棉花学报ＣｏｔｔｏｎＳｃｉｅｎｃｅ２００８，２０（２）：１４１～１４７
植物体细胞胚胎发生机理的研究进展
张朝军．李付广’。张玲
（中国农业科学院棉花研究所，农业部棉花遗传改良重点
开放实验室，河南安阳４５５０００）
专题与述评
摘要：体细胞胚胎的诱导是大多数植物组织培养中的关键环节。在愈伤组织分化胚性愈伤组织的过程中，随着细胞功能的转变，细胞内部基因的差异表达，引起了植物体内蛋白质组分、酶组分与活性、激素等各方面的变化，这些变化一直是组织培养研究中的热点。本文对体细胞胚胎的氨基酸变化、标记性蛋白、基因的差异表达、同工酶变化、激素动态和高体细胞胚胎发生率的材料遗传与选育等方面的研究进展作了综述。关键词：植物组织培养；体细胞胚；氨基酸；同工酶；激素
中图分类号：Ｓ５６２．０３５．３
文献标识码：Ａ
文章编号：１００２—７８０７（２００８）０２—０１４１—０７
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收稿日期：２００７—０８－２１
作者简介：张朝军（１９６８－），男，副研究员ｚｈａｎｇｃｊ＠ｃｒｉｃａａｓ．ｃｏｒｆＬｏｎ；＊通讯作者，ｌｉｆｕｇ＠ｃｒｉｃａａｓ．∞ｍ
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基金项目：国家“８６３”项目资助“优质高产棉花分子品种创制”（２００６ＡＡｌ００１０５）
１４２棉花学报
转基因生物及其产业的社会和经济效益巨大，已成为全球竞争的焦点。植物转基因技术研究也成为人们关注的焦点。近年来，遗传转化方法不断创新，以转化系统的原理大致可分为三类：农杆菌介导的基因转移；以原生质体、细胞或组织为受体的直接转移，如电激、微注射、ＰＥＧ介导转化原生质体等；种质系统的基因转移（ｇｅｒｍｌｉｎｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ），如利用注射子房、种胚、体细胞遗传转化方法是目前应用最多、最成功的方法。但是农杆菌介导遗传转化方法依赖于高效植物组织培养体系的建立。植物体细胞再生植株多数是通过体细胞脱分化产生愈伤组织、再分化诱导出胚性愈伤组织，经胚状体途径获得再生植株，如小麦、玉米、水稻、棉花，也有直接再生植株的，如烟草。经胚状体途径获得再生植株的过程一般可以分为以下三个阶段：体细胞脱分化产生愈伤组织、再分化诱导出胚性愈伤组织，经胚状体途径获得再生植株。其中胚性愈伤组织的诱导是组织培养中的关键环节，其研究内容涉及生物学领域的各个学科。在植物组织培养由愈伤组织分化胚性愈伤组织的过程中，随着细胞功能的转变，细胞内部基因的差异表达，引起了植物体内蛋白质组分、酶是组织培养研究中的热点。激素动态、氨基酸变化等生化研究已经应用到培养基改良中；基因的差异表达研究处于启始阶段，多种植物胚胎发生早期产生３５－～５５ｋＤ多肽是共有的胚性发生分子标志，对特异表达的基因的克隆与研究尚未开展；白等初级阶段；在遗传方面，多数植物存在基因型限制，但对其遗传规律仍不明确。本文对这些方面的研究进展进行了概述。
Ｇｌｕ、ＡＬａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ和Ｐｒｏ几种氨基酸的含量在胚性愈伤中含量较高，而Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ的含量较低［２］，它们可能是胚状体发生的关键性氨基酸［３＿５］。其中Ａｒｇ在细胞内的大量积累有利于细胞分裂和细胞分化能力的提高［６。８］，Ｇｌｕ有利于棉花胚状体发生，所以可以被添加到培养基中［１’５’９］，因此在棉花组织培养中多添加Ａｒｇ和Ｇｌｕ。此外，在培养基中加入Ａｒｇ、Ａｓｐ、应ｃ７－ｓ３。
１．２体细胞胚发生中酶活性及同工酶研究
胚及花粉等途径导入外源基因。其中农杆菌介导Ｈｉｓ和Ｌｙｓ等也有促进胚性愈伤形成方面的正效
胚性愈伤组织（ＥＣ）发生与发育是大量酶特异性合成和参与代谢的结果［３，１０－１１］。报道较多的是与活性氧代谢有关的酶类：酸性磷酸酶、乙醇脱氢酶、酯酶、葡萄糖一６一磷酸脱氢酶和磷酸葡萄糖变位酶等。研究发现过氧化物酶同工酶的变化与形态发生有关，在多数植物的ＳＥ发生中过氧化物酶（ＰＯＤ）的活性较高，同工酶的种类较多［１２－１４］，在枸杞［１５］、小麦ｍ］、烟草‘・７１、豌豆‘１引、柑桔‘１８３的组织培养中进行过研究，发现细胞分化在过氧化物酶同工酶酶谱变化上都有极其细致的反映，有研究认为过氧化物酶同工酶的变化可以作为组织培养过程中细胞再分化的指标。以胡萝卜更多［１９－２３］。大量研究表明，在组织培养中，过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱的变化是有规律可循的。
以胡萝卜为材料研究结果证明，鸟氨酸甲酰转移酶的瞬时增加与体细胞胚发生潜力相关。还有报道认为，野生胡萝卜体细胞胚形成过程中需氢酶同工酶的研究结果表明‘ｚ引，长芽和不长芽愈伤组织中的６一磷酸葡萄糖脱氢酶和苹果酸脱氢酶同工酶酶谱明显不同，长芽愈伤组织中酶带较多且酶活性较强。对向日葵的形态发生过程中的酸性磷酸酶、乙醇脱氢酶、酯酶、葡萄糖一６一磷酸脱氢酶和磷酸葡萄糖变位酶的图谱分析结果表明，各个发育时期均有其特异性酶带，而且２，４一Ｄ浓度等并未导致图谱的明显差异［２引。因此，也有研究认为，可以把氧化物酶，结合酯酶和酸性磷酸酶同工酶作为ＥＣ发生的标志酶［１“２３。２“。１．３体细胞胚发生的标记性蛋白研究
体细胞经脱分化、再分化为胚性细胞受细胞内外多种因子调控［２引，其中最重要的是受特定基因的调控，根据特定蛋白的变化可以判断出胚胎
组分与活性、激素等各方面的变化，这些变化一直（Ｄａｕｃｕ￥ｃａｒｏｔａ）体细胞胚发生为材料的研究报道
蛋白质组学的研究仍处于同工酶变化、标记性蛋一要多胺和精氨酸脱羧酶的参与。对哈蜜瓜４种脱
１
愈伤组织和胚性愈伤组织（ＥＣ）的氨基
酸与酶体系的变化
１．１氨基酸含量的变化
棉花从下胚轴开始诱导出愈伤组织到愈伤组织出现胚分化，其可溶性糖、淀粉含量呈下降趋势，而蛋白质和核酸含量呈上升趋势［１］。愈伤组织至胚性愈伤组织阶段游离氨基酸含量降低，而蛋白质氨基酸和总氨基酸的含量却在增加［２］。并不是所有的氨基酸含量都发生非常明显的变化，往往只有几种发生较大变化，分析表明：Ａｒｇ、
２期张朝军等：植物体细胞胚胎发生机理的研究进展
１４３
发生的基因程序是否已经表达［１０，２７Ｊ。Ｓｕｎｇ［２３］等指出根据３个方面的生化变化可以判断出胚胎发生的基因程序是否已经表达，即精胺和亚精胺的合成、胚胎特异蛋白的合成、抗环己亚胺（蛋白质合成抑制剂）能力。不同植物ＥＣ发生有不同的标记性蛋白：苜蓿［２８］ＥＣ发生中膜上的５０ｋＤ多肽；在枸杞［１５。、小麦Ｄｓ，ｓｓ］、烟草［１７’２引、柑桔‘１８１、哈密瓜［２４｜、秦艽［２６］、紫花苜蓿‘２８３等ＥＣ中的４５～５５ｋＤ的胚胎相关性多肽；小麦［１“３５３体细胞胚发生
早期的４９ｋＤ的胚胎相关性多肽；枸杞［１５］ＥＣ中的３５ｋＤ和４４ｋＤ特异蛋白质等。在蒲公英和苜
蓿的体细胞胚中，细胞核中的ＡＧＬｌ５蛋白明显
增加。ＡＧＬｌ５（ＡＧＡＭＯＵＳ－ｌｉｋｅ１５）蛋白是一标
志蛋白［３３。。大量研究表明，伴随着特定的基因的表达，产生３５～５５ｋＤ多肽是多种植物胚胎发生早期共有的胚性发生分子标志［２０’３引。
２
核酸代谢与基因的差异表达
２．１体细胞胚发生中ＤＡＮ。ＲＮＡ合成动态
细胞ＤＮＡ复制不仅为细胞增殖奠定了物质
基础，也为愈伤组织再分化为胚性愈伤组织提供了条件［３引．应用３Ｈ一胸苷（３Ｈ—ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）标记放射自显影方法研究小麦哺］、红豆草［３６］体细胞胚发生结果表明，ＤＮＡ合成动态正好与胚性愈伤组织生长曲线相一致，加入抑制剂后不仅抑制了ＤＮＡ的复制，同时也抑制了胚性愈伤组织的增殖，而且抑制剂加入时间愈早，影响愈严重。
对体细胞胚胎发生过程的研究表明，胚性愈伤组织的ＲＮＡ合成速率增加迅速，其ＲＮＡ合成速率明显高于非胚性愈伤组织［３＾“３…。胡萝卜是研究最多的植物，ＲＮＡ合成起始于诱导培养的第
２～４ｈ。培养２ｄ后，细胞分裂加快，总ＲＮＡ和
蛋白质含量增加，且在胚性细胞中合成的ＲＮＡ主要是ｍＲＮＡ。应用３Ｈ一尿苷标记放射自显影方法研究小麦［３５１、红豆草ｆ－３６］体细胞胚发生结果表明，胚性愈伤组织的ＲＮＡ合成速率迅速增，而且在体细胞胚发育过程中一直保持较高的水平，加入ＡＭＤ对ＲＮＡ的合成具有显著的抑制效应，而且加入时间愈早，抑制效应越明显。ＡＭＤ不仅抑制ＲＮＡ的合成，同时抑制了胚性愈伤组织的生长和分化。
２．２特异表达基因的研究
现有报道主要利用ｍＲＮＡ差异显示技术及其相关的改良技术［３８１，进行植物体细胞胚胎发生
中特异表达的基因的ＥＳＴｓ序列检测与分析。在对胡萝卜的研究中发现其体细胞胚中的ｃＤＮＡ序列与在黄瓜的胚、根和芽等器官中表达的基因具有同源性，有些也与黄豆［３引、小麦、芹菜等的ｃＤＮＡ具有同源性。对陆地棉品种珂字２０１胚性和非胚性愈伤组织的研究发现，胚性愈伤组织中的ＲＮＡ含量高于非胚性愈伤组织，ＲＮＡ和ｍＲ－ＮＡ的含量高于下胚轴和经过诱导的非胚性愈伤组织中的含量。同时获得了大量胚性愈伤组织中特异表达的基因，发现该类基因与多种代谢途径
有关Ｍｔｌｌ。
３
激素动态研究
植物激素并非是由其中某一类型单独发挥作
用，而在更多情况下，是由多种类激素相互协调、相互影响和相互对立条件下促进植物成长发育的，体细胞胚胎发生与内源激素关系十分密切［４２。４引。多数组织培养工作者认为胚性愈伤组织的形成和维持受内源激素调控，高水平内源ＡＢＡ、低水平内源乙烯有利于胚性能力的启动或表达。体胚发生和发育受内源激素调节，在体胚发生过程中，各种内源激素都会发生动态变化。内源ＩＡＡ含量上升或维持在较高水平的是胡萝卜、水稻等体胚发生的关键因素；高水平内源ＫＴ对不同植物体胚发生作用不同，有明显的基因型差异；内源ＡＢＡ有利于体胚发育和成熟；高水平内源乙烯抑制体胚发生，高水平多胺促进体胚发生，二者相互制约。外源生长调节物质与体胚发生中内源激素的关系比较复杂，相对明确的是添加ＡＢＡ、多胺能提高其相应内源物质的水平，进而调节体胚发生［４４３。
由于不同植物、同种植物的不同基因型对激素调节的水平不同，在组织培养过程中对外源激素的反应也表现出基因型的特征。在棉花组织培养中，筛选一个合适的基因型与激素组合是诱导体细胞胚胎发生的关键。在众多的测试组合中，发现ＩＢＡ无论在胚性愈伤的诱导还是活力保持上均优于２，４一Ｄ和ＩＡＡ。ＩＢＡ与ＫＴ配合使用能使珂字２０１品种的愈伤组织的胚胎分化率提高到８９．５％［４５。。有研究表明ＢＲ能使难以进行胚
胎发生的品种进行胚胎发生［４５。。
４
能量代谢动态
在棉花愈伤组织分化为体细胞胚的过程中，
１４４棉花学报
２０卷
可溶性糖含量先上升后下降。在枸杞的早期胚性
细胞中［４６。，ＡＴＰ酶反应产物主要沉积于质膜和
液胞膜上。当在质膜上ＡＴＰ酶活性高，且呈连续分布时其它部位未见ＡＴＰ酶活性。在胚性细胞后期，ＡＴＰ酶活性从细胞质膜逐渐转入细胞内，细胞质、液泡以及细胞核中均有ＡＴＰ酶活性反应。处于“生理隔离”的晚期胚性细胞或胚性细胞团一直处于一个厚壁包围之中，并与其周围细胞之间的胞间连丝消失，随着胚性细胞壁的加厚，在细胞间隙和细胞壁上存在广泛的ＡＴＰ酶活性。
５
体细胞胚胎发生的遗传研究及应用
组织培养基因型的限制集中在愈伤组织分化
为胚性愈伤组织的能力上“７１。在水稻中的组织培养特性的遗传研究，有关再生力方面有的报道较多。不少双列杂交的研究表明，水稻体细胞培养愈伤组织的再生力表现较高的遗传力，既有一个控制高再生力的显性基因，也有一个控制高再生力的隐性基因［４８４９。，国外也有控制高再生力的显性基因［５¨３］的报道。水稻愈伤组织增殖力与２组基因有关，并且在高增殖力的ＫｕｊＵ与低增殖力的Ｓｏｍｅｗａｋｅ的Ｆ２中，低增殖力和高增殖力类型的分离符合１对因子分离的３。１的理论比［５１１。水稻的愈伤组织增殖和再生力是由不同的基因控制的。
徐丽娟［５胡等对６个世代的胚性愈伤组织频率进行了分析，认为玉米幼胚胚性愈伤组织发生频率不存在上位性；而主要以加性效应为主，显性度为０．１，狭义遗传力为９２％，广义遗传力为９７％，控制该性状的基因至少有３对。国外有报道认为［５引，玉米愈伤组织的发生频率和植株再生能力，主要受２对核基因控制，另外还有一对核基因位点可能只对其有修饰作用，基因间的作用方式主要以加性效应为主，不存在上位性效应。但是，许多研究者对于细胞质的作用提出了不同的看法，认为母性效应会影响胚性愈伤组织的诱导，它的遗传方式较为复杂。对小麦嘲］、大麦Ｅ５７－５８］、油菜Ｅｓ９］、向日葵［６０］及橡树［６妇等的研究认为也存在主基因，但存在较多争议。
棉花与其它植物一样，在基因型限制的研究中存在争议，主要结果有：（１）再生能力可以遗传，为数量性状［６引。（２）再生能力是质量性状∞］，一对隐性主基因控制胚状体的发生能力，而胚状体
诱导率受少数修饰基因存在。（３）品种的局限性具有一定规律［４７１。在美国爱字棉和斯字棉系列难再生，岱字棉极难或不能再生，珂字棉最易再生。在我国，黄河流域品种容易，长江流域品种困难。（４）一个封闭基因系统（Ｂｌｏｃｋｅｒｇｅｎｅ
ｓｙｓ—
ｔｅｒｎ）控制着再生性状。
对棉花组织培养中体细胞胚胎发生的研究主要集中在培养体系的建立与改良方面‘４５矗３｛引，对发生机制、生理生化动态的研究比水稻、枸杞、胡萝卜等的研究落后较多，需要加强开展这方面的工作。
６
高分化率材料的选育
在大多数已经建立组织培养体系的植物中都
存在基因型限制问题，但是人们在建立组织培养体系的过程中考虑最多的是品种（系）间的差异，对异花、常异花授粉植物的品种（系）内单株间组织培养特性的差异研究较少。如棉花组织培养中国外常用的珂字３１２、珂字２０１等，国内常用的冀合７１３、中棉所２４、泗棉３号等。很少进行品种内单株培养特性的筛选。吴家和等卟５３利用棉花单株一半种子种植、一半种子用于组织培养的方法，从泗棉３号中选育出２个适用于组织培养的棉花特种材料。同时把珂字３１２的的愈伤分化率提高到９６．１％左右。张朝军等［６６］建立了棉花叶柄组织培养与高分化率材料选育体系，并在中棉所２６、中棉所３６中选育出了２０多个分化率高于９５％的株系。－ｌ？结语‘
、…““一一
～一…’
植物组织培养的关键步骤是细胞脱分化后的再分化，即胚性愈伤组织的产生。植物细胞的脱分化与再分化是大量基因差异表达、协同作用的结果，也是基因与培养条件互作的结果。不同基因型要求不同的环境，因此存在基因型限制问题。研究组织培养要从基因型与培养体系两方面入手，综合多学科的知识与试验手段，对植物细胞发育进行系统的研究，才可能获得突破。目前的研究主要集中在胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织间的差异上，对从愈伤组织到胚性愈伤组织阶段缺乏动态研究。在基因型限制方面对不同培养条件下的基因型限制关系也缺乏系统研究。利用植物组织培养中存在的基因型差异，寻找关键基因，有可能是揭示植物组织培养中体细胞分化的重点。
２期
张朝军等：植物体细胞胚胎发生机理的研究进展
１４５
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２期张朝军等：植物体细胞胚胎发生机理的研究进展
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ｂｒｙｏｓｏｒｉｇｉｎａｔｅｄｆｒｏｍｌｅａｆａｎｄｓｔｅｍｅｘｐｌａｎｔｓ：ＲＡＰＤｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆ
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ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２００３，１６０（６）：６９９－７０７．［６２３ＧＡｗＥＬ
Ｎ
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ＳＯ—
ｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎ
ｃｏｔｔｏｎ
ｐｅｔｉｏｌｅｃａｌｌｕｓｃｕｌｔｕｒｅｓ
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●
棉花学报ＣｏｔｔｏｎＳｃｉｅｎｃｅ２００８，２０（２）：１４１～１４７
植物体细胞胚胎发生机理的研究进展
张朝军．李付广’。张玲
（中国农业科学院棉花研究所，农业部棉花遗传改良重点
开放实验室，河南安阳４５５０００）
专题与述评
摘要：体细胞胚胎的诱导是大多数植物组织培养中的关键环节。在愈伤组织分化胚性愈伤组织的过程中，随着细胞功能的转变，细胞内部基因的差异表达，引起了植物体内蛋白质组分、酶组分与活性、激素等各方面的变化，这些变化一直是组织培养研究中的热点。本文对体细胞胚胎的氨基酸变化、标记性蛋白、基因的差异表达、同工酶变化、激素动态和高体细胞胚胎发生率的材料遗传与选育等方面的研究进展作了综述。关键词：植物组织培养；体细胞胚；氨基酸；同工酶；激素
中图分类号：Ｓ５６２．０３５．３
文献标识码：Ａ
文章编号：１００２—７８０７（２００８）０２—０１４１—０７
ＡｄｖａｎｃｅｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ
ｏｎ
ＰｌａｎｔＳｏｍａｔｉｃＥｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ
ＺＨＡＮＧＣｈａｏ－ｊｕｎ，ＬＩＦｕ—ｇｕａｎｇ，ＺＨＡＮＧＬｉｎｇ（ＣｏｔｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｏｔｔｏｎ
４５５０００，Ｃｈｉｎａ）
Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｎｙａｎｇ，Ｈｅｎａｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓ（ＥＣ）ｉｓｏｆｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ．Ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ
ａ
ｋｅｙ
ｃｏｕｒｓｅ
ｏｆｔｈｅｗｈｏｌｅｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅ
ｄｙｎａｍｉｃ
ｉｎｐｌａｎｔ
ｓｏｍａｔｉｃ
ｃｈａｎｇｅｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄ，ｅｎｚｙｍｅａｎｄｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒａｎｄｇｅｎｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ，ａｎｄｔｈｅｈｅｒｉｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｉｎｖｉｔｒｏｐｌａｎｔｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．ＩｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｉｎｄｕｃｉｎｇｃａｌｌｕｓｔｏＥＣｂｙｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｗｏｕｌｄｈａｐｐｅｎｔｏｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，ｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ，ｐｈｙｔｏ－ｈｏｒｍｏｎｅ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ
ｗｉｔｈｃｅｌｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ，ａｎｄ
ａ
ｓｅｒｉｅｓｏｆｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｉｎｐｌａｎｔ，
ａｎｄｈｏｗｔｈｅｓｅａｆｆｅｃｔｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｗｅｒｅｔｈｅｈｏｔｐｏｉｎｔｏｆｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ．ＴｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｒｅｓｕＩｔｓｏｆｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ，ａｍｉｎｏａｃｉｄ，ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＥＣｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄｉｎｔｏｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅ—ｍｅｎｔｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ
ｗｈｉｃｈｗａｓａｄｄｅｄｍｏｒｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓ１ｉｋｅＡｒｇａｎｄＧｌｕ．Ｉｔ
Ｗａｓｐｒｏｖｅｄｔｈａｔ
ＰＯＤ，ＡＰａｓｅａｎｄＥｓｔｅｒａｓｅＩｓｏｅｎｚｙｍｅｓｐｌａｙｅｄｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＥＣ．Ｉｎｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ＨｉｇｈＡＢＡａｍｏｎｇｗｉｔｈｌｏｗＰＥＰ．Ｔｈｅｓｔｕｄｙ
ｏｆｐｈｙｔｏ－ｈｏｒｍｏｎｅｗａｓ
ｏｎ
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ｏｎ
ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ｗｈｉｃｈｓｈｏｕｌｄｂｅｅｎｈａｎｃｅｄ，ｗｅｒｅ
ｉｎｉｔｉａｌｒｅｓｅａｒｃｈｐｅｒｉｏｄｏｆｉｓｏｅｎｚｙｍｅａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ．Ｉｎｇｅｎｅｔｉｃｓｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ，ｔｈｏｕｇｈｔｈｅｇｅｎ—ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｅｘｉｓｔｅｄｉｎｍｏｓｔｏｆｐｌａｎｔｓ．ｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌｓｗｉｔｈｈｉｇｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
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ｌｅｃｔｅｄｉｎｆｅｗｃｒｏｐｓ．Ｓｏｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｆｕｒｔｈｅｒｓｅａｒｃｈｆｏｒｔｈｅｍａｉｎｇｅｎｅｓｏｆｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃｃａｌｌｕｓａｎｄｓｅｌｅｃｔｔｈｅｈｉｇｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｍａｔｅｒｉａｌｓｒａｐｉｄｌｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ；ｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏ；ａｍｉｎｏａｃｉｄ；ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ；ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ
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收稿日期：２００７—０８－２１
作者简介：张朝军（１９６８－），男，副研究员ｚｈａｎｇｃｊ＠ｃｒｉｃａａｓ．ｃｏｒｆＬｏｎ；＊通讯作者，ｌｉｆｕｇ＠ｃｒｉｃａａｓ．∞ｍ
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基金项目：国家“８６３”项目资助“优质高产棉花分子品种创制”（２００６ＡＡｌ００１０５）
１４２棉花学报
转基因生物及其产业的社会和经济效益巨大，已成为全球竞争的焦点。植物转基因技术研究也成为人们关注的焦点。近年来，遗传转化方法不断创新，以转化系统的原理大致可分为三类：农杆菌介导的基因转移；以原生质体、细胞或组织为受体的直接转移，如电激、微注射、ＰＥＧ介导转化原生质体等；种质系统的基因转移（ｇｅｒｍｌｉｎｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ），如利用注射子房、种胚、体细胞遗传转化方法是目前应用最多、最成功的方法。但是农杆菌介导遗传转化方法依赖于高效植物组织培养体系的建立。植物体细胞再生植株多数是通过体细胞脱分化产生愈伤组织、再分化诱导出胚性愈伤组织，经胚状体途径获得再生植株，如小麦、玉米、水稻、棉花，也有直接再生植株的，如烟草。经胚状体途径获得再生植株的过程一般可以分为以下三个阶段：体细胞脱分化产生愈伤组织、再分化诱导出胚性愈伤组织，经胚状体途径获得再生植株。其中胚性愈伤组织的诱导是组织培养中的关键环节，其研究内容涉及生物学领域的各个学科。在植物组织培养由愈伤组织分化胚性愈伤组织的过程中，随着细胞功能的转变，细胞内部基因的差异表达，引起了植物体内蛋白质组分、酶是组织培养研究中的热点。激素动态、氨基酸变化等生化研究已经应用到培养基改良中；基因的差异表达研究处于启始阶段，多种植物胚胎发生早期产生３５－～５５ｋＤ多肽是共有的胚性发生分子标志，对特异表达的基因的克隆与研究尚未开展；白等初级阶段；在遗传方面，多数植物存在基因型限制，但对其遗传规律仍不明确。本文对这些方面的研究进展进行了概述。
Ｇｌｕ、ＡＬａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｖａｌ和Ｐｒｏ几种氨基酸的含量在胚性愈伤中含量较高，而Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ的含量较低［２］，它们可能是胚状体发生的关键性氨基酸［３＿５］。其中Ａｒｇ在细胞内的大量积累有利于细胞分裂和细胞分化能力的提高［６。８］，Ｇｌｕ有利于棉花胚状体发生，所以可以被添加到培养基中［１’５’９］，因此在棉花组织培养中多添加Ａｒｇ和Ｇｌｕ。此外，在培养基中加入Ａｒｇ、Ａｓｐ、应ｃ７－ｓ３。
１．２体细胞胚发生中酶活性及同工酶研究
胚及花粉等途径导入外源基因。其中农杆菌介导Ｈｉｓ和Ｌｙｓ等也有促进胚性愈伤形成方面的正效
胚性愈伤组织（ＥＣ）发生与发育是大量酶特异性合成和参与代谢的结果［３，１０－１１］。报道较多的是与活性氧代谢有关的酶类：酸性磷酸酶、乙醇脱氢酶、酯酶、葡萄糖一６一磷酸脱氢酶和磷酸葡萄糖变位酶等。研究发现过氧化物酶同工酶的变化与形态发生有关，在多数植物的ＳＥ发生中过氧化物酶（ＰＯＤ）的活性较高，同工酶的种类较多［１２－１４］，在枸杞［１５］、小麦ｍ］、烟草‘・７１、豌豆‘１引、柑桔‘１８３的组织培养中进行过研究，发现细胞分化在过氧化物酶同工酶酶谱变化上都有极其细致的反映，有研究认为过氧化物酶同工酶的变化可以作为组织培养过程中细胞再分化的指标。以胡萝卜更多［１９－２３］。大量研究表明，在组织培养中，过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱的变化是有规律可循的。
以胡萝卜为材料研究结果证明，鸟氨酸甲酰转移酶的瞬时增加与体细胞胚发生潜力相关。还有报道认为，野生胡萝卜体细胞胚形成过程中需氢酶同工酶的研究结果表明‘ｚ引，长芽和不长芽愈伤组织中的６一磷酸葡萄糖脱氢酶和苹果酸脱氢酶同工酶酶谱明显不同，长芽愈伤组织中酶带较多且酶活性较强。对向日葵的形态发生过程中的酸性磷酸酶、乙醇脱氢酶、酯酶、葡萄糖一６一磷酸脱氢酶和磷酸葡萄糖变位酶的图谱分析结果表明，各个发育时期均有其特异性酶带，而且２，４一Ｄ浓度等并未导致图谱的明显差异［２引。因此，也有研究认为，可以把氧化物酶，结合酯酶和酸性磷酸酶同工酶作为ＥＣ发生的标志酶［１“２３。２“。１．３体细胞胚发生的标记性蛋白研究
体细胞经脱分化、再分化为胚性细胞受细胞内外多种因子调控［２引，其中最重要的是受特定基因的调控，根据特定蛋白的变化可以判断出胚胎
组分与活性、激素等各方面的变化，这些变化一直（Ｄａｕｃｕ￥ｃａｒｏｔａ）体细胞胚发生为材料的研究报道
蛋白质组学的研究仍处于同工酶变化、标记性蛋一要多胺和精氨酸脱羧酶的参与。对哈蜜瓜４种脱
１
愈伤组织和胚性愈伤组织（ＥＣ）的氨基
酸与酶体系的变化
１．１氨基酸含量的变化
棉花从下胚轴开始诱导出愈伤组织到愈伤组织出现胚分化，其可溶性糖、淀粉含量呈下降趋势，而蛋白质和核酸含量呈上升趋势［１］。愈伤组织至胚性愈伤组织阶段游离氨基酸含量降低，而蛋白质氨基酸和总氨基酸的含量却在增加［２］。并不是所有的氨基酸含量都发生非常明显的变化，往往只有几种发生较大变化，分析表明：Ａｒｇ、
２期张朝军等：植物体细胞胚胎发生机理的研究进展
１４３
发生的基因程序是否已经表达［１０，２７Ｊ。Ｓｕｎｇ［２３］等指出根据３个方面的生化变化可以判断出胚胎发生的基因程序是否已经表达，即精胺和亚精胺的合成、胚胎特异蛋白的合成、抗环己亚胺（蛋白质合成抑制剂）能力。不同植物ＥＣ发生有不同的标记性蛋白：苜蓿［２８］ＥＣ发生中膜上的５０ｋＤ多肽；在枸杞［１５。、小麦Ｄｓ，ｓｓ］、烟草［１７’２引、柑桔‘１８１、哈密瓜［２４｜、秦艽［２６］、紫花苜蓿‘２８３等ＥＣ中的４５～５５ｋＤ的胚胎相关性多肽；小麦［１“３５３体细胞胚发生
早期的４９ｋＤ的胚胎相关性多肽；枸杞［１５］ＥＣ中的３５ｋＤ和４４ｋＤ特异蛋白质等。在蒲公英和苜
蓿的体细胞胚中，细胞核中的ＡＧＬｌ５蛋白明显
增加。ＡＧＬｌ５（ＡＧＡＭＯＵＳ－ｌｉｋｅ１５）蛋白是一标
志蛋白［３３。。大量研究表明，伴随着特定的基因的表达，产生３５～５５ｋＤ多肽是多种植物胚胎发生早期共有的胚性发生分子标志［２０’３引。
２
核酸代谢与基因的差异表达
２．１体细胞胚发生中ＤＡＮ。ＲＮＡ合成动态
细胞ＤＮＡ复制不仅为细胞增殖奠定了物质
基础，也为愈伤组织再分化为胚性愈伤组织提供了条件［３引．应用３Ｈ一胸苷（３Ｈ—ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）标记放射自显影方法研究小麦哺］、红豆草［３６］体细胞胚发生结果表明，ＤＮＡ合成动态正好与胚性愈伤组织生长曲线相一致，加入抑制剂后不仅抑制了ＤＮＡ的复制，同时也抑制了胚性愈伤组织的增殖，而且抑制剂加入时间愈早，影响愈严重。
对体细胞胚胎发生过程的研究表明，胚性愈伤组织的ＲＮＡ合成速率增加迅速，其ＲＮＡ合成速率明显高于非胚性愈伤组织［３＾“３…。胡萝卜是研究最多的植物，ＲＮＡ合成起始于诱导培养的第
２～４ｈ。培养２ｄ后，细胞分裂加快，总ＲＮＡ和
蛋白质含量增加，且在胚性细胞中合成的ＲＮＡ主要是ｍＲＮＡ。应用３Ｈ一尿苷标记放射自显影方法研究小麦［３５１、红豆草ｆ－３６］体细胞胚发生结果表明，胚性愈伤组织的ＲＮＡ合成速率迅速增，而且在体细胞胚发育过程中一直保持较高的水平，加入ＡＭＤ对ＲＮＡ的合成具有显著的抑制效应，而且加入时间愈早，抑制效应越明显。ＡＭＤ不仅抑制ＲＮＡ的合成，同时抑制了胚性愈伤组织的生长和分化。
２．２特异表达基因的研究
现有报道主要利用ｍＲＮＡ差异显示技术及其相关的改良技术［３８１，进行植物体细胞胚胎发生
中特异表达的基因的ＥＳＴｓ序列检测与分析。在对胡萝卜的研究中发现其体细胞胚中的ｃＤＮＡ序列与在黄瓜的胚、根和芽等器官中表达的基因具有同源性，有些也与黄豆［３引、小麦、芹菜等的ｃＤＮＡ具有同源性。对陆地棉品种珂字２０１胚性和非胚性愈伤组织的研究发现，胚性愈伤组织中的ＲＮＡ含量高于非胚性愈伤组织，ＲＮＡ和ｍＲ－ＮＡ的含量高于下胚轴和经过诱导的非胚性愈伤组织中的含量。同时获得了大量胚性愈伤组织中特异表达的基因，发现该类基因与多种代谢途径
有关Ｍｔｌｌ。
３
激素动态研究
植物激素并非是由其中某一类型单独发挥作
用，而在更多情况下，是由多种类激素相互协调、相互影响和相互对立条件下促进植物成长发育的，体细胞胚胎发生与内源激素关系十分密切［４２。４引。多数组织培养工作者认为胚性愈伤组织的形成和维持受内源激素调控，高水平内源ＡＢＡ、低水平内源乙烯有利于胚性能力的启动或表达。体胚发生和发育受内源激素调节，在体胚发生过程中，各种内源激素都会发生动态变化。内源ＩＡＡ含量上升或维持在较高水平的是胡萝卜、水稻等体胚发生的关键因素；高水平内源ＫＴ对不同植物体胚发生作用不同，有明显的基因型差异；内源ＡＢＡ有利于体胚发育和成熟；高水平内源乙烯抑制体胚发生，高水平多胺促进体胚发生，二者相互制约。外源生长调节物质与体胚发生中内源激素的关系比较复杂，相对明确的是添加ＡＢＡ、多胺能提高其相应内源物质的水平，进而调节体胚发生［４４３。
由于不同植物、同种植物的不同基因型对激素调节的水平不同，在组织培养过程中对外源激素的反应也表现出基因型的特征。在棉花组织培养中，筛选一个合适的基因型与激素组合是诱导体细胞胚胎发生的关键。在众多的测试组合中，发现ＩＢＡ无论在胚性愈伤的诱导还是活力保持上均优于２，４一Ｄ和ＩＡＡ。ＩＢＡ与ＫＴ配合使用能使珂字２０１品种的愈伤组织的胚胎分化率提高到８９．５％［４５。。有研究表明ＢＲ能使难以进行胚
胎发生的品种进行胚胎发生［４５。。
４
能量代谢动态
在棉花愈伤组织分化为体细胞胚的过程中，
１４４棉花学报
２０卷
可溶性糖含量先上升后下降。在枸杞的早期胚性
细胞中［４６。，ＡＴＰ酶反应产物主要沉积于质膜和
液胞膜上。当在质膜上ＡＴＰ酶活性高，且呈连续分布时其它部位未见ＡＴＰ酶活性。在胚性细胞后期，ＡＴＰ酶活性从细胞质膜逐渐转入细胞内，细胞质、液泡以及细胞核中均有ＡＴＰ酶活性反应。处于“生理隔离”的晚期胚性细胞或胚性细胞团一直处于一个厚壁包围之中，并与其周围细胞之间的胞间连丝消失，随着胚性细胞壁的加厚，在细胞间隙和细胞壁上存在广泛的ＡＴＰ酶活性。
５
体细胞胚胎发生的遗传研究及应用
组织培养基因型的限制集中在愈伤组织分化
为胚性愈伤组织的能力上“７１。在水稻中的组织培养特性的遗传研究，有关再生力方面有的报道较多。不少双列杂交的研究表明，水稻体细胞培养愈伤组织的再生力表现较高的遗传力，既有一个控制高再生力的显性基因，也有一个控制高再生力的隐性基因［４８４９。，国外也有控制高再生力的显性基因［５¨３］的报道。水稻愈伤组织增殖力与２组基因有关，并且在高增殖力的ＫｕｊＵ与低增殖力的Ｓｏｍｅｗａｋｅ的Ｆ２中，低增殖力和高增殖力类型的分离符合１对因子分离的３。１的理论比［５１１。水稻的愈伤组织增殖和再生力是由不同的基因控制的。
徐丽娟［５胡等对６个世代的胚性愈伤组织频率进行了分析，认为玉米幼胚胚性愈伤组织发生频率不存在上位性；而主要以加性效应为主，显性度为０．１，狭义遗传力为９２％，广义遗传力为９７％，控制该性状的基因至少有３对。国外有报道认为［５引，玉米愈伤组织的发生频率和植株再生能力，主要受２对核基因控制，另外还有一对核基因位点可能只对其有修饰作用，基因间的作用方式主要以加性效应为主，不存在上位性效应。但是，许多研究者对于细胞质的作用提出了不同的看法，认为母性效应会影响胚性愈伤组织的诱导，它的遗传方式较为复杂。对小麦嘲］、大麦Ｅ５７－５８］、油菜Ｅｓ９］、向日葵［６０］及橡树［６妇等的研究认为也存在主基因，但存在较多争议。
棉花与其它植物一样，在基因型限制的研究中存在争议，主要结果有：（１）再生能力可以遗传，为数量性状［６引。（２）再生能力是质量性状∞］，一对隐性主基因控制胚状体的发生能力，而胚状体
诱导率受少数修饰基因存在。（３）品种的局限性具有一定规律［４７１。在美国爱字棉和斯字棉系列难再生，岱字棉极难或不能再生，珂字棉最易再生。在我国，黄河流域品种容易，长江流域品种困难。（４）一个封闭基因系统（Ｂｌｏｃｋｅｒｇｅｎｅ
ｓｙｓ—
ｔｅｒｎ）控制着再生性状。
对棉花组织培养中体细胞胚胎发生的研究主要集中在培养体系的建立与改良方面‘４５矗３｛引，对发生机制、生理生化动态的研究比水稻、枸杞、胡萝卜等的研究落后较多，需要加强开展这方面的工作。
６
高分化率材料的选育
在大多数已经建立组织培养体系的植物中都
存在基因型限制问题，但是人们在建立组织培养体系的过程中考虑最多的是品种（系）间的差异，对异花、常异花授粉植物的品种（系）内单株间组织培养特性的差异研究较少。如棉花组织培养中国外常用的珂字３１２、珂字２０１等，国内常用的冀合７１３、中棉所２４、泗棉３号等。很少进行品种内单株培养特性的筛选。吴家和等卟５３利用棉花单株一半种子种植、一半种子用于组织培养的方法，从泗棉３号中选育出２个适用于组织培养的棉花特种材料。同时把珂字３１２的的愈伤分化率提高到９６．１％左右。张朝军等［６６］建立了棉花叶柄组织培养与高分化率材料选育体系，并在中棉所２６、中棉所３６中选育出了２０多个分化率高于９５％的株系。－ｌ？结语‘
、…““一一
～一…’
植物组织培养的关键步骤是细胞脱分化后的再分化，即胚性愈伤组织的产生。植物细胞的脱分化与再分化是大量基因差异表达、协同作用的结果，也是基因与培养条件互作的结果。不同基因型要求不同的环境，因此存在基因型限制问题。研究组织培养要从基因型与培养体系两方面入手，综合多学科的知识与试验手段，对植物细胞发育进行系统的研究，才可能获得突破。目前的研究主要集中在胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织间的差异上，对从愈伤组织到胚性愈伤组织阶段缺乏动态研究。在基因型限制方面对不同培养条件下的基因型限制关系也缺乏系统研究。利用植物组织培养中存在的基因型差异，寻找关键基因，有可能是揭示植物组织培养中体细胞分化的重点。
２期
张朝军等：植物体细胞胚胎发生机理的研究进展
１４５
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