中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(1):97～105
植物花青素代谢途径分析及调控模型建立
张 宁 胡宗利 陈绪清
1
1
1,2
3
侯晓姝 李 勇 陈国平
11133
(1重庆大学生物工程学院 重庆 400030 2北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 北京 100089)
摘要 介绍了植物花青素的合成、修饰、转运及汇集过程,从转录水平和转录后水平分析了花青素途径分子调控机制,概述了外部因素对花青素积累的影响,并在此基础上提出了一个新的花青素途径调控机制模型。
关键词 花青素 代谢途径 调控机制 模型
中图分类号 Q756
植物的色素主要有三大类:甜菜碱类、类胡萝卜素类和花青素类。色素,,包括粉、红、[2]
。
苯丙氨酸是类黄酮类生物合成的直接前体,花青素是在细胞质中从苯丙氨酸经一系列的酶促反应合成,经不同的羟基化、糖基化、甲基化、酰基化修饰后被转运到液泡中予以汇集
[10,11]
,花青素在结构上主要分三
类:天竺葵素(pelargonidin)、矢车菊素(cyanidin)和飞燕草素(delphinidin)。由矢车菊素和飞燕草素衍生出芍药花素(peonidin)、碧冬茄素(petunidin)和锦葵素
(malvidin)等花青素
[3]
。花青素的生物合成代谢
途径可以分为5个阶段(图1)
。
。花青素主要积累在植物液泡
[4,5]
中并有多种生理功能,例如吸引昆虫传粉,抵御低温和紫外线伤害,以及防治植物病害等
;花青素是迄今
为止所发现的最强效的自由基清除剂,具有抗氧化衰老、抗突变、抗癌与抗动脉硬化功能;此外,花青素还是一种安全、无毒的天然食用色素研究价值。
花青素生物合成代谢途径是类黄酮途径的一个分支途径,其调控机制的相关研究已成为生命科学研究的热点之一。目前,已从玉米、拟南芥、矮牵牛、葡萄、金鱼草、苹果、紫苏等植物中分离并克隆了大量与花青素生物合成代谢相关的结构基因与调控基因
[8,9]
[6,7]
。因此,花青素在
园艺、医药、化妆、食品等方面具有一定的应用潜力和
。本
文在归纳分析现有研究的基础上,提出了一个新的花
收稿日期:2007210222 修回日期:2007211215
3国家“863”计划(2006AA02Z138),重庆市自然科学基金重点项目(CSTC,2006BA5006),重庆市自然科学基金(CSTC,2007BB0250),资助项目
33通讯作者,电子信箱:[email protected]
图1 花青素代谢途径
Fig.1 Themetabolicpathwayofanthocyanin
第一阶段由苯丙氨酸到42香豆酰CoA,该步骤受苯丙氨酸裂解酶(PAL)和肉桂酸羟化酶(C4H)的活性
98
调控,这是许多次生代谢共有的。
中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.12008
类的修饰,这些修饰是通过7GT及5GT实现的,不同的糖基化修饰可能是一个新的花青素苷合成特异调控机制
[19～22]
第二阶段由42香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氢黄酮醇,是类黄酮代谢的关键反应,经不同酶催化可转化为花青素和其他类黄酮物质如黄酮醇和类异黄酮。该步骤受查尔酮合成酶(CHS)和黄烷酮232羟化酶
(F3H)的活性调控[12,13]。
。与红葡萄相比,绿色葡萄中UFGT不表达,而
[23]
在淡红色品种中表达量要低10倍,这说明糖基化水平的调控决定了葡萄皮中花青素的积累
。BAHD家族
是一类多功能的酰基转移酶,有多种底物特异性。花青素酰基转移酶(AT)是BAHD家族的重要亚族,可以把多种有机酸修饰在花青素骨架上,以提高花青素的稳定性、水溶性及光吸收。在花青素糖基化后,AT能催化花青素的酰基化而使大部分花色显示红色到蓝色,在红色菊花中分离得到3个花青素酰基转移酶:
Dm3MaT1、Dm3MaT2和Dm3MaT3
[～26]
第三阶段是各种花青素的合成,受两个酶活性调控:二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS/
LDOX)将无色的二氢黄酮醇转化成无色花青素进而合
成未修饰的花青素
[10]
。
[10]
目前植物中花青素的生物合成途径前三个阶段已经基本明确,主要是花青素骨架的合成
。但对于花
青素骨架修饰及转运、汇集等阶段的研究才刚刚起步。 此外,未修饰的无色花青素和花青素也可以作为无色花青素还原酶(LNR)、花青素还原酶(ANR)的底物,LNR、ANR是合成原花青素的关键酶,素催化生成原花青素,2葡黄酮232葡糖基转移酶(的青苷
[14,15]
。
。花青素,被转运,已经发现了一些[27]
。谷胱甘肽转移酶(GST)参
与了这个转运过程,谷胱甘肽S2交联结合泵(GSHS2
conjugatepump)是结合ATP的ABC运输转运器,通过
[16]
ANR,位于ANS下游,疏水基间的交互作用结合花青苷,然后运送到液泡膜上,但是如何从膜上转入液泡内尚不清楚。玉米中
Bronze2编码了一个谷胱甘肽转移酶,可以把谷胱甘肽
可以把花青素转变成原花青素。从葡萄中也分离纯
化到无色花青素还原酶(LNR)和花青素还原酶
(ANR),这两种酶受转录因子VvMYBPA1激活调控,
转移到花青苷上。而矮牵牛中的Bronze2同源蛋白
AN9则是一个运输蛋白,可以把花青苷转运到液泡膜
主要在果实和种子中表达。此外,葡萄VvMYBPA1转录因子还可以激活黄酮类合成途径中的其他结构基因,但是不能激活花青素苷合成特异酶VvUFGT,而葡萄VvMYBA1转录因子则可以特异地激活VvUFGT的表达,这说明未修饰的花青素经不同转录因子的调控而分别进入花青素苷或原花青素合成途径
[15]
上,进而被运输到液泡内
[28]
。拟南芥TT19也编码一个
谷胱甘肽转移酶,突变体tt19的花青素转运功能可以用矮牵牛AN9转基因弥补,而原花青素却不能积累,说明GST只能转运花青素而不能转运原花青素
[9]
。此
。不同途外,花青素也可以通过小囊泡转运到液泡中。在康乃馨花瓣中已经发现了液泡中的花青素包涵体(AVIs),这些包涵体可以优先聚集糖基化和酰基化的花青素
[29]
径竞争同一底物可以认为是一种新的花青素途径调控机制,例如,拟南芥原花青素合成途径中缺少ANR能增加花青素的合成
[14,17]
。。
第四阶段是花青素骨架合成之后的修饰。许多花青素都要在一个或者几个位点上经过甲基化、酰基化、羟基化、糖基化修饰,不同的修饰就形成了不同的花青素,例如:叶和花表皮的花青素通常是甲基化的
[18]
在甘薯的花青素包涵体(AVIs)中分离出了一个光诱导的金属蛋白酶VP24,含有多重跨膜结构域,参加液泡中花青素的转运和汇集
[30]
。
。花
青素糖基转移酶(GT)对于植物花色和花青素的稳定性及可溶性很重要,是因为其决定了糖基化的位置。第3位糖基化通常是花青素共有的步骤。多数花青素的糖基化是通过葡萄糖转移酶类的尿苷二磷酸2葡萄糖2类黄酮232葡糖基转移酶(UFGT/3GT)实现的。此外,在一些植物中也存在第5位或第7位的鼠李糖及其他糖
2 花青素生物合成代谢途径的分子调控
多数的花青素途径调控发生在结构基因的转录水平上,受多种转录因子在不同时空上的组合调控,还有一些受转录后水平的调控
2.1 转录水平的调控
2.1.1 转录因子 在花青素转录调控过程中有
[8,9]
。
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张 宁等:植物花青素代谢途径分析及调控模型建立
99
WD40,WRKY,BZIP,MADS2box,R2R32MYB及basichelix2loop2helix(bHLH)等各种转录因子,这些转录因子
目前所知的调控基因中,MYB转录因子最多。
MYB转录因子含有保守的DNA结合区域(MYB结构
通过与结构基因启动子中相应的顺式作用元件结合,从而激活或者抑制花色素苷生物合成途径中一个或多个基因的表达
[31]
域),每个MYB结构域约由52个氨基酸构成,花青素相关的MYB转录因子通常包含R2和R32个基序
(R2R32MYB)或包含R31个基序(R32MYB),含有特
。迄今为止,研究发现花青素结构基
因调控的一般都是由MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白形成一个蛋白复合体,直接调控结构基因的转录,而不合成中间调控物
[32,33]
异的DNA序列识别区和启动子结合区
[58]
。许多现象
[8]
表明一些MYB转录因子有双重功能,即:作为结构基因的直接活化子和作为活化bHLH基因的活化子
。
。在不同植物中,
已分离的3种转录因子及其调控机制如表1所示。
表1 不同植物中转录因子MYB、bHLH和WD40调控的结构基因和调控类型
Table1 StructuralgenesandregulationtypesregulatedbytranscriptionfactorMYB、
bHLHandWD40indifferentplants
MYB
bHLHTT8GL3EGL3
PAP2MYB11MYB12MYMYB4
GL3EGL3
WD40TTG1TTG1
调控类型激活
激活激活
DFR、、DFR、DFR、GSTF3H、DFR、UFGT、GST
参考文献
[34][33][35][36]
拟南芥TT2PAP1
矮牵牛AN2、AN4PhMYB27
JAF13AN1JAF13AN1bHLH2
ZmR、ZmBIN1、Lc
AN11AN11
抑制
激活抑制激活激活激活抑制抑制激活激活激活抑制
C4H
DFR、ANS、UFGTDFR、ANS、UFGTDFRANSDFR、UFGTDFRDFR、UFGTDFR、UFGTLAR、ANRUFGT
F3H、DFR、ANS、UFGTC4H、4CL
[37][32,38][32][39][40][41][42][43][15][44]
[45][46][47][48]
未知
玉米
ZmC1ZmPC1-1Zm38
PAC
不需要
葡萄金鱼草
VvMYBPA1VvMYBA1
Rosealvenosa
DelilamutabilMYC2F3GLM
YC2RP
PFWD
AmMYB308
紫苏草莓
番茄苹果大丁草
MYB2PLFaMYB1ANT1MdMYB10MdMYBAGMYB10
激活抑制
激活激活激活激活
ANS、UFGT
CHS、CHI、DFR、UFGT、GSTCHS、CHI、F3H、DFRLDOX、UFGTANSDFR
[49][50][51,52][53][54]
[57,58]
MdbHLH3MdbHLH33GMYC1
WD40重复蛋白是一种很古老的蛋白家族,在动物,真菌,细菌和植物中均有发现。WD40重复蛋白是一种β螺旋蛋白家族,核心区域由40个氨基酸残基组成
[56]
这些配体主要是bHLH和MYB转录因子。bHLH
家族蛋白都有一个螺旋2环2螺旋结构区域,bHLH转录
[59]
因子可以结合到序列特异DNA(CANNTG)上。已
。其作用是促进蛋白与蛋白之间的相互作用。异得到的花青素合成相关的bHLH蛋白都是高度同源的,并且异源表达也能够正常发挥作用。bHLH蛋白在花青素途径调控中需要和MYB类转录因子共同作用
源表达WD40重复蛋白发现,该蛋白可以与其它蛋白配体作用并可以正常发挥作用,通过酵母双杂交发现
100
而激活花青素的合成
[32]
中国生物工程杂志ChinaBiotechnology
,不过,在拟南芥中还发现,一
[60]
Vol.28No.12008
物转录激活调控的转录因子互相作用及调控的结构基因如表1。
2.1.3 转录抑制调控 花青素途径的转录调节并不
些Lc类似蛋白直接和WD40蛋白TTG1相互作用可以形成一个无激活功能的复合体
。bHLH类调节因子
是由多种进化系统进化而来的,根据bHLH的序列特征,可以把已有的bHLH调节因子分为两类,一类包括
PhJAF13、AmDELILA、ZmLC和ZmR等,另一类包括PhAN1、AtTT8等。尽管不同转录因子间具有一定的同
是单纯的激活转录,也有抑制转录的作用。金鱼草转录因子AmMYB308和拟南芥转录因子AtMYB4是
R2R32MYB转录抑制因子,可以抑制花青素途径的上
游结构基因。金鱼草AmMYB308基因在烟草中的超表达可以抑制花青素上游结构基因C4H、4CL的表达,而沉默拟南芥AtMYB4基因,其上游结构基因C4H表达量上升
[37,47]
源性,但却控制着花色素苷合成途径中不同结构基因的表达
[34]
。
拟南芥TTG2基因编码一个WRKY转录因子,在幼叶、种皮及毛状体中表达。TTG2的表达受MYB和
bHLH转录因子调控,其5′端非编码区有两个MYB结
。红色矮牵牛花冠中花青素的合成在开花
前就开始了,而在开花时下降。矮牵牛PhMYB27基因在花青素合成终止时大量表达,YB27和AtMYB4有同源性,MYB蛋白,可矮牵相互作用,
,使PhAN1成
合位点,R2R32MYB转录因子可以直接作用于这些位点,TTG2的缺失或抑制使拟南芥不能正常合成花青素和形成毛状体。说明拟南芥WRKY转录因子TTG2受
MYB和bHLH复合体调控,[32]
。草莓中分离出的FaMYB1
花青素结构基因的表达
[61]
。R2R32MYB蛋白,该基因在转色、成熟和过熟的果实中表达,转入烟草过量表达后,花瓣中花色素苷合成酶ANS、UFGT的基因表达受到抑制而花青素积累明显减少。通过酵母双杂交显示,FaMYB1无转录激活区域,并且FaMYB1可以与矮牵牛bHLH转录因子AN1和JAF13相互作用
[49]
2.1.2 转录激活调控 ,,并且多。花青素转录激活又有两种调控方式,一种是不依赖bHLH转录因子的MYB转录因子和WD40蛋白二元复合体协同调控;另一种是MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白三元复合体协同调控。
玉米中MYB类转录因子ZmP和ZmC1都可以结合在结构基因DFR的启动子上,它们都需要一个
WD40蛋白配体(ZmPAC)。ZmC1还需要一个bHLH
。玉
米MYB转录激活因子C1可以被其等位基因MYB转录因子C121抑制,C端和DNA结合区域的改变对于
C121的抑制作用都有重要的影响2.2 转录后水平的调控
[42,43]
。
除了发生在结构基因的转录水平上外,一些花青素途径的调控还发生在转录后水平上。
玉米Sn调控基因编码bHLH转录因子,调控花青素合成,发现在其编码区上游的引导序列有5个ATG及3个独立的开放阅读框。RT2PCR发现不同组织中引导区发生了不同的剪接,剪接删除了下游的两个开放阅读框。通过转化玉米原生质体发现,玉米中剪接前导序列与不剪接序列相比,花青素的合成量减少了4倍。说明bHLH转录因子的激活调控是多水平的调控,包括转录水平和转录后水平
[63]
配体(ZmR或ZmB)形成三元复合体(MYB2bHLH2
WD40)协同调控以激活结构基因的转录;ZmP则不需
要bHLH配体,只需要形成(MYB2WD40)二元复合体就可以激活DFR的转录。虽然二元复合体可以正常激活DFR,但是和三元复合体相比,缺少了激活UFGT
(ZmBZ1)的功能,并且二者的表达部位不一样,说明二
元复合体的功能是不完整的,bHLH配体可以调控复合体的特异性
[41,62]
。
大多植物花青素途径是通过三元复合体(MYB2
bHLH2WD40)起始转录激活的,然而复合体中3种转录
。而bHLH的转录
[58]
后水平可能受WD40重复蛋白调控。玉米bHLH转
因子的量是不确定的。转录因子bHLH和MYB一般都能形成同源多聚体,WD40重复蛋白的作用通常是促进蛋白与蛋白之间的相互作用,在植物体内MYB2bHLH2
WD40三元复合体是包含多聚bHLH和MYB蛋白的多
录因子Lc的基因引导序列包含3个上游的ATG并且分别属于一个开放阅读框。上游开放阅读框可以抑制下游开放阅读框,因为翻译的重复起始是无效的
[64]
。
玉米Bronze2基因编码谷胱甘肽转移酶(GST),Bronze2初级转录物包含1个单独的内含子,在玉米的叶子中
价复合体,3种转录因子的价数尚未可知
[58]
。其他植
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张 宁等:植物花青素代谢途径分析及调控模型建立
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存在剪接和不剪接两种转录物,这两种转录物分别在不同的组织转录,并且转录物受转录因子R/B和C1诱导,分别可以翻译成26kDa和14kDa的蛋白。但只有
26kDa的蛋白能检测得到,并且只存在于积累花青素的
是通过诱导相关转录因子的表达,然后通过这些转录因子调控花青素途径结构基因的表达,进而影响花青素的合成和积累。
组织。说明Bronze2受转录后的mRNA剪接调控
[65]
。
4 植物花青素途径调控模型
根据前人对植物花青素生物合成调控机制的研究成果,我们提出了一个新的花青素途径调控模型(图
2)。
3 影响花青素生物合成代谢途径的外部
因素
植物液泡中的花青素积累受多种环境因素刺激,包括光照、UV2A、UV2B、低温、缺水、蔗糖,以及其他生物胁迫等。
苹果MdMYB1转录因子是一个受光诱导的R2R32
MYB转录因子,光诱导MdMYB1的表达,进而诱导花
青素合成
[66]
。拟南芥MYB转录因子(PAP1、PAP2)、
bHLH转录因子(TT8、EGL3、GL3)及WD40蛋白(TTG1)受强光诱导,在光诱导下,PAP1PAP2及结构基因(CHS,DFR,F3H,[67米中,下超表达,B和bHLH的水平上,而不是在结构基因水平上
[68,69]
。
。苹果皮中的转录因子
图2 植物花青素途径调控模型
Fig12 Theregulatingmodelofanthocyaninpathway
UV2B可以诱导莴苣叶中CHS、F3H和DFR的表达升高及花青素的合成
[70]
植物花青素途径受外部因素(如光照、低温、UV2
A、UV2B、缺水等)和内部因素(各种转录因子)的影响,
MdMYBA受低温及UV2B诱导,转化苹果和番茄发现MdMYBA可以特异地结合到花青素结构基因ANS的启
其调控可分为激活调控和抑制调控。外部因素通过内部因素起作用,即先诱导转录因子的表达,进而激活花青素途径结构基因的表达。
bHLH转录因子的启动子调控区含有MYB识别元件(MRE),受MYB转录因子的调控。MYB转录因子、
bHLH转录因子和WD40重复蛋白组成三元复合体,或
动子上,然后诱导苹果幼芽和番茄果实产生花青素,说明低温及UV2B通过诱导MdMYBA表达进而激活花青素途径结构基因的表达
[53]
。
将在黑暗条件下生长的芜青采用不同的光照射,只有UV2A可以诱导花青素的合成,在UV2A的照射下,结构基因PAL、CHS、F3H、DFR、ANS表达量随照射时间的延长明显升高。UV2A特异地诱导芜青花青素表达,而UV2B及红光蓝光不能诱导芜青花青素表达,说明红芜青花青素的合成是由一个不同的UV2A特异光受体介导的
[71]
者组成不含bHLH转录因子的二元复合体。WD40重复蛋白的作用是促进蛋白与蛋白之间的相互作用及参与bHLH基因转录后mRNA剪接的调控。WRKY转录因子受MYB和bHLH转录复合体调控,并作为一个配体调控花青素结构基因的表达。结构基因启动子调控区包含3个部分:MYB识别元件(MRE)、ACGT元件
(ACE)及一个新发现的R反应元件。启动转录需要一
。
缺水可以促进葡萄中花青素的大量积累,表达分析发现缺水使花青素合成途径基因F3H、DFR、UFGT、
GST表达量增高
[72]
。然而这是新陈代谢的直接作用还
个完整的MRE,R反应元件包括BHLH因子的结合位点CANNTG,而ACE元件可以结合一个锌指蛋白
(BZIP),作为转录复合体的一个配体共同激活转
是生长的抑制作用尚不清楚。
蔗糖可以特异地诱导拟南芥转录因子MYB75/
PAP1基因的表达,从而诱导花青素的合成
[73]
。
录
[74,75]
。
已有研究表明,外部因素影响花青素的积累大都
花青素途径的抑制途径主要通过MYB抑制子实
102
中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.12008
现的。与同源MYB活化子形成多聚体而抑制转录活化子;与MYB活化子竞争bHLH基因启动子结合区域而阻遏bHLH转录因子的转录;与MYB活化子竞争结合bHLH转录因子而抑制转录激活复合体的形成;与
MYB活化子竞争结构基因启动子结合区域而阻遏结构
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此模型可以较好地解释花青素转录调控机制,但是尚有未知之处,例如:外部因素影响MYB转录因子表达的方式,转录复合体在植物体内的价数及构象和
MYB抑制子的去抑制方式等。
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[10]
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。已分离
并分析了大量与花青素途径相关的结构基因和调控基因,花青素途径的前期、中期步骤已基本清楚,骤和进化模式的研究也不断深入越来越广泛,有待解决的问题主要有:、转运及汇集过程,花青素途径各种转录因子的相互作用机制,花青素途径在其他水平上的调控机制,植物体内花青素的降解途径,花青素途径和其他途径的联系等。随着分子生物学的不断进步和研究的不断深入,阐明花青素途径调控网络对于明确植物代谢调控机制、改良植物花青素性状有着重大的研究意义和应用价值。
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ZHANGNing HUZong2li CHENXu2qing HOUXiao2shu LIGuo2ping
(1BioengineeringCollegeofChongqing)
(2BeijingAgro2biotechnologyResearchCenterofBeijing 100089,China)
1
1
1,2
1
1
1
Abstract Themetabolicpathsynthesis,modification,transportationandsequestrationweremechanismoftheanthocyaninpathwaywasdiscussedonbothtranscriptiptionallevels.
Particularattentionwaspaidtothefunctionsofvarious
transcriptionfacteffectsofexternalfactors,suchasillumination,UV2A,UV2B,low2temperature,waterdepletion,sugarandotherbioticstressesontheaccumulationofanthocyaninweresummarized.Amodelwasproposedtoexplaintheregulatingmechanismofanthocyaninpathway,andaprospectofanthocyaninresearchwasdepicted.
Keywords Anthocyanin Metabolicpathway Regulatingmechanism Model
中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(1):97～105
植物花青素代谢途径分析及调控模型建立
张 宁 胡宗利 陈绪清
1
1
1,2
3
侯晓姝 李 勇 陈国平
11133
(1重庆大学生物工程学院 重庆 400030 2北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 北京 100089)
摘要 介绍了植物花青素的合成、修饰、转运及汇集过程,从转录水平和转录后水平分析了花青素途径分子调控机制,概述了外部因素对花青素积累的影响,并在此基础上提出了一个新的花青素途径调控机制模型。
关键词 花青素 代谢途径 调控机制 模型
中图分类号 Q756
植物的色素主要有三大类:甜菜碱类、类胡萝卜素类和花青素类。色素,,包括粉、红、[2]
。
苯丙氨酸是类黄酮类生物合成的直接前体,花青素是在细胞质中从苯丙氨酸经一系列的酶促反应合成,经不同的羟基化、糖基化、甲基化、酰基化修饰后被转运到液泡中予以汇集
[10,11]
,花青素在结构上主要分三
类:天竺葵素(pelargonidin)、矢车菊素(cyanidin)和飞燕草素(delphinidin)。由矢车菊素和飞燕草素衍生出芍药花素(peonidin)、碧冬茄素(petunidin)和锦葵素
(malvidin)等花青素
[3]
。花青素的生物合成代谢
途径可以分为5个阶段(图1)
。
。花青素主要积累在植物液泡
[4,5]
中并有多种生理功能,例如吸引昆虫传粉,抵御低温和紫外线伤害,以及防治植物病害等
;花青素是迄今
为止所发现的最强效的自由基清除剂,具有抗氧化衰老、抗突变、抗癌与抗动脉硬化功能;此外,花青素还是一种安全、无毒的天然食用色素研究价值。
花青素生物合成代谢途径是类黄酮途径的一个分支途径,其调控机制的相关研究已成为生命科学研究的热点之一。目前,已从玉米、拟南芥、矮牵牛、葡萄、金鱼草、苹果、紫苏等植物中分离并克隆了大量与花青素生物合成代谢相关的结构基因与调控基因
[8,9]
[6,7]
。因此,花青素在
园艺、医药、化妆、食品等方面具有一定的应用潜力和
。本
文在归纳分析现有研究的基础上,提出了一个新的花
收稿日期:2007210222 修回日期:2007211215
3国家“863”计划(2006AA02Z138),重庆市自然科学基金重点项目(CSTC,2006BA5006),重庆市自然科学基金(CSTC,2007BB0250),资助项目
33通讯作者,电子信箱:[email protected]
图1 花青素代谢途径
Fig.1 Themetabolicpathwayofanthocyanin
第一阶段由苯丙氨酸到42香豆酰CoA,该步骤受苯丙氨酸裂解酶(PAL)和肉桂酸羟化酶(C4H)的活性
98
调控,这是许多次生代谢共有的。
中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.12008
类的修饰,这些修饰是通过7GT及5GT实现的,不同的糖基化修饰可能是一个新的花青素苷合成特异调控机制
[19～22]
第二阶段由42香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氢黄酮醇,是类黄酮代谢的关键反应,经不同酶催化可转化为花青素和其他类黄酮物质如黄酮醇和类异黄酮。该步骤受查尔酮合成酶(CHS)和黄烷酮232羟化酶
(F3H)的活性调控[12,13]。
。与红葡萄相比,绿色葡萄中UFGT不表达,而
[23]
在淡红色品种中表达量要低10倍,这说明糖基化水平的调控决定了葡萄皮中花青素的积累
。BAHD家族
是一类多功能的酰基转移酶,有多种底物特异性。花青素酰基转移酶(AT)是BAHD家族的重要亚族,可以把多种有机酸修饰在花青素骨架上,以提高花青素的稳定性、水溶性及光吸收。在花青素糖基化后,AT能催化花青素的酰基化而使大部分花色显示红色到蓝色,在红色菊花中分离得到3个花青素酰基转移酶:
Dm3MaT1、Dm3MaT2和Dm3MaT3
[～26]
第三阶段是各种花青素的合成,受两个酶活性调控:二氢黄酮醇还原酶(DFR)、花青素合成酶(ANS/
LDOX)将无色的二氢黄酮醇转化成无色花青素进而合
成未修饰的花青素
[10]
。
[10]
目前植物中花青素的生物合成途径前三个阶段已经基本明确,主要是花青素骨架的合成
。但对于花
青素骨架修饰及转运、汇集等阶段的研究才刚刚起步。 此外,未修饰的无色花青素和花青素也可以作为无色花青素还原酶(LNR)、花青素还原酶(ANR)的底物,LNR、ANR是合成原花青素的关键酶,素催化生成原花青素,2葡黄酮232葡糖基转移酶(的青苷
[14,15]
。
。花青素,被转运,已经发现了一些[27]
。谷胱甘肽转移酶(GST)参
与了这个转运过程,谷胱甘肽S2交联结合泵(GSHS2
conjugatepump)是结合ATP的ABC运输转运器,通过
[16]
ANR,位于ANS下游,疏水基间的交互作用结合花青苷,然后运送到液泡膜上,但是如何从膜上转入液泡内尚不清楚。玉米中
Bronze2编码了一个谷胱甘肽转移酶,可以把谷胱甘肽
可以把花青素转变成原花青素。从葡萄中也分离纯
化到无色花青素还原酶(LNR)和花青素还原酶
(ANR),这两种酶受转录因子VvMYBPA1激活调控,
转移到花青苷上。而矮牵牛中的Bronze2同源蛋白
AN9则是一个运输蛋白,可以把花青苷转运到液泡膜
主要在果实和种子中表达。此外,葡萄VvMYBPA1转录因子还可以激活黄酮类合成途径中的其他结构基因,但是不能激活花青素苷合成特异酶VvUFGT,而葡萄VvMYBA1转录因子则可以特异地激活VvUFGT的表达,这说明未修饰的花青素经不同转录因子的调控而分别进入花青素苷或原花青素合成途径
[15]
上,进而被运输到液泡内
[28]
。拟南芥TT19也编码一个
谷胱甘肽转移酶,突变体tt19的花青素转运功能可以用矮牵牛AN9转基因弥补,而原花青素却不能积累,说明GST只能转运花青素而不能转运原花青素
[9]
。此
。不同途外,花青素也可以通过小囊泡转运到液泡中。在康乃馨花瓣中已经发现了液泡中的花青素包涵体(AVIs),这些包涵体可以优先聚集糖基化和酰基化的花青素
[29]
径竞争同一底物可以认为是一种新的花青素途径调控机制,例如,拟南芥原花青素合成途径中缺少ANR能增加花青素的合成
[14,17]
。。
第四阶段是花青素骨架合成之后的修饰。许多花青素都要在一个或者几个位点上经过甲基化、酰基化、羟基化、糖基化修饰,不同的修饰就形成了不同的花青素,例如:叶和花表皮的花青素通常是甲基化的
[18]
在甘薯的花青素包涵体(AVIs)中分离出了一个光诱导的金属蛋白酶VP24,含有多重跨膜结构域,参加液泡中花青素的转运和汇集
[30]
。
。花
青素糖基转移酶(GT)对于植物花色和花青素的稳定性及可溶性很重要,是因为其决定了糖基化的位置。第3位糖基化通常是花青素共有的步骤。多数花青素的糖基化是通过葡萄糖转移酶类的尿苷二磷酸2葡萄糖2类黄酮232葡糖基转移酶(UFGT/3GT)实现的。此外,在一些植物中也存在第5位或第7位的鼠李糖及其他糖
2 花青素生物合成代谢途径的分子调控
多数的花青素途径调控发生在结构基因的转录水平上,受多种转录因子在不同时空上的组合调控,还有一些受转录后水平的调控
2.1 转录水平的调控
2.1.1 转录因子 在花青素转录调控过程中有
[8,9]
。
2008,28(1)
张 宁等:植物花青素代谢途径分析及调控模型建立
99
WD40,WRKY,BZIP,MADS2box,R2R32MYB及basichelix2loop2helix(bHLH)等各种转录因子,这些转录因子
目前所知的调控基因中,MYB转录因子最多。
MYB转录因子含有保守的DNA结合区域(MYB结构
通过与结构基因启动子中相应的顺式作用元件结合,从而激活或者抑制花色素苷生物合成途径中一个或多个基因的表达
[31]
域),每个MYB结构域约由52个氨基酸构成,花青素相关的MYB转录因子通常包含R2和R32个基序
(R2R32MYB)或包含R31个基序(R32MYB),含有特
。迄今为止,研究发现花青素结构基
因调控的一般都是由MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白形成一个蛋白复合体,直接调控结构基因的转录,而不合成中间调控物
[32,33]
异的DNA序列识别区和启动子结合区
[58]
。许多现象
[8]
表明一些MYB转录因子有双重功能,即:作为结构基因的直接活化子和作为活化bHLH基因的活化子
。
。在不同植物中,
已分离的3种转录因子及其调控机制如表1所示。
表1 不同植物中转录因子MYB、bHLH和WD40调控的结构基因和调控类型
Table1 StructuralgenesandregulationtypesregulatedbytranscriptionfactorMYB、
bHLHandWD40indifferentplants
MYB
bHLHTT8GL3EGL3
PAP2MYB11MYB12MYMYB4
GL3EGL3
WD40TTG1TTG1
调控类型激活
激活激活
DFR、、DFR、DFR、GSTF3H、DFR、UFGT、GST
参考文献
[34][33][35][36]
拟南芥TT2PAP1
矮牵牛AN2、AN4PhMYB27
JAF13AN1JAF13AN1bHLH2
ZmR、ZmBIN1、Lc
AN11AN11
抑制
激活抑制激活激活激活抑制抑制激活激活激活抑制
C4H
DFR、ANS、UFGTDFR、ANS、UFGTDFRANSDFR、UFGTDFRDFR、UFGTDFR、UFGTLAR、ANRUFGT
F3H、DFR、ANS、UFGTC4H、4CL
[37][32,38][32][39][40][41][42][43][15][44]
[45][46][47][48]
未知
玉米
ZmC1ZmPC1-1Zm38
PAC
不需要
葡萄金鱼草
VvMYBPA1VvMYBA1
Rosealvenosa
DelilamutabilMYC2F3GLM
YC2RP
PFWD
AmMYB308
紫苏草莓
番茄苹果大丁草
MYB2PLFaMYB1ANT1MdMYB10MdMYBAGMYB10
激活抑制
激活激活激活激活
ANS、UFGT
CHS、CHI、DFR、UFGT、GSTCHS、CHI、F3H、DFRLDOX、UFGTANSDFR
[49][50][51,52][53][54]
[57,58]
MdbHLH3MdbHLH33GMYC1
WD40重复蛋白是一种很古老的蛋白家族,在动物,真菌,细菌和植物中均有发现。WD40重复蛋白是一种β螺旋蛋白家族,核心区域由40个氨基酸残基组成
[56]
这些配体主要是bHLH和MYB转录因子。bHLH
家族蛋白都有一个螺旋2环2螺旋结构区域,bHLH转录
[59]
因子可以结合到序列特异DNA(CANNTG)上。已
。其作用是促进蛋白与蛋白之间的相互作用。异得到的花青素合成相关的bHLH蛋白都是高度同源的,并且异源表达也能够正常发挥作用。bHLH蛋白在花青素途径调控中需要和MYB类转录因子共同作用
源表达WD40重复蛋白发现,该蛋白可以与其它蛋白配体作用并可以正常发挥作用,通过酵母双杂交发现
100
而激活花青素的合成
[32]
中国生物工程杂志ChinaBiotechnology
,不过,在拟南芥中还发现,一
[60]
Vol.28No.12008
物转录激活调控的转录因子互相作用及调控的结构基因如表1。
2.1.3 转录抑制调控 花青素途径的转录调节并不
些Lc类似蛋白直接和WD40蛋白TTG1相互作用可以形成一个无激活功能的复合体
。bHLH类调节因子
是由多种进化系统进化而来的,根据bHLH的序列特征,可以把已有的bHLH调节因子分为两类,一类包括
PhJAF13、AmDELILA、ZmLC和ZmR等,另一类包括PhAN1、AtTT8等。尽管不同转录因子间具有一定的同
是单纯的激活转录,也有抑制转录的作用。金鱼草转录因子AmMYB308和拟南芥转录因子AtMYB4是
R2R32MYB转录抑制因子,可以抑制花青素途径的上
游结构基因。金鱼草AmMYB308基因在烟草中的超表达可以抑制花青素上游结构基因C4H、4CL的表达,而沉默拟南芥AtMYB4基因,其上游结构基因C4H表达量上升
[37,47]
源性,但却控制着花色素苷合成途径中不同结构基因的表达
[34]
。
拟南芥TTG2基因编码一个WRKY转录因子,在幼叶、种皮及毛状体中表达。TTG2的表达受MYB和
bHLH转录因子调控,其5′端非编码区有两个MYB结
。红色矮牵牛花冠中花青素的合成在开花
前就开始了,而在开花时下降。矮牵牛PhMYB27基因在花青素合成终止时大量表达,YB27和AtMYB4有同源性,MYB蛋白,可矮牵相互作用,
,使PhAN1成
合位点,R2R32MYB转录因子可以直接作用于这些位点,TTG2的缺失或抑制使拟南芥不能正常合成花青素和形成毛状体。说明拟南芥WRKY转录因子TTG2受
MYB和bHLH复合体调控,[32]
。草莓中分离出的FaMYB1
花青素结构基因的表达
[61]
。R2R32MYB蛋白,该基因在转色、成熟和过熟的果实中表达,转入烟草过量表达后,花瓣中花色素苷合成酶ANS、UFGT的基因表达受到抑制而花青素积累明显减少。通过酵母双杂交显示,FaMYB1无转录激活区域,并且FaMYB1可以与矮牵牛bHLH转录因子AN1和JAF13相互作用
[49]
2.1.2 转录激活调控 ,,并且多。花青素转录激活又有两种调控方式,一种是不依赖bHLH转录因子的MYB转录因子和WD40蛋白二元复合体协同调控;另一种是MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白三元复合体协同调控。
玉米中MYB类转录因子ZmP和ZmC1都可以结合在结构基因DFR的启动子上,它们都需要一个
WD40蛋白配体(ZmPAC)。ZmC1还需要一个bHLH
。玉
米MYB转录激活因子C1可以被其等位基因MYB转录因子C121抑制,C端和DNA结合区域的改变对于
C121的抑制作用都有重要的影响2.2 转录后水平的调控
[42,43]
。
除了发生在结构基因的转录水平上外,一些花青素途径的调控还发生在转录后水平上。
玉米Sn调控基因编码bHLH转录因子,调控花青素合成,发现在其编码区上游的引导序列有5个ATG及3个独立的开放阅读框。RT2PCR发现不同组织中引导区发生了不同的剪接,剪接删除了下游的两个开放阅读框。通过转化玉米原生质体发现,玉米中剪接前导序列与不剪接序列相比,花青素的合成量减少了4倍。说明bHLH转录因子的激活调控是多水平的调控,包括转录水平和转录后水平
[63]
配体(ZmR或ZmB)形成三元复合体(MYB2bHLH2
WD40)协同调控以激活结构基因的转录;ZmP则不需
要bHLH配体,只需要形成(MYB2WD40)二元复合体就可以激活DFR的转录。虽然二元复合体可以正常激活DFR,但是和三元复合体相比,缺少了激活UFGT
(ZmBZ1)的功能,并且二者的表达部位不一样,说明二
元复合体的功能是不完整的,bHLH配体可以调控复合体的特异性
[41,62]
。
大多植物花青素途径是通过三元复合体(MYB2
bHLH2WD40)起始转录激活的,然而复合体中3种转录
。而bHLH的转录
[58]
后水平可能受WD40重复蛋白调控。玉米bHLH转
因子的量是不确定的。转录因子bHLH和MYB一般都能形成同源多聚体,WD40重复蛋白的作用通常是促进蛋白与蛋白之间的相互作用,在植物体内MYB2bHLH2
WD40三元复合体是包含多聚bHLH和MYB蛋白的多
录因子Lc的基因引导序列包含3个上游的ATG并且分别属于一个开放阅读框。上游开放阅读框可以抑制下游开放阅读框,因为翻译的重复起始是无效的
[64]
。
玉米Bronze2基因编码谷胱甘肽转移酶(GST),Bronze2初级转录物包含1个单独的内含子,在玉米的叶子中
价复合体,3种转录因子的价数尚未可知
[58]
。其他植
2008,28(1)
张 宁等:植物花青素代谢途径分析及调控模型建立
101
存在剪接和不剪接两种转录物,这两种转录物分别在不同的组织转录,并且转录物受转录因子R/B和C1诱导,分别可以翻译成26kDa和14kDa的蛋白。但只有
26kDa的蛋白能检测得到,并且只存在于积累花青素的
是通过诱导相关转录因子的表达,然后通过这些转录因子调控花青素途径结构基因的表达,进而影响花青素的合成和积累。
组织。说明Bronze2受转录后的mRNA剪接调控
[65]
。
4 植物花青素途径调控模型
根据前人对植物花青素生物合成调控机制的研究成果,我们提出了一个新的花青素途径调控模型(图
2)。
3 影响花青素生物合成代谢途径的外部
因素
植物液泡中的花青素积累受多种环境因素刺激,包括光照、UV2A、UV2B、低温、缺水、蔗糖,以及其他生物胁迫等。
苹果MdMYB1转录因子是一个受光诱导的R2R32
MYB转录因子,光诱导MdMYB1的表达,进而诱导花
青素合成
[66]
。拟南芥MYB转录因子(PAP1、PAP2)、
bHLH转录因子(TT8、EGL3、GL3)及WD40蛋白(TTG1)受强光诱导,在光诱导下,PAP1PAP2及结构基因(CHS,DFR,F3H,[67米中,下超表达,B和bHLH的水平上,而不是在结构基因水平上
[68,69]
。
。苹果皮中的转录因子
图2 植物花青素途径调控模型
Fig12 Theregulatingmodelofanthocyaninpathway
UV2B可以诱导莴苣叶中CHS、F3H和DFR的表达升高及花青素的合成
[70]
植物花青素途径受外部因素(如光照、低温、UV2
A、UV2B、缺水等)和内部因素(各种转录因子)的影响,
MdMYBA受低温及UV2B诱导,转化苹果和番茄发现MdMYBA可以特异地结合到花青素结构基因ANS的启
其调控可分为激活调控和抑制调控。外部因素通过内部因素起作用,即先诱导转录因子的表达,进而激活花青素途径结构基因的表达。
bHLH转录因子的启动子调控区含有MYB识别元件(MRE),受MYB转录因子的调控。MYB转录因子、
bHLH转录因子和WD40重复蛋白组成三元复合体,或
动子上,然后诱导苹果幼芽和番茄果实产生花青素,说明低温及UV2B通过诱导MdMYBA表达进而激活花青素途径结构基因的表达
[53]
。
将在黑暗条件下生长的芜青采用不同的光照射,只有UV2A可以诱导花青素的合成,在UV2A的照射下,结构基因PAL、CHS、F3H、DFR、ANS表达量随照射时间的延长明显升高。UV2A特异地诱导芜青花青素表达,而UV2B及红光蓝光不能诱导芜青花青素表达,说明红芜青花青素的合成是由一个不同的UV2A特异光受体介导的
[71]
者组成不含bHLH转录因子的二元复合体。WD40重复蛋白的作用是促进蛋白与蛋白之间的相互作用及参与bHLH基因转录后mRNA剪接的调控。WRKY转录因子受MYB和bHLH转录复合体调控,并作为一个配体调控花青素结构基因的表达。结构基因启动子调控区包含3个部分:MYB识别元件(MRE)、ACGT元件
(ACE)及一个新发现的R反应元件。启动转录需要一
。
缺水可以促进葡萄中花青素的大量积累,表达分析发现缺水使花青素合成途径基因F3H、DFR、UFGT、
GST表达量增高
[72]
。然而这是新陈代谢的直接作用还
个完整的MRE,R反应元件包括BHLH因子的结合位点CANNTG,而ACE元件可以结合一个锌指蛋白
(BZIP),作为转录复合体的一个配体共同激活转
是生长的抑制作用尚不清楚。
蔗糖可以特异地诱导拟南芥转录因子MYB75/
PAP1基因的表达,从而诱导花青素的合成
[73]
。
录
[74,75]
。
已有研究表明,外部因素影响花青素的积累大都
花青素途径的抑制途径主要通过MYB抑制子实
102
中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.12008
现的。与同源MYB活化子形成多聚体而抑制转录活化子;与MYB活化子竞争bHLH基因启动子结合区域而阻遏bHLH转录因子的转录;与MYB活化子竞争结合bHLH转录因子而抑制转录激活复合体的形成;与
MYB活化子竞争结构基因启动子结合区域而阻遏结构
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此模型可以较好地解释花青素转录调控机制,但是尚有未知之处,例如:外部因素影响MYB转录因子表达的方式,转录复合体在植物体内的价数及构象和
MYB抑制子的去抑制方式等。
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[10]
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并分析了大量与花青素途径相关的结构基因和调控基因,花青素途径的前期、中期步骤已基本清楚,骤和进化模式的研究也不断深入越来越广泛,有待解决的问题主要有:、转运及汇集过程,花青素途径各种转录因子的相互作用机制,花青素途径在其他水平上的调控机制,植物体内花青素的降解途径,花青素途径和其他途径的联系等。随着分子生物学的不断进步和研究的不断深入,阐明花青素途径调控网络对于明确植物代谢调控机制、改良植物花青素性状有着重大的研究意义和应用价值。
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ZHANGNing HUZong2li CHENXu2qing HOUXiao2shu LIGuo2ping
(1BioengineeringCollegeofChongqing)
(2BeijingAgro2biotechnologyResearchCenterofBeijing 100089,China)
1
1
1,2
1
1
1
Abstract Themetabolicpathsynthesis,modification,transportationandsequestrationweremechanismoftheanthocyaninpathwaywasdiscussedonbothtranscriptiptionallevels.
Particularattentionwaspaidtothefunctionsofvarious
transcriptionfacteffectsofexternalfactors,suchasillumination,UV2A,UV2B,low2temperature,waterdepletion,sugarandotherbioticstressesontheaccumulationofanthocyaninweresummarized.Amodelwasproposedtoexplaintheregulatingmechanismofanthocyaninpathway,andaprospectofanthocyaninresearchwasdepicted.
Keywords Anthocyanin Metabolicpathway Regulatingmechanism Model