本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pET-32a （+），从Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点插入PCR 产物-PrP 435。但由于单菌落所得载体pET-32a
（+）在Eco R Ⅰ位点突变，由GAATTC 突变为GAATTA （已测序），按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a （+），在4℃连接过夜、TSS 法转化E.coli DH5a 未获成功。而将一周以后在4℃保存的连接液TSS 法转化E.coli DH5 a 却获成功。我们利用双引物primer genome 进行菌落PCR 筛选阳性克隆时发现，本应扩增出430
bp 的DNA 片断，实验结果却扩增出约1300 bp，860 bp，430 bp三个DNA 条带。消除所有污染因素后，结果依然是三个DNA 条带。由此我们怀疑可能是PCR 产物串联以后连入pET-32a （+）。
根据以上现象我们对结果作如下探索：疑似串联重组质粒命名为PrP X -pET-32a （+），PrP X -pET-32a （+）转化E.coli BL21（DE3），进行表达鉴
定；Eco R Ⅰ单酶切PrP X -pET-32a （+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，试图获得
单拷贝阳性克隆；用引物primer vector 进行菌落PCR 鉴定；使用5′primer genome 单引物进行菌落PCR 筛选鉴定； PrPX -pET-32a （+）和pET-32a （+）测序。试验结
果表明：表达出49 KD蛋白，比单拷贝克隆表达蛋白（35 KD）多15 KD，相当于2倍拷贝串联克隆表达蛋白大小。由于插入片段已突变出两个终止子，所以我们认为PrP 435串联数应在2以上，前一拷贝应为反向插入，而后一拷贝应为正向
插入。
使用5′primer genome 单引物进行菌落PCR ，试验结果扩增出约860 bp ，420 bp ，
两个DNA 片段，420 bp附近有稍大模糊条带，据此我们认为：串联数应在4以上。因为，由图3-5，使用5′primer genome 单引物进行菌落PCR 时，上游因物在
E1-E6处和PrP X -pET-32a （+）退火，下游引物在H1-H5处和PrP X -pET-32a （+）
退火，上游因物带有Eco R Ⅰ酶切位点可以与载体上E0产生错配。所以E1和H1之间可扩增出430 bp片段，E1和H5之间可扩增出约1300 bp片段，E1和E4之间可扩增出约860 bp片段。E1和3之间Taq 酶同时往中间扩增，Taq 酶要占一定的空间，就会使下游引物所加的Hind Ⅲ酶切位点和三个保护性碱基消失一部分，扩增出约420 bp（比430 bp小）条带。其他各条带可同理推出。
图3-5串联质粒PrP X -pET-32a （+）多克隆位点
Fig.3-5 The MCS of cascade recombinant PrPX -pET-32a （+）
sense strand ， anti- sense strand ， H Hind Ⅲ，
E Eco R Ⅰ， vector
本实验早期我们用Eco R Ⅰ单酶切PrP X -pET-32a （+），琼脂糖凝胶回收，并
重新连接，试图获得单拷贝阳性克隆，但重复多次，经表达鉴定，未获成功。原因是Eco R Ⅰ位点突变（已测序）。以后重复该实验所用pET-32a （+）Eco R Ⅰ位点完好，Eco R Ⅰ单酶切PrP X -pET-32a （+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，实验
结果获得单拷贝阳性克隆。
PrP X -pET-32a （+）经上海联合基因公司和上海基康基因公司测序均未获成
功。原因可能是串联克隆造成的多个长回文序列，形成DNA 的某种二级结构造成测序困难。
虽本实验然重复出了失误实验的结果，表达出了相应的蛋白作，但也只是一次探索。建议对以下三个方面作进一步得把探索性研究，首先由于测序无法完成，可进一步做Western-Blot 鉴定（使用牛朊蛋白单抗做过两次，非特异性较强，未能得到好的照片）；其次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链并产生一个终止子，导致蛋白表达量很低，而且为无用蛋白，若能将引物primer genome 两个酶切位点作颠倒，使用单酶切两种PCR 产物（酶切位点相互颠倒），作连接以后，再做克隆，可克隆入完全正向连接的串联克隆；再次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链，可表达出PrP 核心片段的反义肽，可做反义肽方面的进一步探索。
有时候实验中出现串连并不是我们所期望的，如何避免串连，提高连接效率? 笔者做过这方面的探讨。具体如下：由于细菌在遗传上的不稳定性，在进行细菌操作时，应挑选多个菌落。在实验过程中曾经遇到pET-32a （+）Eco R Ⅰ位点由GAATTC 突变为GAATTA （已测序），造成连接以后连接产物的串联，就是由于在操作过程中挑选单个菌落造成的。
重组质粒构建通常使用酶切然后胶回收再连接、转化，最后进行阳性克隆鉴定的方法。但实验中经常遇到酶切操作困难和胶回收量低、转化效率低、串连等问题。特别是进行双酶切时，由于两个酶在通用buffer 中的效率不一致，琼脂糖凝胶电泳无法区分单酶切和双酶切，连接产物中可能混有大量的空载体，这样就会给阳性克隆筛选带来麻烦。还有可能由于过多的剧烈条件造成酶切产物个别核苷酸的丢失，还可造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。我们将重组质粒的构建方法略加改进，取得了良好的效果和重复性。具体操作介绍如下：
pET-32a （+）去RNA ，经溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、氯仿、乙醇沉淀。将pET-32a （+）与PCR 产物按1：20的比例混合，Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切2小时。酶切产物不进行任何形式的纯化，直接用1/10量连接2小时。连接产物立即转化E.coli DH5α，在含50 ug/ml AMP 的液体TB 培养基中过夜，收集细菌提取质粒、纯化。用pET-32a （+）多克隆位点上Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ之间已被双酶切去除的Sal Ⅰ位点对应酶Sal Ⅰ单酶切（图1－8），使pET-32a （+）空载体线性化。酶切产物转化E.coli BL-21，涂布含50 ug/ml AMP LB平板，挑单菌落进行菌落PCR ，筛选阳性克隆。转化E.coli BL-21之前也可进行阳性克隆富集。上述包含阳性克隆和pET-32a （+）空载体混合质粒，用Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切，乙醇回收去掉小片段， T4DNA连接酶连接反应体系同上。TSS 缓冲液转化E.coli BL-21（DE3）。（图1-7， 1-8）
图1-7 一种新的重组质粒构建方法
Fig.1-7 A new method for the contruction of recombinant plasmid
图1-8 pET-32a（+）多克隆位点
Fig. pET-32a（+） MCS
此方法具有很大的跳跃性，不需检测酶切是否完全，Sal Ⅰ单酶切使pET-32a （+）空载体线性化。E.coli BL-21的转化效率大约是E.coli DH5α的1/10（见《pET System Manual》22页），线性化pET-32a （+）比超螺旋质粒转化率低的多，线性化空载体转入E.coli BL-21的几率很小。经两次富集阳性克隆，菌落PCR 筛选阳性克隆率几乎100%。传统方法使用胶回收pET-32a （+）的浓度
很低，难于测定OD 260值，载体和PCR 产物比例不当很容易造成串联，本方法未
将载体和PCR 产物的酶切小片段去除，各粘性末端都有对应的酶切小片段，串联的几率降低到最小。所以连接时可以不加限制的增加PCR 产物的量，极大的提高了正确连接的效率。胶回收DNA ，可能由于剧烈条件造成酶切产物个别核苷酸的丢失，造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。本方法将胶回收DNA 步骤取消，降低质粒的错义突变和无义突变的几率。
本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pET-32a （+），从Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点插入PCR 产物-PrP 435。但由于单菌落所得载体pET-32a
（+）在Eco R Ⅰ位点突变，由GAATTC 突变为GAATTA （已测序），按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a （+），在4℃连接过夜、TSS 法转化E.coli DH5a 未获成功。而将一周以后在4℃保存的连接液TSS 法转化E.coli DH5 a 却获成功。我们利用双引物primer genome 进行菌落PCR 筛选阳性克隆时发现，本应扩增出430
bp 的DNA 片断，实验结果却扩增出约1300 bp，860 bp，430 bp三个DNA 条带。消除所有污染因素后，结果依然是三个DNA 条带。由此我们怀疑可能是PCR 产物串联以后连入pET-32a （+）。
根据以上现象我们对结果作如下探索：疑似串联重组质粒命名为PrP X -pET-32a （+），PrP X -pET-32a （+）转化E.coli BL21（DE3），进行表达鉴
定；Eco R Ⅰ单酶切PrP X -pET-32a （+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，试图获得
单拷贝阳性克隆；用引物primer vector 进行菌落PCR 鉴定；使用5′primer genome 单引物进行菌落PCR 筛选鉴定； PrPX -pET-32a （+）和pET-32a （+）测序。试验结
果表明：表达出49 KD蛋白，比单拷贝克隆表达蛋白（35 KD）多15 KD，相当于2倍拷贝串联克隆表达蛋白大小。由于插入片段已突变出两个终止子，所以我们认为PrP 435串联数应在2以上，前一拷贝应为反向插入，而后一拷贝应为正向
插入。
使用5′primer genome 单引物进行菌落PCR ，试验结果扩增出约860 bp ，420 bp ，
两个DNA 片段，420 bp附近有稍大模糊条带，据此我们认为：串联数应在4以上。因为，由图3-5，使用5′primer genome 单引物进行菌落PCR 时，上游因物在
E1-E6处和PrP X -pET-32a （+）退火，下游引物在H1-H5处和PrP X -pET-32a （+）
退火，上游因物带有Eco R Ⅰ酶切位点可以与载体上E0产生错配。所以E1和H1之间可扩增出430 bp片段，E1和H5之间可扩增出约1300 bp片段，E1和E4之间可扩增出约860 bp片段。E1和3之间Taq 酶同时往中间扩增，Taq 酶要占一定的空间，就会使下游引物所加的Hind Ⅲ酶切位点和三个保护性碱基消失一部分，扩增出约420 bp（比430 bp小）条带。其他各条带可同理推出。
图3-5串联质粒PrP X -pET-32a （+）多克隆位点
Fig.3-5 The MCS of cascade recombinant PrPX -pET-32a （+）
sense strand ， anti- sense strand ， H Hind Ⅲ，
E Eco R Ⅰ， vector
本实验早期我们用Eco R Ⅰ单酶切PrP X -pET-32a （+），琼脂糖凝胶回收，并
重新连接，试图获得单拷贝阳性克隆，但重复多次，经表达鉴定，未获成功。原因是Eco R Ⅰ位点突变（已测序）。以后重复该实验所用pET-32a （+）Eco R Ⅰ位点完好，Eco R Ⅰ单酶切PrP X -pET-32a （+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，实验
结果获得单拷贝阳性克隆。
PrP X -pET-32a （+）经上海联合基因公司和上海基康基因公司测序均未获成
功。原因可能是串联克隆造成的多个长回文序列，形成DNA 的某种二级结构造成测序困难。
虽本实验然重复出了失误实验的结果，表达出了相应的蛋白作，但也只是一次探索。建议对以下三个方面作进一步得把探索性研究，首先由于测序无法完成，可进一步做Western-Blot 鉴定（使用牛朊蛋白单抗做过两次，非特异性较强，未能得到好的照片）；其次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链并产生一个终止子，导致蛋白表达量很低，而且为无用蛋白，若能将引物primer genome 两个酶切位点作颠倒，使用单酶切两种PCR 产物（酶切位点相互颠倒），作连接以后，再做克隆，可克隆入完全正向连接的串联克隆；再次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链，可表达出PrP 核心片段的反义肽，可做反义肽方面的进一步探索。
有时候实验中出现串连并不是我们所期望的，如何避免串连，提高连接效率? 笔者做过这方面的探讨。具体如下：由于细菌在遗传上的不稳定性，在进行细菌操作时，应挑选多个菌落。在实验过程中曾经遇到pET-32a （+）Eco R Ⅰ位点由GAATTC 突变为GAATTA （已测序），造成连接以后连接产物的串联，就是由于在操作过程中挑选单个菌落造成的。
重组质粒构建通常使用酶切然后胶回收再连接、转化，最后进行阳性克隆鉴定的方法。但实验中经常遇到酶切操作困难和胶回收量低、转化效率低、串连等问题。特别是进行双酶切时，由于两个酶在通用buffer 中的效率不一致，琼脂糖凝胶电泳无法区分单酶切和双酶切，连接产物中可能混有大量的空载体，这样就会给阳性克隆筛选带来麻烦。还有可能由于过多的剧烈条件造成酶切产物个别核苷酸的丢失，还可造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。我们将重组质粒的构建方法略加改进，取得了良好的效果和重复性。具体操作介绍如下：
pET-32a （+）去RNA ，经溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、氯仿、乙醇沉淀。将pET-32a （+）与PCR 产物按1：20的比例混合，Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切2小时。酶切产物不进行任何形式的纯化，直接用1/10量连接2小时。连接产物立即转化E.coli DH5α，在含50 ug/ml AMP 的液体TB 培养基中过夜，收集细菌提取质粒、纯化。用pET-32a （+）多克隆位点上Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ之间已被双酶切去除的Sal Ⅰ位点对应酶Sal Ⅰ单酶切（图1－8），使pET-32a （+）空载体线性化。酶切产物转化E.coli BL-21，涂布含50 ug/ml AMP LB平板，挑单菌落进行菌落PCR ，筛选阳性克隆。转化E.coli BL-21之前也可进行阳性克隆富集。上述包含阳性克隆和pET-32a （+）空载体混合质粒，用Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切，乙醇回收去掉小片段， T4DNA连接酶连接反应体系同上。TSS 缓冲液转化E.coli BL-21（DE3）。（图1-7， 1-8）
图1-7 一种新的重组质粒构建方法
Fig.1-7 A new method for the contruction of recombinant plasmid
图1-8 pET-32a（+）多克隆位点
Fig. pET-32a（+） MCS
此方法具有很大的跳跃性，不需检测酶切是否完全，Sal Ⅰ单酶切使pET-32a （+）空载体线性化。E.coli BL-21的转化效率大约是E.coli DH5α的1/10（见《pET System Manual》22页），线性化pET-32a （+）比超螺旋质粒转化率低的多，线性化空载体转入E.coli BL-21的几率很小。经两次富集阳性克隆，菌落PCR 筛选阳性克隆率几乎100%。传统方法使用胶回收pET-32a （+）的浓度
很低，难于测定OD 260值，载体和PCR 产物比例不当很容易造成串联，本方法未
将载体和PCR 产物的酶切小片段去除，各粘性末端都有对应的酶切小片段，串联的几率降低到最小。所以连接时可以不加限制的增加PCR 产物的量，极大的提高了正确连接的效率。胶回收DNA ，可能由于剧烈条件造成酶切产物个别核苷酸的丢失，造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。本方法将胶回收DNA 步骤取消，降低质粒的错义突变和无义突变的几率。