大肠埃希氏菌O157：H7检测方法研究进展
摘要：大肠埃希氏菌O157∶H7 是肠出血性大肠杆菌的主要病原血清型, 可引起腹泻、出血性肠炎, 极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜两种严重的并发症, 死亡率高，因此快速准确地检测这种病原菌对预防和控制由其引起腹泻有着十分重要的作用。本文介绍了大肠埃希氏菌O157∶H7 实验室检测方法的研究进展，主要包括微生物学检验方法中的细菌分离培养和快速酶触反应法、免疫学检测法、ISO-GRID检测系统、免疫捕获LAMP法、PCR法、DNA探针技术等分子生物学方法。
关键词：大肠埃希氏菌O157∶H7、检测方法、研究进展
大肠埃希氏菌（E.Coli简称大肠杆菌）于1885年由德国科学家T。Escherich从健康婴儿粪便中分离并命名[1]。
根据毒力基因、致病性、致病机理、临床症状、流行病学特点和血清分型等，国际上将致泻性大肠埃希氏菌分为6类，即：肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）和肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）以及近来发现的肠产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠埃希氏菌（ESIES）[2;3;4]。
大肠杆菌O157∶H7 是肠出血性大肠杆菌的主要病原血清型, 可引起腹泻、出血性肠炎, 极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜两种严重的并发症, 死亡率高[5]。于1982 年在美国被首次发现，此后在世界各地散发或地方流行，1996 年在日本大阪地区发生流行，患者逾万，死亡11 人，1999—2000 年在中国江苏、安徽等地发生了多起食源性感染O157:H7 事件，导致l77 人死亡[6;7]。世界卫生组织已将O157:H7 列为新的食源性病原菌。
一、大肠埃希氏菌O157:H7病原学特点
EHEC O157:H7 属于肠杆菌科埃希氏菌属，具有一般大肠杆菌的形态特征的同时又有区别于一般大肠杆菌的特征[8]：
1、为革兰氏阴性、无芽孢直杆菌，大多数菌株以周生鞭毛运动；
2、在普通营养琼脂培养基上为光滑型菌落，有光泽，湿润，灰白色；
3、最适生长温度为33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，45.5℃停止生长；
4、不耐热，在75℃一分钟即可被杀灭；对氯敏感，在有效氯含量0.4 ppm 以
上的水体中难以存活；
5、具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小时；
6、温度低于5 ℃的环境中生存，在-20 ℃可存活9 个月；
7、可产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子，SLT抗力很高，经80 ℃处理30 min 仍具有活性；
8、发酵多种碳水化合物，但不发酵或迟缓发酵山梨醇，也不能产生葡萄糖酸苷酶。
二、大肠埃希氏菌O157:H7流行特点和临床症状特点
2.1流行特点
O157：H7的感染和暴发流行多发生在发达国家, 但我国近年来多数省市已有该菌的检出和感染病例报告,局部暴发流行和散发病例时有发生。目前该菌的感染无论在发达国家还是发展中国家, 都受到广泛关注。
1.季节性：，主要发生在夏秋两季，春冬季发病相对较少，7 月到8 月为发病高峰期，此外，雨季也是感染的易发季节。
2.地区分布：多发生于发达国家，主要以散发性为主。
3.易感人群：儿童5-9岁、老人50-59岁明显高于其它年龄组，最小3个月，最大85岁。
4.宿主：是一种动物源性传染病，奶牛，尤其是放牧的小牛是其主要储存宿主，从腹泻患者、畜禽粪便、市售肉类以及猪、鸽、鸡、鸭等动物中也有分离到O157:H7 的报道[9]。
5.传播途径：以食源性传播为主，水源性传播和接触传播也是重要的传播途径。牛肉、生奶、鸡肉及其制品，蔬菜、水果及制品等均可引起污染，其中牛肉是最主要的传播载体。
6.感染力：O157:H7 具有较强的感染力，一般大肠杆菌需要100 万个活菌才可引起发病，而O157:H7 只需100 到200 个活菌即可突破胃酸屏障，引发感染。
2.2临床症状
牛：是O157:H7 的主要携带者，但成年牛一般不会发病，只有犊牛才会出现腹泻症状。
猪：感染O157:H7后可导致水肿病，以头部，肠系膜和胃壁浆液性水肿为主
要特征，且常伴有共济失调，麻痹或惊厥等神经症状，发病率较低但死亡率很高。
人：易感O157:H7 ，大多急性发病，常突然发生剧烈腹痛和非血性腹泻，数天后出现血性腹泻，低热或不发热。表现为水样便、粘液便或脓血便，在有的病例中，取得的粪便样品甚至是“只有血没有粪渣”，可见出血性腹泻的程度[7]。
三 、大肠埃希氏菌O157：H7的检验方法
大肠埃希氏菌O157:H7 感染已成为全球性的公共卫生和食品安全问题，对其进行快速、特异的检测对于该病的早期诊断及疫情有效控制至关重要。生物技术的发展为EHEC O157:H7 的实验室诊断提供了许多有效的手段和方法。
3.1 微生物检验方法
3.1.1细菌分离培养
该方法是大肠埃希氏菌O157：H7常见的诊断方法，为分离培养 + 生化试验鉴定 + 血清试验分型，首先是细菌分离培养：可以用显色培养基对O157:H7 进行初筛，目前常规使用山梨醇麦康凯琼脂培养基（SMAC）对菌株进行分离和筛选，在正常条件下，EHEC O157:H7 不能发酵山梨醇，在SMAC 琼脂上呈现为无色或者灰色菌落，而其他大肠杆菌则呈红色菌落[10]。经初步分离培养后进一步通过血清学实验进行鉴定，目前常用的血清学诊断方法有玻片凝集试验、乳胶凝集试验和ELISA 法等。
检测方法不需特殊仪器， 简单易行， 费用低，但所需时间长 （一般需 7d 左右 ），检测周期长并易受人为因素干扰。有报道 EHEC O157： H7 与枸橼酸杆菌、 EIEC与志贺菌中的某些血清型出现抗原交叉反应较为多见[11]，所以大肠埃希氏菌O157的鉴定需要分离培养 + 生化试验鉴定 + 血清试验分型综合分析
[12]。
3.1 .2 快速酶触反应显色培养基法
快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将它们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，成为今后微生物检测发展的一个重要发展方向[13]。
3.2 免疫学检测方法
免疫血清学检测技术是利用抗原和抗体之间的特异性反应，通过检测标记在反应物上的示踪物，对抗原或抗体进行定性或定量测定的快速检测技术。根据标记物的不同，应用于大肠埃希氏菌O157检测中的方法主要有：酶联免疫吸附分析法、荧光免疫测定技术、免疫胶体金标记技术、免疫磁珠分离技术、蛋白芯片检测技术及斑点金免疫渗滤法等[14;15;16]。
虽然免疫学检测技术具有快速、 可批量操作、 特异性强、 敏感度高、 检测重复性好等优点，但由于抗原抗体存在交叉反应，使检测的结果可能出现假阳性，因而只能对样品进行初检。
3.3 ISO－GRID检测系统
ISO－GRID检测系统是一种基于疏水性网膜（HGMF）的过滤系统。该系统通过使用这种含有1600个小方格的滤膜，来对微生物进行检测或计数。
此方法快速简便，重复性好，而且，除大肠杆菌O157﹕H7外，还适用于沙门氏菌、酵母、霉菌、大肠菌群及大肠杆菌的检测和计数。
3.4PCR法
PCR技术原理为提高DNA探针的敏感性，可先将靶DNA序列扩增，增加DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。应用于大肠埃希氏菌O157检测中的PCR方法主要有：免疫捕获PCR法、荧光定量PCR技术、复合PCR方法[17]等。
免疫捕获PCR法：根据特异性抗体与病原菌菌体抗原特异性结合的免疫学原理, 将特异性抗体包被于磁珠或PCR 管壁上, 富集或捕获菌悬液和标本中的病原菌, 再进行PCR 反应, 即可检测目标病原菌[18]。即应用免疫磁珠捕获法和抗体包被微量PCR 管免疫捕获法富集标本中的E.coli O157∶H7 , 再以PCR 法快速检测O157 抗原编码基因, 以期更为快速且高灵敏度[19]。
荧光定量PCR技术：其特异性好, 灵敏度高, 检测速度快, 自动化程度高高等特点, 已被广泛应用于微生物学检测中[20;21]。
3.5 DNA探针技术
DNA探针技术是最新发展起来的一项特异、灵敏、快速的检测方法，但因有一定比例的假阳性反应，故所有阳性结果必须用标准的培养方法加以确证，
原理用特异性的DNA探针进行E.coliO157:H7核糖体RNA（rRNA）的检测。待检样品经前增菌、选择性增菌和后增菌后，溶解细菌。加入标记好的E.coliO157:H7异性的DNA探针用于液相杂交。如果待检样品中存有E.coliO157:H7的rRNA，荧光素标记的检测探针和多聚脱氧腺嘌呤核苷酸(polydA)末端捕获探针将与目标rRNA序列进行杂交。然后把包被有多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(polydT)(固相)的测杆插入杂交溶液。PolydA和poldT之间进行碱基配对，便于探针捕获：目标杂种核酸分子结合在固体载体上，未接合的探针被冲洗掉。测杆被培养在辣根过氧化物酶-抗荧光素接合剂中。接合剂与存在于杂交检测探针上的荧光素标记物结合，未结合的剂被冲掉。并将测杆培养于酶底物-色原溶液中，辣根过氧化物酶与酶底物反应，将色原转变为蓝色化合物。一旦遇酸反应便停止，色原的颜色变为黄色。在450nm处测量吸收值，吸收值大于临界则表明在待检的样品中存有E.coliO157:H7。
3.6 免疫捕获LAMP法
免疫捕获LAMP法是基于免疫学方法与分子生物学方法相结合的一种病原菌快速检测的方法。免疫捕获可作为检测实际样品的预处理过程，根据特异性抗体与病原菌菌体抗原特异性结合的免疫学原理，将特异性抗体包被于酶标板上，捕获菌悬液和标本中的病原菌，有效去除了食品样品中抑制LAMP扩增的干扰成分，再进行LAMP反应，即可检测目标病原菌。与传统单一的LAMP检测相比，金婷婷等人采用的酶标板免疫捕获待测菌的方法，既大大缩短了增菌时间，又提高了检测结果的准确性和稳定性[22-26]。
除以上介绍的方法之外，其它一些检测方法有噬菌体分型、 脉冲场电 （PFGE）、限制片段长度多态性（RFLP）和扩增片段长度多态性（AFLP） 分析、生物传感器法[8]、溶解曲线分析方法细胞毒性试验[27;28]等也应用在大肠埃希氏菌O157:H7的检测中。虽然传统检测方法费时费力，但仍然是目前检测的金标准，而随着研究的不断深入，检测方法的改进和提高， 相信在不久的将来会实现快速、特异、准确、灵敏、大规模的检测致泻性大肠埃希氏菌，对快速有效的实施针对治疗， 及时救治生命， 预防食物中毒， 保障公众健康具有重大意义。
参考文献
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大肠埃希氏菌O157：H7检测方法研究进展
摘要：大肠埃希氏菌O157∶H7 是肠出血性大肠杆菌的主要病原血清型, 可引起腹泻、出血性肠炎, 极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜两种严重的并发症, 死亡率高，因此快速准确地检测这种病原菌对预防和控制由其引起腹泻有着十分重要的作用。本文介绍了大肠埃希氏菌O157∶H7 实验室检测方法的研究进展，主要包括微生物学检验方法中的细菌分离培养和快速酶触反应法、免疫学检测法、ISO-GRID检测系统、免疫捕获LAMP法、PCR法、DNA探针技术等分子生物学方法。
关键词：大肠埃希氏菌O157∶H7、检测方法、研究进展
大肠埃希氏菌（E.Coli简称大肠杆菌）于1885年由德国科学家T。Escherich从健康婴儿粪便中分离并命名[1]。
根据毒力基因、致病性、致病机理、临床症状、流行病学特点和血清分型等，国际上将致泻性大肠埃希氏菌分为6类，即：肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）和肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）以及近来发现的肠产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠埃希氏菌（ESIES）[2;3;4]。
大肠杆菌O157∶H7 是肠出血性大肠杆菌的主要病原血清型, 可引起腹泻、出血性肠炎, 极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜两种严重的并发症, 死亡率高[5]。于1982 年在美国被首次发现，此后在世界各地散发或地方流行，1996 年在日本大阪地区发生流行，患者逾万，死亡11 人，1999—2000 年在中国江苏、安徽等地发生了多起食源性感染O157:H7 事件，导致l77 人死亡[6;7]。世界卫生组织已将O157:H7 列为新的食源性病原菌。
一、大肠埃希氏菌O157:H7病原学特点
EHEC O157:H7 属于肠杆菌科埃希氏菌属，具有一般大肠杆菌的形态特征的同时又有区别于一般大肠杆菌的特征[8]：
1、为革兰氏阴性、无芽孢直杆菌，大多数菌株以周生鞭毛运动；
2、在普通营养琼脂培养基上为光滑型菌落，有光泽，湿润，灰白色；
3、最适生长温度为33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，45.5℃停止生长；
4、不耐热，在75℃一分钟即可被杀灭；对氯敏感，在有效氯含量0.4 ppm 以
上的水体中难以存活；
5、具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小时；
6、温度低于5 ℃的环境中生存，在-20 ℃可存活9 个月；
7、可产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子，SLT抗力很高，经80 ℃处理30 min 仍具有活性；
8、发酵多种碳水化合物，但不发酵或迟缓发酵山梨醇，也不能产生葡萄糖酸苷酶。
二、大肠埃希氏菌O157:H7流行特点和临床症状特点
2.1流行特点
O157：H7的感染和暴发流行多发生在发达国家, 但我国近年来多数省市已有该菌的检出和感染病例报告,局部暴发流行和散发病例时有发生。目前该菌的感染无论在发达国家还是发展中国家, 都受到广泛关注。
1.季节性：，主要发生在夏秋两季，春冬季发病相对较少，7 月到8 月为发病高峰期，此外，雨季也是感染的易发季节。
2.地区分布：多发生于发达国家，主要以散发性为主。
3.易感人群：儿童5-9岁、老人50-59岁明显高于其它年龄组，最小3个月，最大85岁。
4.宿主：是一种动物源性传染病，奶牛，尤其是放牧的小牛是其主要储存宿主，从腹泻患者、畜禽粪便、市售肉类以及猪、鸽、鸡、鸭等动物中也有分离到O157:H7 的报道[9]。
5.传播途径：以食源性传播为主，水源性传播和接触传播也是重要的传播途径。牛肉、生奶、鸡肉及其制品，蔬菜、水果及制品等均可引起污染，其中牛肉是最主要的传播载体。
6.感染力：O157:H7 具有较强的感染力，一般大肠杆菌需要100 万个活菌才可引起发病，而O157:H7 只需100 到200 个活菌即可突破胃酸屏障，引发感染。
2.2临床症状
牛：是O157:H7 的主要携带者，但成年牛一般不会发病，只有犊牛才会出现腹泻症状。
猪：感染O157:H7后可导致水肿病，以头部，肠系膜和胃壁浆液性水肿为主
要特征，且常伴有共济失调，麻痹或惊厥等神经症状，发病率较低但死亡率很高。
人：易感O157:H7 ，大多急性发病，常突然发生剧烈腹痛和非血性腹泻，数天后出现血性腹泻，低热或不发热。表现为水样便、粘液便或脓血便，在有的病例中，取得的粪便样品甚至是“只有血没有粪渣”，可见出血性腹泻的程度[7]。
三 、大肠埃希氏菌O157：H7的检验方法
大肠埃希氏菌O157:H7 感染已成为全球性的公共卫生和食品安全问题，对其进行快速、特异的检测对于该病的早期诊断及疫情有效控制至关重要。生物技术的发展为EHEC O157:H7 的实验室诊断提供了许多有效的手段和方法。
3.1 微生物检验方法
3.1.1细菌分离培养
该方法是大肠埃希氏菌O157：H7常见的诊断方法，为分离培养 + 生化试验鉴定 + 血清试验分型，首先是细菌分离培养：可以用显色培养基对O157:H7 进行初筛，目前常规使用山梨醇麦康凯琼脂培养基（SMAC）对菌株进行分离和筛选，在正常条件下，EHEC O157:H7 不能发酵山梨醇，在SMAC 琼脂上呈现为无色或者灰色菌落，而其他大肠杆菌则呈红色菌落[10]。经初步分离培养后进一步通过血清学实验进行鉴定，目前常用的血清学诊断方法有玻片凝集试验、乳胶凝集试验和ELISA 法等。
检测方法不需特殊仪器， 简单易行， 费用低，但所需时间长 （一般需 7d 左右 ），检测周期长并易受人为因素干扰。有报道 EHEC O157： H7 与枸橼酸杆菌、 EIEC与志贺菌中的某些血清型出现抗原交叉反应较为多见[11]，所以大肠埃希氏菌O157的鉴定需要分离培养 + 生化试验鉴定 + 血清试验分型综合分析
[12]。
3.1 .2 快速酶触反应显色培养基法
快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将它们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，成为今后微生物检测发展的一个重要发展方向[13]。
3.2 免疫学检测方法
免疫血清学检测技术是利用抗原和抗体之间的特异性反应，通过检测标记在反应物上的示踪物，对抗原或抗体进行定性或定量测定的快速检测技术。根据标记物的不同，应用于大肠埃希氏菌O157检测中的方法主要有：酶联免疫吸附分析法、荧光免疫测定技术、免疫胶体金标记技术、免疫磁珠分离技术、蛋白芯片检测技术及斑点金免疫渗滤法等[14;15;16]。
虽然免疫学检测技术具有快速、 可批量操作、 特异性强、 敏感度高、 检测重复性好等优点，但由于抗原抗体存在交叉反应，使检测的结果可能出现假阳性，因而只能对样品进行初检。
3.3 ISO－GRID检测系统
ISO－GRID检测系统是一种基于疏水性网膜（HGMF）的过滤系统。该系统通过使用这种含有1600个小方格的滤膜，来对微生物进行检测或计数。
此方法快速简便，重复性好，而且，除大肠杆菌O157﹕H7外，还适用于沙门氏菌、酵母、霉菌、大肠菌群及大肠杆菌的检测和计数。
3.4PCR法
PCR技术原理为提高DNA探针的敏感性，可先将靶DNA序列扩增，增加DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。应用于大肠埃希氏菌O157检测中的PCR方法主要有：免疫捕获PCR法、荧光定量PCR技术、复合PCR方法[17]等。
免疫捕获PCR法：根据特异性抗体与病原菌菌体抗原特异性结合的免疫学原理, 将特异性抗体包被于磁珠或PCR 管壁上, 富集或捕获菌悬液和标本中的病原菌, 再进行PCR 反应, 即可检测目标病原菌[18]。即应用免疫磁珠捕获法和抗体包被微量PCR 管免疫捕获法富集标本中的E.coli O157∶H7 , 再以PCR 法快速检测O157 抗原编码基因, 以期更为快速且高灵敏度[19]。
荧光定量PCR技术：其特异性好, 灵敏度高, 检测速度快, 自动化程度高高等特点, 已被广泛应用于微生物学检测中[20;21]。
3.5 DNA探针技术
DNA探针技术是最新发展起来的一项特异、灵敏、快速的检测方法，但因有一定比例的假阳性反应，故所有阳性结果必须用标准的培养方法加以确证，
原理用特异性的DNA探针进行E.coliO157:H7核糖体RNA（rRNA）的检测。待检样品经前增菌、选择性增菌和后增菌后，溶解细菌。加入标记好的E.coliO157:H7异性的DNA探针用于液相杂交。如果待检样品中存有E.coliO157:H7的rRNA，荧光素标记的检测探针和多聚脱氧腺嘌呤核苷酸(polydA)末端捕获探针将与目标rRNA序列进行杂交。然后把包被有多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸(polydT)(固相)的测杆插入杂交溶液。PolydA和poldT之间进行碱基配对，便于探针捕获：目标杂种核酸分子结合在固体载体上，未接合的探针被冲洗掉。测杆被培养在辣根过氧化物酶-抗荧光素接合剂中。接合剂与存在于杂交检测探针上的荧光素标记物结合，未结合的剂被冲掉。并将测杆培养于酶底物-色原溶液中，辣根过氧化物酶与酶底物反应，将色原转变为蓝色化合物。一旦遇酸反应便停止，色原的颜色变为黄色。在450nm处测量吸收值，吸收值大于临界则表明在待检的样品中存有E.coliO157:H7。
3.6 免疫捕获LAMP法
免疫捕获LAMP法是基于免疫学方法与分子生物学方法相结合的一种病原菌快速检测的方法。免疫捕获可作为检测实际样品的预处理过程，根据特异性抗体与病原菌菌体抗原特异性结合的免疫学原理，将特异性抗体包被于酶标板上，捕获菌悬液和标本中的病原菌，有效去除了食品样品中抑制LAMP扩增的干扰成分，再进行LAMP反应，即可检测目标病原菌。与传统单一的LAMP检测相比，金婷婷等人采用的酶标板免疫捕获待测菌的方法，既大大缩短了增菌时间，又提高了检测结果的准确性和稳定性[22-26]。
除以上介绍的方法之外，其它一些检测方法有噬菌体分型、 脉冲场电 （PFGE）、限制片段长度多态性（RFLP）和扩增片段长度多态性（AFLP） 分析、生物传感器法[8]、溶解曲线分析方法细胞毒性试验[27;28]等也应用在大肠埃希氏菌O157:H7的检测中。虽然传统检测方法费时费力，但仍然是目前检测的金标准，而随着研究的不断深入，检测方法的改进和提高， 相信在不久的将来会实现快速、特异、准确、灵敏、大规模的检测致泻性大肠埃希氏菌，对快速有效的实施针对治疗， 及时救治生命， 预防食物中毒， 保障公众健康具有重大意义。
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