粒和目的基因共转染用于检测目的基因对

・199・

表达EGFP 的质粒和目的基因共转染用于检测目的基因对细胞周期的影响

张　军　方超平　刘　莉　李闻捷　沈　茜　(第二军医大学附属长海医院实验诊断科, 上海200433)

　　中国图书分类号　R 392　　文献标识码　A 　　文章编号　10002484X (2004) 0320199203

　　在基因功能研究过程中, 常常使用的一种方法就是将目的基因转到靶细胞内进行瞬时表达(transient ex pression ) , 以流式细胞仪检测细胞周期的变化, 观察转基因对细胞增殖的影响。由于各种转基因方法的不同, 转基因的效率也不同, 往往是仅有一部分细胞可以表达目的基因, 没有转基因的细胞将影响检测的结果。如何将已经转基因的细胞同未转基因的细胞区分开来进行检测, 是一个技术上的难点。一种最直接的方法是采用目的基因表达蛋白的抗体直接标记表达目的基因的细胞, 条件是该目的基因必须是细胞内特异的, 且表达的蛋白位于细胞膜。另外一种方法就是采用双基因共转染方法, 常用的共转染基因有B 或T 淋巴细胞的分化抗原, 如:CD19、C D20等1。由于这些基因特异地表达于B 或T 淋巴细胞, 对靶细胞的功能影响极小, 而且表达抗原位于细胞膜上, 采用商品化的荧光标记抗体进行检测, 比较容易。但是, 采用商品化的抗体造成检测成本较高, 且胰酶消化过程会破坏贴壁生长靶细胞的表面抗原, 影响抗体标记。目前常用的一种方法就是将表达绿色荧光蛋白的质粒和目的基因共转染2; 在共转染时, 加入目的基因表达质粒的量远高于表达G FP 质粒的量, 以保证表达G FP 基因的细胞能够表达目的基因。由于普通的G FP 是表达于细胞胞浆内, 在细胞周期检测过程中进行乙醇固定时, G FP 会从胞内泄漏, 造成无法区分转基因细胞和阴性细胞。解决的方法是在G FP 蛋白的末端加入膜定位信号, 使G FP 定位表达于细胞膜或胞内膜上, 这样可以大大减少处理过程中G FP 的泄漏、丢失, 从而可以有效地区分转基因和未转基因细胞。我们采用以下几种表达绿色荧光蛋白的载体:pBB14、pC M VEG FP spectrin 、pEG FPN 21对这种方法进行了评价。

1　材料与方法

111　细胞和基因转染　293细胞和NIH3T3细胞常

规培养。细胞转染采用Lipofectamine T M (Life T echnol 2

作者简介:张　军(1973年-) , 男, 讲师, 实验诊断学博士; 通讯作者:沈　茜(1954年-) , 女, 教授, 实验诊断学博士生导师。

ogies ) 试剂盒。以pSP72质粒(未克隆入外源基因)

作为目的基因, 目的基因质粒和表达G FP 的质粒的用量比是10∶1。转基因后48小时, 收集细胞进行检测。

112　质粒　pSP72质粒购自Promega 公司。pEG F 2P N 21购自Clontech 公司,pBB14、pC M VEG FPspectrin 、

均由K alejta R F 惠赠。pBB14质粒表达伪狂犬病毒野生型蛋白Us9和EG FP 的融合蛋白(Us92EG FP ) , 由于含有Us9蛋白, 可以定位表达于胞浆内膜、高尔基体、胞浆囊泡等部位3,4。pC M VEG FPspectrin 基因内含有人定形素(spectrin ) 的PH (Pleckstrin H om ology ) 结构域, 可以使G FP 定位表达于胞浆内膜上。113　细胞处理和流式细胞仪检测

11311　观察75%乙醇固定对细胞绿色荧光蛋白的

影响　在转基因后48小时, 以0125%胰酶消化处理细胞, 离心收集细胞后, 以P BS 重悬细胞, 浓度为106个/ml 。细胞分为两份, 一份不处理留作对照(对照管) , 一份(固定管) 加入两倍体积在-20℃预冷的75%乙醇固定细胞1小时,P BS 洗涤细胞1次后流

式细胞仪(FACSCalibur ,Becton 2Dickins on 公司) 检测, 以CellQuest 软件获取、分析细胞。

11312　pSP72质粒和绿色荧光蛋白共转染后细胞周

期的检测　收集细胞后, 并经75%乙醇固定后, 以P BS 洗涤细胞1次。加入含有50μg/ml 的PI (碘化丙啶) 和100μg/ml 的无DNA 酶污染的RNA 酶(RNase A ) P BS 染色液, 置4℃避光染色1小时。以CellQuest 软件获取细胞。G FP 和PI 的检测分别采

用F L1通道(530/30nm ) 和F L2通道(572/26nm ) 。F L1通道采用对数值,F L2通道采用线性值。以Cel 2lQuest 和M odifit LT 软件进行细胞周期分析。

2　结果

211　75%乙醇固定后对细胞绿色荧光蛋白的影响

　三种质粒pBB14、pC M VEG FPspectrin 、pEG FPN 21在和pSP72质粒共转染后48小时荧光显微镜下观察均可见到绿色荧光。流式细胞仪检测对照管和固定管的绿色荧光蛋白表达, 典型结果见图1。pBB14、

・200・pC M VEG FPspectrin 质粒转基因细胞经固定处理后G FP 阳性细胞较对照组有轻度下降, 但是仍维持较

高的水平。pEG FPN 21转基因细胞经处理后, G FP 阳性细胞较对照组明显下降。212　pSP72质粒和绿色荧光蛋白基因共转染后细胞周期的检测结果　由于三种质粒中pBB14、pC M VEG FPspectrin 经75%乙醇固定处理后G FP 阳性细胞与对照细胞没有显著下降, 因此, 我们认为这两

种质粒适合于共转染细胞, 观察目的基因对细胞周期的影响。我们以未含外源基因的pSP72质粒和pBB14或pC M VEG FPspectrin 共转染293细胞或NIH3T3细胞建立了这种方法, 典型的检测结果见图2。pSP72质粒和pBB14或pC M VEG FPspectrin 共转染细胞后,G FP 阳性细胞的细胞周期结果与G FP 阴性细胞结果基本一致, 说明单纯转质粒对细胞的周期没有明显影响

。

N ote :Single parameter F L1histogram overlays of control (bold lines ) and ethanol 2fixed (dashed lines ) cells. The values on the X 2axis represent the fluorescence in 2

tensity of the G FP. The values on the Y 2axis represent the cell count. The fluorescence intensity of the EG FPN 21expressing cells decreased dramatically after ethanol fixation (A ) . Cells trans fected with the pBB14or pC M VEG FP spectrin after ethanol fixation showed an alm ost identical fluorescence pattern to the control cells (B ,C )

.

图1　pBB 14、pCMVEGFP spectrin 、pEGFPN 21转基因后绿色荧光蛋白表达的流式细胞仪检测结果

Fig. 1　F low cytometric examination of GFP expression of cells transfected with pBB 14, pCMVEGFP spectrin and pEGFPN 21

N ote :Dot plot of F L2width and F L2area displays the singlet cells (region 3,R3) and the aggregated cells (A ) . S ingle parameter F L1histogram displays the G FP

positive cells (region 2,R2) (B ) . PI fluorescence intensity histogram (C ) displays the cell cycle result of the singlet cells gated in the region 3(R3) . PI fluo 2rescence intensity histogram (D ) displays the cell cycle result of the G FP positive cells gated in region 2and region 3. Cell cycle of the G FP positive cells was alm ost the same as the G FP negative cells.

图2　pSP72质粒和绿色荧光蛋白基因共转染后细胞周期的检测结果

Fig. 2　Cell cycle analysis by flow cytometry after cotransfection of pSP72and the GFP expressing plasmids

・201・

3　讨论

由于绿色荧光蛋白非常易于观察和检测, 因此已经成为转基因研究中的重要指示分子。目前对于共转基因用于检测目的基因对于细胞周期的影响, 不管是采用质粒法还是病毒载体法, 在进行细胞固定处理时都有绿色荧光蛋白的泄漏, 因此有效地保持转基因细胞的G FP 不丢失是非常重要的。我们的研究结果表明pBB14和pC M VEG FPspectrin 转基因后的细胞经过常规的细胞周期检测处理过程后, G FP 阳性细胞数尽管较对照组有轻度下降, 但是仍

维持非常高的水平, 完全可以达到区分转基因和未

转基因细胞的目的, 而且pSP72质粒和pBB14或pC M VEG FPspectrin 共转染基因后, 对细胞的周期没有明显的影响, 这就说明转入目的基因后可以观察到细胞周期的变化, 我们使用该方法观察了新克隆的一些基因对细胞周期的影响, 取得了理想的效果。通过我们的研究和国外学者的研究均表明, 共转染携带膜定位信号肽的G FP 融合蛋白的质粒用于检

(上接第189页)

Chernoff 等已对人静脉注射I L 210的安全性进行了评

价, 为进行临床试验奠定了基础9。除了直接注射

Th2型细胞因子治疗UH A , 还可以用Th1型因子抗体进行逆转或进行Th2型因子基因治疗, 这些方法有待进一步研究。

4　参考文献

1　S ouza S S ,Ferriani R A ,Santos C M et al. Immunological evaluation of patients with recurrent abortion J . J Reprod Immunol , 2002; 56:1112121.

2　Li T C ,M akris M , T omsu M et al. Recurrent miscarriage :an etiology ,

management and prognosisJ . Hum Reprod Update ,2002;8:4632481. 3　邱丽华. 原因不明复发性流产与Th1/Th2型细胞因子J . 国外医

学・计划生育分册,2000;19(1) :20223.

4　M akhseed M ,Raghupathy R ,Azizieh F et al. Th1and Th2cytokine pro 2files in recurrent aborters with success ful pregnancy and with subsequest abortionsJ . Hum Peprod ,2001;16:221922226.

5　H ill J A ,P olgar K,Anders on D J. T helper 1immunity to trophoblasts in

测目的基因对靶细胞的影响是一种非常简便、效果理想的方法。

该实验得到复旦大学遗传所党永军博士的大力帮助, 在此表示感谢。

4　参考文献

1　Jiang W , Hunter T. Analysis of cell 2cycle profiles in trans fected cells us 2ing a membrane 2targeted G FPJ . Biotechniques ,1998;24(3) :3492354. 2　Lamm G M , S teinlein P , C otten M et al . A rapid , quantitative and in 2expensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently trans fected cellsJ . Nucleic Acids Res ,1997;25(23) :485524857. 3　K alejta R F , Shenk T , Beavis A J. Use of a membrane 2localized green

fluorescent protein allows simultaneous identification of trans fected cells and cell cycle analysis by flow cytometry J . Cytometry ,1997;29(4) :2862291.

4　K alejta R F , Brideau A D , Ban field B W et al . An integral membrane

green fluorescent protein marker , Us92G FP , is quantitatively retained in cells during propidium iodide 2based cell cycle analysis by flow cytometry J . Exp Cell Res ,1999;248(1) :3222328.

[收稿2002211229　修回2003201204

(编辑　张　慧)

w omen with recurrent spontaneous abortion J . Jama , 1995; 273:199321996.

6　Raghupathy R ,M akhseed M ,Azizieh F et al. M aternal Th1and Th2type

reactivity to placental antigens in normal human pregnancy and unex 2plained recurrent spontaneous abortionsJ . Cell Immunol ,1999;196(2) :122.

7　Rezaei A ,Dabbagh A. T 2helper (1) cytokines increase during early preg 2nancy in w omen with a history of recurrent spontaneous abortionJ . M ed Sci M onit ,2002;8:6072610.

8　Chaouat GA ,M eliani A A ,M artal J et al. I L 210prevents naturally occur 2ring fetal loss in the C BA ×DBA/2mating combiation ,and local defect in I L 210production in this abortion 2prone combination is corrected by inviv o

injection of IFN 2

γJ .J Immunol ,1995;154:426124266. 9　Chernoff A E , G ranowitz E V ,Shapiro L et al. A randomized ,controlled

trial of I L 210in humans inhibition of in flamnatory cytokine production and immune responsesJ .J Immunol ,1995;154:549225497.

[收稿2003206220(编辑　徐　杰)

・199・

表达EGFP 的质粒和目的基因共转染用于检测目的基因对细胞周期的影响

张　军　方超平　刘　莉　李闻捷　沈　茜　(第二军医大学附属长海医院实验诊断科, 上海200433)

　　中国图书分类号　R 392　　文献标识码　A 　　文章编号　10002484X (2004) 0320199203

　　在基因功能研究过程中, 常常使用的一种方法就是将目的基因转到靶细胞内进行瞬时表达(transient ex pression ) , 以流式细胞仪检测细胞周期的变化, 观察转基因对细胞增殖的影响。由于各种转基因方法的不同, 转基因的效率也不同, 往往是仅有一部分细胞可以表达目的基因, 没有转基因的细胞将影响检测的结果。如何将已经转基因的细胞同未转基因的细胞区分开来进行检测, 是一个技术上的难点。一种最直接的方法是采用目的基因表达蛋白的抗体直接标记表达目的基因的细胞, 条件是该目的基因必须是细胞内特异的, 且表达的蛋白位于细胞膜。另外一种方法就是采用双基因共转染方法, 常用的共转染基因有B 或T 淋巴细胞的分化抗原, 如:CD19、C D20等1。由于这些基因特异地表达于B 或T 淋巴细胞, 对靶细胞的功能影响极小, 而且表达抗原位于细胞膜上, 采用商品化的荧光标记抗体进行检测, 比较容易。但是, 采用商品化的抗体造成检测成本较高, 且胰酶消化过程会破坏贴壁生长靶细胞的表面抗原, 影响抗体标记。目前常用的一种方法就是将表达绿色荧光蛋白的质粒和目的基因共转染2; 在共转染时, 加入目的基因表达质粒的量远高于表达G FP 质粒的量, 以保证表达G FP 基因的细胞能够表达目的基因。由于普通的G FP 是表达于细胞胞浆内, 在细胞周期检测过程中进行乙醇固定时, G FP 会从胞内泄漏, 造成无法区分转基因细胞和阴性细胞。解决的方法是在G FP 蛋白的末端加入膜定位信号, 使G FP 定位表达于细胞膜或胞内膜上, 这样可以大大减少处理过程中G FP 的泄漏、丢失, 从而可以有效地区分转基因和未转基因细胞。我们采用以下几种表达绿色荧光蛋白的载体:pBB14、pC M VEG FP spectrin 、pEG FPN 21对这种方法进行了评价。

1　材料与方法

111　细胞和基因转染　293细胞和NIH3T3细胞常

规培养。细胞转染采用Lipofectamine T M (Life T echnol 2

作者简介:张　军(1973年-) , 男, 讲师, 实验诊断学博士; 通讯作者:沈　茜(1954年-) , 女, 教授, 实验诊断学博士生导师。

ogies ) 试剂盒。以pSP72质粒(未克隆入外源基因)

作为目的基因, 目的基因质粒和表达G FP 的质粒的用量比是10∶1。转基因后48小时, 收集细胞进行检测。

112　质粒　pSP72质粒购自Promega 公司。pEG F 2P N 21购自Clontech 公司,pBB14、pC M VEG FPspectrin 、

均由K alejta R F 惠赠。pBB14质粒表达伪狂犬病毒野生型蛋白Us9和EG FP 的融合蛋白(Us92EG FP ) , 由于含有Us9蛋白, 可以定位表达于胞浆内膜、高尔基体、胞浆囊泡等部位3,4。pC M VEG FPspectrin 基因内含有人定形素(spectrin ) 的PH (Pleckstrin H om ology ) 结构域, 可以使G FP 定位表达于胞浆内膜上。113　细胞处理和流式细胞仪检测

11311　观察75%乙醇固定对细胞绿色荧光蛋白的

影响　在转基因后48小时, 以0125%胰酶消化处理细胞, 离心收集细胞后, 以P BS 重悬细胞, 浓度为106个/ml 。细胞分为两份, 一份不处理留作对照(对照管) , 一份(固定管) 加入两倍体积在-20℃预冷的75%乙醇固定细胞1小时,P BS 洗涤细胞1次后流

式细胞仪(FACSCalibur ,Becton 2Dickins on 公司) 检测, 以CellQuest 软件获取、分析细胞。

11312　pSP72质粒和绿色荧光蛋白共转染后细胞周

期的检测　收集细胞后, 并经75%乙醇固定后, 以P BS 洗涤细胞1次。加入含有50μg/ml 的PI (碘化丙啶) 和100μg/ml 的无DNA 酶污染的RNA 酶(RNase A ) P BS 染色液, 置4℃避光染色1小时。以CellQuest 软件获取细胞。G FP 和PI 的检测分别采

用F L1通道(530/30nm ) 和F L2通道(572/26nm ) 。F L1通道采用对数值,F L2通道采用线性值。以Cel 2lQuest 和M odifit LT 软件进行细胞周期分析。

2　结果

211　75%乙醇固定后对细胞绿色荧光蛋白的影响

　三种质粒pBB14、pC M VEG FPspectrin 、pEG FPN 21在和pSP72质粒共转染后48小时荧光显微镜下观察均可见到绿色荧光。流式细胞仪检测对照管和固定管的绿色荧光蛋白表达, 典型结果见图1。pBB14、

・200・pC M VEG FPspectrin 质粒转基因细胞经固定处理后G FP 阳性细胞较对照组有轻度下降, 但是仍维持较

高的水平。pEG FPN 21转基因细胞经处理后, G FP 阳性细胞较对照组明显下降。212　pSP72质粒和绿色荧光蛋白基因共转染后细胞周期的检测结果　由于三种质粒中pBB14、pC M VEG FPspectrin 经75%乙醇固定处理后G FP 阳性细胞与对照细胞没有显著下降, 因此, 我们认为这两

种质粒适合于共转染细胞, 观察目的基因对细胞周期的影响。我们以未含外源基因的pSP72质粒和pBB14或pC M VEG FPspectrin 共转染293细胞或NIH3T3细胞建立了这种方法, 典型的检测结果见图2。pSP72质粒和pBB14或pC M VEG FPspectrin 共转染细胞后,G FP 阳性细胞的细胞周期结果与G FP 阴性细胞结果基本一致, 说明单纯转质粒对细胞的周期没有明显影响

。

N ote :Single parameter F L1histogram overlays of control (bold lines ) and ethanol 2fixed (dashed lines ) cells. The values on the X 2axis represent the fluorescence in 2

tensity of the G FP. The values on the Y 2axis represent the cell count. The fluorescence intensity of the EG FPN 21expressing cells decreased dramatically after ethanol fixation (A ) . Cells trans fected with the pBB14or pC M VEG FP spectrin after ethanol fixation showed an alm ost identical fluorescence pattern to the control cells (B ,C )

.

图1　pBB 14、pCMVEGFP spectrin 、pEGFPN 21转基因后绿色荧光蛋白表达的流式细胞仪检测结果

Fig. 1　F low cytometric examination of GFP expression of cells transfected with pBB 14, pCMVEGFP spectrin and pEGFPN 21

N ote :Dot plot of F L2width and F L2area displays the singlet cells (region 3,R3) and the aggregated cells (A ) . S ingle parameter F L1histogram displays the G FP

positive cells (region 2,R2) (B ) . PI fluorescence intensity histogram (C ) displays the cell cycle result of the singlet cells gated in the region 3(R3) . PI fluo 2rescence intensity histogram (D ) displays the cell cycle result of the G FP positive cells gated in region 2and region 3. Cell cycle of the G FP positive cells was alm ost the same as the G FP negative cells.

图2　pSP72质粒和绿色荧光蛋白基因共转染后细胞周期的检测结果

Fig. 2　Cell cycle analysis by flow cytometry after cotransfection of pSP72and the GFP expressing plasmids

・201・

3　讨论

由于绿色荧光蛋白非常易于观察和检测, 因此已经成为转基因研究中的重要指示分子。目前对于共转基因用于检测目的基因对于细胞周期的影响, 不管是采用质粒法还是病毒载体法, 在进行细胞固定处理时都有绿色荧光蛋白的泄漏, 因此有效地保持转基因细胞的G FP 不丢失是非常重要的。我们的研究结果表明pBB14和pC M VEG FPspectrin 转基因后的细胞经过常规的细胞周期检测处理过程后, G FP 阳性细胞数尽管较对照组有轻度下降, 但是仍

维持非常高的水平, 完全可以达到区分转基因和未

转基因细胞的目的, 而且pSP72质粒和pBB14或pC M VEG FPspectrin 共转染基因后, 对细胞的周期没有明显的影响, 这就说明转入目的基因后可以观察到细胞周期的变化, 我们使用该方法观察了新克隆的一些基因对细胞周期的影响, 取得了理想的效果。通过我们的研究和国外学者的研究均表明, 共转染携带膜定位信号肽的G FP 融合蛋白的质粒用于检

(上接第189页)

Chernoff 等已对人静脉注射I L 210的安全性进行了评

价, 为进行临床试验奠定了基础9。除了直接注射

Th2型细胞因子治疗UH A , 还可以用Th1型因子抗体进行逆转或进行Th2型因子基因治疗, 这些方法有待进一步研究。

4　参考文献

1　S ouza S S ,Ferriani R A ,Santos C M et al. Immunological evaluation of patients with recurrent abortion J . J Reprod Immunol , 2002; 56:1112121.

2　Li T C ,M akris M , T omsu M et al. Recurrent miscarriage :an etiology ,

management and prognosisJ . Hum Reprod Update ,2002;8:4632481. 3　邱丽华. 原因不明复发性流产与Th1/Th2型细胞因子J . 国外医

学・计划生育分册,2000;19(1) :20223.

4　M akhseed M ,Raghupathy R ,Azizieh F et al. Th1and Th2cytokine pro 2files in recurrent aborters with success ful pregnancy and with subsequest abortionsJ . Hum Peprod ,2001;16:221922226.

5　H ill J A ,P olgar K,Anders on D J. T helper 1immunity to trophoblasts in

测目的基因对靶细胞的影响是一种非常简便、效果理想的方法。

该实验得到复旦大学遗传所党永军博士的大力帮助, 在此表示感谢。

4　参考文献

1　Jiang W , Hunter T. Analysis of cell 2cycle profiles in trans fected cells us 2ing a membrane 2targeted G FPJ . Biotechniques ,1998;24(3) :3492354. 2　Lamm G M , S teinlein P , C otten M et al . A rapid , quantitative and in 2expensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently trans fected cellsJ . Nucleic Acids Res ,1997;25(23) :485524857. 3　K alejta R F , Shenk T , Beavis A J. Use of a membrane 2localized green

fluorescent protein allows simultaneous identification of trans fected cells and cell cycle analysis by flow cytometry J . Cytometry ,1997;29(4) :2862291.

4　K alejta R F , Brideau A D , Ban field B W et al . An integral membrane

green fluorescent protein marker , Us92G FP , is quantitatively retained in cells during propidium iodide 2based cell cycle analysis by flow cytometry J . Exp Cell Res ,1999;248(1) :3222328.

[收稿2002211229　修回2003201204

(编辑　张　慧)

w omen with recurrent spontaneous abortion J . Jama , 1995; 273:199321996.

6　Raghupathy R ,M akhseed M ,Azizieh F et al. M aternal Th1and Th2type

reactivity to placental antigens in normal human pregnancy and unex 2plained recurrent spontaneous abortionsJ . Cell Immunol ,1999;196(2) :122.

7　Rezaei A ,Dabbagh A. T 2helper (1) cytokines increase during early preg 2nancy in w omen with a history of recurrent spontaneous abortionJ . M ed Sci M onit ,2002;8:6072610.

8　Chaouat GA ,M eliani A A ,M artal J et al. I L 210prevents naturally occur 2ring fetal loss in the C BA ×DBA/2mating combiation ,and local defect in I L 210production in this abortion 2prone combination is corrected by inviv o

injection of IFN 2

γJ .J Immunol ,1995;154:426124266. 9　Chernoff A E , G ranowitz E V ,Shapiro L et al. A randomized ,controlled

trial of I L 210in humans inhibition of in flamnatory cytokine production and immune responsesJ .J Immunol ,1995;154:549225497.

[收稿2003206220(编辑　徐　杰)