基因工程实验指导
缩略词表
实验一 植物总 DNA 的快速少量抽提（CTAB 法）
一 【实验目的】
1、了解植物DNA 抽提的主要方法；
2、掌握CTAB 法快速抽提DNA 的方法。
二 【实验原理】
该方法简便、快速，DNA 产量高 (纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。CTAB (十六烷基三乙基溴化铵) 是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB 的处理下，结合 65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM） 浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA ，最后经异丙醇或乙醇等DNA 沉淀剂将DNA 沉淀分离出来。CTAB 能溶解于乙醇。
三 【试剂】
1、2倍CTAB 提取缓冲液：含100 mmol ／L Tris·HCl(pH 8.0) 、20mmol/L EDTA 、
1.4 mo1／L NaCl、2％(m/V)CTAB和40 mmo1／L β-巯基乙醇。
2、10％CTAB （含l0％CTAB 和0.7mol ／L NaCl ）：在80ml 的水中溶解4.1g Nacl ，缓缓加入10g CTAB并搅拌，可加热至65度溶解，定容至100ml 。
3、1倍CTAB 沉淀缓冲液（含50 mmol／L Tris·HCl(pH 8.0)、10mmol/L EDTA、1％(m/V)CTAB和20mmol/Lβ-巯基乙醇）。
4、氯仿一异戊醇：氯仿:异戊醇=24:1。
5、1 mol／L 乙酸铵。
6、7.5mol ／L 乙酸铵。
7、异丙醇。
8、70％乙醇、无水乙醇。
9、TE 缓冲液(含10 mmo1/L Tris和1 mmo1/L EDTA，pH 8.0，高压灭菌) 。 10、1μg／mL RNase。
四 【仪器设备及材料】
1、仪器设备 离心机、水浴锅、液氮罐、天平、研钵、EP 管、微量移液器(20μL 、200μL、1000μL)。
2、材料 植物叶片（枣树叶片）。
五 【实验步骤】
1、称取适量（每人取0.1g~0.3g）叶片放入预冷的研钵中，加入适量液氮，迅速研成粉末，装入离心管中。
2、加0.6-0.8ml 65 ℃预热CTAB 到到装有叶片粉末的离心管中，混匀。立即置于65 ℃水浴 30min ，每5 min，上下颠倒1次，12000g 离心5 min。
3、加入等体积（ 600μl ）氯仿/异戊醇 (24:1)，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。12000g 离心5 min，取上清于一新1.5ml 离心管.
4、在回收的上层相中加入1/10体积的65℃的CTAB ／NaCl 溶液，颠倒混匀，重复步骤3。
5、加入正好1体积的CTAB 沉淀液，颠倒混匀。如果看不见沉淀，于65℃温育30min 。于4℃，500g 离心5min 。
6、用80%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TE 缓冲液重悬（每克起始材料0.1~0.5ml ）。每克新鲜组织能够提取100-500ugDNA 。
六【注意事项】
1、尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10 mM的-ME 处理。
2、研钵预冻，粉末至加CTAB 前不要融化。
3、24:1的氯仿/异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的。
4、所用试剂必需灭菌。
实验二 基因组DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测
一 【实验目的】
1、了解掌握检测DNA 质量的方法以及DNA 定量的方法；
2、了解影响DNA 在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素；
3、训练DNA 的琼脂糖凝胶电泳操作。
二 【实验原理】
琼脂糖凝胶电泳技术是DNA 分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA 分离纯化的重要实验手段。DNA 分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA 带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA 分子本身的大小和构型。DNA 分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA 分子也可以通过这种方法进行分离。
溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，在紫外光照射下可发出波长590nm 的红色荧光，DNA 分子与EB 形成荧光络合物后，其发射的荧光比原来要增强数十倍，常用来观察凝胶中DNA 条带的位置。
三 【试剂】
1、琼脂糖凝胶 (0.7～1.5%，琼脂糖粉末与1×TAE 配成) 。
2、TAE(Tris-乙酸盐，EDTA) 电泳缓冲液（50×浓缩贮存液）：Tris 碱242g ；冰醋酸57.1mL ；0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 100mL；加600mL 蒸馏水，剧烈搅拌，加蒸馏水至1000mL ，浓盐酸调pH 至8.0。
3、溴化乙锭(EB)贮存液(10mg/mL)：在100mLH 2O 中加入1g 溴化乙锭用磁力搅拌器搅拌几个小时，然后转至棕色瓶中，4℃贮存。
4、10×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF 、15%的Ficoll 水溶液、0.1mol/LNa2EDTA ，pH8.0、1.0%SDS。
四 【仪器设备及材料】
1、仪器设备 刻度量筒、玻璃棒、三角烧瓶、移液枪及枪头、微波炉或沸水浴、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成) 、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、紫外分析仪、数码相机、封口胶带和电源等。
2、实验材料 实验一所获得的基因组DNA 。
五 【实验步骤】
1、用封口胶带封住塑料托盘开放的两边或清洁干燥的玻璃板的边缘形成一个模具(仅靠用手指沿平板边缘来回抹几次，使胶布紧密封住粘缝就可以了) ，置一个水平台上。
2、根据被分离DNA 片段的大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉将其加入到盛有已定量电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中，用玻璃棒搅拌均匀后放入沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化。
3、琼脂糖溶液正在冷却时，用合适的样品梳形成加样孔，梳齿的位置应在托盘底面上0.5～1.0mm 。
4、待凝胶稍微冷却后，将胶缓慢倒入已用胶带封好的模具中，胶厚度以3～5mm 为宜。
5、让凝胶溶液完全凝结，室温下约30min ，待胶略凝结时放入4℃冰箱可大大缩短凝结时间。小心拔出梳子，轻轻撕去封边胶带，将凝胶安放到电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极(黑末端) 。
6、向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1~3mm。
7、取适量的DNA 样品与10×加样缓冲液混合(分析单一DNA 样品，如L 噬菌体或质粒DNA ，每个5mm 宽加样孔可加100~500ngDNA。如果样品由不同大小的许多DNA 片段组成，如哺乳动物DNA 酶切样品，则每个加样孔加入20~30μg 的DNA 也不会造成分辨率明显下降) ，然后用移液枪将样品加入样品孔内。一定要包含合适的DNA 分子量标准物，将其分别加至样品孔的左侧和右侧孔中。
8、加样完毕后，关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA 应向阳极(红色插头) 侧泳动。给予1~5V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。若电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡。
9、电泳时间的选择取决于胶的长度、电压和DNA 片段的大小。胶越长，电压越低，DNA 片段越大，所需时间就越长。然而使用高压时，大的DNA 片段的分辨率很低，电泳出的条带不清晰。
10、当DNA 样品在凝胶中迁移足够距离时，关上电源并取出样品放入事先配好的EB 溶液中染色5~7min(EB 见光分解，应置于暗室中) ，在紫外分析仪上观察并可用数码相机进行拍摄。
六 【注意事项】
1、注意溴化乙锭(EB)是一种强诱变剂，有致癌嫌疑，操作过程戴手套和口罩，并注意把实验中沾染EB 和未沾染EB 的实验器具分开，防止EB 交叉污染，万一接触了溴化乙锭，立即用大量的水冲洗。
2、配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，严重影响DNA 片段的泳动。
3、微波炉加热时间过长，琼脂糖溶液会变得过热或剧烈沸腾。应调整好加热所有琼脂糖颗粒完全溶解需要的最短时间。
4、溴酚蓝与0.5kb 大小的DNA 的泳动度相近，这可给泳动最快的DNA 片段提供一个指示。
5、凝胶要用于印迹分析或将要回收DNA 条带时，每个样品必须使用一个新的枪头。
6、影响DNA 的迁移率的因素：
（1）DNA 分子大小：DNA 分子越小，迁移越快。
（2）DNA 分子构象：共价闭环DNA>线形DNA>开环双链DNA 。
（3）琼脂糖浓度：其浓度越低，迁移越快。
（4）两极间电压：电压越高，迁移越快。
7、DNA 区带不清晰，有可能是点样量少或过大，但也有可能是电压过高、凝胶有气泡、凝胶孔破裂的原因。
8、为了消除RNA 的影响，可以在电泳前加RNA 酶(约每10μL DNA加1μL RNA酶) ，37℃水浴30min 。
9、在进行电泳的过程中，溴酚蓝有可能会变黄，这是由于电泳液使用过久或残留在电泳液中的凝胶变质引起DNA 结构改变或丢失。时常更换电泳液和刷洗电泳槽即可。
实验三 利用PCR 技术扩增目的基因
利用PCR 技术扩增目的基因是一个设计性实验。首先对数据库进行基因检索，并以此为模板，利用分子生物学软件设计引物；然后使用PCR 仪进行基因扩增，并对产物进行电泳检测，凝胶成像系统分析实验结果。此外，还可以用纳米材料来优化反应条件，提高基因扩增效率。
一 【实验目的】
1、能够使用Primer Premier 5.0或Oligo 7.0等分子生物学软件设计和分析引物。
2、初步学习利用NCBI （美国国立生物技术信息中心）等生物信息学数据库。
3、掌握PCR 的原理和技术，并能够对PCR 反应进行优化。
二 【实验原理】
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR ）是一种体外模拟自然DNA 复制过程的核酸扩增技术，亦称为体外酶促基因扩增。PCR 与分子克隆和核酸序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作的基础。近年来伴随着PCR 技术的发展，PCR 不但可以对目的基因进行定性，而且可以定量（即原始模版的确切数目），因此广泛应用于遗传学、微生物学、医学乃至整个生命科学的研究中。
PCR 的原理类似于DNA 的天然复制过程。利用耐热的DNA 聚合酶，在待扩增的基因片段两侧和与其互补的两个引物，经过变性、退火和延伸等三步的一个循环，实现模板DNA 拷贝数增加一倍，在以后进行的循环过程中，每一循环的产物作为下一轮循环的模板。n 次循环后，拷贝数增加2n 倍。因此，进行25~30个循环后，拷贝数即可达到上百万倍(106) 。
PCR 的基本反应体系包括：需要扩增的模板（template ）、一对寡核苷酸引物（primers ）、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP ）、耐热DNA 聚合酶（DNA polymerase）缓冲液（reaction buffer system）、二价阳离子（Mg 2+）等。纳米材料做为新型的PCR 增效剂不仅可以增加PCR 特异性和效率，而且可以提高PCR 反应的灵敏度。这是迄今为止其它类型的PCR 所无法比拟的。实验中用纳米金（10nm ）作为PCR 的增效剂来提高扩增效率，使扩增的特异性增强，有利于下一步的基因操作。使用该技术扩增目的基因的前提条件是必须了解该基因的序列组成或该基因两端的序列组成。
三 【试剂】
1、Taq DNA 聚合酶；引物；10×PCR Buffer （含Mg 2+）；DNTP ；DNA Marker 和琼脂糖(Agarose)等购自公司。
2、6×凝胶加样缓冲液：0.25％溴酚兰，0.25%二甲苯青FF ，40%蔗糖，4℃保存。
3、溴化乙锭保存液：10mg ／ml ，避光保存。
4、50×TAE 缓冲液（242g Tris碱，57.1ml 冰醋酸，100ml 0.5M EDTA，H 2O 补充至1000 ml）。
四 【仪器设备及材料】
1、仪器：基因扩增仪（PCR 仪），水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，微量移液器，紫外透射仪，凝胶成像系统。
2、材料：基因扩增的模板为实验一、二提取鉴定的马铃薯基因组DNA 。
五 【实验步骤】
1. 在NCBI 的数据库中查找相关的基因序列，利用Primer Premier 5.0 等分子生物学软件设计和分析引物。每个实验组分别设计两个引物，引物序列设计好以后就可以直接委托相关的生物技术公司合成，合成好的引物寡核苷酸配置成20μM贮存液。
引物设计使用Primer Premier5软件，并遵循以下原则：
⑴ 引物的长度一般在18bp~28bp之间，对于长片段扩增来说，引物的长度在这个范围内适当取长；
⑵ 引物的GC 含量一般为40％~60％，不能过高或过低，上下游引物的GC 含量应不要相差太大，另外两对引物的Tm 值应尽量接近，一般应相差不超过3℃，这有利于引物的特异性退火；
⑶ 在其它条件都符合的条件下，尽量选择引物在模板上错配位点少的引物对，另外，引物3’端应尽量避免出现三个以上的重复碱基和A 碱基。这样可以防止错配引起的非特异性产物；
⑷ 引物二聚体及发夹结构能引起引物的有效浓度降低，从而导致扩增失败。因此应尽可能避免引物二聚体及发夹结构。
2. 在0.2ml 的PCR 管内配制25μl反应体系：
反应物 体积/μl
10× PCR buffer 2.5
dNTP (2.5mM) 2.0
引物1 (2μM) 2.5
引物2 (2μM) 2.5
Taq 酶 (5U/μL) 0.5
Template 1
ddH 2O 13
总体积 25μl
3．将PCR 反应体系混匀，按以下循环条件在基因扩增仪上进行PCR 循环： 预变性 94℃ 3min
变性 95℃ 40s
退火 54℃ 30循环
延伸 72℃ 50s
完全延伸 72℃ 10min
4. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结果。
（1）制备1.2％琼脂糖凝胶板：将1.2％琼脂糖凝胶置微波炉中溶化, 稍等冷却，倒入制胶槽中，充分凝固后拔出样品梳；
（2）将凝胶板放人电泳槽，加入1×TAE 缓冲液，使液面略高于凝胶；
（3）从反应混合液中取出DNA 扩增产物2 μl 并加1μl 6×凝胶加样缓冲液，混匀后全部加入凝胶板的样品孔中进行电泳；
（4）电泳90V 约30~40min；
（5）在500 ml 水中加入溴化乙锭保存液, (EB终浓度0.5~1μg/ml),混匀；
（6）将疑胶轻轻滑入染色液，染色20~30分钟；
（7）取出凝胶，用水稍漂洗；
（8）紫外灯下确定DNA 区带。
六 【思考题】
1、退火温度T m 是如何计算得到？
2、PCR 循环次数是否越多越好？为什么？
3、如果电泳出现了弥散现象，可能有哪些原因？
4、如何确保你设计引物的特异性？
七 【注意事项】
由于PCR 能够使DNA 分子大量扩增，所以应当注意防止反应体系被痕量DNA 模板污染。尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。
1、在装有紫外灯的层流式工作台内吸加PCR 试剂和进行反应。不用时应打开紫外灯。工作台内应配置有PCR 专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其他
必需品。自动移液器的管部是常见的污染源，配液和移液时应当使用一次性吸头和活塞的正向排液式移液器。所有缓冲液、吸头和离心管使用前必须经过高压处理。
2、准备成套试剂，分装为小份，在靠近工作台的冰箱中设立专门位置来保存。配制试剂时，用从未接触过任何DNA 的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后将这一小份全部废弃，不得重新置存。
3、装有PCR 试剂的微量离心管打开之前，应先在专用工作台内的微量离心机上作瞬时离心(10秒) 。使液体沉积于管底，减少污染的机会。
4、加完所有其他反应成分、包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA 。模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻弹击管侧壁，混匀液体。再作瞬时离心(10秒) ，使水相和有机相分开。
5、将模板DNA 加入PCR 系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应。并非即用管都应盖严。拿过模板DNA 管后应更换手套。
6、应设置阳性对照反应(即由少量适当的靶序列参与的PCR) 。对靶序列的稀释工作应于实验前在实验室内别的位置进行，防止将靶DNA 的浓溶液带到实验室中专门进行PCR 的位置。
7、必须设置一个不含模板DNA 但含有PCR 系统中所有其他成分的对照反应，这一对照管须在准备好所有其他PCR 以后才进行吸加。
实验四 琼脂糖凝胶电泳回收PCR 产物
一 【实验目的】
学习掌握琼脂糖凝胶电泳回收PCR 产物技术。
二、【实验原理】实验原理
DNA 片段的分离与回收是基因工程操作中的一项重要技术，例如可收集特定酶切片段用于克隆或制备探针，回收PCR 产物用于再次鉴定等。回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会大大增加前期的工作量。
本实验采用的是DNA 凝胶回收试剂盒，其原理是：在凝胶融化液中凝胶块被迅速融化并释放出DNA 。加入高离液序列溶液后DNA 片段被选择性吸附到silica 膜上。经洗涤去除残留在silica 膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到silica 膜上的DNA 片段经微量水或El μent 洗脱下来，即可用于各种分子生物学实验。
三 【试剂】
1×TAE 电泳缓冲液；溴化乙锭溶液（EB ）；琼脂糖；6×加样缓冲液；DNA 凝胶回收试剂盒（从公司购买）。
四 【仪器设备及材料】
1 材料：实验三所得PCR 产物（未经纯化）
2 仪器：电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、紫外透射仪、微波炉、台式离心机、移液器、恒温孵育器（55~65℃）、1.5ml 离心管、刀片、酒精灯。
五 【实验步骤】
1、按常规方法将实验三的PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳（依据上样量的多少制胶）。
2、在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶。
3、称量凝胶重量，以1mg=1μl换算凝胶体积。
4、加入一定量的溶胶缓冲液（具体参照试剂盒说明书）。
5、悬浮均匀后于55℃~65℃加热，期间每2~3min摇晃一次，直至凝胶块完全融化。
6、把DNA —琼脂糖溶液加到一个DNA 回收纯化柱上，并把柱子装在收集试管内，14000rpm 离心1ml ，弃去流出液（为提高回收率，可重复该步骤）。
*对于体积大于700μl 的样品，则分别加到不同的柱子上，每次700μl。
7、用700μl无水乙醇稀释的洗涤缓冲液洗涤柱子，加入柱子中后静置2~3min。室温下14000rpm 离心1min 。
8、弃滤液，以同样的方法再洗涤一次。
9、把柱子装在一个灭菌干净的1.5ml 离心管上，加入30~50μl的DNA 洗脱缓冲液或无菌去离子水到柱基质上，14000rpm 离心1min 以洗脱出DNA 。
10、取3~5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。
六 【注意事项】
PCR 产物的纯化选用直接纯化法还是胶回收法主要取决于PCR 产物。若PCR 产物电泳时为单一条带，可采用直接纯化法，即将酶、dNTP 等多余物质去掉便可；若PCR 产物电泳时为多条带，则要根据需要回收特定条带，此时须选用胶回收法。
实验五 大肠杆菌感受态细胞细胞的制备
一 【实验目的】
学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
二 【实验原理】
在进行基因克隆时，体外构建的DNA 重组子必须导入合适的受体细胞，才可以复制，增殖和表达。裸露的外源DNA 直接进入细胞体内称为转化。载体与外源目的基因构成的重组载体可以通过转化直接导入受体细胞，从而实现基因在异源细胞的表达。进行转化时，要求细胞处于容易吸收外源DNA 的状态，即感受态，重组分子才能进入细胞内。
通过CaCl 2 处理的大肠杆菌细胞就是一种感受态细胞。在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。DNA 可吸附于其表面。在短暂的热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。
带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内可表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
三 【试剂】
1、LB 液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L 、酵母提取物5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L用NaO 调pH 值至7.0，高压灭菌。固体培养基需加1％琼脂粉。
2、0.05mol/L CaCl2溶液：称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml 重蒸水中，定容至100ml ，高压灭菌。
3、含15%甘油的0.05mol/L CaCl2： 称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml 重蒸水中，加入15ml 甘油，定容至100ml ，高压灭菌。
四 【仪器设备及材料】
E.coli DH5α菌株、eppendorf 管、恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、制冰机、分光光度计、微量移液枪、高压灭菌锅。
五 【实验步骤】
1、用无菌牙签在LB 平板上挑取新培养的E.coli DH5α单菌落，接种到盛有4 mL LB 液体培养基的7 mL 离心管中，37℃，280 r/min于恒温摇床培养10 h；
2、将上述培养物按照体积比1:100放大于装有100 mL LB液体培养基的250 mL锥形瓶中继续培养2~3 h至OD 600=0.3~0.4左右；
3、将上述培养物转入50 mL无菌离心管中，冰浴10 min；
4、4℃，5 000 r/min条件下离心5 min，尽可能将上清去干净；
5、用5~10 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬沉淀物；
6、4℃，5 000 r/min条件下离心5 min；
7、去上清液，用500 µL 冰预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬沉淀物，然后加入油甘至其终浓度为15％，按100 µL/份分装，放在-70℃冰箱备用。
六 【注意事项】
1、 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD 600来控制。DH5α菌株的OD 600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右（不同的菌株情况有所不同），这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA 应主要是超螺旋态DNA （cccDNA ）。转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng 的cccDNA 即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl 2 等均需是最高纯度的（GR. 或AR. ），并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4、防止杂菌和杂DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip 头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA 所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验方法也适用于其它E.coli 受体菌株的不同的质粒DNA 的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩（如离心），才能较准确的计算转化率。
实验六 PCR 产物的T/A克隆及重组子的筛选
一 【实验目的】
1、掌握PCR 产物的T/A克隆的原理及方法法。
2、了解转化子筛选的原理和一般方法。
3、掌握抗性筛选及蓝白斑筛选原理及学会蓝白斑筛选操作过程。
二 【实验原理】
1、PCR 产物的T/A克隆原理
通过PCR 的方法扩增目的基因片段的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA 序列，获得的目的片段通常需要通过TA 克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA 序列。TA 克隆系统由Invitrogen 公司（San Diego，CA ）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR 产物的克隆和测序。其原理是利用Taq 酶能够在PCR 产物的3’末端加上一个非模板依赖的A ，而T 载体是一种带有3’T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS ）中。
由于在PCR 过程中，使用的DNA 聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）使用不同的Taq 酶，在PCR 扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq 酶可以在扩增产物的3末端加上A ，因此PCR 产物回收纯化后可以和T 载体直接连接。（2）使用高保真的DNA 聚合酶，如pfu 酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A ，得到的DNA 序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A 的过程，通常是以PCR 回收产物为模板，加上一定量的普通Taq 酶和反应液，加入dATP （或dNTP ）， 72℃ 10分钟，然后将加A 产物直接用于TA 连接。
2重组子的筛选原理
在转化过程中，并非每个宿主细胞都被转化，即使获得转化的细胞，也并非都含目的基因，可能含有自身形成环状的在体分子，一个载体与两个外源DNA 形成的重组子，或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。因此转化后须在不同层次、不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。
（1）克隆载体具有抗生素抗性基因，如：Amp 、Ter 、Kan 等。外源基因插在抗性基因之外，这个重组子转化入宿主后，宿主就具有了抗生素抗性，因而在含抗生素
的培养基中，只有阳性重组子才能生长。但有些单酶切的情况下，连接时有可能出现反向连接或自身环化，所以还需要进行酶切鉴定。
（2）蓝白筛选是通过插入失活lacZ 基因，破坏重组子与宿主之间的ɑ-互补作用来鉴别重组子与非重组子的筛选方法，是携带lacZ 基因的许多载体的筛选优势。这些载体包括M13噬菌体，pUC 质粒系列，pEGM 质粒系列等。它们的共同特点是载体上携带一段细菌lacZ 基因的α肽编码序列，其编码产物为β-半乳糖苷酶的α肽。当无外源DNA 插入时，质粒表达α肽。突变型Lac-E.Coli 可表达该酶的ω肽。单独存在的α及ω肽均无β-半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达这两个肽时，宿主细胞内才有β-半乳糖苷酶活性，在含有底物X-gal(5-溴－4－氯－3－吲哚－ β－D －半乳糖苷) 的诱导剂IPTG （异丙基硫代－ β－D －半乳糖苷）条件下，菌落呈蓝色，这就是α-互补。如果LacZ 基因由于插入外源基因而失活，结果无α肽表达，转化菌落无α-互补，缺乏β-半乳糖苷酶活性，在含有X-gal 培养板上为白色菌落，而载体自身环化后转化的细菌为蓝色菌落。由于这种颜色标志，重组子与非重组子的区别一目了然，可以很容易将之区分。
三 【试剂】
T 载体试剂盒（从公司购买）、实验五制备的DH5α大肠杆菌感受态细胞，
四 【仪器设备及材料】
1、材料：实验四回收的PCR
2、仪器：低温恒槽、移液器、超净工作台、制冰机、产物
五 【实验步骤】
1、连接反应一般在灭菌的0.2mlPCR 薄壁管中进行。
2、10μl体积反应体系如下：
（1）取T 载体1μl (50ng)，加入PCR 产物（T 载体: PCR产物摩尔数为1:3~10）。
（2）加入含ATP 的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH 2O 补足至10μl 。
连接反应体系如下（10 µL 反应体系）
1）2×Ligase buffer
2）GEM-T Vector 5 µL 1 µL
3）T 4 DNA Ligase （3U/µL ） 1 µL
4）PCR 回收产物 3 µL
3、混匀，稍加离心，通常为14-16℃水浴连接8-14hr ，或4℃过夜。
4、转染。
（1） 将装有100 µL E.coli D H5α感受态细胞的1.5 mL离心管置于冰上，让其在冰浴中慢慢溶解；
（2） 加入3～10 µL 连接反应液，混匀后，冰浴30 min；
（3） 42℃水浴中热激处理90 S；
（4） 快速冰浴冷却2～3 min；
（5） 加入400 µL LB 液体培养基，混匀后，37℃恒温振荡培养1h ，然后涂布于含有相应抗生素及100 µL X-gal（20 mg/mL）和20 µL IPTG（100 m mol/L）的LB 固体培养基上，涂后晾干10～15 min，于在37℃培养16～20 h。
（6） 同时做两个对照：
对照组1： 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。
对照组2： 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
（7） 计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg 质粒DNA ）＝转化子总数／质粒DNA 加入量（mg ） 感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
六 【注意事项】
1、要获得目的基因的TA 克隆，PCR 产物的特异性要好。
2、PCR 产物在TA 克隆前要通过纯化。
3、在PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA 污染。
实验七 重组子的鉴定
一 【实验目的】
通过实验，掌握质粒滞后实验、PCR 扩增技术及酶切在重组子的鉴定过程的应用及操作技术。
二 【实验原理】
载体插入外源DNA 片段后，分子量变大，电泳时相对空载体要跑得慢，称之为滞后现象；如果载体入外源DNA 片段后，可依据该片段序列设计引物，利用PCR 扩增技术扩增出大小相等的DNA 片段，可通过电泳观察；如果载体入外源DNA 片段则可依据载体多克隆位点的进行酶切酶切检测，可通过电泳观察到切下的大小相等的DNA 片段。
三 【试剂】
1、氨苄青霉素（Amp ）：用无菌水配制成100mg/mL溶液，置 -20℃冰箱保存。
2、含Amp 的LB 液体培养基：将配好的LB 液体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp 储存液，使终浓度为50ug/ml。
3、溶液Ⅰ：50 m mol/L Tris·Cl （pH 8.0），10 m mol/L EDTA（pH 8.0）
4、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH（10 mol/L贮存液用时稀释），1 % SDS
5、溶液 Ⅲ：5 mol/L乙酸钾 60 mL，冰乙酸 11.5 mL，水 28.5 mL 8
6、TE 缓冲液：10 m mol/L Tris·Cl （pH 8.0），1 m mol/L EDTA（pH 8.0）
7、PCR 扩增所需试剂同实验三。
8、限制性内切酶。
四 【仪器设备及材料】
1、材料：实验五制备的感受态细胞，实验六T/A克隆连接产物。
五 【实验步骤】
1、大肠杆菌质粒DNA 小量碱法提取及滞后实验
（1）用无菌牙签从平板上挑取蓝白斑中的白色菌斑，置于装有4 mL LB液体培养基的7 mL 离心管中，37℃，300 r/ min 振荡培养12～16 h；
（2）将培养液转到1.5 mL 离心管中，12 000 r/ min 离心1 min，倒掉上清液，最后吸干菌液；
（3）加入200 µL 溶液Ⅰ，重悬细胞；
（4）加入200 µL 的溶液Ⅱ，轻轻振荡4～5次，室温静置2～3 min；
（5）加入200 µL 溶液Ⅲ，振荡4～5次，4℃，12 000 r/ min离心5 min；
（6）将上清液转入一新离心管（500 µL ），加入等体积的氯仿和酚（氯仿:酚＝1:1），振荡4～5次，4℃，12 000 r/ min离心5 min （如果蛋白多可抽提2遍）；
（7）吸取450 µL 上清液转入1.5 mL离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，在-20℃冰箱中放置30 min以上；
（8）取出，4℃，12 000 r/ min离心5 min，倒掉上清液，吸干酒精，用70%酒精洗涤沉淀2遍；
（9）用加有RNase 的TE 缓冲液 15 μL 溶解沉淀，电泳检测滞后。
2、重组质粒的PCR 及酶切鉴定
（1）以上述电泳检测滞后的质粒为模板进行PCR 鉴定，鉴定方法与PCR 扩增方法相同。
（2）将PCR 鉴定所得阳性重组质粒用Xho I、Kpn I双酶切鉴定，反应体系如下（10 µL ）：
1） 质粒 8.0 µL
2） 10×buffer 1.0 µL
3） Xho I （10U/µL ） 0.5 µL
4） Kpn I （10U/µL ） 0.5 µL
37℃酶切过夜，将酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。
基因工程实验指导
缩略词表
实验一 植物总 DNA 的快速少量抽提（CTAB 法）
一 【实验目的】
1、了解植物DNA 抽提的主要方法；
2、掌握CTAB 法快速抽提DNA 的方法。
二 【实验原理】
该方法简便、快速，DNA 产量高 (纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。CTAB (十六烷基三乙基溴化铵) 是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB 的处理下，结合 65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM） 浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB 。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA ，最后经异丙醇或乙醇等DNA 沉淀剂将DNA 沉淀分离出来。CTAB 能溶解于乙醇。
三 【试剂】
1、2倍CTAB 提取缓冲液：含100 mmol ／L Tris·HCl(pH 8.0) 、20mmol/L EDTA 、
1.4 mo1／L NaCl、2％(m/V)CTAB和40 mmo1／L β-巯基乙醇。
2、10％CTAB （含l0％CTAB 和0.7mol ／L NaCl ）：在80ml 的水中溶解4.1g Nacl ，缓缓加入10g CTAB并搅拌，可加热至65度溶解，定容至100ml 。
3、1倍CTAB 沉淀缓冲液（含50 mmol／L Tris·HCl(pH 8.0)、10mmol/L EDTA、1％(m/V)CTAB和20mmol/Lβ-巯基乙醇）。
4、氯仿一异戊醇：氯仿:异戊醇=24:1。
5、1 mol／L 乙酸铵。
6、7.5mol ／L 乙酸铵。
7、异丙醇。
8、70％乙醇、无水乙醇。
9、TE 缓冲液(含10 mmo1/L Tris和1 mmo1/L EDTA，pH 8.0，高压灭菌) 。 10、1μg／mL RNase。
四 【仪器设备及材料】
1、仪器设备 离心机、水浴锅、液氮罐、天平、研钵、EP 管、微量移液器(20μL 、200μL、1000μL)。
2、材料 植物叶片（枣树叶片）。
五 【实验步骤】
1、称取适量（每人取0.1g~0.3g）叶片放入预冷的研钵中，加入适量液氮，迅速研成粉末，装入离心管中。
2、加0.6-0.8ml 65 ℃预热CTAB 到到装有叶片粉末的离心管中，混匀。立即置于65 ℃水浴 30min ，每5 min，上下颠倒1次，12000g 离心5 min。
3、加入等体积（ 600μl ）氯仿/异戊醇 (24:1)，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。12000g 离心5 min，取上清于一新1.5ml 离心管.
4、在回收的上层相中加入1/10体积的65℃的CTAB ／NaCl 溶液，颠倒混匀，重复步骤3。
5、加入正好1体积的CTAB 沉淀液，颠倒混匀。如果看不见沉淀，于65℃温育30min 。于4℃，500g 离心5min 。
6、用80%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TE 缓冲液重悬（每克起始材料0.1~0.5ml ）。每克新鲜组织能够提取100-500ugDNA 。
六【注意事项】
1、尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用10 mM的-ME 处理。
2、研钵预冻，粉末至加CTAB 前不要融化。
3、24:1的氯仿/异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的。
4、所用试剂必需灭菌。
实验二 基因组DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测
一 【实验目的】
1、了解掌握检测DNA 质量的方法以及DNA 定量的方法；
2、了解影响DNA 在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素；
3、训练DNA 的琼脂糖凝胶电泳操作。
二 【实验原理】
琼脂糖凝胶电泳技术是DNA 分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA 分离纯化的重要实验手段。DNA 分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA 带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA 分子本身的大小和构型。DNA 分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA 分子也可以通过这种方法进行分离。
溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，在紫外光照射下可发出波长590nm 的红色荧光，DNA 分子与EB 形成荧光络合物后，其发射的荧光比原来要增强数十倍，常用来观察凝胶中DNA 条带的位置。
三 【试剂】
1、琼脂糖凝胶 (0.7～1.5%，琼脂糖粉末与1×TAE 配成) 。
2、TAE(Tris-乙酸盐，EDTA) 电泳缓冲液（50×浓缩贮存液）：Tris 碱242g ；冰醋酸57.1mL ；0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 100mL；加600mL 蒸馏水，剧烈搅拌，加蒸馏水至1000mL ，浓盐酸调pH 至8.0。
3、溴化乙锭(EB)贮存液(10mg/mL)：在100mLH 2O 中加入1g 溴化乙锭用磁力搅拌器搅拌几个小时，然后转至棕色瓶中，4℃贮存。
4、10×加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF 、15%的Ficoll 水溶液、0.1mol/LNa2EDTA ，pH8.0、1.0%SDS。
四 【仪器设备及材料】
1、仪器设备 刻度量筒、玻璃棒、三角烧瓶、移液枪及枪头、微波炉或沸水浴、凝胶灌制平板(塑料或玻璃制成) 、凝胶样品梳、稳压稳流电泳仪、紫外分析仪、数码相机、封口胶带和电源等。
2、实验材料 实验一所获得的基因组DNA 。
五 【实验步骤】
1、用封口胶带封住塑料托盘开放的两边或清洁干燥的玻璃板的边缘形成一个模具(仅靠用手指沿平板边缘来回抹几次，使胶布紧密封住粘缝就可以了) ，置一个水平台上。
2、根据被分离DNA 片段的大小用电泳缓冲液配制适宜浓度琼脂糖溶液：应准确称量琼脂糖干粉将其加入到盛有已定量电泳缓冲液的三角烧瓶或玻璃瓶中，用玻璃棒搅拌均匀后放入沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化。
3、琼脂糖溶液正在冷却时，用合适的样品梳形成加样孔，梳齿的位置应在托盘底面上0.5～1.0mm 。
4、待凝胶稍微冷却后，将胶缓慢倒入已用胶带封好的模具中，胶厚度以3～5mm 为宜。
5、让凝胶溶液完全凝结，室温下约30min ，待胶略凝结时放入4℃冰箱可大大缩短凝结时间。小心拔出梳子，轻轻撕去封边胶带，将凝胶安放到电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极(黑末端) 。
6、向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1~3mm。
7、取适量的DNA 样品与10×加样缓冲液混合(分析单一DNA 样品，如L 噬菌体或质粒DNA ，每个5mm 宽加样孔可加100~500ngDNA。如果样品由不同大小的许多DNA 片段组成，如哺乳动物DNA 酶切样品，则每个加样孔加入20~30μg 的DNA 也不会造成分辨率明显下降) ，然后用移液枪将样品加入样品孔内。一定要包含合适的DNA 分子量标准物，将其分别加至样品孔的左侧和右侧孔中。
8、加样完毕后，关上电泳槽盖，接好电极插头。DNA 应向阳极(红色插头) 侧泳动。给予1~5V/cm的电压，其中距离以阳极至阴极之间的测量为准。若电极插头连接正确，阳极和阴极由于电解作用将产生气泡。
9、电泳时间的选择取决于胶的长度、电压和DNA 片段的大小。胶越长，电压越低，DNA 片段越大，所需时间就越长。然而使用高压时，大的DNA 片段的分辨率很低，电泳出的条带不清晰。
10、当DNA 样品在凝胶中迁移足够距离时，关上电源并取出样品放入事先配好的EB 溶液中染色5~7min(EB 见光分解，应置于暗室中) ，在紫外分析仪上观察并可用数码相机进行拍摄。
六 【注意事项】
1、注意溴化乙锭(EB)是一种强诱变剂，有致癌嫌疑，操作过程戴手套和口罩，并注意把实验中沾染EB 和未沾染EB 的实验器具分开，防止EB 交叉污染，万一接触了溴化乙锭，立即用大量的水冲洗。
2、配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH 或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，严重影响DNA 片段的泳动。
3、微波炉加热时间过长，琼脂糖溶液会变得过热或剧烈沸腾。应调整好加热所有琼脂糖颗粒完全溶解需要的最短时间。
4、溴酚蓝与0.5kb 大小的DNA 的泳动度相近，这可给泳动最快的DNA 片段提供一个指示。
5、凝胶要用于印迹分析或将要回收DNA 条带时，每个样品必须使用一个新的枪头。
6、影响DNA 的迁移率的因素：
（1）DNA 分子大小：DNA 分子越小，迁移越快。
（2）DNA 分子构象：共价闭环DNA>线形DNA>开环双链DNA 。
（3）琼脂糖浓度：其浓度越低，迁移越快。
（4）两极间电压：电压越高，迁移越快。
7、DNA 区带不清晰，有可能是点样量少或过大，但也有可能是电压过高、凝胶有气泡、凝胶孔破裂的原因。
8、为了消除RNA 的影响，可以在电泳前加RNA 酶(约每10μL DNA加1μL RNA酶) ，37℃水浴30min 。
9、在进行电泳的过程中，溴酚蓝有可能会变黄，这是由于电泳液使用过久或残留在电泳液中的凝胶变质引起DNA 结构改变或丢失。时常更换电泳液和刷洗电泳槽即可。
实验三 利用PCR 技术扩增目的基因
利用PCR 技术扩增目的基因是一个设计性实验。首先对数据库进行基因检索，并以此为模板，利用分子生物学软件设计引物；然后使用PCR 仪进行基因扩增，并对产物进行电泳检测，凝胶成像系统分析实验结果。此外，还可以用纳米材料来优化反应条件，提高基因扩增效率。
一 【实验目的】
1、能够使用Primer Premier 5.0或Oligo 7.0等分子生物学软件设计和分析引物。
2、初步学习利用NCBI （美国国立生物技术信息中心）等生物信息学数据库。
3、掌握PCR 的原理和技术，并能够对PCR 反应进行优化。
二 【实验原理】
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR ）是一种体外模拟自然DNA 复制过程的核酸扩增技术，亦称为体外酶促基因扩增。PCR 与分子克隆和核酸序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作的基础。近年来伴随着PCR 技术的发展，PCR 不但可以对目的基因进行定性，而且可以定量（即原始模版的确切数目），因此广泛应用于遗传学、微生物学、医学乃至整个生命科学的研究中。
PCR 的原理类似于DNA 的天然复制过程。利用耐热的DNA 聚合酶，在待扩增的基因片段两侧和与其互补的两个引物，经过变性、退火和延伸等三步的一个循环，实现模板DNA 拷贝数增加一倍，在以后进行的循环过程中，每一循环的产物作为下一轮循环的模板。n 次循环后，拷贝数增加2n 倍。因此，进行25~30个循环后，拷贝数即可达到上百万倍(106) 。
PCR 的基本反应体系包括：需要扩增的模板（template ）、一对寡核苷酸引物（primers ）、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP ）、耐热DNA 聚合酶（DNA polymerase）缓冲液（reaction buffer system）、二价阳离子（Mg 2+）等。纳米材料做为新型的PCR 增效剂不仅可以增加PCR 特异性和效率，而且可以提高PCR 反应的灵敏度。这是迄今为止其它类型的PCR 所无法比拟的。实验中用纳米金（10nm ）作为PCR 的增效剂来提高扩增效率，使扩增的特异性增强，有利于下一步的基因操作。使用该技术扩增目的基因的前提条件是必须了解该基因的序列组成或该基因两端的序列组成。
三 【试剂】
1、Taq DNA 聚合酶；引物；10×PCR Buffer （含Mg 2+）；DNTP ；DNA Marker 和琼脂糖(Agarose)等购自公司。
2、6×凝胶加样缓冲液：0.25％溴酚兰，0.25%二甲苯青FF ，40%蔗糖，4℃保存。
3、溴化乙锭保存液：10mg ／ml ，避光保存。
4、50×TAE 缓冲液（242g Tris碱，57.1ml 冰醋酸，100ml 0.5M EDTA，H 2O 补充至1000 ml）。
四 【仪器设备及材料】
1、仪器：基因扩增仪（PCR 仪），水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，微量移液器，紫外透射仪，凝胶成像系统。
2、材料：基因扩增的模板为实验一、二提取鉴定的马铃薯基因组DNA 。
五 【实验步骤】
1. 在NCBI 的数据库中查找相关的基因序列，利用Primer Premier 5.0 等分子生物学软件设计和分析引物。每个实验组分别设计两个引物，引物序列设计好以后就可以直接委托相关的生物技术公司合成，合成好的引物寡核苷酸配置成20μM贮存液。
引物设计使用Primer Premier5软件，并遵循以下原则：
⑴ 引物的长度一般在18bp~28bp之间，对于长片段扩增来说，引物的长度在这个范围内适当取长；
⑵ 引物的GC 含量一般为40％~60％，不能过高或过低，上下游引物的GC 含量应不要相差太大，另外两对引物的Tm 值应尽量接近，一般应相差不超过3℃，这有利于引物的特异性退火；
⑶ 在其它条件都符合的条件下，尽量选择引物在模板上错配位点少的引物对，另外，引物3’端应尽量避免出现三个以上的重复碱基和A 碱基。这样可以防止错配引起的非特异性产物；
⑷ 引物二聚体及发夹结构能引起引物的有效浓度降低，从而导致扩增失败。因此应尽可能避免引物二聚体及发夹结构。
2. 在0.2ml 的PCR 管内配制25μl反应体系：
反应物 体积/μl
10× PCR buffer 2.5
dNTP (2.5mM) 2.0
引物1 (2μM) 2.5
引物2 (2μM) 2.5
Taq 酶 (5U/μL) 0.5
Template 1
ddH 2O 13
总体积 25μl
3．将PCR 反应体系混匀，按以下循环条件在基因扩增仪上进行PCR 循环： 预变性 94℃ 3min
变性 95℃ 40s
退火 54℃ 30循环
延伸 72℃ 50s
完全延伸 72℃ 10min
4. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结果。
（1）制备1.2％琼脂糖凝胶板：将1.2％琼脂糖凝胶置微波炉中溶化, 稍等冷却，倒入制胶槽中，充分凝固后拔出样品梳；
（2）将凝胶板放人电泳槽，加入1×TAE 缓冲液，使液面略高于凝胶；
（3）从反应混合液中取出DNA 扩增产物2 μl 并加1μl 6×凝胶加样缓冲液，混匀后全部加入凝胶板的样品孔中进行电泳；
（4）电泳90V 约30~40min；
（5）在500 ml 水中加入溴化乙锭保存液, (EB终浓度0.5~1μg/ml),混匀；
（6）将疑胶轻轻滑入染色液，染色20~30分钟；
（7）取出凝胶，用水稍漂洗；
（8）紫外灯下确定DNA 区带。
六 【思考题】
1、退火温度T m 是如何计算得到？
2、PCR 循环次数是否越多越好？为什么？
3、如果电泳出现了弥散现象，可能有哪些原因？
4、如何确保你设计引物的特异性？
七 【注意事项】
由于PCR 能够使DNA 分子大量扩增，所以应当注意防止反应体系被痕量DNA 模板污染。尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。
1、在装有紫外灯的层流式工作台内吸加PCR 试剂和进行反应。不用时应打开紫外灯。工作台内应配置有PCR 专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其他
必需品。自动移液器的管部是常见的污染源，配液和移液时应当使用一次性吸头和活塞的正向排液式移液器。所有缓冲液、吸头和离心管使用前必须经过高压处理。
2、准备成套试剂，分装为小份，在靠近工作台的冰箱中设立专门位置来保存。配制试剂时，用从未接触过任何DNA 的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后将这一小份全部废弃，不得重新置存。
3、装有PCR 试剂的微量离心管打开之前，应先在专用工作台内的微量离心机上作瞬时离心(10秒) 。使液体沉积于管底，减少污染的机会。
4、加完所有其他反应成分、包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA 。模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻弹击管侧壁，混匀液体。再作瞬时离心(10秒) ，使水相和有机相分开。
5、将模板DNA 加入PCR 系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应。并非即用管都应盖严。拿过模板DNA 管后应更换手套。
6、应设置阳性对照反应(即由少量适当的靶序列参与的PCR) 。对靶序列的稀释工作应于实验前在实验室内别的位置进行，防止将靶DNA 的浓溶液带到实验室中专门进行PCR 的位置。
7、必须设置一个不含模板DNA 但含有PCR 系统中所有其他成分的对照反应，这一对照管须在准备好所有其他PCR 以后才进行吸加。
实验四 琼脂糖凝胶电泳回收PCR 产物
一 【实验目的】
学习掌握琼脂糖凝胶电泳回收PCR 产物技术。
二、【实验原理】实验原理
DNA 片段的分离与回收是基因工程操作中的一项重要技术，例如可收集特定酶切片段用于克隆或制备探针，回收PCR 产物用于再次鉴定等。回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会大大增加前期的工作量。
本实验采用的是DNA 凝胶回收试剂盒，其原理是：在凝胶融化液中凝胶块被迅速融化并释放出DNA 。加入高离液序列溶液后DNA 片段被选择性吸附到silica 膜上。经洗涤去除残留在silica 膜上的杂质和高浓度盐离子后，吸附到silica 膜上的DNA 片段经微量水或El μent 洗脱下来，即可用于各种分子生物学实验。
三 【试剂】
1×TAE 电泳缓冲液；溴化乙锭溶液（EB ）；琼脂糖；6×加样缓冲液；DNA 凝胶回收试剂盒（从公司购买）。
四 【仪器设备及材料】
1 材料：实验三所得PCR 产物（未经纯化）
2 仪器：电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、紫外透射仪、微波炉、台式离心机、移液器、恒温孵育器（55~65℃）、1.5ml 离心管、刀片、酒精灯。
五 【实验步骤】
1、按常规方法将实验三的PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳（依据上样量的多少制胶）。
2、在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶。
3、称量凝胶重量，以1mg=1μl换算凝胶体积。
4、加入一定量的溶胶缓冲液（具体参照试剂盒说明书）。
5、悬浮均匀后于55℃~65℃加热，期间每2~3min摇晃一次，直至凝胶块完全融化。
6、把DNA —琼脂糖溶液加到一个DNA 回收纯化柱上，并把柱子装在收集试管内，14000rpm 离心1ml ，弃去流出液（为提高回收率，可重复该步骤）。
*对于体积大于700μl 的样品，则分别加到不同的柱子上，每次700μl。
7、用700μl无水乙醇稀释的洗涤缓冲液洗涤柱子，加入柱子中后静置2~3min。室温下14000rpm 离心1min 。
8、弃滤液，以同样的方法再洗涤一次。
9、把柱子装在一个灭菌干净的1.5ml 离心管上，加入30~50μl的DNA 洗脱缓冲液或无菌去离子水到柱基质上，14000rpm 离心1min 以洗脱出DNA 。
10、取3~5μl样品，1%琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。
六 【注意事项】
PCR 产物的纯化选用直接纯化法还是胶回收法主要取决于PCR 产物。若PCR 产物电泳时为单一条带，可采用直接纯化法，即将酶、dNTP 等多余物质去掉便可；若PCR 产物电泳时为多条带，则要根据需要回收特定条带，此时须选用胶回收法。
实验五 大肠杆菌感受态细胞细胞的制备
一 【实验目的】
学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
二 【实验原理】
在进行基因克隆时，体外构建的DNA 重组子必须导入合适的受体细胞，才可以复制，增殖和表达。裸露的外源DNA 直接进入细胞体内称为转化。载体与外源目的基因构成的重组载体可以通过转化直接导入受体细胞，从而实现基因在异源细胞的表达。进行转化时，要求细胞处于容易吸收外源DNA 的状态，即感受态，重组分子才能进入细胞内。
通过CaCl 2 处理的大肠杆菌细胞就是一种感受态细胞。在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。DNA 可吸附于其表面。在短暂的热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。
带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内可表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
三 【试剂】
1、LB 液体培养基：胰蛋白胨10.0 g/L 、酵母提取物5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L用NaO 调pH 值至7.0，高压灭菌。固体培养基需加1％琼脂粉。
2、0.05mol/L CaCl2溶液：称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml 重蒸水中，定容至100ml ，高压灭菌。
3、含15%甘油的0.05mol/L CaCl2： 称取0.28g CaCl2（无水，分析纯），溶于50ml 重蒸水中，加入15ml 甘油，定容至100ml ，高压灭菌。
四 【仪器设备及材料】
E.coli DH5α菌株、eppendorf 管、恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、制冰机、分光光度计、微量移液枪、高压灭菌锅。
五 【实验步骤】
1、用无菌牙签在LB 平板上挑取新培养的E.coli DH5α单菌落，接种到盛有4 mL LB 液体培养基的7 mL 离心管中，37℃，280 r/min于恒温摇床培养10 h；
2、将上述培养物按照体积比1:100放大于装有100 mL LB液体培养基的250 mL锥形瓶中继续培养2~3 h至OD 600=0.3~0.4左右；
3、将上述培养物转入50 mL无菌离心管中，冰浴10 min；
4、4℃，5 000 r/min条件下离心5 min，尽可能将上清去干净；
5、用5~10 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬沉淀物；
6、4℃，5 000 r/min条件下离心5 min；
7、去上清液，用500 µL 冰预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重悬沉淀物，然后加入油甘至其终浓度为15％，按100 µL/份分装，放在-70℃冰箱备用。
六 【注意事项】
1、 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD 600来控制。DH5α菌株的OD 600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右（不同的菌株情况有所不同），这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
2、质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA 应主要是超螺旋态DNA （cccDNA ）。转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng 的cccDNA 即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。
3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl 2 等均需是最高纯度的（GR. 或AR. ），并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4、防止杂菌和杂DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip 头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA 所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA 的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
本实验方法也适用于其它E.coli 受体菌株的不同的质粒DNA 的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩（如离心），才能较准确的计算转化率。
实验六 PCR 产物的T/A克隆及重组子的筛选
一 【实验目的】
1、掌握PCR 产物的T/A克隆的原理及方法法。
2、了解转化子筛选的原理和一般方法。
3、掌握抗性筛选及蓝白斑筛选原理及学会蓝白斑筛选操作过程。
二 【实验原理】
1、PCR 产物的T/A克隆原理
通过PCR 的方法扩增目的基因片段的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA 序列，获得的目的片段通常需要通过TA 克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA 序列。TA 克隆系统由Invitrogen 公司（San Diego，CA ）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR 产物的克隆和测序。其原理是利用Taq 酶能够在PCR 产物的3’末端加上一个非模板依赖的A ，而T 载体是一种带有3’T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS ）中。
由于在PCR 过程中，使用的DNA 聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）使用不同的Taq 酶，在PCR 扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq 酶可以在扩增产物的3末端加上A ，因此PCR 产物回收纯化后可以和T 载体直接连接。（2）使用高保真的DNA 聚合酶，如pfu 酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A ，得到的DNA 序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A 的过程，通常是以PCR 回收产物为模板，加上一定量的普通Taq 酶和反应液，加入dATP （或dNTP ）， 72℃ 10分钟，然后将加A 产物直接用于TA 连接。
2重组子的筛选原理
在转化过程中，并非每个宿主细胞都被转化，即使获得转化的细胞，也并非都含目的基因，可能含有自身形成环状的在体分子，一个载体与两个外源DNA 形成的重组子，或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。因此转化后须在不同层次、不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子，以及鉴定所需的特异性重组子。
（1）克隆载体具有抗生素抗性基因，如：Amp 、Ter 、Kan 等。外源基因插在抗性基因之外，这个重组子转化入宿主后，宿主就具有了抗生素抗性，因而在含抗生素
的培养基中，只有阳性重组子才能生长。但有些单酶切的情况下，连接时有可能出现反向连接或自身环化，所以还需要进行酶切鉴定。
（2）蓝白筛选是通过插入失活lacZ 基因，破坏重组子与宿主之间的ɑ-互补作用来鉴别重组子与非重组子的筛选方法，是携带lacZ 基因的许多载体的筛选优势。这些载体包括M13噬菌体，pUC 质粒系列，pEGM 质粒系列等。它们的共同特点是载体上携带一段细菌lacZ 基因的α肽编码序列，其编码产物为β-半乳糖苷酶的α肽。当无外源DNA 插入时，质粒表达α肽。突变型Lac-E.Coli 可表达该酶的ω肽。单独存在的α及ω肽均无β-半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达这两个肽时，宿主细胞内才有β-半乳糖苷酶活性，在含有底物X-gal(5-溴－4－氯－3－吲哚－ β－D －半乳糖苷) 的诱导剂IPTG （异丙基硫代－ β－D －半乳糖苷）条件下，菌落呈蓝色，这就是α-互补。如果LacZ 基因由于插入外源基因而失活，结果无α肽表达，转化菌落无α-互补，缺乏β-半乳糖苷酶活性，在含有X-gal 培养板上为白色菌落，而载体自身环化后转化的细菌为蓝色菌落。由于这种颜色标志，重组子与非重组子的区别一目了然，可以很容易将之区分。
三 【试剂】
T 载体试剂盒（从公司购买）、实验五制备的DH5α大肠杆菌感受态细胞，
四 【仪器设备及材料】
1、材料：实验四回收的PCR
2、仪器：低温恒槽、移液器、超净工作台、制冰机、产物
五 【实验步骤】
1、连接反应一般在灭菌的0.2mlPCR 薄壁管中进行。
2、10μl体积反应体系如下：
（1）取T 载体1μl (50ng)，加入PCR 产物（T 载体: PCR产物摩尔数为1:3~10）。
（2）加入含ATP 的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位，用ddH 2O 补足至10μl 。
连接反应体系如下（10 µL 反应体系）
1）2×Ligase buffer
2）GEM-T Vector 5 µL 1 µL
3）T 4 DNA Ligase （3U/µL ） 1 µL
4）PCR 回收产物 3 µL
3、混匀，稍加离心，通常为14-16℃水浴连接8-14hr ，或4℃过夜。
4、转染。
（1） 将装有100 µL E.coli D H5α感受态细胞的1.5 mL离心管置于冰上，让其在冰浴中慢慢溶解；
（2） 加入3～10 µL 连接反应液，混匀后，冰浴30 min；
（3） 42℃水浴中热激处理90 S；
（4） 快速冰浴冷却2～3 min；
（5） 加入400 µL LB 液体培养基，混匀后，37℃恒温振荡培养1h ，然后涂布于含有相应抗生素及100 µL X-gal（20 mg/mL）和20 µL IPTG（100 m mol/L）的LB 固体培养基上，涂后晾干10～15 min，于在37℃培养16～20 h。
（6） 同时做两个对照：
对照组1： 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。
对照组2： 以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB 平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
（7） 计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
转化频率（转化子数／每mg 质粒DNA ）＝转化子总数／质粒DNA 加入量（mg ） 感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
六 【注意事项】
1、要获得目的基因的TA 克隆，PCR 产物的特异性要好。
2、PCR 产物在TA 克隆前要通过纯化。
3、在PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA 污染。
实验七 重组子的鉴定
一 【实验目的】
通过实验，掌握质粒滞后实验、PCR 扩增技术及酶切在重组子的鉴定过程的应用及操作技术。
二 【实验原理】
载体插入外源DNA 片段后，分子量变大，电泳时相对空载体要跑得慢，称之为滞后现象；如果载体入外源DNA 片段后，可依据该片段序列设计引物，利用PCR 扩增技术扩增出大小相等的DNA 片段，可通过电泳观察；如果载体入外源DNA 片段则可依据载体多克隆位点的进行酶切酶切检测，可通过电泳观察到切下的大小相等的DNA 片段。
三 【试剂】
1、氨苄青霉素（Amp ）：用无菌水配制成100mg/mL溶液，置 -20℃冰箱保存。
2、含Amp 的LB 液体培养基：将配好的LB 液体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp 储存液，使终浓度为50ug/ml。
3、溶液Ⅰ：50 m mol/L Tris·Cl （pH 8.0），10 m mol/L EDTA（pH 8.0）
4、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH（10 mol/L贮存液用时稀释），1 % SDS
5、溶液 Ⅲ：5 mol/L乙酸钾 60 mL，冰乙酸 11.5 mL，水 28.5 mL 8
6、TE 缓冲液：10 m mol/L Tris·Cl （pH 8.0），1 m mol/L EDTA（pH 8.0）
7、PCR 扩增所需试剂同实验三。
8、限制性内切酶。
四 【仪器设备及材料】
1、材料：实验五制备的感受态细胞，实验六T/A克隆连接产物。
五 【实验步骤】
1、大肠杆菌质粒DNA 小量碱法提取及滞后实验
（1）用无菌牙签从平板上挑取蓝白斑中的白色菌斑，置于装有4 mL LB液体培养基的7 mL 离心管中，37℃，300 r/ min 振荡培养12～16 h；
（2）将培养液转到1.5 mL 离心管中，12 000 r/ min 离心1 min，倒掉上清液，最后吸干菌液；
（3）加入200 µL 溶液Ⅰ，重悬细胞；
（4）加入200 µL 的溶液Ⅱ，轻轻振荡4～5次，室温静置2～3 min；
（5）加入200 µL 溶液Ⅲ，振荡4～5次，4℃，12 000 r/ min离心5 min；
（6）将上清液转入一新离心管（500 µL ），加入等体积的氯仿和酚（氯仿:酚＝1:1），振荡4～5次，4℃，12 000 r/ min离心5 min （如果蛋白多可抽提2遍）；
（7）吸取450 µL 上清液转入1.5 mL离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，在-20℃冰箱中放置30 min以上；
（8）取出，4℃，12 000 r/ min离心5 min，倒掉上清液，吸干酒精，用70%酒精洗涤沉淀2遍；
（9）用加有RNase 的TE 缓冲液 15 μL 溶解沉淀，电泳检测滞后。
2、重组质粒的PCR 及酶切鉴定
（1）以上述电泳检测滞后的质粒为模板进行PCR 鉴定，鉴定方法与PCR 扩增方法相同。
（2）将PCR 鉴定所得阳性重组质粒用Xho I、Kpn I双酶切鉴定，反应体系如下（10 µL ）：
1） 质粒 8.0 µL
2） 10×buffer 1.0 µL
3） Xho I （10U/µL ） 0.5 µL
4） Kpn I （10U/µL ） 0.5 µL
37℃酶切过夜，将酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。