・300・・研究报告・
二烯丙基二硫对HL260细胞的生长抑制和诱导分化作用
武明花 唐黎 李利平 黄卫国 苏琦
目前,研究诱导白血病细胞终末分化的药物很多,但真正能够应用于临床并产生良好疗效的只有维生素A酸类。然而,维生素A酸类也有其局限性和维甲酸综合征等不良反应,因此,寻找新的分化诱导剂仍有十分重要的意义。近年来,大蒜及其烯丙基硫化物抗肿瘤活性的研究是抗癌药物研究的一个新领域。为探讨二烯丙基二硫(DADS)抗肿瘤作用及其机制,我们观察了DADS对人急性髓系白血病HL260细胞的抑制及诱导分化的影响。
材料和方法
1 材料和主要试剂 HL260细胞引自湖南医科大学肿瘤研
分别培养1,2,3,4d后,测定处A570值。
3.2 流式细胞仪测定:将不同浓度DADS及ATRA处理的
细胞(1×105/ml)培养3d,离心收集细胞,用FITC标记的
CD11b鼠单抗进行标记,进行流式细胞仪检测。
4 DADS对小鼠肾囊膜下HL260细胞生长抑制和诱导分化
作用
4.1 小鼠的预处理及HL260细胞接种:昆明种封闭群小鼠
(由本校实验动物中心提供)40只,体重约27～33g,腹腔注
射环磷酰胺(150mg/kg),。取对数生长期的
HL260,6/ml,加入纤维蛋白原工作
究所,培养于含10%的热灭活小牛血清(杭州四季青公司)、
100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的RPMI1640(Gibco公司产品)中,在37℃,5%CO2μl,100μl,使之成为细胞凝块。麻醉状态下将凝块插入1d。
2 接种HL260细胞的小鼠分组及给药:将动物随机分为
代。DADS为Fluka公司产品,为80%[含10%～20(]DADS与
Tween80以1∶2100
5组,每组动物数为8只。DADS组设21,42,84mg/kgDADS三个剂量组,不同剂量组用生理盐水稀释成所需浓
倍,保存于-20℃冰箱中(ATRA)、佛波酯
(TPA)、硝基四氮唑蓝(NBT)、纤维蛋白原和凝血酶均为Sigma公司产品;FITC标记的CD11b鼠单克隆抗体(单抗)购
度,阳性对照组用ATRA11mg/kg;空白对照组用生理盐水。采用鼠尾静脉注射,于接种次日给药,连续5d。第6天处死小鼠,在解剖显微镜下测量肿瘤长、短径。肿瘤体积=长径×短径×短径/2,抑瘤率(%)=(对照组瘤体积-用药组瘤体积)/对照组瘤体积×100%。
4.3 形态观察:将荷瘤肾在10%的中性甲醛中固定24h,石
于北京中山生物技术有限公司。
2 DADS对人白血病细胞生长的抑制作用 采用噻唑蓝还
原法(MTT法)测定[1],取对数生长期细胞,调细胞浓度为3×104/ml,将100μl细胞悬液置96孔培养板中,实验设为10组。1～6组为不同浓度(0.625,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0μg/ml)DADS;7组为试剂对照(RPMI1640);8组为肿瘤细胞阴性对照;9组为ATRA对照;10组为溶媒对照(Tween
80)。每组8个复孔。置37℃,5%CO2培养箱中培养24,48
蜡包埋,切片,苏木精2伊红染色,光学显微镜下观察细胞形态变化。
5 统计学方法 采用SPSS10.0统计学软件进行结果处
2
理,实验组与对照组比较用t检验。组间比较采用四格表χ
分析。
结
果
和72h,进行MTT检测。以试剂对照组调零,测波长570
nm吸光度(A)值。按公式:细胞生长抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%计算各浓度组的抑制率。以上实验
1 DADS对体外培养的HL260细胞生长的抑制作用
各重复3次,求平均值。
3 细胞分化检测 将对数生长期细胞以1×10/ml的细胞
4
DADS作用的50%细胞生长抑制浓度(IC50)为3.94μg/ml。
从表1可见DADS对HL260细胞的生长抑制与药物浓度有明显依赖关系,DADS从0.625μg/ml增至20.0μg/ml,其对
HL260细胞的生长抑制率由18%增至70%。各实验组随时
浓度接种于96孔板中,200μl/孔。
3.1 NBT还原法检测:分别加入不同浓度DADS和
Tween80、溶剂(RPMI1640)、ATRA对照,并设空白对照组。
基金项目:湖南省卫生厅科研基金资助项目(00068)
作者单位:421001 湖南省衡阳市,南华大学医学院肿瘤研究所
(武明花、黄卫国、苏琦);衡阳市铁路医院肿瘤内科(唐黎);湖南省株
间增加抑制效率明显增加。经方差分析,DADS在不同浓度,不同时间,细胞生长抑制率组间差异有显著性(P
0.01)。Tween80组与各浓度组之间比较差异有显著性(P0.05)。
2 DADS对NBT还原能力的影响 DADS对HL260细胞
州市中心医院妇产科(李利平)
通信作者:苏琦
NBT还原反应阳性率24h与对照组相比差异无显著性(P
・301・
>0.05),自48h起呈时间依赖性增加,且在0.625～1.25死;而DADS达84mg/kg时,肾囊膜下HL260细胞明显坏死。阳性对照组的形态变化不如DADS明显。
表3 DADS对小鼠肾囊膜下HL260细胞的生长抑制作用
组别
样本给药前结束时数体重(g)体重(g)
88
8827±228±229±228±227±228±2
29±228±2μg/ml时呈剂量依赖性增加;浓度>1.25μg/ml时,随浓度增加,NBT还原能力下降;1.25μg/ml为峰值(P
1.25μg/mlDADS与ATRA比较差异无显著性(P>0.05)。Tween80组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)(表2)。
瘤体积
(mm3)5.73±0.842.89±0.23
2.63±0.571.95±0.71抑瘤率
(%)049.5
56.965.9表1 MTT法检测DADS对HL260细胞的生长抑制率
(%,
・300・・研究报告・
二烯丙基二硫对HL260细胞的生长抑制和诱导分化作用
武明花 唐黎 李利平 黄卫国 苏琦
目前,研究诱导白血病细胞终末分化的药物很多,但真正能够应用于临床并产生良好疗效的只有维生素A酸类。然而,维生素A酸类也有其局限性和维甲酸综合征等不良反应,因此,寻找新的分化诱导剂仍有十分重要的意义。近年来,大蒜及其烯丙基硫化物抗肿瘤活性的研究是抗癌药物研究的一个新领域。为探讨二烯丙基二硫(DADS)抗肿瘤作用及其机制,我们观察了DADS对人急性髓系白血病HL260细胞的抑制及诱导分化的影响。
材料和方法
1 材料和主要试剂 HL260细胞引自湖南医科大学肿瘤研
分别培养1,2,3,4d后,测定处A570值。
3.2 流式细胞仪测定:将不同浓度DADS及ATRA处理的
细胞(1×105/ml)培养3d,离心收集细胞,用FITC标记的
CD11b鼠单抗进行标记,进行流式细胞仪检测。
4 DADS对小鼠肾囊膜下HL260细胞生长抑制和诱导分化
作用
4.1 小鼠的预处理及HL260细胞接种:昆明种封闭群小鼠
(由本校实验动物中心提供)40只,体重约27～33g,腹腔注
射环磷酰胺(150mg/kg),。取对数生长期的
HL260,6/ml,加入纤维蛋白原工作
究所,培养于含10%的热灭活小牛血清(杭州四季青公司)、
100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的RPMI1640(Gibco公司产品)中,在37℃,5%CO2μl,100μl,使之成为细胞凝块。麻醉状态下将凝块插入1d。
2 接种HL260细胞的小鼠分组及给药:将动物随机分为
代。DADS为Fluka公司产品,为80%[含10%～20(]DADS与
Tween80以1∶2100
5组,每组动物数为8只。DADS组设21,42,84mg/kgDADS三个剂量组,不同剂量组用生理盐水稀释成所需浓
倍,保存于-20℃冰箱中(ATRA)、佛波酯
(TPA)、硝基四氮唑蓝(NBT)、纤维蛋白原和凝血酶均为Sigma公司产品;FITC标记的CD11b鼠单克隆抗体(单抗)购
度,阳性对照组用ATRA11mg/kg;空白对照组用生理盐水。采用鼠尾静脉注射,于接种次日给药,连续5d。第6天处死小鼠,在解剖显微镜下测量肿瘤长、短径。肿瘤体积=长径×短径×短径/2,抑瘤率(%)=(对照组瘤体积-用药组瘤体积)/对照组瘤体积×100%。
4.3 形态观察:将荷瘤肾在10%的中性甲醛中固定24h,石
于北京中山生物技术有限公司。
2 DADS对人白血病细胞生长的抑制作用 采用噻唑蓝还
原法(MTT法)测定[1],取对数生长期细胞,调细胞浓度为3×104/ml,将100μl细胞悬液置96孔培养板中,实验设为10组。1～6组为不同浓度(0.625,1.25,2.5,5.0,10.0,20.0μg/ml)DADS;7组为试剂对照(RPMI1640);8组为肿瘤细胞阴性对照;9组为ATRA对照;10组为溶媒对照(Tween
80)。每组8个复孔。置37℃,5%CO2培养箱中培养24,48
蜡包埋,切片,苏木精2伊红染色,光学显微镜下观察细胞形态变化。
5 统计学方法 采用SPSS10.0统计学软件进行结果处
2
理,实验组与对照组比较用t检验。组间比较采用四格表χ
分析。
结
果
和72h,进行MTT检测。以试剂对照组调零,测波长570
nm吸光度(A)值。按公式:细胞生长抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%计算各浓度组的抑制率。以上实验
1 DADS对体外培养的HL260细胞生长的抑制作用
各重复3次,求平均值。
3 细胞分化检测 将对数生长期细胞以1×10/ml的细胞
4
DADS作用的50%细胞生长抑制浓度(IC50)为3.94μg/ml。
从表1可见DADS对HL260细胞的生长抑制与药物浓度有明显依赖关系,DADS从0.625μg/ml增至20.0μg/ml,其对
HL260细胞的生长抑制率由18%增至70%。各实验组随时
浓度接种于96孔板中,200μl/孔。
3.1 NBT还原法检测:分别加入不同浓度DADS和
Tween80、溶剂(RPMI1640)、ATRA对照,并设空白对照组。
基金项目:湖南省卫生厅科研基金资助项目(00068)
作者单位:421001 湖南省衡阳市,南华大学医学院肿瘤研究所
(武明花、黄卫国、苏琦);衡阳市铁路医院肿瘤内科(唐黎);湖南省株
间增加抑制效率明显增加。经方差分析,DADS在不同浓度,不同时间,细胞生长抑制率组间差异有显著性(P
0.01)。Tween80组与各浓度组之间比较差异有显著性(P0.05)。
2 DADS对NBT还原能力的影响 DADS对HL260细胞
州市中心医院妇产科(李利平)
通信作者:苏琦
NBT还原反应阳性率24h与对照组相比差异无显著性(P
・301・
>0.05),自48h起呈时间依赖性增加,且在0.625～1.25死;而DADS达84mg/kg时,肾囊膜下HL260细胞明显坏死。阳性对照组的形态变化不如DADS明显。
表3 DADS对小鼠肾囊膜下HL260细胞的生长抑制作用
组别
样本给药前结束时数体重(g)体重(g)
88
8827±228±229±228±227±228±2
29±228±2μg/ml时呈剂量依赖性增加;浓度>1.25μg/ml时,随浓度增加,NBT还原能力下降;1.25μg/ml为峰值(P
1.25μg/mlDADS与ATRA比较差异无显著性(P>0.05)。Tween80组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)(表2)。
瘤体积
(mm3)5.73±0.842.89±0.23
2.63±0.571.95±0.71抑瘤率
(%)049.5
56.965.9表1 MTT法检测DADS对HL260细胞的生长抑制率
(%,