L-赖氨酸的发酵生产工艺研究
摘 要: L-赖氨酸是人体和动物所不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种。L-赖氨酸是国际市场上发展前景良好的产品，消费需求每年以7-10%的速度递增，国内年产量则以每年20-30%以上的速度递增。其广泛应用于医药、食品和饲料等领域。目前生产赖氨酸最主要的方法是微生物发酵法。本文从赖氨酸的生产现状、生产方法，发酵过程中的代谢调控以及赖氨酸生产菌种的选育和生产赖氨酸的前景展望这几个方面综述了赖氨酸生产工艺。
关键词: 赖氨酸； 发酵； 菌种； 展望
前 言
赖氨酸(Lysine) 的化学名称为2，6-二氨基己酸，有L-型(左旋)、D-型(右旋)和 DL 型(消旋)三种旋学异构体。赖氨酸是人和动物营养的必需氨基酸之一， 不能参加转氨作用[1] 。人类和动物可吸收利用的只有L型。它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。L-赖氨酸主要用于医药、食品和饲料工业。全球约9 0％的赖氨酸用作饲料添加剂，约5％用作食品添加剂，其余5％用作医药中间体[2]。目前，全球赖氨酸年总需求量约为85万t/a，年增长率为7％一8％。现全球赖氨酸总产能约为80万t/a，产量较大的是日本味之素公司(26万t/a)、美国ADM公司、BASF韩国公司和协和发酵工业公司等。国内赖氨酸需求量估计在13万t/a左右。赖氨酸应用范围较广，2003年以后，我国已成为全球最大的赖氨酸生产大国。目前已建成和正在建设的赖氨酸厂主要有广西赖氨酸公司、福建大泉赖氨酸有限公司、四川川化味之素有限公司、大成赖氨酸厂、肇东赖氨酸厂等。文章从赖氨酸的生产现状、生产方法，发酵过程中的代谢调控以及赖氨酸生产菌种的选育和生产赖氨酸的前景展望等方面论述了赖氨酸生产工艺的研究进展。
1 赖氨酸生产现状
L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法最多的特点是工艺流程简单，但是原料来源很有限，仅适合小规模生产。此后又出现了化学合成法、水解法，酶法。直到1960年，日本首先采用微生物发酵法生产赖氨酸。微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。氨基酸的L-型立体专一性决定了发
酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。我国于20世纪60年代中期开始进行赖氨酸菌株选育和发酵的研究，但因产量较低难以工业化。直到70年代未80年代初世界赖氨酸实现工业化后我国的研究才取得突破。目前，世界约2/3的赖氨酸企业采用发酵法生产，生产的为L-型赖氨酸，生产工艺巳基本成熟。近年来，赖氨酸的需求逐年增加，全世界每年大概80万t赖氨酸通过发酵生产的方式获得。 2 L-赖氨酸发酵生产研究
2.1 生产菌种
用于工业上发酵生产赖氨酸的菌株主要是棒状杆菌和短杆菌等的变异株，棒状杆菌具有极高的经济价值，其中谷氨酸棒状杆菌应用最为广泛。此外，赖氨酸生产还有大肠杆菌、黄色短杆菌、酿酒酵母、乳酸发酵短杆菌、假丝酵母等。谷氨酸棒状杆菌包括其亚种黄色短杆菌亚种乳糖短杆菌钝齿棒状杆菌和分枝短杆菌是赖氨酸工业生产中最重要的微生物
2.2 黄色短杆菌产赖氨酸的合成途径与调控机制
由上图可以得出要想得到高产的生产菌株，必须从以下几个方面对菌种进行控制：①切断代谢支路：选育和应用营养缺陷型菌株，切断丙氨酸、苏氨酸的分支途径是积累赖氨酸的有效手段。②解除反馈抑制：选育抗结构类似物的突变株，可以得到对AK（天门冬氨酸激酶）反馈抑制脱敏的菌株，代谢调节被遗传性地解除。③设法增加前体物质天门冬氨酸的浓度，以抵消变构抑制剂的影响。因此可以考虑选育丙氨酸缺陷型，抗天门冬氨酸结构类似物的突变株。④解除代谢互锁：赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在代谢互锁，因此可以考虑选育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸结构类似物的突变株。
2.3 发酵
2.3.1 发酵工艺条件以及影响因素组成
①温度：前期 32℃，后期30℃。②ph值：最适ph值6.5-7.0，控制范围在ph值
6.5-7.5之间。③种龄和接种量：二级种子接种量2%、种龄8-12h，三级种子接种量10%、种龄6-8h。④供氧：供氧需充足，过高、过低的溶氧对发酵均不利，表现为菌体浓度下降、产酸降低，发酵时间延长，否则生成乳酸。⑤初糖浓度控制在11%~15%，转化率最高。
2.3.2 发酵控制
发酵法生产赖氨酸的主要原料为淀粉、糖蜜玉米等淀粉类原料需经糖化转化为葡萄糖后才可用，且发酵液配方中需再补充生物素；甘蔗废糖蜜含较高的生物素，发酵液配方中无需再补充生物素。主要以淀粉水解液或甘蔗糖蜜为碳源发酵生产赖氨酸。
目前大多数赖氨酸生产厂家的发酵操作方式为分批操作，发酵生产涉及到发酵液和管路系统的消毒灭菌、营养调节、酸碱度调节、通风量调节等一系列复杂操作，都由配置的DCS系统完成，完全实现了自动化。A.IqaajSassi[6]等对黄色短杆菌ATCC21513进行流加方式发酵，研究表明产酸率可达110.6 g/L。官衡等对赖氨酸产生菌FB42流加发酵的全过程进行了分析，结果显示在小型反应器中的发酵水平为81.6 g/L，转化率为41.8%，生产强度为1.16g/(h·L)，和分批发酵相比分别提高了45.4%、9.7%和28.4%因此，流加方式发酵将是赖氨酸发酵的趋势[7]。
2.4 提取
要从成熟的发酵液中提取赖氨酸，必须对发酵液进行过滤或离心分离除去菌体和碳酸钙。传统的过滤方法为机械过滤，只能除去大颗粒的固体杂质。将超滤技术用于处理赖氨酸发酵液具有如下优点：可以截留发酵液中的菌体蛋白、悬浮固体等杂质，有利于提高下一个工序离子交换中树脂的使用效率和寿命，减轻后续工艺废水处理的压力，截留住的滤渣含有丰富的菌体蛋白及少量的赖氨酸，可以作为饲料添加剂。曾碧格等采用超滤技术直接处理赖氨酸的发酵液，结果表明：能够一步截留未经任何处理的赖氨酸发酵液中的菌体蛋白、固体颗粒等杂质，滤渣量约为原料体积的10%，而同等量的发酵液经过离子交换后，浓废水量约为该滤渣的20倍[8]。可见，超滤技术应用在赖氨酸发酵液处理上，大大减少了后续污物处理的压力，可实现赖氨酸超滤的收率97%以上，并且膜通量的衰减幅度较小，膜设备运行良好。
全世界绝大多数赖氨酸生产厂都采用离子交换方法从发酵成熟液中提取赖氨酸，然后制成含量在98.5％以上的赖氨酸单盐酸盐成品。离子交换树脂为强酸阳性离子交换树脂，洗脱剂为氨水。这一工序的技术具有以下优势：回收率高；洗出液中赖氨酸浓度高，减少了浓缩时的蒸汽消耗，降低生产负荷；离子交换树脂用量少。国外的离子交换系统大多为模拟移动床式操作系统[9]，逆流操作并采用两级离子交换单元。第一级离子交换单元可得到纯度为97.5%的赖氨酸；第二级使用弱酸阳性离子交换树脂，除去第一级离子交换后洗水中的无机杂质，可将赖氨酸最终纯度提高到98.5％。模拟移动床式操作系统稳定且操作弹性大，洗脱液用量少，洗出液赖氨酸质量分数比固定床高，同时树脂用量是固定床的1/5～1/8。
2.5 浓缩和结晶
浓缩工序是能耗最大的过程。我国赖氨酸生产最初用标准式浓缩器，每吨洗出液蒸汽消耗为1.1 t，蒸出的氨不回收。赖氨酸浓缩液经用盐酸调节pH后成为单盐酸盐溶液，在结晶器中结晶。我国有的生产厂采用冷冻结晶的方法，得到含2个结晶水的湿晶，分离的母液返回提取工序。赖氨酸湿晶含有的结晶水须在干燥工序中除去。我国多数赖氨酸厂均采用单层流化床干燥器生产，其中采用德国Vagon公司的床内设置加热器的流化床干燥器技术较为先进。
3 微生物生产赖氨酸的前景展望
我国的赖氨酸工业技术发展至今除生产菌种需继续加强研发外就整体而言已达到或接近世界先进水平传统的细胞诱变法产生的工业生产菌存在着致命的弱点，即失去特性的子代诱变体会积累[5]，它将影响菌种功能的发挥。日本的J0hnishi等人使用基因重构的方法，即用等位基因替换的方法将高产生产菌的高丝氨酸脱氢酶基因(hom)和天门冬氨酸激酶基因(Lys C)引入野生谷氨酸棒杆菌，得到了目前世界较高水平的赖氨酸菌种，我国应在这方面加快研发步伐。
[参考文献]
[1] 王选良.谷氨酸发酵[J].《中国酿造》.1986(05):12-20
[2] 张刚.《乳酸细菌——基础、技术和应用》[M].北京：生物·医药出版分社，2007.1
[3] 刘森芝.谷氨酸发酵生产菌的研究与开发[J].《发酵科技通讯》.2009(04):30-31
[4] 张刚.《乳酸细菌——基础、技术和应用》[M].北京：生物·医药出版分社，2007.1
[5] 廉立伟，谭玉晶，刘巍，文强．细菌鉴定在谷氨酸发酵生产中的应用[J].《发酵科技通讯》.2004(04):22-23
[6] 吕阳爱.谷氨酸发酵过程污染噬菌体的处理[J].《发酵科技通讯》.2009(04):25-26
[7] 邱炜炜，林有波，谢天阳，预防噬菌体污染的有效方法[J].《发酵科技通讯》.2000(01):38-39
[8]郑集．陈钧辉．普通生物化学[M]．高等教育出版社，200.446-448.
[9]朱晓彤.氨基酸与深加工产品的生产及应用[ J ].医药中间 体及其化工原料. 2 004. (2) l 7 ~ 2 4.
[10]齐秀兰，阎浩林，L-赖氨酸高产菌选育的研究[J].微生物学杂志，1997,1712
[11]张伟国，顾正华，L-赖氨酸高产菌选育的研究[J]，食品与发酵工业，2001,27980
L-赖氨酸的发酵生产工艺研究
摘 要: L-赖氨酸是人体和动物所不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种。L-赖氨酸是国际市场上发展前景良好的产品，消费需求每年以7-10%的速度递增，国内年产量则以每年20-30%以上的速度递增。其广泛应用于医药、食品和饲料等领域。目前生产赖氨酸最主要的方法是微生物发酵法。本文从赖氨酸的生产现状、生产方法，发酵过程中的代谢调控以及赖氨酸生产菌种的选育和生产赖氨酸的前景展望这几个方面综述了赖氨酸生产工艺。
关键词: 赖氨酸； 发酵； 菌种； 展望
前 言
赖氨酸(Lysine) 的化学名称为2，6-二氨基己酸，有L-型(左旋)、D-型(右旋)和 DL 型(消旋)三种旋学异构体。赖氨酸是人和动物营养的必需氨基酸之一， 不能参加转氨作用[1] 。人类和动物可吸收利用的只有L型。它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。L-赖氨酸主要用于医药、食品和饲料工业。全球约9 0％的赖氨酸用作饲料添加剂，约5％用作食品添加剂，其余5％用作医药中间体[2]。目前，全球赖氨酸年总需求量约为85万t/a，年增长率为7％一8％。现全球赖氨酸总产能约为80万t/a，产量较大的是日本味之素公司(26万t/a)、美国ADM公司、BASF韩国公司和协和发酵工业公司等。国内赖氨酸需求量估计在13万t/a左右。赖氨酸应用范围较广，2003年以后，我国已成为全球最大的赖氨酸生产大国。目前已建成和正在建设的赖氨酸厂主要有广西赖氨酸公司、福建大泉赖氨酸有限公司、四川川化味之素有限公司、大成赖氨酸厂、肇东赖氨酸厂等。文章从赖氨酸的生产现状、生产方法，发酵过程中的代谢调控以及赖氨酸生产菌种的选育和生产赖氨酸的前景展望等方面论述了赖氨酸生产工艺的研究进展。
1 赖氨酸生产现状
L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法最多的特点是工艺流程简单，但是原料来源很有限，仅适合小规模生产。此后又出现了化学合成法、水解法，酶法。直到1960年，日本首先采用微生物发酵法生产赖氨酸。微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。氨基酸的L-型立体专一性决定了发
酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。我国于20世纪60年代中期开始进行赖氨酸菌株选育和发酵的研究，但因产量较低难以工业化。直到70年代未80年代初世界赖氨酸实现工业化后我国的研究才取得突破。目前，世界约2/3的赖氨酸企业采用发酵法生产，生产的为L-型赖氨酸，生产工艺巳基本成熟。近年来，赖氨酸的需求逐年增加，全世界每年大概80万t赖氨酸通过发酵生产的方式获得。 2 L-赖氨酸发酵生产研究
2.1 生产菌种
用于工业上发酵生产赖氨酸的菌株主要是棒状杆菌和短杆菌等的变异株，棒状杆菌具有极高的经济价值，其中谷氨酸棒状杆菌应用最为广泛。此外，赖氨酸生产还有大肠杆菌、黄色短杆菌、酿酒酵母、乳酸发酵短杆菌、假丝酵母等。谷氨酸棒状杆菌包括其亚种黄色短杆菌亚种乳糖短杆菌钝齿棒状杆菌和分枝短杆菌是赖氨酸工业生产中最重要的微生物
2.2 黄色短杆菌产赖氨酸的合成途径与调控机制
由上图可以得出要想得到高产的生产菌株，必须从以下几个方面对菌种进行控制：①切断代谢支路：选育和应用营养缺陷型菌株，切断丙氨酸、苏氨酸的分支途径是积累赖氨酸的有效手段。②解除反馈抑制：选育抗结构类似物的突变株，可以得到对AK（天门冬氨酸激酶）反馈抑制脱敏的菌株，代谢调节被遗传性地解除。③设法增加前体物质天门冬氨酸的浓度，以抵消变构抑制剂的影响。因此可以考虑选育丙氨酸缺陷型，抗天门冬氨酸结构类似物的突变株。④解除代谢互锁：赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在代谢互锁，因此可以考虑选育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸结构类似物的突变株。
2.3 发酵
2.3.1 发酵工艺条件以及影响因素组成
①温度：前期 32℃，后期30℃。②ph值：最适ph值6.5-7.0，控制范围在ph值
6.5-7.5之间。③种龄和接种量：二级种子接种量2%、种龄8-12h，三级种子接种量10%、种龄6-8h。④供氧：供氧需充足，过高、过低的溶氧对发酵均不利，表现为菌体浓度下降、产酸降低，发酵时间延长，否则生成乳酸。⑤初糖浓度控制在11%~15%，转化率最高。
2.3.2 发酵控制
发酵法生产赖氨酸的主要原料为淀粉、糖蜜玉米等淀粉类原料需经糖化转化为葡萄糖后才可用，且发酵液配方中需再补充生物素；甘蔗废糖蜜含较高的生物素，发酵液配方中无需再补充生物素。主要以淀粉水解液或甘蔗糖蜜为碳源发酵生产赖氨酸。
目前大多数赖氨酸生产厂家的发酵操作方式为分批操作，发酵生产涉及到发酵液和管路系统的消毒灭菌、营养调节、酸碱度调节、通风量调节等一系列复杂操作，都由配置的DCS系统完成，完全实现了自动化。A.IqaajSassi[6]等对黄色短杆菌ATCC21513进行流加方式发酵，研究表明产酸率可达110.6 g/L。官衡等对赖氨酸产生菌FB42流加发酵的全过程进行了分析，结果显示在小型反应器中的发酵水平为81.6 g/L，转化率为41.8%，生产强度为1.16g/(h·L)，和分批发酵相比分别提高了45.4%、9.7%和28.4%因此，流加方式发酵将是赖氨酸发酵的趋势[7]。
2.4 提取
要从成熟的发酵液中提取赖氨酸，必须对发酵液进行过滤或离心分离除去菌体和碳酸钙。传统的过滤方法为机械过滤，只能除去大颗粒的固体杂质。将超滤技术用于处理赖氨酸发酵液具有如下优点：可以截留发酵液中的菌体蛋白、悬浮固体等杂质，有利于提高下一个工序离子交换中树脂的使用效率和寿命，减轻后续工艺废水处理的压力，截留住的滤渣含有丰富的菌体蛋白及少量的赖氨酸，可以作为饲料添加剂。曾碧格等采用超滤技术直接处理赖氨酸的发酵液，结果表明：能够一步截留未经任何处理的赖氨酸发酵液中的菌体蛋白、固体颗粒等杂质，滤渣量约为原料体积的10%，而同等量的发酵液经过离子交换后，浓废水量约为该滤渣的20倍[8]。可见，超滤技术应用在赖氨酸发酵液处理上，大大减少了后续污物处理的压力，可实现赖氨酸超滤的收率97%以上，并且膜通量的衰减幅度较小，膜设备运行良好。
全世界绝大多数赖氨酸生产厂都采用离子交换方法从发酵成熟液中提取赖氨酸，然后制成含量在98.5％以上的赖氨酸单盐酸盐成品。离子交换树脂为强酸阳性离子交换树脂，洗脱剂为氨水。这一工序的技术具有以下优势：回收率高；洗出液中赖氨酸浓度高，减少了浓缩时的蒸汽消耗，降低生产负荷；离子交换树脂用量少。国外的离子交换系统大多为模拟移动床式操作系统[9]，逆流操作并采用两级离子交换单元。第一级离子交换单元可得到纯度为97.5%的赖氨酸；第二级使用弱酸阳性离子交换树脂，除去第一级离子交换后洗水中的无机杂质，可将赖氨酸最终纯度提高到98.5％。模拟移动床式操作系统稳定且操作弹性大，洗脱液用量少，洗出液赖氨酸质量分数比固定床高，同时树脂用量是固定床的1/5～1/8。
2.5 浓缩和结晶
浓缩工序是能耗最大的过程。我国赖氨酸生产最初用标准式浓缩器，每吨洗出液蒸汽消耗为1.1 t，蒸出的氨不回收。赖氨酸浓缩液经用盐酸调节pH后成为单盐酸盐溶液，在结晶器中结晶。我国有的生产厂采用冷冻结晶的方法，得到含2个结晶水的湿晶，分离的母液返回提取工序。赖氨酸湿晶含有的结晶水须在干燥工序中除去。我国多数赖氨酸厂均采用单层流化床干燥器生产，其中采用德国Vagon公司的床内设置加热器的流化床干燥器技术较为先进。
3 微生物生产赖氨酸的前景展望
我国的赖氨酸工业技术发展至今除生产菌种需继续加强研发外就整体而言已达到或接近世界先进水平传统的细胞诱变法产生的工业生产菌存在着致命的弱点，即失去特性的子代诱变体会积累[5]，它将影响菌种功能的发挥。日本的J0hnishi等人使用基因重构的方法，即用等位基因替换的方法将高产生产菌的高丝氨酸脱氢酶基因(hom)和天门冬氨酸激酶基因(Lys C)引入野生谷氨酸棒杆菌，得到了目前世界较高水平的赖氨酸菌种，我国应在这方面加快研发步伐。
[参考文献]
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[5] 廉立伟，谭玉晶，刘巍，文强．细菌鉴定在谷氨酸发酵生产中的应用[J].《发酵科技通讯》.2004(04):22-23
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[7] 邱炜炜，林有波，谢天阳，预防噬菌体污染的有效方法[J].《发酵科技通讯》.2000(01):38-39
[8]郑集．陈钧辉．普通生物化学[M]．高等教育出版社，200.446-448.
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