利用不同的方法筛选和鉴定转化子
作者
学院:生命科学学院
班级:XXXX
学号:XXXXX
同组人员:XXX
摘要:本实验通过使用限制性内切酶切割质粒，用定向克隆的方法相连，并转化到大肠杆菌中，然后对转化产物进行了筛选和鉴定. 从所得的五个转化子中，经过PCR 、琼脂糖电泳鉴定，摇瓶发酵，观察是否有绿色荧光蛋白基因筛选出有重组质粒的大肠杆菌.
关键词: PCR 酶切重组质粒大肠杆菌凝胶电泳
1 引言
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点. 在实际工作中，由于量少，连接产物没有也不可能再经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒. 同时，细菌的转化效率极低，进行转化后，绝大部分细菌是没有被转化的. 因此有必要对转化产物进行筛选和鉴定.
首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子. 因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以，将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落.
其次，通过菌落直接PCR 从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子. 但因为PCR 技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果. 因此有必要进一步进行鉴定.
从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了GFP 荧光蛋白。
2材料与方法
2.1 材料:实验九所得转化子
2.2 设备用具：PCR 仪，恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，凝胶成像系统装置，三角瓶电热恒温培养箱，电泳仪，超净台，移液枪，1.5mL 离心管
2.3 试剂
rTaq 酶：10×PCR buffer；dNTP mixtures(10mM)
前向引物P1：5’-CGCGAA TTCA TGGCAGATCAG-3’
反向引物P2：5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCA TCA TAACTTTGACACAAA-3’
限制性核酸内切酶Hind Ⅲ；；ddH2O ；限制性核酸内切酶缓冲液:10×M buffer，0.5×TBE buffer ；EB 母液；质粒提取试剂；酶切试剂；酶反应终止液；1%琼脂糖；无菌蒸馏水；6×loading buffer；矿物油.
LB 液体培养基
配方:称胰蛋白胨7g ，酵母提取物3.5g ，NaCl7g 于1000ml 的三角瓶中，加入700ml 蒸馏水搅拌溶解，然后用NaOH 调pH 至7.5，加塞，包扎瓶口，高温蒸汽灭菌备用。
2.2 方法
2.2.1 转化子的筛选
选出在实验九中，LB 固体培养基上生长出来的白色菌落. 选取五个，做好标记.
2.2.2 菌落直接PCR
用无菌牙签分别挑取5个白色单菌落，在编好号码的PCR 反应管中的底部分别涂抹，然后在PCR 管仲配制75μL 反应体系. 反应体系如下:
DNA template buffer 用牙签挑取菌落在PCR 管中涂抹
10×PCR buffer 7.5μL
dNTP mixture 6μL
前向引物(P1) 3μL
后向引物(P2) 3μL
rTaq 酶1μL
ddH2O 54.5μL （up to 75μL ）
所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心即可. 为了防止反应混合液蒸发，最后添加15μL 矿物油.
PCR 仪的参数设置
94℃ 4min
94℃ 30s
62℃ 30s 35 cycles
72℃ 30s
72℃ 5min
琼脂糖凝胶电泳检测:
反应结束后，取10μL 产品，加入2μL 6×loading buffer，混匀后点样，电泳15min. 观察产物带.
2.2.3 质粒提取及大小鉴定:
照上述电泳的结果，用无菌牙签从平板上挑选出2个PCR 反应阳性菌落，接种于含Amp10μg/mL的10mL LB液体培养基中，37℃下震荡培养24h ，观察实验结果，并以别组的结果没有绿色荧光蛋白基因的液体培养基作为阴性对照，对比观察并拍照记录。(附LB 液体培养基的配制方法)
LB 液体培养基配制方法:称取胰蛋白胨7g ，NaCl 7g, 酵母提取物3.5g 于1000ml 三角瓶中，加入700ml 蒸馏水搅拌溶解，放入高压灭菌锅中灭菌备用，每个同学使用时，每个液体培养基只需要10ml 左右。
3实验结果
3.1 PCR 产物电泳图
图1菌落直接PCR 产物电泳图
3.2 液体培养基观察绿色荧光
图 2 液体培养基大肠杆菌绿色荧光现象图
4实验结果分析
4.1 菌落直接PCR 结果
在上一次的转化试验中，在含有氨苄青霉素的培养基中，有大量的大肠杆菌生长，我从中挑选出5个菌落直接PCR 。进行凝胶电泳后，结果如图1所示. 图1中，1、3为阳性转化子，2 、4 、5为阴性转化子，因此，5个菌落中有2个（1、3）呈阳性。再对比marker 可知，1、3的窄条带大小均为768bp ，与GFP 片段大小相符。综上初步判断，1、3所代表的菌落为所需鉴定的转化子。
4.2 质粒提取与大小鉴定
在质量相同的情况下，各种DNA 的迁移率为超螺旋>线性>开环. 由于DNA 分子的构型不同，电泳时受到阻力不同，导致了泳动速率的不同. 对于相对分子质量相同的DNA 分子，其物理构象越接近球状，泳动时遇到的阻力就越小，速率越快. 所以，共价闭合环状超螺旋的构象最接近球状，速率最快，因此从电泳结果看，（结果如图1所示）在碱基数约为100处有条带且条带较宽，说明酶切不是非常完全，但是相比其他组的酶切效果，也算是比较理想。编号为1和3的菌落的碱基数接近768bp, 符合实验所需的绿色荧光基因的碱基数，而2、4、5号菌均无碱基数为768bp 左右的条带，说明在其转化到大肠杆菌的载体中没有连接目的基因（可能是非目的基因与载体相连），故对符合实验需求的1号和3号进行摇菌。
4.2 目的基因表达
以别的组的没有绿色荧光的液体培养基作为阴性对照，用蓝光灯照射可明显看出，本实验中电泳鉴定出碱基数接近768bp 所对应的1号和3号大肠杆菌菌落均含有目的基因和载体结合的重组质粒，且在摇瓶培养后，均表达了绿色荧光基因，因此可以判断，在第八次实验的PCR 的纯化与定向克隆以及第九次实验的转化实验均非常成功。
5结论或讨论
5.1结论
证实了转化试验中所得到的，标号为1和3的转化子为重组子，其电泳结果显示其碱基数约为768bp 且含有目的基因GFP （绿色荧光蛋白基因）。
5.2综合讨论
实验材料由转化实验所得，这次实验是从另一面去检验实验八的定向克隆和实验九的转化效率。从结果来看，实验八和实验九均非常成功，所以才有本试验中，绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌的表达。
另外，从这个试验中，我得到了一些教训，将在下面一一列出：
1、要善于和别人合作，提高效率；由于这个实验中，我们要处理5个菌落，且既要配制PCR 反应体系，又要配制培养基。因此，合理的分工显得格外重要。比如可让一个同学做辅助性步骤（如调好移液枪等），另一个同学专心做主要的步骤，这样可节省许多时间。
2、实验时要细心，由于加的试剂比较多，且加的量都很小，因此要注意严格控制加入试剂。注意不要加错试剂或者加多试剂、防止细菌污染样品、调准仪器等，否则实验将不能顺利进行。
3、基因工程实验的仪器设备比较贵重，故一个实验室的仪器设备十分有限，而一个实验室做实验的有三四十人，因此为了赶上大家的进度，我们很容易会做得很急，但是正因为我们做得太急了，所以容易出错，导致重做。因此，要想把实验做好，则思路要清晰，一步一步来，不能急，对于一些相似的试剂，例如10 x loading buffer和10×M buffer非常相似，更要小心不能加错, 否则都要重做, 更加跟不上大家的进度，因此，做基因工程的实验，细心，耐心是非常重要的，因为欲速则不达，另外，遇到不懂的问题要善于同学之间相互讨论，若还是不懂，则主动寻求老师的帮助。
最后，特别感谢在基因工程实验这一门实验课中给予我帮助的老师与同学，感谢XXX 老师每节课耐心地给我们讲授知识，也要感谢XXX 老师的教导和实验员刘老师每节课都为我们准备实验材料和各种试剂，以及指导我们配置溶液和电泳所用的凝胶以及为我们答疑。如果没有各位老师的教导，我们的实验也不可能这么成功！同时，非常感谢帮助过我的同学们，有你们的帮助，让我更好地完成实验。
6参考文献
[1] 田长恩. 生物工程上游技术实验指导.2008.6
[2] 孙明，基因工程，高等教育出版社，2007年12月
[3] 朱玉贤，李毅，郑晓峰，现代分子生物学，高等教育出版社，2007年11月
利用不同的方法筛选和鉴定转化子
作者
学院:生命科学学院
班级:XXXX
学号:XXXXX
同组人员:XXX
摘要:本实验通过使用限制性内切酶切割质粒，用定向克隆的方法相连，并转化到大肠杆菌中，然后对转化产物进行了筛选和鉴定. 从所得的五个转化子中，经过PCR 、琼脂糖电泳鉴定，摇瓶发酵，观察是否有绿色荧光蛋白基因筛选出有重组质粒的大肠杆菌.
关键词: PCR 酶切重组质粒大肠杆菌凝胶电泳
1 引言
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点. 在实际工作中，由于量少，连接产物没有也不可能再经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒. 同时，细菌的转化效率极低，进行转化后，绝大部分细菌是没有被转化的. 因此有必要对转化产物进行筛选和鉴定.
首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子. 因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以，将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落.
其次，通过菌落直接PCR 从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子. 但因为PCR 技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果. 因此有必要进一步进行鉴定.
从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了GFP 荧光蛋白。
2材料与方法
2.1 材料:实验九所得转化子
2.2 设备用具：PCR 仪，恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，凝胶成像系统装置，三角瓶电热恒温培养箱，电泳仪，超净台，移液枪，1.5mL 离心管
2.3 试剂
rTaq 酶：10×PCR buffer；dNTP mixtures(10mM)
前向引物P1：5’-CGCGAA TTCA TGGCAGATCAG-3’
反向引物P2：5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCA TCA TAACTTTGACACAAA-3’
限制性核酸内切酶Hind Ⅲ；；ddH2O ；限制性核酸内切酶缓冲液:10×M buffer，0.5×TBE buffer ；EB 母液；质粒提取试剂；酶切试剂；酶反应终止液；1%琼脂糖；无菌蒸馏水；6×loading buffer；矿物油.
LB 液体培养基
配方:称胰蛋白胨7g ，酵母提取物3.5g ，NaCl7g 于1000ml 的三角瓶中，加入700ml 蒸馏水搅拌溶解，然后用NaOH 调pH 至7.5，加塞，包扎瓶口，高温蒸汽灭菌备用。
2.2 方法
2.2.1 转化子的筛选
选出在实验九中，LB 固体培养基上生长出来的白色菌落. 选取五个，做好标记.
2.2.2 菌落直接PCR
用无菌牙签分别挑取5个白色单菌落，在编好号码的PCR 反应管中的底部分别涂抹，然后在PCR 管仲配制75μL 反应体系. 反应体系如下:
DNA template buffer 用牙签挑取菌落在PCR 管中涂抹
10×PCR buffer 7.5μL
dNTP mixture 6μL
前向引物(P1) 3μL
后向引物(P2) 3μL
rTaq 酶1μL
ddH2O 54.5μL （up to 75μL ）
所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心即可. 为了防止反应混合液蒸发，最后添加15μL 矿物油.
PCR 仪的参数设置
94℃ 4min
94℃ 30s
62℃ 30s 35 cycles
72℃ 30s
72℃ 5min
琼脂糖凝胶电泳检测:
反应结束后，取10μL 产品，加入2μL 6×loading buffer，混匀后点样，电泳15min. 观察产物带.
2.2.3 质粒提取及大小鉴定:
照上述电泳的结果，用无菌牙签从平板上挑选出2个PCR 反应阳性菌落，接种于含Amp10μg/mL的10mL LB液体培养基中，37℃下震荡培养24h ，观察实验结果，并以别组的结果没有绿色荧光蛋白基因的液体培养基作为阴性对照，对比观察并拍照记录。(附LB 液体培养基的配制方法)
LB 液体培养基配制方法:称取胰蛋白胨7g ，NaCl 7g, 酵母提取物3.5g 于1000ml 三角瓶中，加入700ml 蒸馏水搅拌溶解，放入高压灭菌锅中灭菌备用，每个同学使用时，每个液体培养基只需要10ml 左右。
3实验结果
3.1 PCR 产物电泳图
图1菌落直接PCR 产物电泳图
3.2 液体培养基观察绿色荧光
图 2 液体培养基大肠杆菌绿色荧光现象图
4实验结果分析
4.1 菌落直接PCR 结果
在上一次的转化试验中，在含有氨苄青霉素的培养基中，有大量的大肠杆菌生长，我从中挑选出5个菌落直接PCR 。进行凝胶电泳后，结果如图1所示. 图1中，1、3为阳性转化子，2 、4 、5为阴性转化子，因此，5个菌落中有2个（1、3）呈阳性。再对比marker 可知，1、3的窄条带大小均为768bp ，与GFP 片段大小相符。综上初步判断，1、3所代表的菌落为所需鉴定的转化子。
4.2 质粒提取与大小鉴定
在质量相同的情况下，各种DNA 的迁移率为超螺旋>线性>开环. 由于DNA 分子的构型不同，电泳时受到阻力不同，导致了泳动速率的不同. 对于相对分子质量相同的DNA 分子，其物理构象越接近球状，泳动时遇到的阻力就越小，速率越快. 所以，共价闭合环状超螺旋的构象最接近球状，速率最快，因此从电泳结果看，（结果如图1所示）在碱基数约为100处有条带且条带较宽，说明酶切不是非常完全，但是相比其他组的酶切效果，也算是比较理想。编号为1和3的菌落的碱基数接近768bp, 符合实验所需的绿色荧光基因的碱基数，而2、4、5号菌均无碱基数为768bp 左右的条带，说明在其转化到大肠杆菌的载体中没有连接目的基因（可能是非目的基因与载体相连），故对符合实验需求的1号和3号进行摇菌。
4.2 目的基因表达
以别的组的没有绿色荧光的液体培养基作为阴性对照，用蓝光灯照射可明显看出，本实验中电泳鉴定出碱基数接近768bp 所对应的1号和3号大肠杆菌菌落均含有目的基因和载体结合的重组质粒，且在摇瓶培养后，均表达了绿色荧光基因，因此可以判断，在第八次实验的PCR 的纯化与定向克隆以及第九次实验的转化实验均非常成功。
5结论或讨论
5.1结论
证实了转化试验中所得到的，标号为1和3的转化子为重组子，其电泳结果显示其碱基数约为768bp 且含有目的基因GFP （绿色荧光蛋白基因）。
5.2综合讨论
实验材料由转化实验所得，这次实验是从另一面去检验实验八的定向克隆和实验九的转化效率。从结果来看，实验八和实验九均非常成功，所以才有本试验中，绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌的表达。
另外，从这个试验中，我得到了一些教训，将在下面一一列出：
1、要善于和别人合作，提高效率；由于这个实验中，我们要处理5个菌落，且既要配制PCR 反应体系，又要配制培养基。因此，合理的分工显得格外重要。比如可让一个同学做辅助性步骤（如调好移液枪等），另一个同学专心做主要的步骤，这样可节省许多时间。
2、实验时要细心，由于加的试剂比较多，且加的量都很小，因此要注意严格控制加入试剂。注意不要加错试剂或者加多试剂、防止细菌污染样品、调准仪器等，否则实验将不能顺利进行。
3、基因工程实验的仪器设备比较贵重，故一个实验室的仪器设备十分有限，而一个实验室做实验的有三四十人，因此为了赶上大家的进度，我们很容易会做得很急，但是正因为我们做得太急了，所以容易出错，导致重做。因此，要想把实验做好，则思路要清晰，一步一步来，不能急，对于一些相似的试剂，例如10 x loading buffer和10×M buffer非常相似，更要小心不能加错, 否则都要重做, 更加跟不上大家的进度，因此，做基因工程的实验，细心，耐心是非常重要的，因为欲速则不达，另外，遇到不懂的问题要善于同学之间相互讨论，若还是不懂，则主动寻求老师的帮助。
最后，特别感谢在基因工程实验这一门实验课中给予我帮助的老师与同学，感谢XXX 老师每节课耐心地给我们讲授知识，也要感谢XXX 老师的教导和实验员刘老师每节课都为我们准备实验材料和各种试剂，以及指导我们配置溶液和电泳所用的凝胶以及为我们答疑。如果没有各位老师的教导，我们的实验也不可能这么成功！同时，非常感谢帮助过我的同学们，有你们的帮助，让我更好地完成实验。
6参考文献
[1] 田长恩. 生物工程上游技术实验指导.2008.6
[2] 孙明，基因工程，高等教育出版社，2007年12月
[3] 朱玉贤，李毅，郑晓峰，现代分子生物学，高等教育出版社，2007年11月