双向电泳技术在植物应答非生物胁迫蛋白质组学研究中的应用

DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.03.020

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2010,38(3):1135-1138

责任编辑　胡俭胜　责任校对　卢瑶

程思思,乙引

＊

,张习敏,马琛　(贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳

550001)

摘要　介绍了双向电泳技术(2-DE)的基本概况及其在植物应答非生物胁迫蛋白质组学研究中的应用,并对今后的发展进行了展望。关键词　双向电泳;蛋白质组学;非生物胁迫中图分类号　S311　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)03-01135-04ApplicationofTwo-dimensionalElectrophoresisTechnologyinPlantResistancetoAbioticStressProteomicalResearchCHENGSi-sietal　(SchoolofLifeSciences,GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou550001)Abstract　Thegeneralsituationoftwo-dimensionalelectrophoresis(2-DE)wasintroducedaswellasitsapplicationinplantresistancetoabi-oticstressproteomicalresearch.Finally,thedevelopmentof2-DEinthefuturewasforecasted.Keywords　Two-dimensionalelectrophoresis;Proteomics;Abioticstress

　　植物在生长发育过程中会遭遇高温、低温、干旱和高盐等各种非生物逆境胁迫。植物感受这些逆境信号后通过信号转导过程调节细胞内抗逆性相关蛋白的表达,进而调整自身的生理状态或形态来提高其对非生物逆境的耐受能力

[1]

术的完善,IPG逐步替代了CA,发展成IPG-DALT(固相pH梯度-道尔顿)。

目前,随着蛋白质组研究的不断发展,双向电泳技术凭着其高通量、高灵敏度、高分辨率、重复性好、便于计算机进行图像分析处理等其他蛋白质分离技术所无法比拟的优势,已经成为蛋白质组学研究领域中不可或缺的实用技术之一,越来越受到大家的关注。2　双向电泳技术在植物应答非生物胁迫蛋白质组学研究中的应用

2.1　在植物应答高温胁迫蛋白质组学研究中的应用　植物体在受到高温逆境刺激后可诱导大量热休克蛋白的表达,这些蛋白是植物对逆境胁迫短期适应的必需组成成分,对减轻高温胁迫引起的伤害有很大的作用。YvesMeyer和YvetteChartier对烟草进行热激处理后,通过2-DE技术分析其叶肉原生质体蛋白质组,发现某些蛋白的合成几乎不受影响,而某些在25℃被检测出的蛋白质在热激处理后合成量明显减

[7]

少,另外还新诱导出17个特异性热激蛋白。M.Krishnan等通过2-DE技术分析了热激下玉米线粒体蛋白质组的变化,发现热激下HSP70和cpn60的合成无明显变化,而一种特殊的LMW-HSP(HSP22)合成受到高温强烈诱导,从而研究了sHSP合成与耐热性的关系。魏令波等用双向电泳-电泳回收法从沙冬青叶片热稳定蛋白质中分离到一种抗冻蛋白afp,其分子量为40kD,pI为9.0,热滞活性为0.9℃(20mg/ml),与其他抗冻蛋白进行比较,没有发现相同的类型。afp在沙冬青体内广泛分布且叶片含量较高,可能是沙冬青抗冻生理过程中的主要物质,对于沙冬青抵御冬季冷冻温度具有重要的作用

[9]

[8]

[6]

。

目前已有许多通过筛选、鉴定植物抗逆性基因以提高植物抗逆性研究的报道,都是从细胞mRNA的角度来考虑的。但实际上蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等几乎无法从mRNA水平来判[2]

断。而通过蛋白质组学的研究,能够更好的反映植物应答非生物胁迫中相关蛋白在时间、空间、数量、活性等方面的差异。因此,对于植物应答非生物胁迫蛋白质组学的研究及双向电泳技术的应用越来越受到人们的关注。

1　双向电泳(2-DE)技术概况

双向电泳是通过2次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术,第一向为等电聚焦(IEF),即根据蛋白质的等电点差异将蛋白质分离;第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),即根据蛋白质的分子量差异将蛋白质分离。双向电泳分离得到的每个斑点都对应着样本中的1种蛋白,是唯一能将样本中1000余种不同的蛋白质同时分离开来,并得到每种蛋白质的等电点、表观分子量和含量等信息的分离技术

[3]

。其技术流程主要包括样品制备、第一向IEF及胶

条平衡、SDS-PAGE、蛋白检测与图像扫描分析等步骤。

双向电泳技术自诞生以来,一直在不断的改进。1975年O'Farrell首先提出双向电泳系统

[4]

,首先将载体两性电解

质(CA)添加在丙烯酰胺凝胶中,凝胶聚合后在电场作用下形成连续的pH梯度进行等电聚焦作为第一向;聚焦后的凝胶在含有SDS的缓冲液中平衡后,用琼脂糖包埋在垂直板状SDS凝胶的浓缩胶上,以不连续SDS梯度凝胶电泳作为第二向,称之为ISO-DALT(等电点-道尔顿)。但是,由于两性电解质是以游离的形式分布于聚丙烯酰胺凝胶的网孔中,容易扩散,形成的pH梯度不够稳定,受电场和时间影响大,因此

[5]

分辨率较低,重复性不好。1975固相pH介质被合成,随着1982年固相pH梯度(ImmobilizedpHgradients,IPG)等技

基金项目　国家自然科学基金(30460031);贵州省科技创新人才团队

建设项目(黔科合人才团队[2009]4007号)资助。

作者简介　程思思(1986-),女,湖北武汉人,硕士研究生,研究方向:

植物学。＊通讯作者:E-mail:[email protected]。

收稿日期　2009-10-09

。StefanMoisyadi和H.MichaelHar-

rington利用2-DE技术研究了热激下甘蔗细胞培养物生长过程中蛋白质组的变化,发现32℃和34℃能诱导出一些大分

子量热激蛋白,36℃热激处理后诱导出一些18kD的热激蛋白,大部分的热激蛋白在热激10min内积累,而18kD的小分子量多肽在热激处理30min后才开始有显著的变化,热激超过38℃会导致热激蛋白合成的明显下降

[10]

。MajoulT等

通过2-DE技术分离小麦胚乳总蛋白,用MALDI-TOF-MS技术鉴定了25个热诱导蛋白,并且在小麦非醇溶谷蛋白组分中分离了43个蛋白,其中24个蛋白表达量上调,19个蛋白-M个蛋

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白,其中5个热上调蛋白与LMW-HSP相似。他们还发现植物耐高温遗传变异与HSP的多态性有关。2.2　在植物应答低温胁迫蛋白质组学研究中的应用　低温是一种主要的非生物胁迫因子,限制了许多重要农作物的产量和地理分布。MakotoHashimoto等分析了低温胁迫下水稻幼苗的蛋白质组,他们对2周龄的水稻幼苗5℃处理48h后,通过2-DE分离叶片、叶鞘和根蛋白质组。每个器官检测出250～400个点,低温下有39个蛋白点的丰度发生变化,19个上调,20个下调。在叶片中发现了4个受低温新诱导出的蛋白质。从鉴定的蛋白质中可以推断出与代谢相关的蛋白质表达量增加,而与防卫反应相关的蛋白质表达量下降。

SuxiaCui等研究了低温胁迫下水稻幼苗蛋白质组差异。从常温到低温15、10、5℃的渐进低温处理的水稻幼苗,通过2-DE技术分离了1700个蛋白质点,低温胁迫下60个蛋白质点上调。MALDI-TOFMS或ESI/MS/MS鉴定了其中的41个蛋白点,除了2个未知功能的蛋白以外,包括了4个分子伴侣,2个蛋白酶,8个细胞壁生物合成酶,7个氧化还原酶等。他们认为细胞壁组分增强对植物耐受低温胁迫具有重要作用

[13]

[12]

[11]

分离出1000个重复性较好的蛋白质点。其中有31个蛋白质点下调,65个蛋白质点上调。MS鉴定了85个蛋白质点,包括已知的和新诱导出的冷响应蛋白。个别蛋白质在低温下发生降解,特别是光合作用蛋白Rubisco大亚基。鉴定的蛋白质都涉及了多个过程,如信号传导、RNA合成、翻译、蛋白质修饰、氧化还原、光合作用、光呼吸和碳循环等。Es-telleGoulas等通过2-DE技术研究了低温胁迫下拟南芥叶绿体内腔和基质蛋白质组的差异。对拟南芥进行低温5℃处理1d、10d和40d,发现低温处理1d对基质蛋白质组的影响很小,而处理10d使得基质蛋白质组有很大改变,但是对内腔蛋白质组影响却很小。低温处理40d导致基质和内腔蛋白质组的同时改变。鉴定了43个蛋白,这些蛋白参与了光合作用、质体代谢功能、激素合成、信号转导等作用

[22][21]

。

2.3　在植物应答干旱胁迫的蛋白质组学研究中的应用　缺水干旱常引起植物形态学、生理学和生化反应,例如,气孔关闭、叶片卷曲、叶片衰老和渗透调节,是限制植物生长和产量的重要因素之一。InmaculadaJorge等比较了干旱胁迫下圣栎幼苗蛋白质组的差异。用2-DE技术分离出100个蛋白点,干旱胁迫下14个蛋白表达丰度发生改变,8个蛋白上调,6个蛋白下调。鉴定了7个蛋白质,分别是RuBisCO大亚基、RuBisCO小亚基、RuBisCO激活酶、球蛋白、高分子麦谷蛋白、果糖二磷酸醛缩酶等

[23]

。

LuisMeza-Basso等用2-DE方法在油菜幼苗中分离了受

低温诱导的蛋白,发现低温处理油菜籽幼苗,0℃蛋白质会继续合成,某些蛋白会优先合成,而另外一些蛋白的合成受到抑制,这些变化与mRNA的改变是一致的

[14]

。MohsenHajheidari等对甜菜

。PamCooper进行干旱胁迫157d后,通过2-DE技术检测出500个蛋白点,其中79个蛋白表达量有明显变化。利用LC-MS/MS分析了20个蛋白,它们主要参与了光合作用、氧化还原调节、

[24]

氧化胁迫、信号转导和分子伴侣活性等。GhulamMuham-madAli和SetsukoKomatsu研究了2周龄水稻幼苗干旱胁迫后叶鞘的蛋白质组的变化。干旱处理2周龄的水稻幼苗2～6d,运用2-DE技术对叶鞘蛋白进行分离,考马斯亮蓝染色。发现10个蛋白表达量上调,2个蛋白表达量下调。RuBisCO大、小亚基在干旱2d后都表现出下调的现象,这种调节在阐明干旱胁迫机制上是十分重要的,因为RuBisCO的表达量与胁迫的伤害程度是度密切相关的。另外10种蛋白包括超氧化物歧化酶(SOD)、激动蛋白解聚因子等在干旱胁迫下的表达量都有所增加。这些蛋白质主要参与了光合作用、代谢、细胞结构及信号传导等。其中一个为肌动蛋白解聚因子,是干旱胁迫诱导的靶蛋白之一

[25]

等观察了低温处理后番茄叶片蛋白质的合成,发现诱导出一个35kD蛋白,然而27kD蛋白几乎消失,通过肽谱分析27kD蛋白是LHCP-II绑定蛋白。这些下调都为低温导致净光能合成能力下降提供了有力依据

[15]

。A.Sabehat等发现将

西红柿果实38℃热激48h后能预防低温冻伤,通过2-DE分析发现热激后检测到的一些大分子或小分子蛋白在未经过热机处理的果实中出现消失或下调的情况,从而揭示了植物组织中热激蛋白持久性维持与耐冷性的关系

[16]

。

AlbertJ等在23℃和3℃同时用ABA处理雀麦草细胞,发现其耐寒性要比只在3℃用ABA处理过的细胞强。用2-DE检测出雀麦草细胞在低温下能诱导出24.5、47、48kD3[17]

种蛋白。BaeMS等对低温胁迫下拟南芥叶片细胞核蛋白质组进行了研究,运用2-DE技术检测出约500个点,发现有38个膜蛋白和54个核蛋白的表达量发生了变化。鉴定了其中的184个蛋白点,这些点对应着158个蛋白质,且与细胞的功能有关。选取其中的6个点做进一步的Northern杂交分析,结果表明它们的基因表达也受冷胁迫影响而改变

[18]

。

CaiyunHe等研究了干旱胁迫下欧美杨的应答,通过2-DE技术分离出1000多个可重复性蛋白点,26个蛋白表达量差异十分明显。鉴定了干旱胁迫诱导出的13个蛋白和高温诱导出的11个蛋白。这些蛋白质主要参与了光合作用,如RuBisCO大亚基和光合系统Ⅰ光反应中心亚基前体等。干旱胁迫对光合作用相关蛋白影响很大,这与净光合速率下降

[26]

是一致的。KazuyaYoshimura等运用2-DE技术研究了干旱胁迫下西瓜蛋白质组的变化,发现干旱胁迫早期诱导的许多蛋白质都与根的形态形成、碳/氮循环相关,可能是通过促进根部生长来提高植物的耐旱性。另一方面,干旱胁迫后期诱导出的木质素合成相关蛋白以及分子伴侣能提高自然耐旱性和维持蛋白质完整性。野生型西瓜在干旱胁迫下通过[27]

。IminN等对低温胁迫下水稻花粉囊蛋白质组进行研

究,发现幼嫩小孢子阶段12℃低温处理4d后,70个蛋白表达量有差异,其中47个上调,11个下调,12个新诱导的蛋白。鉴定了大豆冷响应相关蛋白,其中一个为热休克蛋白

[19]

。RamiT等对短时间内低温胁迫下拟南芥悬浮细胞磷

酸化蛋白质组进行了分析。通过2-DE技术进行分离,并用Pro-QDiamond染色。大部分蛋白质的磷酸化水平在低温胁迫2min到达最高峰,5min后开始下降。发现低温胁迫下拟南芥磷酸化蛋白质组是成动态的

[20]

。Shun-PingYan等6℃

,,。Haj-

38卷3期　　　　　　　　　　　　程思思等　双向电泳技术在植物应答非生物胁迫蛋白质组学研究中的应用

1137

heidari等对遗传背景不同的3种基因型小麦进行正常灌溉和干旱处理,通过2-DE技术分离出650个蛋白点。其中在至少1种基因型小麦中有121个蛋白质表达丰度发生显著改变。用MALDI-TOF/TOF-MS分析鉴定了57个点。通过比较耐旱性和敏感型小麦蛋白质组的差异,发现某些蛋白质的出现可作为应答干旱的表现。通过候选基因,以该蛋白(或基因)控制性状为育种目标,这项研究为培育高抗逆性植物

[28]

品种提供了依据。

2.4　在植物应答高盐胁迫的蛋白质组学研究中的应用　K.Aghaei等分析盐胁迫下大豆蛋白质表达谱。他们用100mMNaCl处理大豆,然后提取胚轴和根部的蛋白,通过2-DE技术检测到321个蛋白点,其中7个重复性较好蛋白点的丰度出现上调和下调。胚胎晚期丰富蛋白、大豆伴球蛋白、碱性-旋转-环-旋转蛋白的表达量上调,而蛋白酶抑制剂、血凝素、31kD醣蛋白前体蛋白的表达量下调。研究表明盐度能改变一些胚轴和根部特殊蛋白的表达,这些蛋白可

[29]

能与耐盐性相关。KeyvanAghaei等对2个马铃薯品种进行盐胁迫处理,提取根部蛋白质进行2-DE分析,其中1个品种检测出322个蛋白点,另1个品种中检测出305个蛋白点,但是2个品种中都有47个蛋白点的丰度发生了改变。与光合作用以及蛋白质合成相关的蛋白质表达量都有很明显的下降,而TSI-1蛋白、HSP、蛋白酶抑制剂、钙网蛋白表达量都有所上升。研究发现与防御反应相关的蛋白能提高植物的耐盐性

[30]

蛋白点。盐胁迫下102个点的丰度发生显著改变。他们分析了盐胁迫下的蛋白质表达图谱,通过LC/MS/MS鉴定了

40个蛋白,其中27个参与了耐氧性,甜菜碱合成,骨架重构,光合作用,ATP合成,蛋白质降解,氰化物解毒,伴侣活性等过程

[35]

。

2.5　在植物应答其他胁迫的蛋白组学研究中的应用　ChangWWP等研究了在低氧适应和缺氧期间玉米根尖蛋白质合成谱,他们首先对玉米幼苗进行2～4h的低氧处理,使玉米根尖的缺氧耐受性得到很大的提高。在缺氧和低氧适应过程中进行蛋白质合成谱分析,在含氧正常、低氧、缺氧环境中检测到262个蛋白质点,用MALDI-TOF-MS分析鉴定出了46种蛋白质,其合成比例发生了改变。这些蛋白参与了许多细胞功能活动,其中包括以前报道的缺氧相关蛋白如乙醇脱氢酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、苹果酸脱氢酶等

[36]

。

柴小清等通过2-DE技术分析了水稻受缺铁胁迫1、3、5

d后叶片蛋白质组的变化。检测到上调表达的蛋白数为29个,下调表达的蛋白数为1个,特异表达的蛋白数为5个。水稻在缺铁条件下表达调控体系发生了一定的变化,一些基因被关闭,由这些基因决定的蛋白合成受阻,而与缺铁环境

[37]

相适应的一些基因则进行表达,诱导合成特异蛋白质。

乔建军等应用2-DE技术比较过氧化氢处理细胞与正常细胞的蛋白质组差异,分析过氧化氢对东北红豆杉细胞蛋白质表达的影响。结果表明,过氧化氢(3.5mmol/L)处理48h后的样品中有12个新增的差异蛋白点,而在对照中有1个

特异蛋白点,这些差异蛋白可能与过氧化氢的作用及细胞发生过敏反应有关

[38]

。

NeilaJellouli等研究了盐胁迫下葡萄叶片、茎和根部的蛋白质表达谱。通过2-DE技术在叶片中检测出560个蛋白点,盐胁迫新诱导出2个蛋白点,茎中检测到854个蛋白点,根部检测到850个蛋白点。通过消化分析和数据库查询鉴定了GP蛋白,发现这个蛋白与PR10蛋白有着98%的相似

[31]

序列。ValeriaDani等对烟草叶非原生质体蛋白表达谱进行了分析,通过2-DE技术检测到150个蛋白点,统计显示20个蛋白点丰度发生变化,鉴定了盐胁迫诱导的一些多肽。1种已知能被生物和非生物胁迫诱导的蛋白表达量上调。另外,几丁质、类萌芽素蛋白、脂转移蛋白的表达量也上调[32]了。

张恩平等研究了耐盐与不耐盐番茄自交系在盐胁迫与正常栽培条件下根部蛋白质表达上的差异。通过2-DE分离,PDQuest软件和Q-TOF质谱分析,发现在盐胁迫条件下

共有8种蛋白质表达水平差异显著。磷酸葡萄糖脱氢酶、乙醇脱氢酶和3-异戊基苹果酸脱氢酶在盐处理的耐盐番茄根系中显著增加,异戊烯二磷酸(IDP)异构酶显著减少

[33]

。

江帆等以中国白菜为研究材料,采用室内培养方法,研究了10、30、50、100、1000μmol/L镉处理对白菜幼苗生长受

害及与蛋白质组变化的关系。通过2-DE技术分析发现经50μmol/L镉处理后的胚根、胚轴、叶片蛋白质组产生明显变化。胚根中新诱导出13个蛋白点,7个蛋白点消失,5个蛋白点表达量明显增加,2个蛋白点表达量减少;在胚轴中5个蛋白点表达量明显增加,4个蛋白点表达量减少,11个蛋白点消失;叶片中新诱导出17个蛋白点,7个蛋白点消失,10个蛋白点表达量明显增加,6个蛋白点表达量减少。白菜对镉的胁迫反应涉及到多个蛋白质(酶)的参与

[39]

。

葛才林等通过2-DE技术研究了有机污染物1,2,4-三氯苯(TCB)胁迫下2个不同类型水稻品种根系蛋白质组的差异。结果表明:TCB胁迫诱导矮仔占根系中β-葡萄糖苷酶和病程相关蛋白家族10蛋白的表达,及汕优63根系中谷胱甘肽-s-转移酶和酸式-还原酮二加氧酶的表达,他们认为这可能是汕优63较矮仔占对TCB胁迫有较高耐性的机理之一

[40]

。温

福平等用粳稻研究了盐胁迫对水稻种子萌发的抑制作用和赤霉酸(GA对盐胁迫的缓解作用,利用2-DE和MALDI-3)

TOF-MS技术分析了水稻蛋白质组的变化。在盐胁迫条件下,发现有4个蛋白点表现出显著的变化,在GA3与盐共处理时,这4个蛋白质点的表达均有不同程度的恢复。经MALDI-TOF-MS分析,其中2个蛋白分别被鉴定为isoflavonereductase-like蛋白与葡萄糖磷酸变位酶,这些蛋白可能与GA3提高水稻耐盐性途径相关

[34]

。

3　结论及展望

在植物应答非生物胁迫蛋白质组学方面的研究已获得较多的成果,对传统的植物生理学及功能基因组学研究做出

了有力补充。而双向电泳技术作为蛋白质组学的核心技术之一,也有了长足的发展和进步。双向电泳技术的改进尤其,。HosseinAskari等对碱蓬

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库和双向电泳图谱数据库的建立,为实验室有效地比较和分析蛋白质提供了可能。

虽然双向电泳技术在植物应答非生物胁迫蛋白质组学的研究中取得了一些进展,但是目前双向电泳技术还存在许多局限性。目前主要面临2个难题:各类极端蛋白质(极酸、极碱、极低拷贝数等)的分离及如何解决自动化高通量。极性蛋白质尤其是碱性蛋白质在细胞中常与DNA结合,在信号转导中起着调控作用,而许多细胞因子及功能蛋白质表达量往往也是很低的,因此分离这类蛋白质有着很重要的意义。在双向电泳进行过程中,有不少步骤需要手工操作,而且经验性强,无法完全自动化,容易产生误差,造成重复性差,不利于实现高通量分离蛋白质。今后如何改进双向电泳技术以克服目前出现的问题还值得探讨和研究。参考文献

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