1
PCR引物设计课堂笔记
○
PCR这个名词大家都不陌生，但实际操作时我们常说的引物设计到底是怎么回事呢？今天我就来给大家用实例演示一下哈。首先，我们要知道引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物设计是PCR的关键，附上PCR的基本流程图：
○
引物设计的原则：
1.引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
2.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
3.序列Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度。退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)
4.G+C含量：有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物的3′端：引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰；引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高； 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败
6.引物的5′端：引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
下面以实例操作演示一下加酶切位点时如何自己设计引物：
2
用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1
○
简单点说，就是现在我们要把Plasmid 2中GFP基因片段添加到Plasmid 1中的NR1基因片段上，但是Plasmid 2中GFP基因片段本身并没有BamHⅠ这个酶切位点，也就说我们要在引物设计中人为地把BamHⅠ这个酶切位点的序列添加给GFP基因片段，这样PCR后得到的GFP基因片段就可以通过BamHⅠ这个酶切位点进入到Plasmid 1中，然后绿色荧光蛋白(GFP)就可以来标记蛋白NR1，达到我们之后实验中来观察蛋白NR1的目的，示意图见下。
○
已知NR1的编码序列(~4000bp)
○
红色为信号肽，蓝色为BamHI酶切位点, 下划线标出BamHI酶切位点的阅读框
○
此次引物设计的要求：PCR扩增GFP；GFP两边添加BamHI酶切位点；保证NR1的阅读框不改变。
○
第一步：扩增GFP基本序列
○
当终止密码子TAA位于整个阅读框的中间位置时，我们需要把其去掉，否则就不能表达全长融合蛋白了。
○
第二步：添加酶切位点，BamHI的识别位点（ggatcc）
○
引物1与引物2是反向互补的噢~
○
第三步：保护阅读框（很重要）
○
注意：紫色标注的就是一个阅读框，为了保证整个阅读框的完整性，此时我们发现引物1…g gat cc? ATG GTG…后少了一个碱基，因此我们需要在引物1…g gat cc? ATG GTG…问号处添加1个碱基ｇ（补上的碱基可以任意选，但是尽量补成编码中性氨基酸的密码子），与此同时需要在引物2…gg atc c?? CTT GTA CAG…问号处需添加2个碱基ｇｇ（要求同上）。若我们在引物1中已经补上2个碱基的话，那么在引物2中就只需补上1个碱基就好了。简单的记，就是引物1,2中补上的碱基数前后相加为3（即一个密码子的数量），这样就不会影响到后面阅读框的改变。
○
第四步：添加保护序列
○
保护序列通常为4~8个，在不形成回文序列的情况下可以任意添加，多为c,g。
○
第五步：最后再根据G/C，Tm值调整引物的整体长度。
这就是我们自己动手设计引物的全过程。当然最后引物设计是否成功还需要实际操作后验证一下的。
3
快来练练手吧
○
假设plasmid B全长序列中不含有EcoRI位点，并已有实验室利用多克隆位点的NotI和HindIII位点在plasmid B插入了基因X的编码序列构建了plasmid B－X，已知基因X编码序列中仅含有1个EcoRI位点。现要求你采用PCR技术扩增plasmid A中的增强型绿荧光蛋白（EGFP）序列，并利用EcoRI位点以同一阅读框将其插入到plasmid B－X的基因X中，并保证全长融合蛋白的表达。
a. EGFP序列如下：
CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA ATTCTGCAGT CGACGGTACC GCGGGCCCGG
GATCCACCGG TCGCCACCAT GGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC
ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC
GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGA………………………………………………………………
GCTGCTGCCCG ACAACCACTA CCTGAGCACC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG
AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG
GACGAGCTGT ACAAGTAAAG CGGCCGCGAC TCTAGATCAT AATCAGCCAT ACCACATTTG
TAGAGGTTTT ACTTGCTTTA AAAAACCTCC CACACCTCCC CCTGAACCTG AAACATAAAA
b. 基因X含EcoRI位点的部分序列及其对应的编码氨基酸残基如下（GAATTC为EcoRI位点）：
5’…..GCC AGT GGA ATT CTG ATT GCC….. 3’
...Ala Ser Gly Ile Leu Ile Ala …
请根据上述信息设计用于扩增EGFP的引物
上游引物5’：
下游引物5’：
参考答案：
上游引物5’：
GCGGgaattcggATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
下游引物5’：
GCGCgaattcgCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
参考资料：分子生物学实验课件，丁香园论坛
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PCR引物设计课堂笔记
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PCR这个名词大家都不陌生，但实际操作时我们常说的引物设计到底是怎么回事呢？今天我就来给大家用实例演示一下哈。首先，我们要知道引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物设计是PCR的关键，附上PCR的基本流程图：
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引物设计的原则：
1.引物长度：一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。
2.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
3.序列Tm值：引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度。退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5～8)
4.G+C含量：有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物的3′端：引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰；引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高； 引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败
6.引物的5′端：引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
下面以实例操作演示一下加酶切位点时如何自己设计引物：
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用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1
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简单点说，就是现在我们要把Plasmid 2中GFP基因片段添加到Plasmid 1中的NR1基因片段上，但是Plasmid 2中GFP基因片段本身并没有BamHⅠ这个酶切位点，也就说我们要在引物设计中人为地把BamHⅠ这个酶切位点的序列添加给GFP基因片段，这样PCR后得到的GFP基因片段就可以通过BamHⅠ这个酶切位点进入到Plasmid 1中，然后绿色荧光蛋白(GFP)就可以来标记蛋白NR1，达到我们之后实验中来观察蛋白NR1的目的，示意图见下。
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已知NR1的编码序列(~4000bp)
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红色为信号肽，蓝色为BamHI酶切位点, 下划线标出BamHI酶切位点的阅读框
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此次引物设计的要求：PCR扩增GFP；GFP两边添加BamHI酶切位点；保证NR1的阅读框不改变。
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第一步：扩增GFP基本序列
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当终止密码子TAA位于整个阅读框的中间位置时，我们需要把其去掉，否则就不能表达全长融合蛋白了。
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第二步：添加酶切位点，BamHI的识别位点（ggatcc）
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引物1与引物2是反向互补的噢~
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第三步：保护阅读框（很重要）
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注意：紫色标注的就是一个阅读框，为了保证整个阅读框的完整性，此时我们发现引物1…g gat cc? ATG GTG…后少了一个碱基，因此我们需要在引物1…g gat cc? ATG GTG…问号处添加1个碱基ｇ（补上的碱基可以任意选，但是尽量补成编码中性氨基酸的密码子），与此同时需要在引物2…gg atc c?? CTT GTA CAG…问号处需添加2个碱基ｇｇ（要求同上）。若我们在引物1中已经补上2个碱基的话，那么在引物2中就只需补上1个碱基就好了。简单的记，就是引物1,2中补上的碱基数前后相加为3（即一个密码子的数量），这样就不会影响到后面阅读框的改变。
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第四步：添加保护序列
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保护序列通常为4~8个，在不形成回文序列的情况下可以任意添加，多为c,g。
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第五步：最后再根据G/C，Tm值调整引物的整体长度。
这就是我们自己动手设计引物的全过程。当然最后引物设计是否成功还需要实际操作后验证一下的。
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快来练练手吧
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假设plasmid B全长序列中不含有EcoRI位点，并已有实验室利用多克隆位点的NotI和HindIII位点在plasmid B插入了基因X的编码序列构建了plasmid B－X，已知基因X编码序列中仅含有1个EcoRI位点。现要求你采用PCR技术扩增plasmid A中的增强型绿荧光蛋白（EGFP）序列，并利用EcoRI位点以同一阅读框将其插入到plasmid B－X的基因X中，并保证全长融合蛋白的表达。
a. EGFP序列如下：
CCGGACTCAG ATCTCGAGCT CAAGCTTCGA ATTCTGCAGT CGACGGTACC GCGGGCCCGG
GATCCACCGG TCGCCACCAT GGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC
ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC
GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGA………………………………………………………………
GCTGCTGCCCG ACAACCACTA CCTGAGCACC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG
AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG
GACGAGCTGT ACAAGTAAAG CGGCCGCGAC TCTAGATCAT AATCAGCCAT ACCACATTTG
TAGAGGTTTT ACTTGCTTTA AAAAACCTCC CACACCTCCC CCTGAACCTG AAACATAAAA
b. 基因X含EcoRI位点的部分序列及其对应的编码氨基酸残基如下（GAATTC为EcoRI位点）：
5’…..GCC AGT GGA ATT CTG ATT GCC….. 3’
...Ala Ser Gly Ile Leu Ile Ala …
请根据上述信息设计用于扩增EGFP的引物
上游引物5’：
下游引物5’：
参考答案：
上游引物5’：
GCGGgaattcggATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
下游引物5’：
GCGCgaattcgCTTGTACAGCTCGTCCATGCC
参考资料：分子生物学实验课件，丁香园论坛
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