胞等，2009年成熟的B细胞和T细胞也获得成功。人类中新生儿的包皮、口腔黏膜、成人真皮最为常用，角质细胞、间充质细胞、脐带血细胞等也有应用。
有学者证明任意的体细胞都有被诱导成iPS细胞的能力，与细胞种类及人的年龄、性别等没有关系。但是，iPS细胞的诱导产出率和培养方式与细胞种类是有关的。
后来，iPS技术在其他如大鼠、狗、兔子等物种中也获得了成功，有人因而提出了iPS可以保护濒危物种的说法。
2、 细胞因子
传统的iPS技术要在目标细胞中导入四个细胞因子：Oct3/4，Sox2，Klf4，c-Myc（即OSKM）。山中伸弥首先筛选出24个与维持ES细胞干性有紧密联系的细胞因子，将它们全部转入体细胞并诱导出iPS细胞，然后进一步减少转入因子的个数，最终确定了必须将以上四个因子同时转入才能成功。
但是，考虑到临床应用前景，四个细胞因子之一的c-Myc作为一个癌症因子，因成瘤性很强而并不友好。2008年，山中伸弥团队通过改进细胞培养条件，在只转入Oct3/4，Sox2，Klf4三个因子的情况下，也得到了iPS细胞，且获得iPS细胞在所有细胞中的比例大大提高，质量也优于转入四个因子的情况。[7]两种iPS细胞植入小鼠体内后，有c-Myc的小鼠有6%死于癌症，而没有c-Myc的小鼠无一死亡。这一方法的唯一问题是c-Myc会使iPS产量大幅提高，该基因的缺失使原本就存在产量不足问题的iPS细胞更难以投入临床应用。
然而，这一问题在今年年初受到了中国一个团队的质疑。他们观察到在敲除了c-Myc后iPS细胞的产量反而提高了。该团队分析认为表观遗传改变要积累到一定程度才能顺利推动基因重编程，之前所认为的c-Myc的缺失导致细胞产量低是因为细胞增殖缓慢，而体细胞一味地增殖会影响表观遗传的改变，反而不利于iPS细胞的生成。因此，对早期体细胞增殖的抑制，可能更利于iPS细胞的产出。[13]
当然细胞培养环境也有影响，有报道称高糖低氧环境更有利于iPS细胞的产生。[8][10] 2011年，美国有学者提出了用miRNA的方法诱导iPS细胞，他们分别对小鼠和人进行了实验，将mir302/367转入体细胞，miRNA可以激活Oct4和Sox2 而无须加入任何的转录因子，同样可以获得iPS细胞，其多能性标记的表达和畸胎瘤的形成等性能都与OSKM获
[11]得的iPS细胞类似，对于小鼠还制成了嵌合体并植入生殖系统。另外他们发现同时加入丙
戌酸钠抑制Hdac2通路，可以更进一步提高iPS细胞产量。
2013年2月，又有德国学者提出只要抑制CD47膜蛋白，而无需其它任何基因或基因
[14]产物同样可以得到iPS细胞。原因是CD47的下调会导致c-Myc表达上升同时调控其它与
干细胞有关的转录因子，从而得到iPS细胞。但该文章中并未提到c-Myc作为癌症基因，其表达量的上调会对机体造成的影响。
另外，近年来也有许多学者找到了一些其它细胞因子来代替OSKM，也有提出用激活wnt通路的方法作为代替的。可见获得iPS细胞的方法也不是唯一的。但总体来说，为获得iPS细胞，各重编程因子的平衡表达对iPS细胞的产出效率和质量很重要。研究表明，Oct3/4会增加重编程效率，而SOX2，Kfl4和c-Myc的高表达则会相对降低重编程效率。
3、 转染方法
经典的iPS转染方法是逆病毒转染，但是逆病毒转染存在的问题是，病毒易导致组织炎症发生从而引发癌变。
后来，山中伸弥团队又分别提出了用腺病毒载体和质粒载体两种转染方法[6]，并证明可以降低癌症的发生率。但质粒载体效率不高，只能通过提高载体量和优化重编程因子来提高iPS产出率。
另外还有一些无转基因iPS方法，例如蛋白转导。有人在大肠杆菌中强制表达聚精氨酸标记的OSKM，将这些蛋白一天四次转入小鼠EF细胞中，30天后也出现了与ES细胞性能类似的iPS细胞，并形成嵌合体植入小鼠体内。
还有人使用一种叫仙台病毒的RNA病毒，这种病毒并不作用于人体，不会引起感染。
4、 iPS细胞的筛选
iPS细胞的筛选标准主要是与ES细胞有相似的性质，包括外形、增值能力、DNA甲基化水平，组蛋白修饰等。有蛋白组学研究证明，iPS细胞与ES细胞类似，含更多与转录调控的蛋白。[9]与之相对比的是成纤维细胞有更多与转运有关的蛋白。
经典的ES细胞标记可以用来筛选iPS，例如NANOG。当然，通过细胞标记识别iPS的方法主要用于小鼠，人的iPS细胞通常从形态上就可以筛选出来，它们排列紧密边缘清晰，而杂细胞通常显得很粗糙。
三、iPS面临的主要问题
目前看来，iPS细胞面临的主要问题有三方面：1）植入体内的可能存在未完全分化的细胞而产生的潜在致瘤性；2）重编码过程速度慢，产率低；3）iPS细胞基因组的完整性。前两个问题相对容易被发现，在上文中也已经提到了一些相关解决方案，下面主要讨论一下第三个问题。
近年来，有研究发现iPS细胞存在一些表观遗传性和基因组的异常[4]，这可能会引起机体对自体细胞诱导的iPS细胞产生排异反应[3]，也有可能导致癌症的发生。因而引起了学界对iPS细胞在重编程过程中保证基因完整性的讨论。主要观点如下：
与传统的细胞有丝分裂一样，重编程中DNA复制过程是DNA损伤的主要来源。细胞的高分裂率会增加DNA损伤的发生，因此细胞培养过程中应控制增殖速度，以利于iPS细胞的获得。
但是，细胞本身有损伤的修复机制，会根据DNA损伤程度选择修复或凋亡。而p53基因在其中起到了非常关键的作用。且多能细胞本身增值较快，对DNA损伤非常敏感，一旦损伤发生，会立即启动p53调控的细胞凋亡程序。一旦p53缺失，有DNA损伤的细胞也会发生重编程，得到的iPS细胞基因组的完整性就会受到影响。
另外，研究发现HDR（同源性诱导修复）是多能干细胞中DNA修复的主要通路，它的特点是需要一条姐妹染色单体与之临时结合才能完成修复。因此，体细胞必须提前激活大量稳定的HDR以保证DNA的损伤修复。
由于iPS细胞基因组完整的重要性，相应的检测方法也随即提出。主要是通过对iPS细胞和ES细胞基因组的比较，例如原位杂交技术、基因芯片技术等。[12]最近又出现了一种叫做下一代基因组序列的方法（next-generation genome squencing），可以测出极微量的基因损伤，精度远优于其它方法。但由于该方法时间长、价格昂贵，尚未大范围应用。
当然，对于以上说法也有一些争议。有学者认为在细胞不断生长的过程中的确有基因突变，但至于是重编码前还是之后有待商榷。他们认为基因突变可能发生在三个阶段：1）重编码过程中；2）细胞早期体外培养过程中；3）突变是体细胞中早先存在的。但这些都只是猜测，还没有确切的证据。
四、小结
总的来说，iPS技术的确是一项开天辟地的成就，为再生医学的发展和疑难杂症的治疗带来的新希望。但是，这项技术离临床治疗还有很长的距离要走，最重要的一点就是要保证细胞的安全性。如果这一问题得以解决，细胞和基因治疗将在为来有更广阔的发展前景。
参考文献：
[1]S.Yamamnaka.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblase cultures bu defined factors.Cell,2006
[2]S. Yamanaka.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell,2007
[3]S. Kaneko. To be immunogenic or not to be that’s the iPSCquention. Cell stem cell,2013
[4]S.M.I.Hussein. Genome damage in induced pluripotent stem cells assessing the mechanisms and their consequences. Bioessays,2012
[5]T.Aoi. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science,2008
[6]K.Okita. Genetation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science,2008
[7]M.Nakagawa. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature biotechnology,2008
[8]Y.Yoshida. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell stem cell,2009
[9]R. Yamana. Rapid and deep profiling of human induced pluripotent stem cell proteome by one-shot nanolc-ms/ms analysis wit meter-scale monolithic silica columns. Journal of proteome,2013
[10]R.Madonna. Glucose metabolism hyperosmotic strss and reprogramming of somatic cells. Molecular biotechnology,2013
[11]F. Anokye-Danso. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell stem cell,2011
[12]Y.Buganim. Single-cell expression analyses during cellular reprogramming reveal an early stochastic and a late hierarchic phase.Cell,2012
[13]Y.Xu. Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency. JBC,2013
[14]S.Kaur. Thrombospondin-1 signaling through CD47 inhibits self-renewal by regulating c-myc and other stem cell transcription factors. Scientific reports,2013