鸡胚原代细胞培养
[实验材料]
9～10日龄鸡胚，Hank"s 液50mL ，0．5％水解乳蛋白液或MEM 培养液20mL(内含犊牛血清1mL ，双抗0．2mL ，pH7．2) ，O ．25％胰蛋白酶5mL 、7％NaHC031mL ，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL 三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用) ，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95％酒精，水浴锅。
[实验内容及操作程序]
1．配液制备细胞前先在Hnak"s 液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH 至7．2～7．4，将胰蛋白酶调整pH7．6(玫瑰红色) 。置37℃水浴锅中预热备用。
2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用Hank"s 液(简称H 液) 洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5mL H液轻摇，静止1～2min ，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H 液留组织。
3．消化自水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量约3～5倍加入三角瓶中，个鸡胚约需5mL 胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发及污染。37℃水浴约20min 左右，每隔5min 轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，
则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
4．洗涤取出三角瓶后静置1min ，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mL Hank"s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。
5．吹打加2mL 含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM 培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min ，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出1mL 于20mL 营养液中，此液细胞数约50万～70万/mL。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做100mL 细胞悬液。
6．细胞计数取上述细胞悬液0．5mL 加入0．1％结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液2mL ，置室温或37℃温箱中5～10min ，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血细胞计数板内，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总数。如3～5个聚集在一起，则按1个计算，然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。
细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数
例如：4大格的细胞总数为284个，而稀释倍数为5(0．5mL 染色液) ，则每毫升细胞悬液的细胞数为284/4×10 000×5=3．5×104个。
7．稀释按照每毫升50万～70万个细胞密度的标准，将细胞悬液用营养液稀释之。
(计数时，可见到大部分细胞完整分散，3～5个细胞成堆，且细胞碎片很少，说明消化适度；如分散细胞少，则消化不够；如细胞碎片多，则消化过度。)
活细胞计数法取2％台盼蓝溶液1滴，细胞悬液1滴，混合计数，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。
8．分装培养分装于链霉素瓶中，每瓶约1mL ，瓶口橡皮塞要塞紧。不合适者弃去，以免漏气造成污染或C02跑掉而营养液变碱。将细胞瓶横卧于培养盘中，于瓶上面划一直线，以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置。瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养，4h 后细胞即可贴附于瓶壁，24～36h 生长成单层细胞，此时可吸去培养液，更换维持液，并接种病毒。
附：细胞培养所需的常用培养基与试剂
1．Hank’s液配制
原液甲
NaCl 8g
KCl 2g
MgSO4·7H20 2g
MgCl2·6H20 2g
2．8％CaCl2 100mL
双蒸水 加至1 000mL
先将固体成分加于800mL 双蒸水中，加温到50～60℃加速溶解，再加入CaCl2溶液，最后加双蒸水补足到1 000mL。加氯仿2mL ，摇匀后于4℃贮存。 原液乙
Na2HPO4·2H20 1.2g
KH2PO4·2H20 1.2g
葡萄糖 20g
0．4％酚红 lOOmL
双蒸水 加：1 000mL
将上列各物混合后使其溶解，加氯仿2mL ，摇匀后于4℃贮存。
Hank"s 工作液
原液甲 1份
原液乙 1份
双蒸水 18份
工作液分装100mL ，或500mL 盐水瓶中，115~C灭菌10min ，使用前以7％NaHCO3调节
pH 至0 7．2～7．6。
2．0．4％酚红溶液配制
酚红 0.4g
0．1％NaOH 溶液 11.28mL
将酚红置于研钵中，加磨边缓缓加NaOH 溶液，直到所有颗粒完全溶解，置于至
lOOmL 量杯中，最后加双蒸水至lOOmL ，摇匀后，保存于4℃冰箱内备用。
3. 0.5％乳蛋白水解物溶液配制
乳蛋白水解物 5g
Hank"s 液 l 000mL
将乳蛋白水解物放入1 000mL Hank"s液中，待完全溶解后，摇匀分装于lOOmL 的盐水瓶中，每瓶95mL ，115℃ lOmin 灭菌，4℃贮存备用。
4．营养液(生长液) 配制
O ．5％乳蛋白水解物 95mL
犊牛血清 5mL
青霉素、链霉素 lmL
将上述溶液混合后，以7％NaHCO3适量调节pH 到7.2～7.4。维持液按上述方法，加
犊牛血清2.5mL 即成。
5．MEM 培养液MEM 培养基一袋，加1 000mL双蒸水，过滤除菌或高压灭菌，分装于100ml 盐水瓶中，每瓶90ml ，用前以 7％NaHC03调pH 到7.2～7.4，并加10％犊牛血
清。
6．双抗配制
青霉素 100万IU
链霉素 1g
Hank"s 液 100mL
将青、链霉素溶解于：100mL Hank"s溶液中，此为双抗溶液，无菌操作，分装小瓶，每瓶：lmL ，内含有青霉素IIU ，链霉素10000μg ，低温冻结保存。 使用时每100mL 营养液中加双抗lmL ，即每mL 营养液中含青霉素100IU ，链霉素
100g μg 。
7. 7％ NaHCO3溶液配制
NaHCO3 7g
双蒸水 100mL
将NaHC03溶于双蒸水中，置水浴锅中加热溶解，115℃ 10min 灭菌后，无菌操作分装
小瓶，每瓶lmL ，4℃保存。
8. 0.25％胰蛋白酶配制
胰蛋白 0.25g
Hang’s液 100mL
将胰蛋白酶溶于Hank"s 液中，待完全溶解后，用0.2μm 滤膜过滤，检验无菌后才能使用。无菌分装小瓶，每瓶5mL ，低温冻结保存。使用时，以7％NaHC03调节pH 到7.6-7.8
鸡胚原代细胞培养
[实验材料]
9～10日龄鸡胚，Hank"s 液50mL ，0．5％水解乳蛋白液或MEM 培养液20mL(内含犊牛血清1mL ，双抗0．2mL ，pH7．2) ，O ．25％胰蛋白酶5mL 、7％NaHC031mL ，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL 三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用) ，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95％酒精，水浴锅。
[实验内容及操作程序]
1．配液制备细胞前先在Hnak"s 液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH 至7．2～7．4，将胰蛋白酶调整pH7．6(玫瑰红色) 。置37℃水浴锅中预热备用。
2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用Hank"s 液(简称H 液) 洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5mL H液轻摇，静止1～2min ，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H 液留组织。
3．消化自水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量约3～5倍加入三角瓶中，个鸡胚约需5mL 胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发及污染。37℃水浴约20min 左右，每隔5min 轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，
则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。
4．洗涤取出三角瓶后静置1min ，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mL Hank"s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。
5．吹打加2mL 含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM 培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min ，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出1mL 于20mL 营养液中，此液细胞数约50万～70万/mL。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做100mL 细胞悬液。
6．细胞计数取上述细胞悬液0．5mL 加入0．1％结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液2mL ，置室温或37℃温箱中5～10min ，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血细胞计数板内，在显微镜下计数。计数方法按白细胞计数法，计算四角大格内完整细胞的总数。如3～5个聚集在一起，则按1个计算，然后将细胞总数按下法换算成每毫升中的细胞数。
细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数
例如：4大格的细胞总数为284个，而稀释倍数为5(0．5mL 染色液) ，则每毫升细胞悬液的细胞数为284/4×10 000×5=3．5×104个。
7．稀释按照每毫升50万～70万个细胞密度的标准，将细胞悬液用营养液稀释之。
(计数时，可见到大部分细胞完整分散，3～5个细胞成堆，且细胞碎片很少，说明消化适度；如分散细胞少，则消化不够；如细胞碎片多，则消化过度。)
活细胞计数法取2％台盼蓝溶液1滴，细胞悬液1滴，混合计数，活细胞不着色，死细胞呈蓝色。
8．分装培养分装于链霉素瓶中，每瓶约1mL ，瓶口橡皮塞要塞紧。不合适者弃去，以免漏气造成污染或C02跑掉而营养液变碱。将细胞瓶横卧于培养盘中，于瓶上面划一直线，以表示直线的对侧面为细胞在瓶内的生长位置。瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养，4h 后细胞即可贴附于瓶壁，24～36h 生长成单层细胞，此时可吸去培养液，更换维持液，并接种病毒。
附：细胞培养所需的常用培养基与试剂
1．Hank’s液配制
原液甲
NaCl 8g
KCl 2g
MgSO4·7H20 2g
MgCl2·6H20 2g
2．8％CaCl2 100mL
双蒸水 加至1 000mL
先将固体成分加于800mL 双蒸水中，加温到50～60℃加速溶解，再加入CaCl2溶液，最后加双蒸水补足到1 000mL。加氯仿2mL ，摇匀后于4℃贮存。 原液乙
Na2HPO4·2H20 1.2g
KH2PO4·2H20 1.2g
葡萄糖 20g
0．4％酚红 lOOmL
双蒸水 加：1 000mL
将上列各物混合后使其溶解，加氯仿2mL ，摇匀后于4℃贮存。
Hank"s 工作液
原液甲 1份
原液乙 1份
双蒸水 18份
工作液分装100mL ，或500mL 盐水瓶中，115~C灭菌10min ，使用前以7％NaHCO3调节
pH 至0 7．2～7．6。
2．0．4％酚红溶液配制
酚红 0.4g
0．1％NaOH 溶液 11.28mL
将酚红置于研钵中，加磨边缓缓加NaOH 溶液，直到所有颗粒完全溶解，置于至
lOOmL 量杯中，最后加双蒸水至lOOmL ，摇匀后，保存于4℃冰箱内备用。
3. 0.5％乳蛋白水解物溶液配制
乳蛋白水解物 5g
Hank"s 液 l 000mL
将乳蛋白水解物放入1 000mL Hank"s液中，待完全溶解后，摇匀分装于lOOmL 的盐水瓶中，每瓶95mL ，115℃ lOmin 灭菌，4℃贮存备用。
4．营养液(生长液) 配制
O ．5％乳蛋白水解物 95mL
犊牛血清 5mL
青霉素、链霉素 lmL
将上述溶液混合后，以7％NaHCO3适量调节pH 到7.2～7.4。维持液按上述方法，加
犊牛血清2.5mL 即成。
5．MEM 培养液MEM 培养基一袋，加1 000mL双蒸水，过滤除菌或高压灭菌，分装于100ml 盐水瓶中，每瓶90ml ，用前以 7％NaHC03调pH 到7.2～7.4，并加10％犊牛血
清。
6．双抗配制
青霉素 100万IU
链霉素 1g
Hank"s 液 100mL
将青、链霉素溶解于：100mL Hank"s溶液中，此为双抗溶液，无菌操作，分装小瓶，每瓶：lmL ，内含有青霉素IIU ，链霉素10000μg ，低温冻结保存。 使用时每100mL 营养液中加双抗lmL ，即每mL 营养液中含青霉素100IU ，链霉素
100g μg 。
7. 7％ NaHCO3溶液配制
NaHCO3 7g
双蒸水 100mL
将NaHC03溶于双蒸水中，置水浴锅中加热溶解，115℃ 10min 灭菌后，无菌操作分装
小瓶，每瓶lmL ，4℃保存。
8. 0.25％胰蛋白酶配制
胰蛋白 0.25g
Hang’s液 100mL
将胰蛋白酶溶于Hank"s 液中，待完全溶解后，用0.2μm 滤膜过滤，检验无菌后才能使用。无菌分装小瓶，每瓶5mL ，低温冻结保存。使用时，以7％NaHC03调节pH 到7.6-7.8