第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编实验动物Ｅ６３ＴｓｕｎｄａＹ．ＳｏｎｍａＴ．ＳｕｇｉｅＴ．Ｆｒｏｇｅｎｓｔｏｒａｇｅｏｆｒａｂｂｉｔｓａｎｄｈａｍｓｔｅｒｅｍｂｒｙｏｓｉｎ：ＺｅｌｌｍａｒｋｅｒＨ，ｅｔｓ，Ｆｒｏｚｅｎ
ｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＧｕｓｔａｖｅＦｉｓｅｃｈｅｒＹｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ１９８１，１２９—１３８．Ｓｔｏｒａｇｅ
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ＲｅｐｒｏｄＳｃｉ，１９９９，５６（３—４）：２７９—２９０．
实验动物的胚胎工程
魏庆信
（湖北省动物胚胎工程及分子育种重点实验室，湖北省农科院畜牧兽医研究所，武汉４３００６４）
【摘要ｌ实验动物的胚胎工程是研究动物的胚胎学、繁殖学、发育学和遗传学的重要手段，也是人类和家畜
胚胎工程的试验模型；同时，实验动物的胚胎ｊ亡程还广泛应用于实验动物自身种系的建立、资源保存及高效繁育。实验动物的胚胎工程涵盖了所有对配子（精子、卵子）和早期胚胎的体外操作，近年来发展很快，新技术、新方法不断出现。本文扼要介绍实验动物的排卵控制、胚胎移植、配子和胚胎的冷冻保存、体外受精、胚胎干细胞和动物克隆等方面的研究进展，供广大实验动物工作者参考。
【关键词】实验动物；胚胎工程
对配子或胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化。
这一综合技术，统称为胚胎生物工程，或简称为胚胎工程（ｅｍｂｒｙｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）…。实验动物的胚胎工程是研究动物的胚胎学、繁殖学、发育学和遗传学的重要手段，也是人类和家畜胚胎工程的试验模型，绝大多数现代生殖医学技术和家畜繁殖技术的建立是从实验动物开始的；｜一时，实验动物的胚胎工程还广泛应用于实验动物自身种系的建立、资源保存及高效繁育。实验动物的胚胎工程涵盖了所有对配子（精子、卵子）和早期胚胎的体外操作，近年来发展很快，新技术、新方法不断出现。本文扼要介绍实验动物的排卵控制、胚胎移植、配子和胚胎的冷冻保存、体外受精、胚胎干细胞和动物克隆等方面的研究进展，供广大实验动物工作者参考。
１排卵控制
排卵控制（ｃｏｎｔｒｏｌｏｖｕｌａｔｉｏｎ）主要是指应用外源激素处理雌性动物，控制其排卵的时问和
数量心。。控制排卵时间的技术称诱发排卵；用较高剂量的激素促使排卵数量多于正常数的技术称为超数排卵。动物胚胎工程和转基因动物的研究往往需要大量的卵子，因此排卵控制中最常用的是超数排卵技术。超数排卵处理的同时也有诱发排卵的效应。超数排卵技术不仅可以为试验研究提供更多的卵子，而且对提高雌性动物的繁殖力、增加产仔数也是行之有效的。用于动物超数排卵的激素主要有：ＰＭＳＧ（孕马血清促性腺激素）、ＨＣＧ（人类绒毛膜促性腺激素）、ＦＳＨ（促卵泡素）、ＬＨ（促黄体素）、ＬＲＨ＿Ａ（促排卵素）等。超数排卵反应是个复杂的生理过程，它受动物的品种、体况、年龄、卵巢的功能状态、环境温度以及激素用量、处理方法等多种因素的影响。一般单胎动物通过超数排卵处理，其排卵数可提高５－１０倍；多胎动物可提高２—３倍。但个体之间有一定的差异，曾有１３２
实验动物第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编１只酬小鼠获得８３枚卵、１只兔获得８８枚卵、１只金黄地鼠获得７２枚卵呤１、Ｉ头猪获得７６枚卵（笔者自己的实验）的超数排卵记录。
小鼠的超数排卵一般用ＰＭＳＧ＋ＨＣＧ的激素组合，向雌鼠腹腔注射ＩＯ－１５１ＵＰＭＳＧ，４８小时后，再
注射同等剂量的ＨＣＧ。注射ＨＣＧ的当夜即可排卵，一般可获得３０一４０枚卵（如与公鼠合笼，即为受精卵）。本实验室李聚学等人对ｌ（Ｍ小鼠的超数排卵进行了较为系统的试验研究，研究结果表明：（１）ＰＭＳＧ＋ＨＣＧ的用量以ＩＯ＋ＩＯＩＵ为宜，其平均排卵数为３９．６，极显著地高于５＋５１Ｕ（平均排卵数为２７．２）和１５＋１５ＩＵ（平均排卵数为２５．５）的激素用量；（２）ＰＭＳＧ与ＨＣＧ注射时间的间隔以４８小时为宜，其平均排卵数分别高于间隔４６小时和５０小时，尤其是极显著高于间隔５０小时的处理；（３）对成年雌鼠，在发情周期的不同阶段处理，其排卵数的差异显著，以发情前期的处理效果最好；（４）不同舍温对超排效果的影响很大，当鼠房的温度维持在２０—２５。Ｃ时，超排效果最好；而当鼠房的温度只有１０ｃｏ左右时，其平均排卵数只有１０．８枚Ｈ１。
２胚胎移植
胚胎移植是指：将一只动物的早期胚胎（或受精卵）取出，或者由体外受精及其它方式获得的
胚胎（或受精卵），移植到另一只同种生理状态相同的雌性动物的体内，使之继续发育成为新个体的技术，又称之为人工受胎或借腹怀胎。提供胚胎的个体称为供体（ｄｏｎｏｒ），接受胚胎的个体称为受体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）。动物胚胎移植首次试验成功已有ｉ００多年的历史，１８９０年英国剑桥大学ＷａｌｔｅｒＨｅａｐｅ从交配后３２ｈ的安哥拉母兔取出２个四细胞期胚胎，移植到１只比利时母兔输卵管，结果生出２只安哥拉仔兔，第一次证实受精卵在寄主母体内发育的可能性旧１。这之后，小鼠、大鼠、牛、羊、猪等各种哺乳动物的胚胎移植相继成功。胚胎移植不仅是所有胚胎操作的最基本技术，而且已广泛应用于人类的生殖医学临床和动物生产，目前全世界每年有数以百万计的牛、羊通过胚胎移植繁殖优良品种的后代。
胚胎移植的技术环节包括供、受体的同步发情、胚胎的采集、胚胎的短期培养和胚胎的移植。
胚胎移植与超数排卵技术相结合，能使一只供体的胚胎移植更多的受体。本实验室建立的小鼠胚胎移植的技术程序如下：首先对供体母鼠进行超数排卵处理，在注射ＨＣＧ的当夜与公鼠合笼；同时将准备做受体的雌鼠与结扎公鼠合笼，制备假孕母鼠；次日将供体鼠脱臼处死，取出输卵管，用Ｍ２液从输卵管内冲取受精卵，镜检，去除未受精卵和发育不正常的卵；如果受精卵需短期培养再移植，则将受精卵置于Ｍｔｓ培养基中，３７＂Ｃ、５％Ｃ０２的培养箱中培养；胚胎移植，取与供体同一天见栓的假孕母鼠，麻醉，去毛，腹部开口，拉出输卵管和卵巢，用移卵管将１５枚左右的受精卵移入输卵管内，复位，缝合哺。。按上述程序，其受胎率在６０％左右，１只供体至少可以移植２只受体。如果要移植囊胚期的胚胎，则应在供体鼠与公鼠合笼的第３天，从子宫中冲取囊胚，移入受体的子宫内。３配子和胚胎的冷冻保存
配子和胚胎的冷冻保存，是指应用低温生物学技术，将其保存在低温或超低温的环境下，使细
胞处于新陈代谢和分裂速度减慢或停止，即使其发育基本处于暂时停顿状态，一旦通过解冻技术恢复正常温度时，又能继续发育或恢复活力。目前普遍应用的是将配子和胚胎置于－１９６。Ｃ的液态氮的环境中，可以长期保存。配子和胚胎的冷冻保存，不仅对于动物种系资源的保存、对于动物种系资源长距离交流具有重要意义，而且已经广泛应用于动物生产，成为优良品种高效繁育、杂交改良的重要手段；同时也为动物胚胎工程提供不受时问和空间限制的材料。
３．１精液的冷冻保存
动物精液的冷冻保存技术是２０世纪随着人工受精技术的广泛开展应运而生。世界上第一例成
功对动物的精液进行冷冻、并且解冻后经人工授精生出动物的是Ｐｏｌｇｅ等人１９５１年完成的，其研究对象是牛，迄今已有５０多年的历史Ⅱ。。这之后其它动物（绵羊、山羊、猪、兔、马、水牛等）的冻精也相继研究成功，并且广泛应用于生产和科研，其中在生产中应用最普及的是牛。目前牛的冻精已产业化生产，全世界的奶牛场已经普遍采用冷冻精液繁殖后代，对奶牛的品种改良、提高产奶量发挥了巨大的作用。动物精液的冷冻稀释液除其它成份外，低温保护剂是至关重要的。常用的】３３
第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编实验动物低温保护剂有甘油、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）等。
实验动物中以兔的冻精研究较多。１９７６年Ｗｅｉｔｚｅ等人采用三基一柠檬酸一葡萄糖一２０％卵黄一４．５％
蹦Ｓ伊ｌ％甘油作为冷冻稀释液，制成颗粒冻精，解冻后移植的受胎率达８９．５％，细管冻精的受胎率达８４．２％，与鲜精的受胎率无显著差异。我国从８０年代开展兔冻精的研究，受胎率在７０—８０％之间。广西大学杨素芳等人，采用１５％ＤＭＳＯ作为抗冻剂，４＂Ｃ下平衡３０－６０ｍｉｎ，解冻后的活力为０．２４９，复苏率为０．３２５㈨。
３．２卵母细胞的冷冻保存
１９７７年，Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ首次报道了冷冻保存小鼠ＭＩＩ期卵母细胞经体外受精移植后产仔。１９８９
年，Ｎａｋａｇａｔａ用玻璃化冷冻保存的小鼠卵母细胞，体外受精后移植，产仔率达４５．８％旧１。８０年代以来，人们已对多种动物的成熟卵母细胞进行冷冻保存，解冻后经体外受精获得的胚胎进行移植，兔（Ｈａｓａｎｉ，１９８８）和肉牛（Ｆｕｋｕ，１９９２）均获得了后代，绵羊、山羊和猪也有成功的报道。南京农业大学偶健等人用ＰＢＳ作为冷冻基础液，分别用甘油和ＤＭＳＯ作为冷冻保护剂，使用程序化冷冻和玻璃化冷冻两种方法，对小鼠卵母细胞的冷冻进行研究，结果表明：以ＤＭＳＯ作为冷冻保护剂的玻璃化冷冻效果较好，Ｇｖ期的存活率显著优于ＭＩＩ期卵母细胞ｎ们。虽然动物卵母细胞的冷冻保存技术取得了一系列进展，但与精液的冷冻保存相比较，尚欠成熟，有待于继续完善。
３．３胚胎的冷冻保存
哺乳动物胚胎的冷冻保存最早成功于１９７２年，Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ等人首次发明了慢速冷冻法，对
小鼠的胚胎冷冻保存获得成功，解冻后移植产下了后代。他们使用的冷冻保护剂是ＤＭＳＯ，人工植冰后以０．３３。Ｃ／ｍｉｎ的速率降至－３５＂Ｃ，然后再以１℃／ｍｉｎ的速率降至一８０℃后投入液氮中保存，整个过程约需３ｈ。其保存的胚胎８０％具有继续发育的能力。这种方法经过近３０年的发展，效果已基本稳定，目前仍然在世界范围内广泛使用。应用这种方法，牛（Ｗｉｌｍｕｔ，１９７３）、兔（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ，１９７６）、大鼠（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ，１９７５）、山羊（Ｂｉｌｔｏｎｅｔａｌ，１９７６）和绵羊（Ｗｉｌｌａｄｓｅｎｅｔａｌ，１９７６）以及其它共１６种动物的胚胎保存成功、解冻移植后产下后代。１９７７年，ｗｉｌｌａｄｓｅｎ等人对上述方法进行了改良，发明了快速冷冻法，将冷冻降温的时间缩短了１ｈ¨川。１９８５年Ｒａｌｌ等首次发明了玻璃化冷冻法，对小鼠８细胞胚胎冷冻保存取得成功¨２１。此后，玻璃化冷冻法经研究者不断改进，日趋成熟。该方法不需要慢速降温过程，胚胎在Ｏ℃以上的温度下，置于高浓度且易形成玻璃化的溶液中平衡后，直接投入液氮，使细胞内、外液皆形成玻璃化状态，胚胎不会死亡。玻璃化冷冻法的主体抗冻保护剂有乙二醇、丙三醇、ＤＭＳＯ等，添加高分子聚蔗糖和渗透压较高的蔗糖，配制成玻璃化溶液。
目前，哺乳动物胚胎的冷冻保存技术已广泛应用于生产和科研实践，其中大量牛、羊体内、体
外生产的冷冻胚胎用于优良品种的繁殖，各种动物的冻胚应用于国际和国内的品种资源的交流和遗传资源的保存。据统计，国际上已有２０余个国家、近３０个单位开展了小鼠冷冻胚胎库的工作。美国杰克逊实验室从１９７８年至今，已冷冻保存５００多个小鼠的品系。
４体外受精
体外受精（ｉｎｖｉｔｒｏｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＩＶＦ）是指：将哺乳动物的精予和卵子在体外人工控制的
环境中完成受精过程的技术，也称胚胎体外生产技术，或“试管动物”技术。在体外受精的基础上，随着显微操作技术的发展，又出现了显微受精受精技术。
４．１体外受精
１８７８年，Ｓｃｈｅｎ用兔和豚鼠的精子与各自的卵细胞在体外进行受精，观察到第一极体和卵裂的
发生。这之后的７０年没有大的进展。直到１９５１年，美籍华人张明觉ｎ副和澳大利亚的Ａｕｓｔｉｎｕ引几乎同时发现了精子的获能（ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ）现象，才使体外受精的研究出现转机。１９５９年张明觉利用获能处理的兔精子进行体外受精试验，获得了世界上第一批体外受精的“试管兔”之后，哺乳动物体外受精技术得到了迅速发展。仓鼠（Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ和Ｃｈａｎｇ，１９６３）、小鼠（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ，１９６８）、人（Ｅｄｗａｒｄｓ，１９６９）、大鼠（Ｍｉｙａｍｏｔｏ和Ｃｈａｎｇ，１９７３）、牛（Ｂｒａｃｋｅｔｔ，１９７８）、猪（Ｉｒｉｔａｎｉ１３４
实验动物第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编
和Ｎｉｗａ，１９７７）、绵羊（Ｂｏｎｄｉｏｄｉ和Ｗｒｉｇｈｔ，１９８０）、山羊（花田章，１９８５）以及其它２０种哺乳动物的体外受精相继获得成功，其中大部分得到了“试管动物”。目前，体外受精技术已经广泛应用于家畜胚胎的体外生产（如牛、羊等）和人类“试管婴儿”的生产。
哺乳动物体外受精的过程包括卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、体外受精、受精卵的体
外培养和胚胎移植等步骤。以小鼠为例：首先从超排小鼠的输卵管内冲取卵母细胞，用含３００“ｇ／ｍｌ透明质酸酶的培养基中脱去卵丘细胞，在ＴｙＨ液中培养成熟；从公鼠的附睾尾部取精子，置于ＴｙＨ（或Ｔ６、ＫＲＢ、Ｗｈｉｔｔｅｎ）液中，３７℃、５％ｃ０２中培养２ｈ，使精子获能；然后将成熟的卵母细胞和获能的精子置于ＴｙＨ液中，３７℃、５％Ｃ０２中培养６－８ｈ，完成体外受精；体外受精卵培养２４－２８ｈ，发育成２—４细胞期的胚胎，即可进行胚胎移植。
４．２显微受精
显微受精是８０年代以后发展起来的一种新型体外受精技术，它是借助显微操作仪，将精子或精
子细胞，直接注入卵母细胞质内或卵周隙中，实现受精过程。这项技术可以排除透明带或质膜对精子入卵的阻碍作用，对精子的死活及其完整性无严格要求。因此对动物受精机理研究、男性不育的治疗、野生动物的保护及转基因动物的制备等方面具有特殊意义和应用前景。１９７６年Ｕｅｈａｒａ和Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ将仓鼠精子注入卵母细胞中，观察到精核能够解聚并可以发育形成雄原核阻引。１９８８年，Ｍａｎｎ将运动的精子注入小鼠卵周隙中首次得到成活的后代ｕ剐。１９９３年，Ｈｏｓｏｉ等将不运动的精子注入兔卵胞质内也得到了正常的后代㈣。１９９５年。Ｋｉｍｕｒａ和Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ对显微操作仪进行改进，用Ｐｉｅｚｏ－ｄｒｉｖｅｎ操作系统使小鼠的显微受精成功率有了很大提高，８０％的注射卵可以成活；其中７０％在体外发育到囊胚，移植产仔率达３０％【１引。目前，显微受精技术已经在无精或少精的男性不育临床治疗，以及转基因动物的制备等方面得到了应用。
５胚胎千细胞
干细胞的研究是近年来生命科学领域发展最快和最受重视的前沿技术之一，被｛Ｓｃｉｅｎｃｅ》杂
志评为１９９９、２０００和２００３年度世界“十大重大科技进展之一。目前干细胞的研究几乎涉及生命科学和生物医药的所有领域，不仅在细胞治疗、基因治疗中显示出重要价值，还在基因功能分析、发育生物学研究、新药筛选等方面发挥重要作用。胚胎干细胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ，ＥＳ）是由哺乳动物早期胚胎的内细胞团（Ｉｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓ，ＩＣＭ）或原生殖细胞（ＰｒｉｍｏｒｄｉａｌｇｅｒｍｃｅｌｋＰＧＣｓ）分离出来的多潜能细胞系，它兼有胚胎细胞和一般培养细胞的双重特性。１９８１年Ｅｖａｎｓ和Ｋａｕｆｍａ首次从小鼠胚胎细胞团中分离出ＥＳ细胞。１引。Ｍａｔｓｕｉ和Ｒｅｓｎｉｋｌ９９２年又从小鼠的原生殖细胞中分离出ＥＳ细胞一，这种由ＰＧＣｓ分离得到的ＥＳ细胞又称为胚胎生殖细胞ＥＧ。这表明囊胚和ＰＧＣｓ组织成为分离和克隆ＥＳ细胞的两大来源。到目前，多种哺乳动物的ＥＳ细胞分离成功。１９８８年Ｄｏｅｔｓｈｍａｎ等建立了仓鼠的ＥＳ细胞系，１９９４年Ｗｈｅｅｌｅｒ和Ｒｏｂｅｒｔ分别用胚胎培养和ＰＧＣｓ培养法获得了猪的ＥＳ细胞，１９９６年Ｔｈｏｍｓｏｎ等获得了猴子的ＥＳ细胞，１９９８年Ｔｈｏｍｓｏｎ等人从人的体外受精囊胚中分离得到ＥＳ细胞。其中小鼠ＥＳ细胞的分离技术已经程序化，并形成商品供科研和生产使用。
ＥＳ细胞法已成为构建转基因动物的主要方法之一，而且是外源基因定位整合和基因敲除的主
要方法，数以千计的基因敲除小鼠品系是通过ＥＳ细胞法完成的。人ＥＳ细胞的分离成功引起了医学界的轰动，人们普遍认为ＥＳ细胞的应用将会引起一场医学革命。由于ＥＳ细胞除具有体外高度自我更新的能力，还有可被定向诱导分化为体内各种类型细胞的能力，因此从理论上，ＥＳ细胞可修复机体内衰老、功能异常或损伤的细胞或组织，甚至于可以形成新的器官。这给某些顽症的治疗带来了希望，人的青命也将大大延长。
６动物克隆
动物克隆（Ｃｌｏｎａｌ）是指动物不经过有性生殖的方式而直接获得与亲本具有相同遗传物质后代
的过程。通常，将所有非受精方式繁殖所获得的动物均称为克隆动物，将产生克隆动物的方法称为克隆技术。在自然条件下，克隆广泛存在于动物、植物和微生物界，哺乳动物的同卵双生即是一种自然的克隆。动物克隆技术对于动物育种、科学试验及发育生物学等基础研究具有重要意义。目前１３５
第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编实验动物能成功制备克隆动物的技术主要有胚胎分割和细胞核移植。
６．１胚胎分割
胚胎分割是指采用机械的方法将动物的早期胚胎分割成２、４或８等份，然后经体内或体外培
养，移植入受体的生殖道内，以得到同卵双生或同卵多生的后代。最早的胚胎分割是１９６８年Ｍｕｌｌａｒ等人用家兔完成的，他们将家兔８细胞胚胎一分为二，移植给母兔，生出了仔兔。１９７４年Ｔｒｏｕｎｓｏｎ和Ｍｏｏｒｅ分割绵羊胚胎，繁殖出同卵双羔埋川。这之后，哺乳动物胚胎分割发展很快，到目前为止，牛、羊、猪、小鼠和灵长类动物均己产生了胚胎分割的后代，并且在动物的繁殖中得到应用。
６．２细胞核移植
由于胚胎分割获得克隆动物的数量非常有限，人们开始探索细胞核移植技术。根据供细胞核来
源的不同，又分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。
６．２．１胚胎细胞核移植
１９８１年Ｉｌｌｍｅｎｓｅｅ和Ｈｏｐｅｅ将小鼠胚胎的内细胞团细胞核直接拄入去核受精卵，获得首批３
只核移植的克隆小鼠。１９８３年Ｍｃｇｒａｔｈ和Ｓｏｌｔｅｒ首次将显微操作技术和细胞融合技术结合起来，建立了重复性好、效率高的核移植技术程序。这之后哺乳动物胚胎细胞核移植技术得到快速发展，牛（Ｐｒａｔｈｅｒｅｔａｌ，１９８７）、兔（ＳｔｉｃｅａｎｄＲｏｂｉ，１９８８）和猪（Ｐｒａｔｈｅｒ，１９８９）等动物胚胎细胞核移植相继成功。本实验室赵浩斌等人，１９９６年以杜洛克８细胞期胚胎的卵裂球做为核供体，以湖北白猪体外成熟的卵母细胞去核后做为核受体，经移核、电融合、重构胚培养、胚胎移植等程序，得到了国内第一例胚胎细胞核移植的“克隆猪”∞。。
６．２．２体细胞核移植
１９９７年英国Ｒｏｓｈｉｌｉｎ研究所Ｗｉｌｍｕｔ等人，采用饥饿培养法，将一只６岁成年母羊的乳腺上
皮细胞作为核供体，成功地克隆出世界首例体细胞核移植的后代一“多莉”，轰动了世界，成为生命科学研究的又一个里程碑。这之后，世界各国掀起了体细胞克隆研究的热潮，小鼠（Ｗａｋａｙａｍａｅｔａｌ，１９９８）、牛（Ｋａｔｏｅｔａｌ，１９９８）、山羊（Ｂａｇｕｉｓｅｔａｌ，１９９９）、猪（Ｚｒｉｎａｅｔａｌ，２０００）等各种动物的体细胞核移植后代相继诞生旧副。其中对牛的体细胞克隆研究最多，技术相对成熟，许多国家都进行了批量生产。
体细胞核移植的成功，第一次说明成年哺乳动物的体细胞不仅具有基因组的全能性，而且还能
在卵母细胞质中回复到发育的起始状态，完成整个个体的发育过程，具有重大的理论意义。从理论上来讲，动物的体细胞可以说是无限的，因而克隆动物的数量不受限制。这一点是胚胎分割和胚胎细胞核移植所无法比拟的。体细胞核移植还为动物的遗传修饰提供了前所未有的技术方法。首先对供体细胞进行基因改造（转基因、基因敲除或其它基因修饰），解决了其它转基因技术种系细胞来源的困难；然后将基因改造的供体细胞再进行核移植，即可制备出各种遗传修饰的动物。
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ｉｎｇｅｒｍｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅ【Ｊ］．Ｃｅｉｌ，１９９２，７０（５）：８４１．
ｔｏ［２１］ＴｒｏｕｎｓｏｎＡＯ，ＭｏｏｒｅＮＷ．Ａｔｔｅｍｐｔｓ
ｏｆｔｈｅｐｒｏｄｕｃｅｉｎｄｅｎｔｉｃａｌｏｆｆｓｐｒｉｎｇｉｎｔｈｅｓｈｅｅｐｂｙｍｅｃｈａｎｉｃａｌｄｉｖｉｓｉｏｎｏｖｕｍＥＪ］．Ｒｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉ０１．Ｓｃｉ．１９７４，２７：５０５－５１０．
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浅谈干扰和影响实验动物血液生化检验的因素
黄小琼，钟志勇，刘盛来
（广东省医学实验动物中心，广州５１００５５）
【摘要】血液生化的检测结果，常常是评判肝肾等重要脏器功能是否正常的客观而又灵敏的指标。本文阐
述了干扰和影响实验动物血液生化检验的因素及控制，为检验者和建立实验室标准操作规范（ＳｏＰ）提供参考。
【关键词】血液生化的检测；实验动物；影响因素
生物化学检验是对离体的血液和体液进行生物化学物质的定量测定。血液生化检验是动物实
验的常规项目，但是，血液生化检测结果却受到诸多因素的影响。长期以来，由于动物血液生化检测缺乏一个大家公认的规范化（标准化）操作规程（ＳＯＰ），各实验室在血液生化检测的取材、１３７
实验动物的胚胎工程
作者：
作者单位：魏庆信湖北省动物胚胎工程及分子育种重点实验室;湖北省农科院畜牧兽医研究所,武汉 430064
相似文献(10条)
1.期刊论文 戴丽军.黄莉.廖军 常用实验动物血清雌二醇和孕酮的测定及比较 -动物科学与动物医学2004,21(11)
目的测定NIH、BABL/C、C57BL/6J小鼠、SD、Wistar大鼠和长爪沙鼠等几种常用实验动物的血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平,为动物生殖和胚胎工程等方面的研究提供基础资料.方法用放射免疫分析法测定上述动物生产前后血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平,进行统计学处理和比较.结果在未生产动物中,血清E2、P的含量与特定物种的体重呈正相关的趋势
(p＜0.01);血清P的含量在动物生产前后变化较大,生产过动物均高于未生产动物(p＜0.01).结论动物血清E2、P的含量具种属特异性;但在已生产动物中似无明显关联.血清P的含量变化与其在动物体内的正常分泌及生理功能相对应.
2.会议论文 郑新民.李聚学.田永祥.李莉.乔宪凤.周荆荣 昆明小白鼠超数排卵的研究 2007
本实验用昆明小白鼠研究了多种影响超排的因素,结果表明:日龄以30-35d为宜,激素使用剂量为5-10IU时,间隔时间46-48h,环境温度在20度左右,任何季节昆明小白鼠超数排卵的效果最佳。
3.学位论文 冯卫国 滴中孔培养法研究牛卵泡颗粒细胞凋亡与卵母细胞发育能力的关系 2006
本文以牛为实验动物，建立了比较完善的滴中孔(WID)培养系统，并应用此系统研究了颗粒细胞凋亡对卵母细胞发育能力、COCs形态以及卵丘扩展的影响，并探讨了以卵泡液中游离颗粒细胞的密度作为一种判定卵母细胞发育能力指标的可行性。实验结果表明：
1.HE染色结果与TUNEL染色一致，并且具有简便及廉价等优点。
2.培养滴体积和培养密度显著影响卵母细胞的成熟质量和胚胎体外发育能力。IVM时，采用10卵/40μl、25卵/100μl可显著提高卵母细胞的成熟质量，而培养密度过大则会削弱卵母细胞的成熟质量；在培养密度不变的情况下，培养滴体积对卵母细胞的成熟质量影响不大。IVC时，采用10胚胎/40μl、20胚胎/40μl、25胚胎/100μl、50胚胎/100μl可显著提高胚胎体外发育能力，而培养密度过小或者过大则会影响到胚胎的发育能力；此外发现，在培养密度不变的情况下，培养滴体积太小会削弱胚胎的发育能力。
3.滴中孔培养法与群卵培养法的效果相似，而单卵培养则显著降低了卵母细胞的发育能力。
4.在直径4-8mm卵泡中，颗粒细胞凋亡程度对卵母细胞的发育能力有显著的影响，轻度闭锁卵泡(凋亡率为10-40％)的卵母细胞发育能力显著高于健康卵泡(凋亡率＜10％)和严重闭锁卵泡(凋亡率＞40％)；但在直径2-3mm卵泡中，即使是轻度闭锁卵泡的卵母细胞发育能力也很差。
5.颗粒细胞的凋亡程度对COCs形态和卵丘扩展具有显著影响，尤其当凋亡比例＞40％时，COCs形态和卵丘扩展程度明显变差。
6.卵丘扩展对卵母细胞的发育具有显著的影响，随着卵丘扩展程度的增加，卵母细胞的发育能力逐渐增强；此外，在卵丘扩展程度相同情况下，轻度闭锁卵泡的卵母细胞发育能力最强。
7.卵泡直径对卵母细胞发育能力有显著影响，直径4-8mm卵泡的卵母细胞发育能力显著高于直径2-3mm卵泡。
8.卵巢的生理状态对卵母细胞发育能力具有一定影响，在直径4-8mm卵泡中，处于卵泡生长期和黄体中期的卵母细胞的发育能力之间差异不显著，但具有高于卵泡优势化期卵母细胞发育能力的趋势。
9.利用卵泡液游离颗粒细胞的密度可以反映卵泡的闭锁程度，来自中等颗粒细胞密度卵泡(细胞密度为10-30×105/ml)的卵母细胞发育能力比较强。
4.期刊论文 商海涛.王勇.牛荣.袁静.唐欢.魏泓 研究生医学实验动物学课程的教学改革实践 -西北医学教育2008,16(2)
根据研究生教学特点,对其医学实验动物学课程教学进行改革实践.根据实验动物学的最新进展、研究生的知识需求及我们的科研方向共分实验动物遗传工程、实验动物胚胎工程、异种移植、实验动物与比较基因组学、实验用小型猪、无茼动物与微生态学、实验动物与生物安全性、动物实验基本技术与方法8个专题向学生授课,力争紧跟学科发展动态,强调知识的前沿性、综合性和交叉性,促进研究生的科研能力和创新能力的培养,创建研究生医学实验动物学教学的新模式.
5.期刊论文 高善颂.李树明.GAO Shan-song.LI Shu-ming 不同剂量PMSG和HCG及冲胚方法对小鼠超排效果的影响 -黑龙江畜牧兽医2006,""(10)
小鼠具有个体小、生长快、繁殖力强、饲养方便等特点,是胚胎工程中最常用的实验动物之一.借用外源性促性腺激素对小鼠进行超排,是获得胚胎工程研究必需的大量卵母细胞或早期胚胎的有效途径.由于受激素组合、小鼠日龄、环境等多因素影响,试验结果差异较大.为进一步探索小鼠超排及其早期胚胎收集的有效方法,试验采用4种不同剂量的孕马血清促性腺激素(PMSG)+人绒毛膜促性腺激素(HCG)组合处理小鼠,并在冲胚过程中对比子宫输卵管直接冲胚法和输卵管全段剖开冲胚法,现报道如下.
6.期刊论文 石华建 鼠类——遗传学研究的好材料 -生物学通报2008,43(12)
从遗传学实验研究角度,介绍鼠类在基因工程、细胞工程、胚胎工程等方面的作用.鼠类是常见的实验动物,占实验用动物的90% 以上.用途非常广泛,在遗传学实验、医学、生物疫苗和药品、外科手术实习演练、食品和药品的安全性评价、生命科学的研究等方面有突出贡献.
7.学位论文 徐艺玫 绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立及可视化胚胎工程的研究 2005
绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母(aequorea，victoria)体内分离纯化出来的一种能发射强烈荧光的特殊蛋白质，在无任何协同因子、底物或附加基因产物存在的情况下就能产生稳定的荧光，而且这种荧光很容易通过荧光显微镜或者肉眼即可观察到。因此，GFP是一种全新的、应用广泛的遗传标记(genetic marker)和蛋白质标记物(protein tag)。 绿色荧光蛋白可以提高转基因动物的制备效率，即将待转的目的基因构件与GFP基因串联起来一并整合，由于GFP基因的表达产物在胚胎发育的早期即可检测到，我们可以只选择那些只表达了GFP阳性重组体的胚胎进行移植，这样即减少移植胚胎的盲目性，又提高转基因动物的制作效率。
用显微注射法将GFP基因注入FVB/NJ小鼠受精卵原核内，获得的子代鼠3周后，提取鼠尾基因组DNA，应用PCR技术进行检测，获得5只PCR阳性小鼠；通过整体成像仪观察其中3只(F0)有绿色荧光表达。对F0代转基因小鼠进行传代，获得子代小鼠通过整体成像仪观察7只(F1)有绿色荧光表达，继而在F1代GFP转基因小鼠中进行交配，得到子代鼠，经整体成像仪观察，发现35只(F2)小鼠有绿色荧光表达，表明初步建立了全身有荧光表达并能传代的GFP转基因小鼠。这为我们进行可视化胚胎工程研究奠定了基础。
GFP转基因小鼠可视化胚胎工程的实验研究：
(1)采集GFP转基因雄鼠附睾尾部精子与常规超排法得到KM鼠的卵母细胞在培养液中进行体外受精，建立体外受精模型，并将受精卵移入培养液中进行体外培养。通过荧光显微镜观察发现，体外受精后6h受精卵有绿色荧光表达.
(2)将体外受精后的胚胎体外培养至囊胚，观察该胚胎卵裂球发育分化的情况。有的胚胎发生阻滞而未能继续发育；有的发育至4-8细胞期；有的胚胎可发育至桑椹胚和囊胚阶段，整个胚胎呈现绿色荧光。虽然胚胎质量的优劣是影响体外培养是否成功的重要因素，而对其起决定作用的是胚胎体外培养条件，其中包括培养液的成分和培养体系。
(3)GFP转基因小鼠的早期胚胎分割。移植前小鼠胚胎的透明带经软化后，用固定在显微操作臂上的微玻璃针进行胚胎分割，分别对2-，4-，8-细胞胚胎及桑椹胚进行了胚胎分割，所获半胚进行体外培养。将8-细胞胚组及桑椹胚的半胚移植到假孕母鼠后，有仔鼠出生。
8.期刊论文 陈浩杰.刘丽均.李晟阳.徐平.罗光彬.CHEN Hao-jie.LIU Li-jun.LI Sheng-yang.XU Ping.LUO Guang-bin 哺乳动物嵌合体制作及分析进展 -中国畜牧杂志2007,43(21)
嵌合体技术对研究哺乳动物早期胚胎的发育,探索细胞分化规律,掌握基因的表达调控规律,建立遗传疾病动物模型等具有重要意义.本文分别就近几年来嵌合体动物的制作方法及分析手段作一简要概述.
9.期刊论文 陈浩杰.刘丽均.李晟阳.徐平.罗光彬 实验用显微操作针的制备 -畜牧与兽医2007,39(8)
如今显微操作技术已广泛应用于体细胞核移植、转基因动物生产、人类辅助生殖等胚胎生物工程中,而在这些实验中很重要的一项是要制作出符合要求的显微操作针,本文介绍利用拉针仪、煅烧仪、磨针仪怎样制作符合实验要求的高质量的显微操作针.
10.期刊论文 陈浩杰.刘丽均.李晟阳.赵立虎.马明仑.徐平.罗光彬 影响精子胞质内显微受精的关键因素 -中国畜牧兽医2007,34(7) 精子胞质内显微受精(ICSI)在人方面已很成熟,但在啮齿类试验动物方面还有待进一步研究,作者就ICSI操作过程中的关键因素作一简要综述.
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Conference_6480703.aspx
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第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编实验动物Ｅ６３ＴｓｕｎｄａＹ．ＳｏｎｍａＴ．ＳｕｇｉｅＴ．Ｆｒｏｇｅｎｓｔｏｒａｇｅｏｆｒａｂｂｉｔｓａｎｄｈａｍｓｔｅｒｅｍｂｒｙｏｓｉｎ：ＺｅｌｌｍａｒｋｅｒＨ，ｅｔｓ，Ｆｒｏｚｅｎ
ｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＧｕｓｔａｖｅＦｉｓｅｃｈｅｒＹｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ１９８１，１２９—１３８．Ｓｔｏｒａｇｅ
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ｔｒｅａｔｍｅｎｔａ９６ｈｐｅｒｉｏｄｏｆｉｎｖｉｔｒｏｃｕｌｔｕｒｅａｆｔｅｒｓｕｐｅｒｏｖｕｌａｔｏｒｙｕｎｄｅｒｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｅｌｅｖａｔｅｄａｍｂｉｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ［Ｊ］．Ａｎｉｍａｌ
ＲｅｐｒｏｄＳｃｉ，１９９９，５６（３—４）：２７９—２９０．
实验动物的胚胎工程
魏庆信
（湖北省动物胚胎工程及分子育种重点实验室，湖北省农科院畜牧兽医研究所，武汉４３００６４）
【摘要ｌ实验动物的胚胎工程是研究动物的胚胎学、繁殖学、发育学和遗传学的重要手段，也是人类和家畜
胚胎工程的试验模型；同时，实验动物的胚胎ｊ亡程还广泛应用于实验动物自身种系的建立、资源保存及高效繁育。实验动物的胚胎工程涵盖了所有对配子（精子、卵子）和早期胚胎的体外操作，近年来发展很快，新技术、新方法不断出现。本文扼要介绍实验动物的排卵控制、胚胎移植、配子和胚胎的冷冻保存、体外受精、胚胎干细胞和动物克隆等方面的研究进展，供广大实验动物工作者参考。
【关键词】实验动物；胚胎工程
对配子或胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化。
这一综合技术，统称为胚胎生物工程，或简称为胚胎工程（ｅｍｂｒｙｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）…。实验动物的胚胎工程是研究动物的胚胎学、繁殖学、发育学和遗传学的重要手段，也是人类和家畜胚胎工程的试验模型，绝大多数现代生殖医学技术和家畜繁殖技术的建立是从实验动物开始的；｜一时，实验动物的胚胎工程还广泛应用于实验动物自身种系的建立、资源保存及高效繁育。实验动物的胚胎工程涵盖了所有对配子（精子、卵子）和早期胚胎的体外操作，近年来发展很快，新技术、新方法不断出现。本文扼要介绍实验动物的排卵控制、胚胎移植、配子和胚胎的冷冻保存、体外受精、胚胎干细胞和动物克隆等方面的研究进展，供广大实验动物工作者参考。
１排卵控制
排卵控制（ｃｏｎｔｒｏｌｏｖｕｌａｔｉｏｎ）主要是指应用外源激素处理雌性动物，控制其排卵的时问和
数量心。。控制排卵时间的技术称诱发排卵；用较高剂量的激素促使排卵数量多于正常数的技术称为超数排卵。动物胚胎工程和转基因动物的研究往往需要大量的卵子，因此排卵控制中最常用的是超数排卵技术。超数排卵处理的同时也有诱发排卵的效应。超数排卵技术不仅可以为试验研究提供更多的卵子，而且对提高雌性动物的繁殖力、增加产仔数也是行之有效的。用于动物超数排卵的激素主要有：ＰＭＳＧ（孕马血清促性腺激素）、ＨＣＧ（人类绒毛膜促性腺激素）、ＦＳＨ（促卵泡素）、ＬＨ（促黄体素）、ＬＲＨ＿Ａ（促排卵素）等。超数排卵反应是个复杂的生理过程，它受动物的品种、体况、年龄、卵巢的功能状态、环境温度以及激素用量、处理方法等多种因素的影响。一般单胎动物通过超数排卵处理，其排卵数可提高５－１０倍；多胎动物可提高２—３倍。但个体之间有一定的差异，曾有１３２
实验动物第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编１只酬小鼠获得８３枚卵、１只兔获得８８枚卵、１只金黄地鼠获得７２枚卵呤１、Ｉ头猪获得７６枚卵（笔者自己的实验）的超数排卵记录。
小鼠的超数排卵一般用ＰＭＳＧ＋ＨＣＧ的激素组合，向雌鼠腹腔注射ＩＯ－１５１ＵＰＭＳＧ，４８小时后，再
注射同等剂量的ＨＣＧ。注射ＨＣＧ的当夜即可排卵，一般可获得３０一４０枚卵（如与公鼠合笼，即为受精卵）。本实验室李聚学等人对ｌ（Ｍ小鼠的超数排卵进行了较为系统的试验研究，研究结果表明：（１）ＰＭＳＧ＋ＨＣＧ的用量以ＩＯ＋ＩＯＩＵ为宜，其平均排卵数为３９．６，极显著地高于５＋５１Ｕ（平均排卵数为２７．２）和１５＋１５ＩＵ（平均排卵数为２５．５）的激素用量；（２）ＰＭＳＧ与ＨＣＧ注射时间的间隔以４８小时为宜，其平均排卵数分别高于间隔４６小时和５０小时，尤其是极显著高于间隔５０小时的处理；（３）对成年雌鼠，在发情周期的不同阶段处理，其排卵数的差异显著，以发情前期的处理效果最好；（４）不同舍温对超排效果的影响很大，当鼠房的温度维持在２０—２５。Ｃ时，超排效果最好；而当鼠房的温度只有１０ｃｏ左右时，其平均排卵数只有１０．８枚Ｈ１。
２胚胎移植
胚胎移植是指：将一只动物的早期胚胎（或受精卵）取出，或者由体外受精及其它方式获得的
胚胎（或受精卵），移植到另一只同种生理状态相同的雌性动物的体内，使之继续发育成为新个体的技术，又称之为人工受胎或借腹怀胎。提供胚胎的个体称为供体（ｄｏｎｏｒ），接受胚胎的个体称为受体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）。动物胚胎移植首次试验成功已有ｉ００多年的历史，１８９０年英国剑桥大学ＷａｌｔｅｒＨｅａｐｅ从交配后３２ｈ的安哥拉母兔取出２个四细胞期胚胎，移植到１只比利时母兔输卵管，结果生出２只安哥拉仔兔，第一次证实受精卵在寄主母体内发育的可能性旧１。这之后，小鼠、大鼠、牛、羊、猪等各种哺乳动物的胚胎移植相继成功。胚胎移植不仅是所有胚胎操作的最基本技术，而且已广泛应用于人类的生殖医学临床和动物生产，目前全世界每年有数以百万计的牛、羊通过胚胎移植繁殖优良品种的后代。
胚胎移植的技术环节包括供、受体的同步发情、胚胎的采集、胚胎的短期培养和胚胎的移植。
胚胎移植与超数排卵技术相结合，能使一只供体的胚胎移植更多的受体。本实验室建立的小鼠胚胎移植的技术程序如下：首先对供体母鼠进行超数排卵处理，在注射ＨＣＧ的当夜与公鼠合笼；同时将准备做受体的雌鼠与结扎公鼠合笼，制备假孕母鼠；次日将供体鼠脱臼处死，取出输卵管，用Ｍ２液从输卵管内冲取受精卵，镜检，去除未受精卵和发育不正常的卵；如果受精卵需短期培养再移植，则将受精卵置于Ｍｔｓ培养基中，３７＂Ｃ、５％Ｃ０２的培养箱中培养；胚胎移植，取与供体同一天见栓的假孕母鼠，麻醉，去毛，腹部开口，拉出输卵管和卵巢，用移卵管将１５枚左右的受精卵移入输卵管内，复位，缝合哺。。按上述程序，其受胎率在６０％左右，１只供体至少可以移植２只受体。如果要移植囊胚期的胚胎，则应在供体鼠与公鼠合笼的第３天，从子宫中冲取囊胚，移入受体的子宫内。３配子和胚胎的冷冻保存
配子和胚胎的冷冻保存，是指应用低温生物学技术，将其保存在低温或超低温的环境下，使细
胞处于新陈代谢和分裂速度减慢或停止，即使其发育基本处于暂时停顿状态，一旦通过解冻技术恢复正常温度时，又能继续发育或恢复活力。目前普遍应用的是将配子和胚胎置于－１９６。Ｃ的液态氮的环境中，可以长期保存。配子和胚胎的冷冻保存，不仅对于动物种系资源的保存、对于动物种系资源长距离交流具有重要意义，而且已经广泛应用于动物生产，成为优良品种高效繁育、杂交改良的重要手段；同时也为动物胚胎工程提供不受时问和空间限制的材料。
３．１精液的冷冻保存
动物精液的冷冻保存技术是２０世纪随着人工受精技术的广泛开展应运而生。世界上第一例成
功对动物的精液进行冷冻、并且解冻后经人工授精生出动物的是Ｐｏｌｇｅ等人１９５１年完成的，其研究对象是牛，迄今已有５０多年的历史Ⅱ。。这之后其它动物（绵羊、山羊、猪、兔、马、水牛等）的冻精也相继研究成功，并且广泛应用于生产和科研，其中在生产中应用最普及的是牛。目前牛的冻精已产业化生产，全世界的奶牛场已经普遍采用冷冻精液繁殖后代，对奶牛的品种改良、提高产奶量发挥了巨大的作用。动物精液的冷冻稀释液除其它成份外，低温保护剂是至关重要的。常用的】３３
第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编实验动物低温保护剂有甘油、二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）等。
实验动物中以兔的冻精研究较多。１９７６年Ｗｅｉｔｚｅ等人采用三基一柠檬酸一葡萄糖一２０％卵黄一４．５％
蹦Ｓ伊ｌ％甘油作为冷冻稀释液，制成颗粒冻精，解冻后移植的受胎率达８９．５％，细管冻精的受胎率达８４．２％，与鲜精的受胎率无显著差异。我国从８０年代开展兔冻精的研究，受胎率在７０—８０％之间。广西大学杨素芳等人，采用１５％ＤＭＳＯ作为抗冻剂，４＂Ｃ下平衡３０－６０ｍｉｎ，解冻后的活力为０．２４９，复苏率为０．３２５㈨。
３．２卵母细胞的冷冻保存
１９７７年，Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ首次报道了冷冻保存小鼠ＭＩＩ期卵母细胞经体外受精移植后产仔。１９８９
年，Ｎａｋａｇａｔａ用玻璃化冷冻保存的小鼠卵母细胞，体外受精后移植，产仔率达４５．８％旧１。８０年代以来，人们已对多种动物的成熟卵母细胞进行冷冻保存，解冻后经体外受精获得的胚胎进行移植，兔（Ｈａｓａｎｉ，１９８８）和肉牛（Ｆｕｋｕ，１９９２）均获得了后代，绵羊、山羊和猪也有成功的报道。南京农业大学偶健等人用ＰＢＳ作为冷冻基础液，分别用甘油和ＤＭＳＯ作为冷冻保护剂，使用程序化冷冻和玻璃化冷冻两种方法，对小鼠卵母细胞的冷冻进行研究，结果表明：以ＤＭＳＯ作为冷冻保护剂的玻璃化冷冻效果较好，Ｇｖ期的存活率显著优于ＭＩＩ期卵母细胞ｎ们。虽然动物卵母细胞的冷冻保存技术取得了一系列进展，但与精液的冷冻保存相比较，尚欠成熟，有待于继续完善。
３．３胚胎的冷冻保存
哺乳动物胚胎的冷冻保存最早成功于１９７２年，Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ等人首次发明了慢速冷冻法，对
小鼠的胚胎冷冻保存获得成功，解冻后移植产下了后代。他们使用的冷冻保护剂是ＤＭＳＯ，人工植冰后以０．３３。Ｃ／ｍｉｎ的速率降至－３５＂Ｃ，然后再以１℃／ｍｉｎ的速率降至一８０℃后投入液氮中保存，整个过程约需３ｈ。其保存的胚胎８０％具有继续发育的能力。这种方法经过近３０年的发展，效果已基本稳定，目前仍然在世界范围内广泛使用。应用这种方法，牛（Ｗｉｌｍｕｔ，１９７３）、兔（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ，１９７６）、大鼠（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ，１９７５）、山羊（Ｂｉｌｔｏｎｅｔａｌ，１９７６）和绵羊（Ｗｉｌｌａｄｓｅｎｅｔａｌ，１９７６）以及其它共１６种动物的胚胎保存成功、解冻移植后产下后代。１９７７年，ｗｉｌｌａｄｓｅｎ等人对上述方法进行了改良，发明了快速冷冻法，将冷冻降温的时间缩短了１ｈ¨川。１９８５年Ｒａｌｌ等首次发明了玻璃化冷冻法，对小鼠８细胞胚胎冷冻保存取得成功¨２１。此后，玻璃化冷冻法经研究者不断改进，日趋成熟。该方法不需要慢速降温过程，胚胎在Ｏ℃以上的温度下，置于高浓度且易形成玻璃化的溶液中平衡后，直接投入液氮，使细胞内、外液皆形成玻璃化状态，胚胎不会死亡。玻璃化冷冻法的主体抗冻保护剂有乙二醇、丙三醇、ＤＭＳＯ等，添加高分子聚蔗糖和渗透压较高的蔗糖，配制成玻璃化溶液。
目前，哺乳动物胚胎的冷冻保存技术已广泛应用于生产和科研实践，其中大量牛、羊体内、体
外生产的冷冻胚胎用于优良品种的繁殖，各种动物的冻胚应用于国际和国内的品种资源的交流和遗传资源的保存。据统计，国际上已有２０余个国家、近３０个单位开展了小鼠冷冻胚胎库的工作。美国杰克逊实验室从１９７８年至今，已冷冻保存５００多个小鼠的品系。
４体外受精
体外受精（ｉｎｖｉｔｒｏｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＩＶＦ）是指：将哺乳动物的精予和卵子在体外人工控制的
环境中完成受精过程的技术，也称胚胎体外生产技术，或“试管动物”技术。在体外受精的基础上，随着显微操作技术的发展，又出现了显微受精受精技术。
４．１体外受精
１８７８年，Ｓｃｈｅｎ用兔和豚鼠的精子与各自的卵细胞在体外进行受精，观察到第一极体和卵裂的
发生。这之后的７０年没有大的进展。直到１９５１年，美籍华人张明觉ｎ副和澳大利亚的Ａｕｓｔｉｎｕ引几乎同时发现了精子的获能（ｃａｐａｃｉｔａｔｉｏｎ）现象，才使体外受精的研究出现转机。１９５９年张明觉利用获能处理的兔精子进行体外受精试验，获得了世界上第一批体外受精的“试管兔”之后，哺乳动物体外受精技术得到了迅速发展。仓鼠（Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ和Ｃｈａｎｇ，１９６３）、小鼠（Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ，１９６８）、人（Ｅｄｗａｒｄｓ，１９６９）、大鼠（Ｍｉｙａｍｏｔｏ和Ｃｈａｎｇ，１９７３）、牛（Ｂｒａｃｋｅｔｔ，１９７８）、猪（Ｉｒｉｔａｎｉ１３４
实验动物第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编
和Ｎｉｗａ，１９７７）、绵羊（Ｂｏｎｄｉｏｄｉ和Ｗｒｉｇｈｔ，１９８０）、山羊（花田章，１９８５）以及其它２０种哺乳动物的体外受精相继获得成功，其中大部分得到了“试管动物”。目前，体外受精技术已经广泛应用于家畜胚胎的体外生产（如牛、羊等）和人类“试管婴儿”的生产。
哺乳动物体外受精的过程包括卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、体外受精、受精卵的体
外培养和胚胎移植等步骤。以小鼠为例：首先从超排小鼠的输卵管内冲取卵母细胞，用含３００“ｇ／ｍｌ透明质酸酶的培养基中脱去卵丘细胞，在ＴｙＨ液中培养成熟；从公鼠的附睾尾部取精子，置于ＴｙＨ（或Ｔ６、ＫＲＢ、Ｗｈｉｔｔｅｎ）液中，３７℃、５％ｃ０２中培养２ｈ，使精子获能；然后将成熟的卵母细胞和获能的精子置于ＴｙＨ液中，３７℃、５％Ｃ０２中培养６－８ｈ，完成体外受精；体外受精卵培养２４－２８ｈ，发育成２—４细胞期的胚胎，即可进行胚胎移植。
４．２显微受精
显微受精是８０年代以后发展起来的一种新型体外受精技术，它是借助显微操作仪，将精子或精
子细胞，直接注入卵母细胞质内或卵周隙中，实现受精过程。这项技术可以排除透明带或质膜对精子入卵的阻碍作用，对精子的死活及其完整性无严格要求。因此对动物受精机理研究、男性不育的治疗、野生动物的保护及转基因动物的制备等方面具有特殊意义和应用前景。１９７６年Ｕｅｈａｒａ和Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ将仓鼠精子注入卵母细胞中，观察到精核能够解聚并可以发育形成雄原核阻引。１９８８年，Ｍａｎｎ将运动的精子注入小鼠卵周隙中首次得到成活的后代ｕ剐。１９９３年，Ｈｏｓｏｉ等将不运动的精子注入兔卵胞质内也得到了正常的后代㈣。１９９５年。Ｋｉｍｕｒａ和Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ对显微操作仪进行改进，用Ｐｉｅｚｏ－ｄｒｉｖｅｎ操作系统使小鼠的显微受精成功率有了很大提高，８０％的注射卵可以成活；其中７０％在体外发育到囊胚，移植产仔率达３０％【１引。目前，显微受精技术已经在无精或少精的男性不育临床治疗，以及转基因动物的制备等方面得到了应用。
５胚胎千细胞
干细胞的研究是近年来生命科学领域发展最快和最受重视的前沿技术之一，被｛Ｓｃｉｅｎｃｅ》杂
志评为１９９９、２０００和２００３年度世界“十大重大科技进展之一。目前干细胞的研究几乎涉及生命科学和生物医药的所有领域，不仅在细胞治疗、基因治疗中显示出重要价值，还在基因功能分析、发育生物学研究、新药筛选等方面发挥重要作用。胚胎干细胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ，ＥＳ）是由哺乳动物早期胚胎的内细胞团（Ｉｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓ，ＩＣＭ）或原生殖细胞（ＰｒｉｍｏｒｄｉａｌｇｅｒｍｃｅｌｋＰＧＣｓ）分离出来的多潜能细胞系，它兼有胚胎细胞和一般培养细胞的双重特性。１９８１年Ｅｖａｎｓ和Ｋａｕｆｍａ首次从小鼠胚胎细胞团中分离出ＥＳ细胞。１引。Ｍａｔｓｕｉ和Ｒｅｓｎｉｋｌ９９２年又从小鼠的原生殖细胞中分离出ＥＳ细胞一，这种由ＰＧＣｓ分离得到的ＥＳ细胞又称为胚胎生殖细胞ＥＧ。这表明囊胚和ＰＧＣｓ组织成为分离和克隆ＥＳ细胞的两大来源。到目前，多种哺乳动物的ＥＳ细胞分离成功。１９８８年Ｄｏｅｔｓｈｍａｎ等建立了仓鼠的ＥＳ细胞系，１９９４年Ｗｈｅｅｌｅｒ和Ｒｏｂｅｒｔ分别用胚胎培养和ＰＧＣｓ培养法获得了猪的ＥＳ细胞，１９９６年Ｔｈｏｍｓｏｎ等获得了猴子的ＥＳ细胞，１９９８年Ｔｈｏｍｓｏｎ等人从人的体外受精囊胚中分离得到ＥＳ细胞。其中小鼠ＥＳ细胞的分离技术已经程序化，并形成商品供科研和生产使用。
ＥＳ细胞法已成为构建转基因动物的主要方法之一，而且是外源基因定位整合和基因敲除的主
要方法，数以千计的基因敲除小鼠品系是通过ＥＳ细胞法完成的。人ＥＳ细胞的分离成功引起了医学界的轰动，人们普遍认为ＥＳ细胞的应用将会引起一场医学革命。由于ＥＳ细胞除具有体外高度自我更新的能力，还有可被定向诱导分化为体内各种类型细胞的能力，因此从理论上，ＥＳ细胞可修复机体内衰老、功能异常或损伤的细胞或组织，甚至于可以形成新的器官。这给某些顽症的治疗带来了希望，人的青命也将大大延长。
６动物克隆
动物克隆（Ｃｌｏｎａｌ）是指动物不经过有性生殖的方式而直接获得与亲本具有相同遗传物质后代
的过程。通常，将所有非受精方式繁殖所获得的动物均称为克隆动物，将产生克隆动物的方法称为克隆技术。在自然条件下，克隆广泛存在于动物、植物和微生物界，哺乳动物的同卵双生即是一种自然的克隆。动物克隆技术对于动物育种、科学试验及发育生物学等基础研究具有重要意义。目前１３５
第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编实验动物能成功制备克隆动物的技术主要有胚胎分割和细胞核移植。
６．１胚胎分割
胚胎分割是指采用机械的方法将动物的早期胚胎分割成２、４或８等份，然后经体内或体外培
养，移植入受体的生殖道内，以得到同卵双生或同卵多生的后代。最早的胚胎分割是１９６８年Ｍｕｌｌａｒ等人用家兔完成的，他们将家兔８细胞胚胎一分为二，移植给母兔，生出了仔兔。１９７４年Ｔｒｏｕｎｓｏｎ和Ｍｏｏｒｅ分割绵羊胚胎，繁殖出同卵双羔埋川。这之后，哺乳动物胚胎分割发展很快，到目前为止，牛、羊、猪、小鼠和灵长类动物均己产生了胚胎分割的后代，并且在动物的繁殖中得到应用。
６．２细胞核移植
由于胚胎分割获得克隆动物的数量非常有限，人们开始探索细胞核移植技术。根据供细胞核来
源的不同，又分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植。
６．２．１胚胎细胞核移植
１９８１年Ｉｌｌｍｅｎｓｅｅ和Ｈｏｐｅｅ将小鼠胚胎的内细胞团细胞核直接拄入去核受精卵，获得首批３
只核移植的克隆小鼠。１９８３年Ｍｃｇｒａｔｈ和Ｓｏｌｔｅｒ首次将显微操作技术和细胞融合技术结合起来，建立了重复性好、效率高的核移植技术程序。这之后哺乳动物胚胎细胞核移植技术得到快速发展，牛（Ｐｒａｔｈｅｒｅｔａｌ，１９８７）、兔（ＳｔｉｃｅａｎｄＲｏｂｉ，１９８８）和猪（Ｐｒａｔｈｅｒ，１９８９）等动物胚胎细胞核移植相继成功。本实验室赵浩斌等人，１９９６年以杜洛克８细胞期胚胎的卵裂球做为核供体，以湖北白猪体外成熟的卵母细胞去核后做为核受体，经移核、电融合、重构胚培养、胚胎移植等程序，得到了国内第一例胚胎细胞核移植的“克隆猪”∞。。
６．２．２体细胞核移植
１９９７年英国Ｒｏｓｈｉｌｉｎ研究所Ｗｉｌｍｕｔ等人，采用饥饿培养法，将一只６岁成年母羊的乳腺上
皮细胞作为核供体，成功地克隆出世界首例体细胞核移植的后代一“多莉”，轰动了世界，成为生命科学研究的又一个里程碑。这之后，世界各国掀起了体细胞克隆研究的热潮，小鼠（Ｗａｋａｙａｍａｅｔａｌ，１９９８）、牛（Ｋａｔｏｅｔａｌ，１９９８）、山羊（Ｂａｇｕｉｓｅｔａｌ，１９９９）、猪（Ｚｒｉｎａｅｔａｌ，２０００）等各种动物的体细胞核移植后代相继诞生旧副。其中对牛的体细胞克隆研究最多，技术相对成熟，许多国家都进行了批量生产。
体细胞核移植的成功，第一次说明成年哺乳动物的体细胞不仅具有基因组的全能性，而且还能
在卵母细胞质中回复到发育的起始状态，完成整个个体的发育过程，具有重大的理论意义。从理论上来讲，动物的体细胞可以说是无限的，因而克隆动物的数量不受限制。这一点是胚胎分割和胚胎细胞核移植所无法比拟的。体细胞核移植还为动物的遗传修饰提供了前所未有的技术方法。首先对供体细胞进行基因改造（转基因、基因敲除或其它基因修饰），解决了其它转基因技术种系细胞来源的困难；然后将基因改造的供体细胞再进行核移植，即可制备出各种遗传修饰的动物。
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浅谈干扰和影响实验动物血液生化检验的因素
黄小琼，钟志勇，刘盛来
（广东省医学实验动物中心，广州５１００５５）
【摘要】血液生化的检测结果，常常是评判肝肾等重要脏器功能是否正常的客观而又灵敏的指标。本文阐
述了干扰和影响实验动物血液生化检验的因素及控制，为检验者和建立实验室标准操作规范（ＳｏＰ）提供参考。
【关键词】血液生化的检测；实验动物；影响因素
生物化学检验是对离体的血液和体液进行生物化学物质的定量测定。血液生化检验是动物实
验的常规项目，但是，血液生化检测结果却受到诸多因素的影响。长期以来，由于动物血液生化检测缺乏一个大家公认的规范化（标准化）操作规程（ＳＯＰ），各实验室在血液生化检测的取材、１３７
实验动物的胚胎工程
作者：
作者单位：魏庆信湖北省动物胚胎工程及分子育种重点实验室;湖北省农科院畜牧兽医研究所,武汉 430064
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1.期刊论文 戴丽军.黄莉.廖军 常用实验动物血清雌二醇和孕酮的测定及比较 -动物科学与动物医学2004,21(11)
目的测定NIH、BABL/C、C57BL/6J小鼠、SD、Wistar大鼠和长爪沙鼠等几种常用实验动物的血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平,为动物生殖和胚胎工程等方面的研究提供基础资料.方法用放射免疫分析法测定上述动物生产前后血清雌二醇(E2)和孕酮(P)水平,进行统计学处理和比较.结果在未生产动物中,血清E2、P的含量与特定物种的体重呈正相关的趋势
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2.会议论文 郑新民.李聚学.田永祥.李莉.乔宪凤.周荆荣 昆明小白鼠超数排卵的研究 2007
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3.学位论文 冯卫国 滴中孔培养法研究牛卵泡颗粒细胞凋亡与卵母细胞发育能力的关系 2006
本文以牛为实验动物，建立了比较完善的滴中孔(WID)培养系统，并应用此系统研究了颗粒细胞凋亡对卵母细胞发育能力、COCs形态以及卵丘扩展的影响，并探讨了以卵泡液中游离颗粒细胞的密度作为一种判定卵母细胞发育能力指标的可行性。实验结果表明：
1.HE染色结果与TUNEL染色一致，并且具有简便及廉价等优点。
2.培养滴体积和培养密度显著影响卵母细胞的成熟质量和胚胎体外发育能力。IVM时，采用10卵/40μl、25卵/100μl可显著提高卵母细胞的成熟质量，而培养密度过大则会削弱卵母细胞的成熟质量；在培养密度不变的情况下，培养滴体积对卵母细胞的成熟质量影响不大。IVC时，采用10胚胎/40μl、20胚胎/40μl、25胚胎/100μl、50胚胎/100μl可显著提高胚胎体外发育能力，而培养密度过小或者过大则会影响到胚胎的发育能力；此外发现，在培养密度不变的情况下，培养滴体积太小会削弱胚胎的发育能力。
3.滴中孔培养法与群卵培养法的效果相似，而单卵培养则显著降低了卵母细胞的发育能力。
4.在直径4-8mm卵泡中，颗粒细胞凋亡程度对卵母细胞的发育能力有显著的影响，轻度闭锁卵泡(凋亡率为10-40％)的卵母细胞发育能力显著高于健康卵泡(凋亡率＜10％)和严重闭锁卵泡(凋亡率＞40％)；但在直径2-3mm卵泡中，即使是轻度闭锁卵泡的卵母细胞发育能力也很差。
5.颗粒细胞的凋亡程度对COCs形态和卵丘扩展具有显著影响，尤其当凋亡比例＞40％时，COCs形态和卵丘扩展程度明显变差。
6.卵丘扩展对卵母细胞的发育具有显著的影响，随着卵丘扩展程度的增加，卵母细胞的发育能力逐渐增强；此外，在卵丘扩展程度相同情况下，轻度闭锁卵泡的卵母细胞发育能力最强。
7.卵泡直径对卵母细胞发育能力有显著影响，直径4-8mm卵泡的卵母细胞发育能力显著高于直径2-3mm卵泡。
8.卵巢的生理状态对卵母细胞发育能力具有一定影响，在直径4-8mm卵泡中，处于卵泡生长期和黄体中期的卵母细胞的发育能力之间差异不显著，但具有高于卵泡优势化期卵母细胞发育能力的趋势。
9.利用卵泡液游离颗粒细胞的密度可以反映卵泡的闭锁程度，来自中等颗粒细胞密度卵泡(细胞密度为10-30×105/ml)的卵母细胞发育能力比较强。
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根据研究生教学特点,对其医学实验动物学课程教学进行改革实践.根据实验动物学的最新进展、研究生的知识需求及我们的科研方向共分实验动物遗传工程、实验动物胚胎工程、异种移植、实验动物与比较基因组学、实验用小型猪、无茼动物与微生态学、实验动物与生物安全性、动物实验基本技术与方法8个专题向学生授课,力争紧跟学科发展动态,强调知识的前沿性、综合性和交叉性,促进研究生的科研能力和创新能力的培养,创建研究生医学实验动物学教学的新模式.
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7.学位论文 徐艺玫 绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立及可视化胚胎工程的研究 2005
绿色荧光蛋白(GFP)是海洋生物水母(aequorea，victoria)体内分离纯化出来的一种能发射强烈荧光的特殊蛋白质，在无任何协同因子、底物或附加基因产物存在的情况下就能产生稳定的荧光，而且这种荧光很容易通过荧光显微镜或者肉眼即可观察到。因此，GFP是一种全新的、应用广泛的遗传标记(genetic marker)和蛋白质标记物(protein tag)。 绿色荧光蛋白可以提高转基因动物的制备效率，即将待转的目的基因构件与GFP基因串联起来一并整合，由于GFP基因的表达产物在胚胎发育的早期即可检测到，我们可以只选择那些只表达了GFP阳性重组体的胚胎进行移植，这样即减少移植胚胎的盲目性，又提高转基因动物的制作效率。
用显微注射法将GFP基因注入FVB/NJ小鼠受精卵原核内，获得的子代鼠3周后，提取鼠尾基因组DNA，应用PCR技术进行检测，获得5只PCR阳性小鼠；通过整体成像仪观察其中3只(F0)有绿色荧光表达。对F0代转基因小鼠进行传代，获得子代小鼠通过整体成像仪观察7只(F1)有绿色荧光表达，继而在F1代GFP转基因小鼠中进行交配，得到子代鼠，经整体成像仪观察，发现35只(F2)小鼠有绿色荧光表达，表明初步建立了全身有荧光表达并能传代的GFP转基因小鼠。这为我们进行可视化胚胎工程研究奠定了基础。
GFP转基因小鼠可视化胚胎工程的实验研究：
(1)采集GFP转基因雄鼠附睾尾部精子与常规超排法得到KM鼠的卵母细胞在培养液中进行体外受精，建立体外受精模型，并将受精卵移入培养液中进行体外培养。通过荧光显微镜观察发现，体外受精后6h受精卵有绿色荧光表达.
(2)将体外受精后的胚胎体外培养至囊胚，观察该胚胎卵裂球发育分化的情况。有的胚胎发生阻滞而未能继续发育；有的发育至4-8细胞期；有的胚胎可发育至桑椹胚和囊胚阶段，整个胚胎呈现绿色荧光。虽然胚胎质量的优劣是影响体外培养是否成功的重要因素，而对其起决定作用的是胚胎体外培养条件，其中包括培养液的成分和培养体系。
(3)GFP转基因小鼠的早期胚胎分割。移植前小鼠胚胎的透明带经软化后，用固定在显微操作臂上的微玻璃针进行胚胎分割，分别对2-，4-，8-细胞胚胎及桑椹胚进行了胚胎分割，所获半胚进行体外培养。将8-细胞胚组及桑椹胚的半胚移植到假孕母鼠后，有仔鼠出生。
8.期刊论文 陈浩杰.刘丽均.李晟阳.徐平.罗光彬.CHEN Hao-jie.LIU Li-jun.LI Sheng-yang.XU Ping.LUO Guang-bin 哺乳动物嵌合体制作及分析进展 -中国畜牧杂志2007,43(21)
嵌合体技术对研究哺乳动物早期胚胎的发育,探索细胞分化规律,掌握基因的表达调控规律,建立遗传疾病动物模型等具有重要意义.本文分别就近几年来嵌合体动物的制作方法及分析手段作一简要概述.
9.期刊论文 陈浩杰.刘丽均.李晟阳.徐平.罗光彬 实验用显微操作针的制备 -畜牧与兽医2007,39(8)
如今显微操作技术已广泛应用于体细胞核移植、转基因动物生产、人类辅助生殖等胚胎生物工程中,而在这些实验中很重要的一项是要制作出符合要求的显微操作针,本文介绍利用拉针仪、煅烧仪、磨针仪怎样制作符合实验要求的高质量的显微操作针.
10.期刊论文 陈浩杰.刘丽均.李晟阳.赵立虎.马明仑.徐平.罗光彬 影响精子胞质内显微受精的关键因素 -中国畜牧兽医2007,34(7) 精子胞质内显微受精(ICSI)在人方面已很成熟,但在啮齿类试验动物方面还有待进一步研究,作者就ICSI操作过程中的关键因素作一简要综述.
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Conference_6480703.aspx
授权使用：延安大学(yadx)，授权号：c750353d-f400-4854-84b7-9e3c00f6e4b8
下载时间：2010年11月28日