实验一 植物体内过氧化物酶活性的测定
一、目的
过氧化物酶普遍存在于植物组织中,其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系,它在代谢中调控IAA 水平,并可作为一种活性氧防御物质,消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。
二、原理
在过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶竭色4-邻甲氧基苯酚,在470nm 波长处测定生成物的吸光度(A )值,即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂
1. 材料:植物叶片
2. 仪器设备:分光光度计;离心机;离心管;研钵;移液管;移液管架;试管;试管架;洗耳球。
3. 试剂及配制:
0.1mol ·L -1磷酸缓冲液(pH7)。
反应液(100ml 0.1mol·L -1磷酸缓冲液(pH6)中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2,充分摇匀)。
四、实验步骤
1. 酶液提取
称取植物叶片1g ,剪碎置于已冷冻过的研钵中,加入少量石英砂,分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液,研磨成匀浆后,倒入离心管中,在8000 r / min离心15min ,上清液即为粗酶提取液,倒入小试管低温下放置备用。
2. 酶活性测定
吸取反应液3ml 于试管中,加入酶提取液0.02ml (视酶活性可增减加入量),迅速摇匀后倒入光径1cm 的比色杯中,以未加酶液之反应液为空白对照,在470nm 波长处,以时间扫描方式,测定3min 内吸光度值变化,取线性变化部分,计算每分钟吸光度变化值(△A470)。
五、酶活性计算
按下式计算酶的相对活性
△A470 × 酶提取液总量(ml )
酶活性(△A470·g -1Fw ·min -1)= -------------------
样品鲜重(g )× 测定时酶液用量(ml )
实验二 尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法)
原理】
临床上通常用Winslow 氏法测定尿或血清中淀粉酶活力. 该法对
淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟, 恰好能将0,1%淀粉
溶液1ml 水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色) 的酶量定为一个活
力单位.
试剂和器材】
1,0.9%氯化钠
2,0.1%淀粉
3, 碘化钾-碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中, 使
用前稀释10倍)
4, 移液管
5, 试管
6, 恒温水浴锅
操作】
1, 取10支试管, 按次序记上号码, 各加0,9%氯化钠1毫升.
2, 用1毫升移液管加尿液1毫升于第一管, 使其与0.9%氯化钠混合
(若尿液中淀粉酶过多, 应预先将尿液适当稀释). 用移液管吸取,
然后任其流出. 反复三次, 使全管混匀.
从第一管吸出1毫升到第二管中, 混匀. 吸出1毫升到第三管...... 依
次类推. 到第九管吸出1毫升弃之. 这样即可获得分别含有尿液1/2,
1/4,1/8......1/5 12毫升的不同浓度的尿稀释液, 第10管不加尿液作
为对照管.
3, 将10支试管置冰水浴中, 然后从第10管起依次迅速准确加入0.1%
淀粉液1毫升. 迅速摇匀. 立即从冰水中取出, 置37℃, 并记录时
间. 注意保持水浴的温度.
4, 保温30分钟后, 取出各管, 迅速浸入冰水浴中冷却. 然后向各管
中加稀碘液2滴摇匀. 观察各管的颜色. 各试管中出现黄到兰的
色序. 黄色表明无淀粉存在, 浅红色到紫色表明有淀粉的水解中
间产物. 兰色表明有淀粉或其初期水解产物存在.
计算】
选择黄色管中尿液稀释倍数最大的一管来计算. 假设第5管为
黄色(从第6管起仍有红色或兰色). 已知第5管内含尿液为1/32毫
升. 即1/32毫升尿液能在37℃,30分钟水解0.1%淀粉1毫升. 所以,
1毫升尿液在同样条件下可水解0.1%淀粉32毫升, 即每毫升尿液中
所含淀粉酶的活性为32个活力单位.
实验三 超氧物歧化酶活性的测定
超氧物歧化酶活性的测定采用硝基四唑蓝还原法测定[21]。
(一) 原理
超氧物歧化酶(SOD )普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT )在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm 处有最大吸收。而SOD 可清除O2,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
(二) 材料、仪器设备及试剂
1. 材料:新鲜苎麻叶片
2. 仪器设备:
(1) 研钵(预冷) ;
(2) TGL-16LG台式高速冰冻高速离心机(12 000r/min, 湖南星科科学仪器有限公司) ;
(3) PUS-2018型 半自动生化分析仪(北京普朗新技术有限公司) ;
(4) 移液管(10ml,5ml,0.5ml,0.2ml 各数支);
(5) 日光灯(反应试管处照度为4 000Lx);
(6) 试管数支;
(7) 洗耳球。
3. 试剂:
(1) 0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH7.8): A.称取磷酸氢二钠7.8005g, 溶解后转移到250ml 容量瓶中,定容。B. 称取磷酸二氢钠7.098g, 溶解后转移到100ml 容量瓶中,定容。C. 将磷酸氢二钠溶液倒入烧杯中,用量筒量取23ml 后加入同一烧杯中,用pH 试纸调节其pH 值至7.8;
(2) 130mmol/L甲硫氨酸(Met )溶液:称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml ;
(3) 750μmol/L 氮蓝四唑(NBT )溶液:称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml ,避光保存;
(4) 100μmol/L EDTA-Na2溶液:称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1 000ml;
(5) 20μmol/L 核黄素溶液:称取0.00753g 核黄素用蒸馏水定容至1 000ml避光保存。
(三) 实验步骤
1. 酶液提取
取取被不同浓度NaCl 溶液处理过的苎麻叶片(视需要定,去叶脉)0.5g 于预冷的研钵中。加1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml 。取1.5ml 于10 000r/min下离心12min ,上清液即为SOD 粗提液。
2. 显色反应
取试管(要求透明度好)4支,1支为对照管,另3支为测定管,按下列加入各溶液:试剂(酶)用量(ml )终浓度(比色时)0.2mol/L 磷酸缓冲液1.5ml, 130mmol/L Met 溶液0.3ml, 750μmol/L NBT溶液0.3ml,100μmol/L EDTA-Na2液0.3ml ,20μmol/L 核黄素0.3ml, 蒸馏水0.25ml 和0.05ml 酶提取液,对照管以缓冲液代替酶液; 总体积为3.0ml 。各管于4 000Lx日光下反应20min (要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长)。列表如表1:
表1. 试剂用量表
试 剂(酶)
用量(ml)
终浓度(比色时)
0.2mol/L磷酸缓冲液
1.5
130mmol/L Met溶液
0.3
13mmol
750μmol/L NBT溶液
0.3
75μmol
100μmol/L EDTA-Na2液
0.3
10μmol
20μmol/L核黄素
0.3
2.0μmol
酶 液
0.05
空白加缓冲液代替酶液
蒸馏水
0.25
总体积
3.0
3. SOD活性测定与计算
至反应结束后,以未加酶液处理的对照管做空白,分别在560nm 测定其它各管的吸光度值。
(四) 结果计算
已知SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD 活性。
SOD 总活性=(ACK-AE) ×V/(ACK×0.5×W ×Vt) 公式(1)
式中SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示;ACK 照光对照管的吸光度,AE 样品管的吸光度;V 样品液总体积(ml );V t测定时样品用量(ml );W 样鲜重(g )。
实验四 过氧化氢酶活性的测定
过氧化氢酶活力的测定在本次实验中采用高锰酸钾溶液滴定法[21]。
(一) 原理
过氧化氢酶(CAT )属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。CAT 酶活性的大小可用一定时间内分解的H2O2 量来表示. 在反应系统中加入一定量(反应过量)的过氧化氢溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量:
5H2O2 +2KMnO4+4H2SO4→5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
(二) 材料、仪器设备及试剂
1. 材料:新鲜苎麻叶片
2. 仪器设备
(1) 研钵;
(2) 三角瓶;
(3) 酸式滴定管;
(4) HH-4数显恒温水浴(30℃)(国华电器有限公司) ;
(5) 容量瓶(250ml);
(6) 试管数支;
(7) AL204电子天平(梅特勒-托得多仪器(上海) 有限公司) 。
2. 试剂
(1) 10%H2SO4(自配);
(2) 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(自配) ;
(3) 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称:取KMnO4 3.160g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成1 000ml,再用0.1mol/L 草酸溶液标定;
(4) 0.1mol/L H2O2:取30% H2O2溶液5.68ml ,稀释至1 000ml,用标准0.1mol/L
KMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定;
(5) 0.1mol/L 草酸:称取优级纯H2C2O4·2H2O 12.607g,用蒸馏水溶解后,定容至1 000ml。
(三) 实验步骤
1. 酶液提取
取 叶片2.5g(去叶脉) 加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至25ml 容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转至容量瓶中,用同一缓冲液定容,10 000r/min离心12min ,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2. 显色反应
取50ml 三角瓶4个(两个测定,两个对照),测定加入酶液2.5ml ,对照为煮死酶液2.5ml ;再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2,同时计算时间,于30℃恒温水浴中反应10min ,立即加入10%H2SO4 2.5ml。然后用0.1mol/L KMnO4滴定,至出现粉红色(30秒内不消失)为终点。
(四) 结果
酶活性用每g 鲜重样品10min 内分解H2O2的mg 数表示:
过氧化氢酶活性(H2O2mg/g/min)=(A -B )×VT/(W×VS ×1.7) 公式(2) 式中:A 对照KMnO4滴定ml 数;B 酶反应后KMnO4滴定ml 数;VT 提取酶液总量(ml );VS 反应时所用酶液量(ml );W 样品鲜重(g )。
实验一 植物体内过氧化物酶活性的测定
一、目的
过氧化物酶普遍存在于植物组织中,其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系,它在代谢中调控IAA 水平,并可作为一种活性氧防御物质,消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。
二、原理
在过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶竭色4-邻甲氧基苯酚,在470nm 波长处测定生成物的吸光度(A )值,即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂
1. 材料:植物叶片
2. 仪器设备:分光光度计;离心机;离心管;研钵;移液管;移液管架;试管;试管架;洗耳球。
3. 试剂及配制:
0.1mol ·L -1磷酸缓冲液(pH7)。
反应液(100ml 0.1mol·L -1磷酸缓冲液(pH6)中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2,充分摇匀)。
四、实验步骤
1. 酶液提取
称取植物叶片1g ,剪碎置于已冷冻过的研钵中,加入少量石英砂,分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液,研磨成匀浆后,倒入离心管中,在8000 r / min离心15min ,上清液即为粗酶提取液,倒入小试管低温下放置备用。
2. 酶活性测定
吸取反应液3ml 于试管中,加入酶提取液0.02ml (视酶活性可增减加入量),迅速摇匀后倒入光径1cm 的比色杯中,以未加酶液之反应液为空白对照,在470nm 波长处,以时间扫描方式,测定3min 内吸光度值变化,取线性变化部分,计算每分钟吸光度变化值(△A470)。
五、酶活性计算
按下式计算酶的相对活性
△A470 × 酶提取液总量(ml )
酶活性(△A470·g -1Fw ·min -1)= -------------------
样品鲜重(g )× 测定时酶液用量(ml )
实验二 尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法)
原理】
临床上通常用Winslow 氏法测定尿或血清中淀粉酶活力. 该法对
淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟, 恰好能将0,1%淀粉
溶液1ml 水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色) 的酶量定为一个活
力单位.
试剂和器材】
1,0.9%氯化钠
2,0.1%淀粉
3, 碘化钾-碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中, 使
用前稀释10倍)
4, 移液管
5, 试管
6, 恒温水浴锅
操作】
1, 取10支试管, 按次序记上号码, 各加0,9%氯化钠1毫升.
2, 用1毫升移液管加尿液1毫升于第一管, 使其与0.9%氯化钠混合
(若尿液中淀粉酶过多, 应预先将尿液适当稀释). 用移液管吸取,
然后任其流出. 反复三次, 使全管混匀.
从第一管吸出1毫升到第二管中, 混匀. 吸出1毫升到第三管...... 依
次类推. 到第九管吸出1毫升弃之. 这样即可获得分别含有尿液1/2,
1/4,1/8......1/5 12毫升的不同浓度的尿稀释液, 第10管不加尿液作
为对照管.
3, 将10支试管置冰水浴中, 然后从第10管起依次迅速准确加入0.1%
淀粉液1毫升. 迅速摇匀. 立即从冰水中取出, 置37℃, 并记录时
间. 注意保持水浴的温度.
4, 保温30分钟后, 取出各管, 迅速浸入冰水浴中冷却. 然后向各管
中加稀碘液2滴摇匀. 观察各管的颜色. 各试管中出现黄到兰的
色序. 黄色表明无淀粉存在, 浅红色到紫色表明有淀粉的水解中
间产物. 兰色表明有淀粉或其初期水解产物存在.
计算】
选择黄色管中尿液稀释倍数最大的一管来计算. 假设第5管为
黄色(从第6管起仍有红色或兰色). 已知第5管内含尿液为1/32毫
升. 即1/32毫升尿液能在37℃,30分钟水解0.1%淀粉1毫升. 所以,
1毫升尿液在同样条件下可水解0.1%淀粉32毫升, 即每毫升尿液中
所含淀粉酶的活性为32个活力单位.
实验三 超氧物歧化酶活性的测定
超氧物歧化酶活性的测定采用硝基四唑蓝还原法测定[21]。
(一) 原理
超氧物歧化酶(SOD )普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT )在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm 处有最大吸收。而SOD 可清除O2,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。
(二) 材料、仪器设备及试剂
1. 材料:新鲜苎麻叶片
2. 仪器设备:
(1) 研钵(预冷) ;
(2) TGL-16LG台式高速冰冻高速离心机(12 000r/min, 湖南星科科学仪器有限公司) ;
(3) PUS-2018型 半自动生化分析仪(北京普朗新技术有限公司) ;
(4) 移液管(10ml,5ml,0.5ml,0.2ml 各数支);
(5) 日光灯(反应试管处照度为4 000Lx);
(6) 试管数支;
(7) 洗耳球。
3. 试剂:
(1) 0.2mol/L 磷酸缓冲液(pH7.8): A.称取磷酸氢二钠7.8005g, 溶解后转移到250ml 容量瓶中,定容。B. 称取磷酸二氢钠7.098g, 溶解后转移到100ml 容量瓶中,定容。C. 将磷酸氢二钠溶液倒入烧杯中,用量筒量取23ml 后加入同一烧杯中,用pH 试纸调节其pH 值至7.8;
(2) 130mmol/L甲硫氨酸(Met )溶液:称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml ;
(3) 750μmol/L 氮蓝四唑(NBT )溶液:称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml ,避光保存;
(4) 100μmol/L EDTA-Na2溶液:称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1 000ml;
(5) 20μmol/L 核黄素溶液:称取0.00753g 核黄素用蒸馏水定容至1 000ml避光保存。
(三) 实验步骤
1. 酶液提取
取取被不同浓度NaCl 溶液处理过的苎麻叶片(视需要定,去叶脉)0.5g 于预冷的研钵中。加1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml 。取1.5ml 于10 000r/min下离心12min ,上清液即为SOD 粗提液。
2. 显色反应
取试管(要求透明度好)4支,1支为对照管,另3支为测定管,按下列加入各溶液:试剂(酶)用量(ml )终浓度(比色时)0.2mol/L 磷酸缓冲液1.5ml, 130mmol/L Met 溶液0.3ml, 750μmol/L NBT溶液0.3ml,100μmol/L EDTA-Na2液0.3ml ,20μmol/L 核黄素0.3ml, 蒸馏水0.25ml 和0.05ml 酶提取液,对照管以缓冲液代替酶液; 总体积为3.0ml 。各管于4 000Lx日光下反应20min (要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长)。列表如表1:
表1. 试剂用量表
试 剂(酶)
用量(ml)
终浓度(比色时)
0.2mol/L磷酸缓冲液
1.5
130mmol/L Met溶液
0.3
13mmol
750μmol/L NBT溶液
0.3
75μmol
100μmol/L EDTA-Na2液
0.3
10μmol
20μmol/L核黄素
0.3
2.0μmol
酶 液
0.05
空白加缓冲液代替酶液
蒸馏水
0.25
总体积
3.0
3. SOD活性测定与计算
至反应结束后,以未加酶液处理的对照管做空白,分别在560nm 测定其它各管的吸光度值。
(四) 结果计算
已知SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD 活性。
SOD 总活性=(ACK-AE) ×V/(ACK×0.5×W ×Vt) 公式(1)
式中SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示;ACK 照光对照管的吸光度,AE 样品管的吸光度;V 样品液总体积(ml );V t测定时样品用量(ml );W 样鲜重(g )。
实验四 过氧化氢酶活性的测定
过氧化氢酶活力的测定在本次实验中采用高锰酸钾溶液滴定法[21]。
(一) 原理
过氧化氢酶(CAT )属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。CAT 酶活性的大小可用一定时间内分解的H2O2 量来表示. 在反应系统中加入一定量(反应过量)的过氧化氢溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量:
5H2O2 +2KMnO4+4H2SO4→5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
(二) 材料、仪器设备及试剂
1. 材料:新鲜苎麻叶片
2. 仪器设备
(1) 研钵;
(2) 三角瓶;
(3) 酸式滴定管;
(4) HH-4数显恒温水浴(30℃)(国华电器有限公司) ;
(5) 容量瓶(250ml);
(6) 试管数支;
(7) AL204电子天平(梅特勒-托得多仪器(上海) 有限公司) 。
2. 试剂
(1) 10%H2SO4(自配);
(2) 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(自配) ;
(3) 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称:取KMnO4 3.160g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成1 000ml,再用0.1mol/L 草酸溶液标定;
(4) 0.1mol/L H2O2:取30% H2O2溶液5.68ml ,稀释至1 000ml,用标准0.1mol/L
KMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定;
(5) 0.1mol/L 草酸:称取优级纯H2C2O4·2H2O 12.607g,用蒸馏水溶解后,定容至1 000ml。
(三) 实验步骤
1. 酶液提取
取 叶片2.5g(去叶脉) 加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至25ml 容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转至容量瓶中,用同一缓冲液定容,10 000r/min离心12min ,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2. 显色反应
取50ml 三角瓶4个(两个测定,两个对照),测定加入酶液2.5ml ,对照为煮死酶液2.5ml ;再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2,同时计算时间,于30℃恒温水浴中反应10min ,立即加入10%H2SO4 2.5ml。然后用0.1mol/L KMnO4滴定,至出现粉红色(30秒内不消失)为终点。
(四) 结果
酶活性用每g 鲜重样品10min 内分解H2O2的mg 数表示:
过氧化氢酶活性(H2O2mg/g/min)=(A -B )×VT/(W×VS ×1.7) 公式(2) 式中:A 对照KMnO4滴定ml 数;B 酶反应后KMnO4滴定ml 数;VT 提取酶液总量(ml );VS 反应时所用酶液量(ml );W 样品鲜重(g )。