柠檬酸发酵综述
摘要：柠檬酸是生物体的主要代谢产物之一，是目前由微生物发酵生产应用最为广泛、产量最高的有机酸。在自然界中的分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝等植物果实中，尤其以未成熟的含量最多。最早的柠檬酸是从柠檬中提取的，故称柠檬酸。柠檬酸具有令人愉悦的酸味，口感好，安全无毒，又是有机体的中间代谢产物，能被人体直接消化吸收，是食品工业最重要的酸味剂。同时其在药物、化妆品行业也有广泛的用途，柠檬酸还具有相当的保健功效，在洗涤方面也有广泛的用途。目前世界柠檬酸的产量已达一百多万吨，主要采用的是微生物发酵法来生产柠檬酸。本文通过查阅文献对柠檬酸的性质、用途以及其发酵生产工艺做简单的综述和总结，其中发酵生产工艺的研究包括发酵菌种的选育、培养条件的选择和产品分离提取的方法。 关键词：柠檬酸、发酵、深层发酵、钙盐法
Review of citric acid fermentation Abstract：Citric acid is one of the main metabolites of organisms, and it is the most widely used and the highest yield of organic acid production by microbial fermentation . Citric acid is widely distributed in nature, mainly in lemon, orange, pineapple and other plant fruits, especially in immature most content. The earliest citric acid is extracted from lemon, so it is called citric acid. Citric acid has a pleasant acidity, taste good, non-toxic, is an organism's intermediate metabolites, and can be directly digested and absorbed of by human body, is the most important sour agent. At the same time the drug, the cosmetics industry also has a wide range of uses, citric acid also has considerable health care effect, and it also has a wide use in the washing. At present the world production of citric acid has reached more than one hundred tons, mainly by microbial fermentation to produce citric acid.
The article mainly tells us the natures and uses of citric acid, and its fermentation production process, including fermentation production process and fermentation.
strains breeding, cultivation condition selection and product separation extraction method.
Keywords: citric acid, fermentation, deep fermentation, calcium salt method
一、 概述
1. 柠檬酸的性质
柠檬酸是一种重要的有机酸,又名枸橼酸。分子式为C6H8O7，相对分子质量为192.13，中文名称为3-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，无色晶体【1】,常含一分子结晶水,无臭,有很强的酸味,易溶于水、乙醇、乙醚，不溶于苯、微溶于氯仿。其水溶液显酸性。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H可以电离热可以分解成多种产物与酸、碱、甘油等发生反应。
2. 柠檬酸的用途
（1）食品工业
因为柠檬酸有温和爽快的酸味，普遍用于各种饮料、汽水、葡萄酒、糖果、点心、饼干、罐头果汁、乳制品等食品的制造。在所有有机酸的市场中，柠檬酸市场占有率 70%以上，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂。 一分子结晶水柠檬酸主要用作清凉饮料、果汁、果酱、水果糖和罐头等的酸性调味剂，也可用作食用油的抗氧化剂。同时改善食品的感官性状，增强食欲和促进体内钙、磷物质的消化吸收。【2-6】
（2）药物
柠檬酸可以与水中的的碳酸盐作用生成二氧化碳和柠檬酸盐，有助于药物有效成分的快速溶解，还可增加某些泻药和麻醉药的溶解作用，并可以改善口味。柠檬酸盐还是血液的抗凝剂
（3）化妆品 作为果酸的一种，主要作用是加快角质更新，常用于乳液、乳霜、洗发精、美白用品、抗老化用品、青春痘用品等。角质的更新有助于皮肤的中黑色素的剥落，毛孔的收细，黑头的溶解等。每天早晨喝一杯热柠水的习惯，柠檬汁的份量以半只柠檬为宜。这会使眼睛更有神、皮肤更红润
（4）洗涤剂 【7】【14】+。 。
采用柠檬酸或柠檬酸盐类作助洗剂，可改善洗涤产品的性能，可以迅速沉淀金属离子，防止污染物重新附着在织物上，保持洗涤必要的碱性;使污垢和灰分散和悬浮;提高表面活性剂的性能，是一种优良的鳌合剂。
（5）其他工业用途
二氧化硫吸收剂，油井处理剂、纺织助剂、金属清洁剂、烟草添加剂和废水处理剂等。最近，柠檬酸酯增塑剂作为新型无毒环境友好产品,对环境保护、资源可持续发展方面具有深远的影响。
3．柠檬酸工业化生产的研究历程
1784年瑞典化学家Scheel首次从柠檬汁中提取柠檬酸并结晶出固体。1860年意大利开始从果汁中用添加石灰乳的方法得到柠檬酸，从而实现了柠檬酸的工业化生产。1916年美国化学家Currie等发现多种黑曲霉菌株能产生柠檬酸。1923年Pfizer公司开始采用黑曲霉浅盘发酵法工业化生产柠檬酸，原料主要使用糖蜜。1952年美国的Miles公司采用液体深层发酵法，采用机械搅拌通风式发酵罐，通入无菌空气，可以有效的缩短发酵周期，从而实现了柠檬酸的工业化生产，其比传统的浅盘发酵工艺在许多方面都体现了巨大的优越性，从而推动了整个世界柠檬酸发酵法生产工业的迅速发展。
我国1967年在黑龙江和平糖厂建立了第一个柠檬酸生产车间，以甜菜蜜饯为原料，浅盘发酵，钙盐离交提取。1968年上海酵母厂首先以淀粉为原料深层发酵柠檬酸获得成功。20世纪70年代中期到20世纪80年代是我国柠檬酸菌种选育的高峰期，先后培育了5代薯干原料高产菌株和适应淀粉、木薯、葡萄糖母液、蜜糖等原料的优良菌株，提高了柠檬酸行业的整体水平，特别是在缩短发酵周期、提高单产方面成绩突出，使我国的柠檬酸发酵技术处于世界领先地位【8】
二、柠檬酸发酵菌种的选育
能够在正常的培养基中合成并分泌柠檬酸的微生物种类很多,目前用于工业化生产的只有黑曲霉，因为其柠檬酸的产量最高，而且有较强的淀粉水解能力，可以利用多样化的碳源。1965年上海市工业微生物研究所以“泸轻二号”为出发菌, 用氮芥诱变筛选出我国首次薯干深层工业化发酵菌株N558,1990年完成国家“七五”攻关项目-精淀粉深层发酵生产柠檬酸, 筛选出Co860菌种发酵产酸达20%, 转化率95%, 周期95h, 应用于工业化生产。目前我国大多数工厂仍采用以上两菌种不仅产酸率高, 而且适应于粗放的发酵底物和生产工艺。
Anita Rywinska【16】等研究利用解脂耶氏酵母酵母菌(Y. lipolytica)在20%的甘油中连续发酵1350h,平均产酸达25%。
2.1柠檬酸产生菌的筛选
柠檬酸生产菌的分离筛选与其他微生物相同，一是收集相当数量的现有菌种，经分离纯化，从中挑选出合适的菌株；二是从自然界中采集大量的含菌样品，分离筛选出优良菌种。若收集现有菌种则可直接活化、分离、纯化，并测定每个菌株的性能，从中选出最优良的菌株；若是通过采集含菌样品来分离选育，可根据糖质发酵柠檬酸高产菌主要是黑曲霉，它们具有强大的分解淀粉、蛋白质、果胶、脂肪等物质的酶系特征，可从腐烂植物、水果表皮，也可从含有腐烂未热水果的酸性土壤中分离。一般将采集的含菌样品经适当的增殖培养，或将样品浸出稀释液100mL和10％薯干粉、10％柠檬酸混合．在振荡摇床上于33—35℃下“富集”培养3—5d，然后进行分离筛选。
2.2柠檬酸产生菌的诱变育种
从自然界分离得到的产柠檬酸菌株一般都需要经过诱变育种才能获得高产菌株。各种化学诱变剂（如亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、甲基磺酸乙酯等）和物理诱变因子（如紫外线，X射线、Co等）是最常见的诱变剂。目前国内普遍使用的柠檬酸产生菌株Co827菌株生产上产柠檬酸13%以上，糖酸转化率为95%以上【9】。
三、柠檬酸发酵工艺的研究
柠檬酸的生产方法主要是从天然植物中提取和生物发酵法两种, 目前以发酵法生产柠檬酸为主【13】。由于所用的菌种、原料和其他生产条件不同，生产方法也不一样。工业生产方法主要有表面发酵法、固体发酵和液体发酵。目前我国柠檬酸的工业化生产都是采用液体深层发酵工艺。
3.1发酵的原料
我国柠檬酸发酵使用的原料非常广泛，选择的原则是价格便宜、因地制宜。通常有淀粉、薯干、玉米、葡萄糖糖浆、蜜糖、纤维素水解糖液等。原料不同其处理方法也不同，发酵工艺也不同。对于淀粉质原料可以直接发酵，也可以经过液化、糖化后制备出淀粉葡萄糖液，再用于发酵培养基的配制。玉米淀粉由于含有较高的蛋白质，通常可以和甘薯粉、淀粉等蛋白质含量低的原料混合在一起使用【10】。
3.2发酵培养基的配制
黑曲霉柠檬酸产生菌是化能异养微生物，只能利用有机碳源。为了满足黑曲霉菌的生长、繁殖，必须提供足量的碳源、氮源和无机盐．使培养基中的化学物质元素组成和菌体物质元素组成相当。但要使黑曲霉柠檬酸产生菌大量生
成和积累柠檬酸，必须控制营养物质的供给，使菌体生长受限制，处于半“饥饿”和代谢失调状态。
依据柠檬酸发酵机制，黑曲霉大量生成和积累柠檬酸的基本条件，是提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，而对磷、锰、铁、锌等无机盐物质的要求则处于低水平。
（1）碳源
目前都认为高糖浓度是柠檬酸发酵的一大特征。我国采用薯干粉的深层发酵，粉浆浓度为16％～20％，若采用淀粉质的深层发酵粉浆浓度可达25％。
（2）氮源
氮源的主要作用是提供微生物细胞生长所需要的物质，主要是蛋白质、氨基酸、核酸、微生物等，并参与微生物的代谢调节与控制。有利于柠檬酸生成与积累。
生理酸性氮： (NH4)2SO4， (NH4)3PO4， (NH4)2HPO4
生理碱性氮： NaNO3．KN03
两性氮：NH4NO3
有机氮： 麸皮、米糠、蛋白陈、氨基酸、尿素等。
经试验证明，黑曲霉偏好于无机氮，当有机氮和无机氮同时存在时，它首先利用无机氮。在无机氮中，生理酸性氮比碱性氮好，这是因为生理酸性氮中的铵离子被利用后，使培养基变酸，可以使发酵中的黑曲霉生长阶段结束，转入产酸阶段，PH下降到较低水平有利于柠檬酸的积累。
（3）无机盐
无机盐是构成微生物生命活动不可缺少的物质。在柠檬酸发酵中，有的无机盐构成菌体，有的促进代谢，有的促进产酸，因此对黑曲霉的生长和柠檬酸发酵具有重要的作用。采用薯干粉、马铃薯、木薯和糖蜜等原料发酵，原料中所含的P、K、Mg、S的量已经足够黑曲霉的生长，不需专门添加。
3.3发酵条件及其控制
（1）温度控制
黑曲霉最适生长温度33～37℃，通常深层液体发酵温度低于28℃时导致菌体增殖缓慢，产酸速率较低，发酵周期延长。而高于37℃时会导致菌体增殖过量，而且杂酸生成量过多，不但影响糖酸转化率，也不利于柠檬酸的提取【10】。
（2）pH值控制
pH值对微生物发酵的影响主要涉及微生物的生长代谢、底物的电离状态、产物的合成以及细胞膜的带电状态等。在柠檬酸的发酵过程中，在菌体生长期即发酵前期，pH维持在4.5左右，而在柠檬酸积累时期，即产酸期的最适
pH2.0～3.0。在产酸期，当发酵液PH达到3.0以上时，其代谢途径发生变化，草酸合成量增加，当发酵液的pH值达到5.0以上时，由于葡萄糖氧化酶活性增强，则葡萄糖酸的生物合成加强，在pH3.0以下是柠檬酸积累的最佳条件。以薯干为原料直接发酵生产柠檬酸时，黑曲霉柠檬酸产生菌的酸性糖化酶的最适作用pH为4.0～4.6【11】。
(3)溶解氧的控制
氧气在黑曲霉的发酵过程中有着重要的意义，在其生长、繁殖以及产酸的过程中均强烈的需氧。
在黑曲霉生长、繁殖期，氧气的作用是保证菌体正常呼吸，使葡萄糖彻底氧化成二氧化碳和水，产生大量的ＡＴＰ，并合成菌体生长所需的各种物质。
在柠檬酸的合成期，氧是生物合成柠檬酸所需要的底物之一，可以由葡萄糖生成柠檬酸。
研究表明柠檬酸在不同的发酵时期，对氧气的需求有较大的差别。菌体增殖期由于生长得呼吸作用消耗大量的氧气，特别是在菌体的对数生长期，需氧量达到最高峰，进入产酸期以后，氧的消耗率立即降到一个较低的水平，并一直持续到发酵终了，因此在发酵过程中应该分段控制通氧量。前期采用较大的通风量，产酸期适当的降到通风量【12】。
3.4柠檬酸深层发酵工艺流程
柠檬酸发酵生产分深层发酵法、固体发酵法和液体表面发酵法。其中深层发酵法是柠檬酸发酵生产的主要方法。其主要生产流程如下图所示。
四、产品的分离提取
成熟的柠檬酸发酵醪中，除含有主产物柠檬酸之外，还含有纤维、菌体、有机杂酸、糖、蛋白类胶体物质、色素、矿物质及其他代谢产物等杂质，它们或来自于发酵原料、或在发酵过程中产生，它们或溶存或悬浮于发酵醪中。通过各种理化方法，清除这些杂质，得到符合各级质量标准的柠檬酸产品的全过程即为柠檬酸的分离提取。目前我国的柠檬酸分离提取主要采用钙盐离子交换法、溶剂萃取法、全离子交换法、连续离子交换法、色谱离子交换法、电渗析法和直接提取法，其中最常用的是钙盐离子交换法
钙盐离子交换法的主要工艺流程如下【15】【13】。 ：
4.1发酵醪预处理
预处理的目的是为柠檬酸的提取工作创造一个好的条件。柠檬酸发酵醪预处理主要是将新鲜成熟发酵液进行热处理，热处理温度为75—90℃，时间宜短不宜长。热处理具有以下几个作用：
(1)及时热处理可杀灭柠檬酸产生菌和杂菌，终止发酵，防止柠檬酸被代谢分解；
(2)使蛋白质变性而絮凝，破坏了胶体，降低了料液粘度，利于过滤；
(3)可使菌体中的柠檬酸部分释放出来。
但热处理要注意以下两个问题；
①温度过高和受热时间过长，会使菌体破裂而自溶，释放出蛋白质，反而使料液粘度增加，颜色变褐，不利于净化；
②过长时间的直接蒸汽加热，会增加料液稀释度，有损于收率(最好间接加热)。
深层法发酵醪可在发酵罐内间接或直接加热．或在过滤加压罐中加热，或用换热器间接加热，或在输送过程中用混合式加热器加热，但不能破坏菌球体，否则影响过滤。
4.2发酵醪过滤
过滤的主要目的是彻底除去发酵醪中的悬浮物；除去发酵醪中的草酸；尽可能减少滤液的稀释度；把柠檬酸的损失减少到最低限度。
以粗粮为原料发酵，醪液含渣量较多，基本上都采用加压式过滤机；采用淀粉水解为原料，发酵液过滤多采用带式过滤机，滤液的复率（含除草酸）采用预涂层真空转鼓过滤机。
发酵液中的有机杂酸主要是草酸和葡萄糖酸，它们都能形成钙盐沉淀，但后者的溶解度较低，故可在中和前除去，后者溶解度高，中和之后绝大部分在废水中排除。利用草酸钙溶解度低于硫酸钙的原理，再一次滤液中加入硫酸钙，使其生产草酸钙，在一次滤液复滤时，一并除去。
4.3中和
中和的主要目的是从发酵清滤液中提取高纯度的四水柠檬酸钙；柠檬酸钙要易过滤和洗涤；废水中柠檬酸钙沉淀要限制在最低程度；尽可能减少洗糖水量，把柠檬酸钙的溶损减少到允许范围。
中和的原理是基于在一定温度和PH条件下四水柠檬酸钙Ca3(C6H5O7)2·4H2O在水中溶解度极小的特性，用钙盐或钙碱与溶液中的柠檬酸发生中和反应，产生四水柠檬酸钙从溶液中沉淀析出，除去残液得到柠檬酸钙固体。所用的中和剂有CaCO3、Ca(0H)2的浆乳。
4.4酸解
酸解的主要目的是把柠檬酸钙完全分解为柠檬酸和石膏；石膏渣中的柠檬酸含量减少到允许程度；尽可能提高酸解液中柠檬酸含量；控制酸解液中的SO42-在适当范围之内；酸解液中的石膏微粒要降低到最低限度。
酸解原理是利用柠檬酸钙在酸性条件下，其解离常数随H+浓度的增高而增大的特性．在强酸(硫酸)存在的溶液中产生复分解反应，生成难溶于水的石膏(CaSO4)沉淀，而将弱酸(柠檬酸)游离出来，溶存于溶液中，即利用在一定温度条件下．CaSO4·2H20溶解度低于Ca3(C6H5O7)2·4H2O的溶解度的原理，加H2SO4产生复分解反应，将柠檬酸从柠檬酸钙中分离出来，然后分出硫酸钙(石膏)得到粗柠檬酸溶液(酸解液)。
4.5净化
净化的主要目的是除去酸解液中的色素；除去酸解液中的Ca2+、Mg2+、Fe3+等阳离子和SO42- 、Cl-等阴离子；尽可能提高净化柠檬酸液的浓度；把柠檬酸的损失降低到允许范围；把再生剂和水的消耗降到最低限度。
4.6蒸发
蒸发的主要目的是及时地将柠檬酸净化液蒸发（浓缩）至规定浓度，为结晶工序及时供料；保证浓缩液质量；把蒸汽消耗、柠檬酸流损降低到允许范围。
4.7结晶
本工序的主要目标及时地从柠檬酸浓缩液中结晶出品体并分出母液；湿柠檬酸晶体要粒度均匀，理化指标符合等级标准，游离水含量尽可能低；保持较高的结晶牢率和结晶收率；防止母液被污染和稀释。
4.8干燥
本工序的主要目标及时将来自离心机的湿柠檬酸晶体的游离水除去并筛分、包装，获得符合等级标准的柠檬酸产品；防止柠檬酸晶体结块或融熔及污染；及时处理等外品和捕集器中的物科，把损耗降低到允许范围；准确掌握干燥段和冷却段的风温和空气质量。
钙盐法具有产品质量稳定，操作衙便，原料易得，设备简单，工艺成熟等优点。但同时也具有单元操作多，劳动强度大，环境污染和腐蚀现象严重，提取率低等缺点。考虑到这种方法的不适性袁许多研究者将目光投向了寻找低能耗少投入低无污染劳动强度低及高收益的提取工艺上。
五、总结与展望
我国的柠檬酸工业面临着机遇与困难并存的现状。在2007年9月, 国家发改委出台《关于促进玉米粉深加工工业健康发展的指导意见》提出,“十一五”期间玉米加工结构是提高淀粉多糖, 多元醇等国内供应不足产品的供给, 稳定以玉米为原料的普通淀粉生产, 控制发展味精等国内供需基本平衡和供大于求的产品, 限制以玉米为原料的柠檬酸赖氨酸等供大于求, 出口导向型产品, 以及以玉米为原料的食用酒精和工业酒精行业。此政策极大的限制了柠檬酸行业未来的发展, 当前开发新的发酵原料成为柠檬酸研究者的一个新的课题。其次, 随着发酵罐的广泛应用, 发酵罐与落后的手工麸曲制备孢子矛盾越来越突出,如何实现麸曲制备工业化, 直接用孢子粉是多年未解的难题。目前最为理想的是以固态发酵改变落后的麸曲制备工艺。第三, 现在的玉米粉原料发酵也只能算是半清夜发酵, 为了提供发酵的氮源要将一定比例的玉米粉直接加入发酵罐中, 由于考虑到发酵液的粘度不能过大, 防止影响溶氧, 总糖浓度无法调高, 产酸率不会太高, 可以考虑发酵后期追加料的方法提高产酸。第四, 拟柠檬酸发酵过程是一个严重的非线性, 时变性,无参数化模型的生化反应过程, 发酵过程释放热量, 在不同时段产生热量的速度不同, 因此温度控制显得极为重要, 目前我国的柠檬酸生产温度控制大多采用手动控制, 主要通过调节冷却水流量以满足生产工艺要求, 这不仅控制效果差, 精密度低, 反应速度慢, 而且直接影响产品的产量和质量, 因此研究温度自动控制系统具有重大的意义。 参考文献
[1]姜成林,徐丽华.微生物资源开发利用[M].北京：中国轻工业出版社，2001.4，74
[2]朱亨政 ．柠像酸发酵，食品与发酵工业，1994(6)：69—74
[3]馀洁 ．工业微生物基础及其应用，科学出版社，t991，199一205
[4] B． 持金森F．马维图纳，生化工程学生物技术手册(上册)。科学出版社．1992。3G2—363
[5]字佐美昭次,桶村光太郎,发酵工业,1985，43(1)1O32—1042
[6]徐积恩 ．柠檬酸生产的发展趋势，食品饲料添加剂信息 1994(5)：16—21
[7]姜锡瑞 ．酶制剂应用技术，中国轻工业出版社,1996,235
[8]程殿林. 微生物工程技术原理，北京：化学工业出版社，2007.7，222-223
[9]储炬，李友荣.微生物工艺学，上海:华东理工大学出版社，2008.3,180
[10]程殿林.微生物工程技术技术原理，北京：化学工业出版社，007.7,228-
230
[11]李维平.生物工艺学，北京：科学出版社，2010.2,65-72
[12]陈可可,张香兰,朱宏涛,等.曲霉属真菌在柠檬酸发酵中的作用[J].云南植
物研究,2008,30(5):624-628
[13]郭兴凤, 瑞宝, 谷文英,等.菜籽蛋白的酶水解- 复合风味蛋白酶水解条件
的研究[ J] .粮油食品科技, 2001,9(2) :32-34.
[14]衣良，谢光亮.柠檬酸钠抗凝剂防止血细胞聚集[J].上海医学检验杂表，
1995:10(2):121
[15]金其荣，有机酸发酵工艺学，北京：轻工业出版社，1985
[16] Anita Rywinska. Waldemar High-yield production of citric
acid by Yarrowia lipolytica on glycerol in repeated-batch
bioreact ors [J].Microbiol Biotechnol, 2010(37):431435.
柠檬酸发酵综述
摘要：柠檬酸是生物体的主要代谢产物之一，是目前由微生物发酵生产应用最为广泛、产量最高的有机酸。在自然界中的分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝等植物果实中，尤其以未成熟的含量最多。最早的柠檬酸是从柠檬中提取的，故称柠檬酸。柠檬酸具有令人愉悦的酸味，口感好，安全无毒，又是有机体的中间代谢产物，能被人体直接消化吸收，是食品工业最重要的酸味剂。同时其在药物、化妆品行业也有广泛的用途，柠檬酸还具有相当的保健功效，在洗涤方面也有广泛的用途。目前世界柠檬酸的产量已达一百多万吨，主要采用的是微生物发酵法来生产柠檬酸。本文通过查阅文献对柠檬酸的性质、用途以及其发酵生产工艺做简单的综述和总结，其中发酵生产工艺的研究包括发酵菌种的选育、培养条件的选择和产品分离提取的方法。 关键词：柠檬酸、发酵、深层发酵、钙盐法
Review of citric acid fermentation Abstract：Citric acid is one of the main metabolites of organisms, and it is the most widely used and the highest yield of organic acid production by microbial fermentation . Citric acid is widely distributed in nature, mainly in lemon, orange, pineapple and other plant fruits, especially in immature most content. The earliest citric acid is extracted from lemon, so it is called citric acid. Citric acid has a pleasant acidity, taste good, non-toxic, is an organism's intermediate metabolites, and can be directly digested and absorbed of by human body, is the most important sour agent. At the same time the drug, the cosmetics industry also has a wide range of uses, citric acid also has considerable health care effect, and it also has a wide use in the washing. At present the world production of citric acid has reached more than one hundred tons, mainly by microbial fermentation to produce citric acid.
The article mainly tells us the natures and uses of citric acid, and its fermentation production process, including fermentation production process and fermentation.
strains breeding, cultivation condition selection and product separation extraction method.
Keywords: citric acid, fermentation, deep fermentation, calcium salt method
一、 概述
1. 柠檬酸的性质
柠檬酸是一种重要的有机酸,又名枸橼酸。分子式为C6H8O7，相对分子质量为192.13，中文名称为3-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，无色晶体【1】,常含一分子结晶水,无臭,有很强的酸味,易溶于水、乙醇、乙醚，不溶于苯、微溶于氯仿。其水溶液显酸性。柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H可以电离热可以分解成多种产物与酸、碱、甘油等发生反应。
2. 柠檬酸的用途
（1）食品工业
因为柠檬酸有温和爽快的酸味，普遍用于各种饮料、汽水、葡萄酒、糖果、点心、饼干、罐头果汁、乳制品等食品的制造。在所有有机酸的市场中，柠檬酸市场占有率 70%以上，到目前还没有一种可以取代柠檬酸的酸味剂。 一分子结晶水柠檬酸主要用作清凉饮料、果汁、果酱、水果糖和罐头等的酸性调味剂，也可用作食用油的抗氧化剂。同时改善食品的感官性状，增强食欲和促进体内钙、磷物质的消化吸收。【2-6】
（2）药物
柠檬酸可以与水中的的碳酸盐作用生成二氧化碳和柠檬酸盐，有助于药物有效成分的快速溶解，还可增加某些泻药和麻醉药的溶解作用，并可以改善口味。柠檬酸盐还是血液的抗凝剂
（3）化妆品 作为果酸的一种，主要作用是加快角质更新，常用于乳液、乳霜、洗发精、美白用品、抗老化用品、青春痘用品等。角质的更新有助于皮肤的中黑色素的剥落，毛孔的收细，黑头的溶解等。每天早晨喝一杯热柠水的习惯，柠檬汁的份量以半只柠檬为宜。这会使眼睛更有神、皮肤更红润
（4）洗涤剂 【7】【14】+。 。
采用柠檬酸或柠檬酸盐类作助洗剂，可改善洗涤产品的性能，可以迅速沉淀金属离子，防止污染物重新附着在织物上，保持洗涤必要的碱性;使污垢和灰分散和悬浮;提高表面活性剂的性能，是一种优良的鳌合剂。
（5）其他工业用途
二氧化硫吸收剂，油井处理剂、纺织助剂、金属清洁剂、烟草添加剂和废水处理剂等。最近，柠檬酸酯增塑剂作为新型无毒环境友好产品,对环境保护、资源可持续发展方面具有深远的影响。
3．柠檬酸工业化生产的研究历程
1784年瑞典化学家Scheel首次从柠檬汁中提取柠檬酸并结晶出固体。1860年意大利开始从果汁中用添加石灰乳的方法得到柠檬酸，从而实现了柠檬酸的工业化生产。1916年美国化学家Currie等发现多种黑曲霉菌株能产生柠檬酸。1923年Pfizer公司开始采用黑曲霉浅盘发酵法工业化生产柠檬酸，原料主要使用糖蜜。1952年美国的Miles公司采用液体深层发酵法，采用机械搅拌通风式发酵罐，通入无菌空气，可以有效的缩短发酵周期，从而实现了柠檬酸的工业化生产，其比传统的浅盘发酵工艺在许多方面都体现了巨大的优越性，从而推动了整个世界柠檬酸发酵法生产工业的迅速发展。
我国1967年在黑龙江和平糖厂建立了第一个柠檬酸生产车间，以甜菜蜜饯为原料，浅盘发酵，钙盐离交提取。1968年上海酵母厂首先以淀粉为原料深层发酵柠檬酸获得成功。20世纪70年代中期到20世纪80年代是我国柠檬酸菌种选育的高峰期，先后培育了5代薯干原料高产菌株和适应淀粉、木薯、葡萄糖母液、蜜糖等原料的优良菌株，提高了柠檬酸行业的整体水平，特别是在缩短发酵周期、提高单产方面成绩突出，使我国的柠檬酸发酵技术处于世界领先地位【8】
二、柠檬酸发酵菌种的选育
能够在正常的培养基中合成并分泌柠檬酸的微生物种类很多,目前用于工业化生产的只有黑曲霉，因为其柠檬酸的产量最高，而且有较强的淀粉水解能力，可以利用多样化的碳源。1965年上海市工业微生物研究所以“泸轻二号”为出发菌, 用氮芥诱变筛选出我国首次薯干深层工业化发酵菌株N558,1990年完成国家“七五”攻关项目-精淀粉深层发酵生产柠檬酸, 筛选出Co860菌种发酵产酸达20%, 转化率95%, 周期95h, 应用于工业化生产。目前我国大多数工厂仍采用以上两菌种不仅产酸率高, 而且适应于粗放的发酵底物和生产工艺。
Anita Rywinska【16】等研究利用解脂耶氏酵母酵母菌(Y. lipolytica)在20%的甘油中连续发酵1350h,平均产酸达25%。
2.1柠檬酸产生菌的筛选
柠檬酸生产菌的分离筛选与其他微生物相同，一是收集相当数量的现有菌种，经分离纯化，从中挑选出合适的菌株；二是从自然界中采集大量的含菌样品，分离筛选出优良菌种。若收集现有菌种则可直接活化、分离、纯化，并测定每个菌株的性能，从中选出最优良的菌株；若是通过采集含菌样品来分离选育，可根据糖质发酵柠檬酸高产菌主要是黑曲霉，它们具有强大的分解淀粉、蛋白质、果胶、脂肪等物质的酶系特征，可从腐烂植物、水果表皮，也可从含有腐烂未热水果的酸性土壤中分离。一般将采集的含菌样品经适当的增殖培养，或将样品浸出稀释液100mL和10％薯干粉、10％柠檬酸混合．在振荡摇床上于33—35℃下“富集”培养3—5d，然后进行分离筛选。
2.2柠檬酸产生菌的诱变育种
从自然界分离得到的产柠檬酸菌株一般都需要经过诱变育种才能获得高产菌株。各种化学诱变剂（如亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、甲基磺酸乙酯等）和物理诱变因子（如紫外线，X射线、Co等）是最常见的诱变剂。目前国内普遍使用的柠檬酸产生菌株Co827菌株生产上产柠檬酸13%以上，糖酸转化率为95%以上【9】。
三、柠檬酸发酵工艺的研究
柠檬酸的生产方法主要是从天然植物中提取和生物发酵法两种, 目前以发酵法生产柠檬酸为主【13】。由于所用的菌种、原料和其他生产条件不同，生产方法也不一样。工业生产方法主要有表面发酵法、固体发酵和液体发酵。目前我国柠檬酸的工业化生产都是采用液体深层发酵工艺。
3.1发酵的原料
我国柠檬酸发酵使用的原料非常广泛，选择的原则是价格便宜、因地制宜。通常有淀粉、薯干、玉米、葡萄糖糖浆、蜜糖、纤维素水解糖液等。原料不同其处理方法也不同，发酵工艺也不同。对于淀粉质原料可以直接发酵，也可以经过液化、糖化后制备出淀粉葡萄糖液，再用于发酵培养基的配制。玉米淀粉由于含有较高的蛋白质，通常可以和甘薯粉、淀粉等蛋白质含量低的原料混合在一起使用【10】。
3.2发酵培养基的配制
黑曲霉柠檬酸产生菌是化能异养微生物，只能利用有机碳源。为了满足黑曲霉菌的生长、繁殖，必须提供足量的碳源、氮源和无机盐．使培养基中的化学物质元素组成和菌体物质元素组成相当。但要使黑曲霉柠檬酸产生菌大量生
成和积累柠檬酸，必须控制营养物质的供给，使菌体生长受限制，处于半“饥饿”和代谢失调状态。
依据柠檬酸发酵机制，黑曲霉大量生成和积累柠檬酸的基本条件，是提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，而对磷、锰、铁、锌等无机盐物质的要求则处于低水平。
（1）碳源
目前都认为高糖浓度是柠檬酸发酵的一大特征。我国采用薯干粉的深层发酵，粉浆浓度为16％～20％，若采用淀粉质的深层发酵粉浆浓度可达25％。
（2）氮源
氮源的主要作用是提供微生物细胞生长所需要的物质，主要是蛋白质、氨基酸、核酸、微生物等，并参与微生物的代谢调节与控制。有利于柠檬酸生成与积累。
生理酸性氮： (NH4)2SO4， (NH4)3PO4， (NH4)2HPO4
生理碱性氮： NaNO3．KN03
两性氮：NH4NO3
有机氮： 麸皮、米糠、蛋白陈、氨基酸、尿素等。
经试验证明，黑曲霉偏好于无机氮，当有机氮和无机氮同时存在时，它首先利用无机氮。在无机氮中，生理酸性氮比碱性氮好，这是因为生理酸性氮中的铵离子被利用后，使培养基变酸，可以使发酵中的黑曲霉生长阶段结束，转入产酸阶段，PH下降到较低水平有利于柠檬酸的积累。
（3）无机盐
无机盐是构成微生物生命活动不可缺少的物质。在柠檬酸发酵中，有的无机盐构成菌体，有的促进代谢，有的促进产酸，因此对黑曲霉的生长和柠檬酸发酵具有重要的作用。采用薯干粉、马铃薯、木薯和糖蜜等原料发酵，原料中所含的P、K、Mg、S的量已经足够黑曲霉的生长，不需专门添加。
3.3发酵条件及其控制
（1）温度控制
黑曲霉最适生长温度33～37℃，通常深层液体发酵温度低于28℃时导致菌体增殖缓慢，产酸速率较低，发酵周期延长。而高于37℃时会导致菌体增殖过量，而且杂酸生成量过多，不但影响糖酸转化率，也不利于柠檬酸的提取【10】。
（2）pH值控制
pH值对微生物发酵的影响主要涉及微生物的生长代谢、底物的电离状态、产物的合成以及细胞膜的带电状态等。在柠檬酸的发酵过程中，在菌体生长期即发酵前期，pH维持在4.5左右，而在柠檬酸积累时期，即产酸期的最适
pH2.0～3.0。在产酸期，当发酵液PH达到3.0以上时，其代谢途径发生变化，草酸合成量增加，当发酵液的pH值达到5.0以上时，由于葡萄糖氧化酶活性增强，则葡萄糖酸的生物合成加强，在pH3.0以下是柠檬酸积累的最佳条件。以薯干为原料直接发酵生产柠檬酸时，黑曲霉柠檬酸产生菌的酸性糖化酶的最适作用pH为4.0～4.6【11】。
(3)溶解氧的控制
氧气在黑曲霉的发酵过程中有着重要的意义，在其生长、繁殖以及产酸的过程中均强烈的需氧。
在黑曲霉生长、繁殖期，氧气的作用是保证菌体正常呼吸，使葡萄糖彻底氧化成二氧化碳和水，产生大量的ＡＴＰ，并合成菌体生长所需的各种物质。
在柠檬酸的合成期，氧是生物合成柠檬酸所需要的底物之一，可以由葡萄糖生成柠檬酸。
研究表明柠檬酸在不同的发酵时期，对氧气的需求有较大的差别。菌体增殖期由于生长得呼吸作用消耗大量的氧气，特别是在菌体的对数生长期，需氧量达到最高峰，进入产酸期以后，氧的消耗率立即降到一个较低的水平，并一直持续到发酵终了，因此在发酵过程中应该分段控制通氧量。前期采用较大的通风量，产酸期适当的降到通风量【12】。
3.4柠檬酸深层发酵工艺流程
柠檬酸发酵生产分深层发酵法、固体发酵法和液体表面发酵法。其中深层发酵法是柠檬酸发酵生产的主要方法。其主要生产流程如下图所示。
四、产品的分离提取
成熟的柠檬酸发酵醪中，除含有主产物柠檬酸之外，还含有纤维、菌体、有机杂酸、糖、蛋白类胶体物质、色素、矿物质及其他代谢产物等杂质，它们或来自于发酵原料、或在发酵过程中产生，它们或溶存或悬浮于发酵醪中。通过各种理化方法，清除这些杂质，得到符合各级质量标准的柠檬酸产品的全过程即为柠檬酸的分离提取。目前我国的柠檬酸分离提取主要采用钙盐离子交换法、溶剂萃取法、全离子交换法、连续离子交换法、色谱离子交换法、电渗析法和直接提取法，其中最常用的是钙盐离子交换法
钙盐离子交换法的主要工艺流程如下【15】【13】。 ：
4.1发酵醪预处理
预处理的目的是为柠檬酸的提取工作创造一个好的条件。柠檬酸发酵醪预处理主要是将新鲜成熟发酵液进行热处理，热处理温度为75—90℃，时间宜短不宜长。热处理具有以下几个作用：
(1)及时热处理可杀灭柠檬酸产生菌和杂菌，终止发酵，防止柠檬酸被代谢分解；
(2)使蛋白质变性而絮凝，破坏了胶体，降低了料液粘度，利于过滤；
(3)可使菌体中的柠檬酸部分释放出来。
但热处理要注意以下两个问题；
①温度过高和受热时间过长，会使菌体破裂而自溶，释放出蛋白质，反而使料液粘度增加，颜色变褐，不利于净化；
②过长时间的直接蒸汽加热，会增加料液稀释度，有损于收率(最好间接加热)。
深层法发酵醪可在发酵罐内间接或直接加热．或在过滤加压罐中加热，或用换热器间接加热，或在输送过程中用混合式加热器加热，但不能破坏菌球体，否则影响过滤。
4.2发酵醪过滤
过滤的主要目的是彻底除去发酵醪中的悬浮物；除去发酵醪中的草酸；尽可能减少滤液的稀释度；把柠檬酸的损失减少到最低限度。
以粗粮为原料发酵，醪液含渣量较多，基本上都采用加压式过滤机；采用淀粉水解为原料，发酵液过滤多采用带式过滤机，滤液的复率（含除草酸）采用预涂层真空转鼓过滤机。
发酵液中的有机杂酸主要是草酸和葡萄糖酸，它们都能形成钙盐沉淀，但后者的溶解度较低，故可在中和前除去，后者溶解度高，中和之后绝大部分在废水中排除。利用草酸钙溶解度低于硫酸钙的原理，再一次滤液中加入硫酸钙，使其生产草酸钙，在一次滤液复滤时，一并除去。
4.3中和
中和的主要目的是从发酵清滤液中提取高纯度的四水柠檬酸钙；柠檬酸钙要易过滤和洗涤；废水中柠檬酸钙沉淀要限制在最低程度；尽可能减少洗糖水量，把柠檬酸钙的溶损减少到允许范围。
中和的原理是基于在一定温度和PH条件下四水柠檬酸钙Ca3(C6H5O7)2·4H2O在水中溶解度极小的特性，用钙盐或钙碱与溶液中的柠檬酸发生中和反应，产生四水柠檬酸钙从溶液中沉淀析出，除去残液得到柠檬酸钙固体。所用的中和剂有CaCO3、Ca(0H)2的浆乳。
4.4酸解
酸解的主要目的是把柠檬酸钙完全分解为柠檬酸和石膏；石膏渣中的柠檬酸含量减少到允许程度；尽可能提高酸解液中柠檬酸含量；控制酸解液中的SO42-在适当范围之内；酸解液中的石膏微粒要降低到最低限度。
酸解原理是利用柠檬酸钙在酸性条件下，其解离常数随H+浓度的增高而增大的特性．在强酸(硫酸)存在的溶液中产生复分解反应，生成难溶于水的石膏(CaSO4)沉淀，而将弱酸(柠檬酸)游离出来，溶存于溶液中，即利用在一定温度条件下．CaSO4·2H20溶解度低于Ca3(C6H5O7)2·4H2O的溶解度的原理，加H2SO4产生复分解反应，将柠檬酸从柠檬酸钙中分离出来，然后分出硫酸钙(石膏)得到粗柠檬酸溶液(酸解液)。
4.5净化
净化的主要目的是除去酸解液中的色素；除去酸解液中的Ca2+、Mg2+、Fe3+等阳离子和SO42- 、Cl-等阴离子；尽可能提高净化柠檬酸液的浓度；把柠檬酸的损失降低到允许范围；把再生剂和水的消耗降到最低限度。
4.6蒸发
蒸发的主要目的是及时地将柠檬酸净化液蒸发（浓缩）至规定浓度，为结晶工序及时供料；保证浓缩液质量；把蒸汽消耗、柠檬酸流损降低到允许范围。
4.7结晶
本工序的主要目标及时地从柠檬酸浓缩液中结晶出品体并分出母液；湿柠檬酸晶体要粒度均匀，理化指标符合等级标准，游离水含量尽可能低；保持较高的结晶牢率和结晶收率；防止母液被污染和稀释。
4.8干燥
本工序的主要目标及时将来自离心机的湿柠檬酸晶体的游离水除去并筛分、包装，获得符合等级标准的柠檬酸产品；防止柠檬酸晶体结块或融熔及污染；及时处理等外品和捕集器中的物科，把损耗降低到允许范围；准确掌握干燥段和冷却段的风温和空气质量。
钙盐法具有产品质量稳定，操作衙便，原料易得，设备简单，工艺成熟等优点。但同时也具有单元操作多，劳动强度大，环境污染和腐蚀现象严重，提取率低等缺点。考虑到这种方法的不适性袁许多研究者将目光投向了寻找低能耗少投入低无污染劳动强度低及高收益的提取工艺上。
五、总结与展望
我国的柠檬酸工业面临着机遇与困难并存的现状。在2007年9月, 国家发改委出台《关于促进玉米粉深加工工业健康发展的指导意见》提出,“十一五”期间玉米加工结构是提高淀粉多糖, 多元醇等国内供应不足产品的供给, 稳定以玉米为原料的普通淀粉生产, 控制发展味精等国内供需基本平衡和供大于求的产品, 限制以玉米为原料的柠檬酸赖氨酸等供大于求, 出口导向型产品, 以及以玉米为原料的食用酒精和工业酒精行业。此政策极大的限制了柠檬酸行业未来的发展, 当前开发新的发酵原料成为柠檬酸研究者的一个新的课题。其次, 随着发酵罐的广泛应用, 发酵罐与落后的手工麸曲制备孢子矛盾越来越突出,如何实现麸曲制备工业化, 直接用孢子粉是多年未解的难题。目前最为理想的是以固态发酵改变落后的麸曲制备工艺。第三, 现在的玉米粉原料发酵也只能算是半清夜发酵, 为了提供发酵的氮源要将一定比例的玉米粉直接加入发酵罐中, 由于考虑到发酵液的粘度不能过大, 防止影响溶氧, 总糖浓度无法调高, 产酸率不会太高, 可以考虑发酵后期追加料的方法提高产酸。第四, 拟柠檬酸发酵过程是一个严重的非线性, 时变性,无参数化模型的生化反应过程, 发酵过程释放热量, 在不同时段产生热量的速度不同, 因此温度控制显得极为重要, 目前我国的柠檬酸生产温度控制大多采用手动控制, 主要通过调节冷却水流量以满足生产工艺要求, 这不仅控制效果差, 精密度低, 反应速度慢, 而且直接影响产品的产量和质量, 因此研究温度自动控制系统具有重大的意义。 参考文献
[1]姜成林,徐丽华.微生物资源开发利用[M].北京：中国轻工业出版社，2001.4，74
[2]朱亨政 ．柠像酸发酵，食品与发酵工业，1994(6)：69—74
[3]馀洁 ．工业微生物基础及其应用，科学出版社，t991，199一205
[4] B． 持金森F．马维图纳，生化工程学生物技术手册(上册)。科学出版社．1992。3G2—363
[5]字佐美昭次,桶村光太郎,发酵工业,1985，43(1)1O32—1042
[6]徐积恩 ．柠檬酸生产的发展趋势，食品饲料添加剂信息 1994(5)：16—21
[7]姜锡瑞 ．酶制剂应用技术，中国轻工业出版社,1996,235
[8]程殿林. 微生物工程技术原理，北京：化学工业出版社，2007.7，222-223
[9]储炬，李友荣.微生物工艺学，上海:华东理工大学出版社，2008.3,180
[10]程殿林.微生物工程技术技术原理，北京：化学工业出版社，007.7,228-
230
[11]李维平.生物工艺学，北京：科学出版社，2010.2,65-72
[12]陈可可,张香兰,朱宏涛,等.曲霉属真菌在柠檬酸发酵中的作用[J].云南植
物研究,2008,30(5):624-628
[13]郭兴凤, 瑞宝, 谷文英,等.菜籽蛋白的酶水解- 复合风味蛋白酶水解条件
的研究[ J] .粮油食品科技, 2001,9(2) :32-34.
[14]衣良，谢光亮.柠檬酸钠抗凝剂防止血细胞聚集[J].上海医学检验杂表，
1995:10(2):121
[15]金其荣，有机酸发酵工艺学，北京：轻工业出版社，1985
[16] Anita Rywinska. Waldemar High-yield production of citric
acid by Yarrowia lipolytica on glycerol in repeated-batch
bioreact ors [J].Microbiol Biotechnol, 2010(37):431435.