猪肉中单核细胞增生李斯特菌的分离与耐药性研究

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2013, Vol.29, No.12

猪肉中单核细胞增生李斯特菌的分离与耐药性研究

石磊 ，王文燕 ，闫鹤 （1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640)(2.厦门银祥集团有限公司，福建厦门 361100）

摘要：了解猪肉中单核细胞增生李斯特菌的污染情况、血清型和耐药性现状。按照国标 GB 4789.30-2010 程序分离猪肉中单核 细胞增生李斯特菌；多重 PCR 确定血清型；纸片扩散法检测单核细胞增生李斯特菌对抗生素的敏感性。研究结果表明 273 份猪肉样 本中有 52（19.02%)个受单核细胞增生李斯特菌的污染，共检出 78 株该致病菌。33 株（42.31%） 、24 株（30.71%） 、16 株（20.51%） 、 3 株（3.85%） 、2 株（2.56%)分别被确定为血清型 1/2a（或 3a） 、1/2b（或 3b 或 7） 、1/2c（或 3c） 、4a（或 4c）和 4b（或 4d 或 4e） 。 所有菌株对氨苄西林、 氨苄西林/舒巴坦、亚胺培能、环丙沙星、左氧氟沙星、万古霉素都敏感，对四环素（20.51%）的耐药率最为 严重。11.54%的菌株对临床治疗李斯特菌病的青霉素、庆大霉素、红霉素等抗生素出现耐药。 tet(M)基因是单核细胞增生李斯特菌耐 四环素的主要机制之一，接合型转座子 Tn916 与该菌四环素耐药散播有直接关系。 关键词：单核细胞增生李斯特菌；检测；血清型；耐药性；接合型转座子 Tn916 文章篇号：1673-9078(2013)12-2826-2829

1,2 1 1

Isolation and Antimicrobial Susceptibilities of Listeria monocytogenes in Pork

SHI Lei1,2 , WANG Wen-yan1 , YAN He 1 (1.College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China) (2.Xiamen Yinxiang Group CO., Ltd, Xiamen 361100, China)

Abstract: To investigate the pork contamination by Listeria monocytogenes , its susceptibility to antimicrobial agents and serotypes, all strains were isolated by the GB 4789.30-2010 method; L. monocytogenes serotypes were identified by PCR; and antibiotic resistant profile of the isolates was examined using disc diffusion assay. A total of 273 pork samples were examined, out of which 52 samples (19.02%) were positive for L. monocytogenes and 78 strains were detected. And 33 (42.31%), 24 (30.71%), 16 (20.51%), 2 (2.56%), 3 (3.85%) of the isolates were identified as serotypes 1/2a (or 3a), 1/2b (or 3b or 7), 1/2c (or 3c), 4a (or4c)and 4b (or 4d or 4e), respectively. With disc diffusion assay, all strains were susceptible to the antibiotics, including ampicillin, ampicillin-sulbactam, imipenem, ciprofloxacin, levofloxacin, and vancomycin. However, the percentages of tetracycline resistances were higher. 11.54% isolates were resistant to penicillin, gentamicin, erythromycin. The conjugative transposon Tn916 is the important determinants of the resistance in spreading of the L. monocytogenes . Key words: Listeria monocytogenes ; detection; serotypes; antibiotic resistance; Tn916 conjugative transposon

单核细胞增生李斯特 菌是一种 革兰氏阳性短杆 菌，它广泛分布在自然界中，如土壤、污水、饲料、 动物、人和动物的粪便中等，并且该菌对外界环境适 应能力很强，在不利因素如低温、高渗透压、酸性环 境、抗菌物质中仍能生长。 据WHO报道：4~8%的水产 品， 5~10%的奶与奶制品， 30%以上的肉与肉制品， 15% 以上的家禽均被其污染。该菌可引起人和动物多种疾

收稿日期：2013-08-17 基金项目：华南理工大学中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 (2012ZZ0083)；国家自然科学基金青年科学基金项目（31201363） ；广州市科 技计划项目（11C12080718） 作者简介：石磊（1961-） ，男，教授，博导 通讯作者：闫鹤（1972-） ，女，讲师，主要从事细菌耐药机制及食品安全

病，人畜感染后主要表现为脑膜炎、败血症等，对于 人类，特别是新生儿、孕妇、老年人以及免疫功能缺 陷者，很容易发病，致死率达20~30%[1]。自上世纪80 年代以来，欧州等国家多次因食品污染爆发人李斯特 菌病，目前我国还没有由该菌引起的疾病爆发流行报 告，但多年来该病在我国猪、羊、鸡、牛、兔等家畜 家禽中有流行 [2]。2002 年单核细胞增生李 斯特菌 被 WHO列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏 菌后的第四大重要的食源性致病菌[3]。 20世纪50年代，美国FDA和大部分欧洲国家允许 使用抗生素作为动物饲料添加剂，造成食源性致病菌 耐药性明显提高。自1988年首次报道单核细胞增生李 斯特菌耐受四环素以来，此后不断的从食物、环境、

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人、动物中分离到对一种或多种抗生素耐药的单核细 胞增生李斯特菌。细菌对四环素类抗生素耐药的分子 机理主要是编码外输泵蛋白、核糖体保护蛋白、灭活 或钝化四环素的酶， 已知的四环素耐药基因有20余种， 在革兰氏阳性菌中发现6类四环素耐药基因：tet(K)、 tet(L)、 tet(M)、 tet(O)、 tet(P)、 tet(S)。 接合转座子Tn916 是散播tet(M)介导的四环素耐药的重要载体，能在不 同的菌间转移[4]。 单核细胞增生李斯特菌有13个血清型，不同的血 清型致病力不同，98%以上的人李斯特菌病病例由 1/2a、1/2b、1/2c和4b血清型引起。在这13个血清型中， 1/2a型在食物中最普遍， 而4b型是最常在患有李斯特菌 病的人身上检测到。这些血清型可以分为三个谱系， 其中谱系I包括1/2b、3b、4a、4b、4d、4e和7血清型， 主要来自人类李斯特菌病；谱系Ⅱ包括1/2a、1/2c 、3a 和3c 血清型， 主要来自食品及动物李斯特菌病； 谱系Ⅲ 菌株很少， 包括4a和4c血清型， 主要来自动物和环境样 本[5]。 本研究主要对广州市及厦门市猪肉中单核细胞增 生李斯特菌的污染情况、血清型和耐药性进行监测分 析，且研究四环素耐药菌的耐药机制，为预防和控制 李斯特菌病提供科学的依据。

1.3 方法 1.3.1 单核细胞增生李斯特鉴定方法

参照GB 4789.30-2010《食品卫生微生物学检验单 核细胞增生李斯特氏菌检验》 方法检测[6]，获得阳性菌 株，用80%甘油保存。

1.3.2 多重PCR鉴定血清型

参考Michel等的方法，设计4对引物分别特异性扩 增单核细胞增生李斯特菌基因Lmo0737、Lmo11180、 ORF 2819和ORF2110，引物信息参考文献[7]。

1.3.3 药敏试验

采用标准琼脂扩散法（Kirby- Bauer） ，结果按照 CLSI(2012) 标准进行结果判断[8]（对单核细胞增生李斯 特菌CLSI 无抑菌圈直径折点判读标准的药物，参见葡 萄球菌和肠球菌） 。

1.3.4 四环素耐药基因tet (M)和接合型转座子 Tn916检测

所有耐四环素的菌株PCR扩增检测四环素耐药基 因tet(M)， 引物序列及条件参考文献[9]；对tet(M)阳性菌 株，PCR检测接合型转座子Tn916，引物序列及条件参 考文献[10]。 在www.ncbi.nlm.nih.gov 网站对测得的序列 进行分析，用Standard Nucleotide BLAST 对获得的基因 序列进行同源性检索。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 样本来源

在广州天河区超市和菜市场及厦门的某养殖场共 采猪肉样本273份。 其中在广州天河区的超市和菜市场 采样145份，分别为：生猪肉100份，包括腿肉、里脊 肉、方肉、夹心肉、五花肉、肉糜、小排、大排、肋 排、尾骨等；猪内脏25份，包括猪肝、猪肾、猪大肠、 猪肚、猪心；熟肉20份。在厦门某养殖场，采样128 份，包括生猪肉和猪内脏。

2 结果与分析 2.1 猪肉中单核细胞增生李斯特菌的检测结 果

表1 猪肉中单核细胞增生李斯特菌污染情况 Table 1 Contamination of Listeria monocytogenes in pork 采样 点 广州 广州 广州 厦门 厦门 合计 采样时间 2012.8~2012.10 2012.8~2012.10 2012.8~2012.10 2012.11~2012.12 2012.11~2012.12 样品 生猪肉 猪内脏 熟肉 生猪肉 猪内脏 检测 件数 100 25 20 113 15 273 检出 样本检 件数 出率/% 40 0 4 8 0 52 40 0 20 7.07 0 19.05

1.1.2 菌株

药敏质控菌株Staphylococcus aureus A TCC25923、 Escherichia coli A TCC25922 和 Pseudomonas aeruginosa A TCC27853。

1.2 仪器和试剂

LB1、 LB2增菌液、单增李斯特菌显色培养基、 PALCAM 琼脂、单核细胞增生李斯特生化鉴定试剂 盒，广东环凯微生物科技有限公司；M-H培养基，美 国Oxoid公司； 抗生素纸片， 杭州微生物试剂有限公司； 选择目前临床用药和兽药共17种抗生素。

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从表1中知273份猪肉有52个样本受到单核细胞增 生李斯特菌的污染，共得到 78株菌，样本检出率为 19.05%。广州的145份猪肉中，有44个样本检出单核 细胞增生李斯特菌，样本检出率为30.34%，生猪肉、 猪内脏、熟肉的测出率分别为40%、0、20%。从这44 个样本中得到65株菌， 其中60株来自生肉， 其余5株菌

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来自熟肉。厦门某养殖场的128份猪肉有8个样本检出 13株单核细胞增生李斯特菌，样本检出率为6.25%， 生猪肉、猪内脏的检出率分别为7.07%、0。 本研究中，单核细胞增生李斯特菌的检出率为 19.05%，略高于之前的研究，如有报道2000年生肉中 单核细胞增生李斯特菌的检出率为2.47%，2003~2005

年 为 7.1% ， 2005~2006 年 为 28% ， 2006~2009 年 为 11.67%， 2008~2009年为12%[11~12]。 养殖场的单核细胞 增生李斯特检出率低于超市和零售市场，这与猪肉的 运输和销售过程长时间暴露在空气中有关。20%的熟 肉样本受单核细胞增生李斯特菌的污染可能是由于此 次熟肉样

表2 猪肉中单核细胞增生李斯特菌对抗生素敏感性结果 Table 2 Antibiotic susceptibility of Listeria monocytogenes from pork 药物种类 抗生素名称 氨苄西林 青霉素 β-内酰胺类 氨苄西林/舒巴坦 头孢噻吩 头孢噻肟 亚胺培能 喹诺酮 环丙沙星 左氧氟沙星 四环素 强力霉素 红霉素 链霉素 庆大霉素 万古霉素 利福平 氯霉素 甲氧苄啶 抑菌圈直径折点 S ≥17 ≥15 ≥15 ≥18 ≥23 ≥16 ≥21 ≥19 ≥19 ≥16 ≥23 ≥10 ≥15 ≥17 ≥20 ≥18 ≥16 I 12~14 15~17 15~22 14~15 16~20 16~18 15~18 13~15 14~22 7~9 13~14 15~16 17~19 13~17 11~15 R ≤16 ≤14 ≤11 ≤14 ≤14 ≤13 ≤15 ≤15 ≤14 ≤12 ≤13 ≤6 ≤12 ≤14 ≤16 ≤12 ≤10 耐药菌 株数 0 1 0 4 7 0 0 0 16 4 3 5 5 0 2 1 4 耐药率 /% 0 1.28 0 5.13 8.97 0 0 0 20.51 5.13 3.85 6.41 6.41 0 2.56 1.28 5.13

四环素 大环内酯 氨基糖苷 糖肽 利福平 氯霉素类 磺胺类

本全部来自零售市场且为家庭式的小作坊生产， 原料、生产、运输和销售各环节缺乏严格的卫生质量 监控。因此，需要加强和规范猪肉的运输、销售和加 工等各环节的卫生监督和管理。

力霉素、甲氧苄啶、氯霉素、链霉素、庆大霉素、利 福平；一株分离自广州某超市，1/2c血清型，分别耐受 四环素、强力霉素、红霉素、庆大霉素、头孢噻吩、 头孢噻肟、链霉素。 药敏 试验结果 表明所有 菌株对四 环素耐 药 （20.51%）最严重，这与前人的研究是一致的[11]，并 且在厦门某养殖场检出的单核细胞增生李斯特菌有 6 株耐药，这6株菌仅有一株耐四环素和红霉素，其他只 耐四环素。单核细胞增生李斯特菌耐四环素严重是因 为四环素作为动物生长促进剂添加在动物饲料中。一 般临床治疗人的李斯特菌病把氨苄西林、利福平或青 霉素和庆大霉素作为首选的抗生素，其次是甲氧苄氨 嘧啶和磺胺类抗生素，红霉素和万古霉素也会使用， 本研究中分离到了耐青霉 （1.28%） 、 庆大霉素 （6.41%） 、 利福平（2.56%）的单核细胞增生李斯特菌。另一个值 得注意的是发现多重耐药菌（6.41%） ，单核细胞增生 李斯特菌的多重耐药性会导致临床治疗李斯特菌病失 败，密切关注单核细胞增生李斯特菌的耐药情况，以

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2.2 单核细胞增生李斯特菌药敏试验结果

表2概述了78株菌对17种抗生素的耐药情况，试验 中的药敏质控菌株均在参考标准给定的范围内。所有 菌株对氨苄西林、 氨苄西林/舒巴坦、亚胺培能、环丙 沙星、左氧氟沙星、万古霉素都敏感。78株菌中有24 （30.77%）株耐药，其中有2株来自熟肉，其耐受抗生 素为四环素、强力霉素、头孢噻肟、链霉素、庆大霉 素、氯霉素、红霉素、利福平、头孢噻吩、甲氧苄啶、 青霉素。试验菌株耐四环素最为严重，耐药率达到 20.51%；其次为头孢噻肟（8.97%） 。耐受一种抗生素 的有13（16.67%）株，耐受三类或三类以上的抗生素 有5（6.41%）株。一株分离自广州某零售市场，1/2a 血清型，分别耐受头孢噻肟、头孢噻吩、四环素、强

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便找到切实可行的方法，消除这些耐药菌对人类健康 的危害。

在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间传递，人类和动 物的肠道细菌是获得可移动质粒和接合型转座子的场 所[11]。

2.3 单核细胞增生李斯特菌血清型分型结果

实验得到的单核细胞增生李斯特菌被分属为五组 血清型。 33株 （42.31%） 属于第一组 （血清型1/2a和3a） （42.31%） ， 第二组 （1/2b和3b） （30.71%） ， 第三组 （1/2c 和3c)（20.51%） ，第四组（4a和4c） （3.85%） ，第五组 （4b和4d和4e） （2.56%） 。谱系Ⅱ（1/2a，1/2c,3a和3c ） 为主要的占62.82%，谱系I（1/2b、3b、4b、4d、4e） 占33.27%，谱系Ⅲ（4a和4c）占3.85%（图1） 。

3 结论

对广州市及厦门市猪肉样本检测结果表明，单核 细胞增生李斯特菌检出率为19.05% ，血清型主要为 1/2a、1/2b和1/2c ，且存在具有强致病性4b性，这几种 血清型能引起严重的李斯特病，该批菌株对临床治疗 李斯特菌病常用药物如庆大霉素、红霉素等存在一定 的耐药性。转座子Tn916是造成该批菌对四环素耐受的 主要原因，关注可移动基因元件介导的耐药性在各种 食源性细菌间传播极为重要，持续监测这些不断出现 的耐药菌株及研究各种耐药机制，以确保有效的人类 李斯特菌病的治疗。

参考文献

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多重PCR无法区分1/2a与3a、 1/2c与3c、 1/2b和3b、 4b与4d或者4e。但是在食物中属于3a、3b、3c4a、4c 、 4e和4d这几种血清型的单核细胞增生李斯特菌是很少 的。分离得到的实验菌株的血清型主要为1/2a、1/2c 和1/2b（93.53%） ，这和国内外报道是一致的 。1/2a 型的单核细胞增生李斯特菌具有较强的耐细菌素能 力，且带有更多的质粒，这些质粒赋予它对环境中的 抗生素和重金属更强的抵抗力，因此其在环境中有很 好的适应能力[14]。1/2a、1/2b和4b这三种血清型的单 核细胞增生李斯特菌能引起人类李斯特病。因此，需 要加强对单核细胞增生李斯特菌以上几种血清型的检 测力度，重点防治李斯特病的爆发。所得到的菌株大 部分是属于谱系I（33.27%）和谱系Ⅱ（62.82%） 。

[13]

2.4 四环素耐药基因和转座子Tn916 检测结果

16株四环素耐药菌株中有l2株检出tet(M)基因，且 这12株菌的耐药基因tet(M)均位于转座子Tn916上。Tet （M） 是最常见的四环素耐药基因， 临床分离18种革兰 [9] 氏阳性菌均已检tet(M)基因 。 本研究中检测到tet（M） 基因均位于转座子Tn916上。研究表明，细菌主要是通 过质粒和接合型转座子（Tn916-Tn1545）两种可移动 基因元件携带的抗生素耐药基因而产生耐药性，且这 两种可移动元件在肠球菌和链球菌中普遍存在，并能

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Abstract: To investigate the pork contamination by Listeria monocytogenes , its susceptibility to antimicrobial agents and serotypes, all strains were isolated by the GB 4789.30-2010 method; L. monocytogenes serotypes were identified by PCR; and antibiotic resistant profile of the isolates was examined using disc diffusion assay. A total of 273 pork samples were examined, out of which 52 samples (19.02%) were positive for L. monocytogenes and 78 strains were detected. And 33 (42.31%), 24 (30.71%), 16 (20.51%), 2 (2.56%), 3 (3.85%) of the isolates were identified as serotypes 1/2a (or 3a), 1/2b (or 3b or 7), 1/2c (or 3c), 4a (or4c)and 4b (or 4d or 4e), respectively. With disc diffusion assay, all strains were susceptible to the antibiotics, including ampicillin, ampicillin-sulbactam, imipenem, ciprofloxacin, levofloxacin, and vancomycin. However, the percentages of tetracycline resistances were higher. 11.54% isolates were resistant to penicillin, gentamicin, erythromycin. The conjugative transposon Tn916 is the important determinants of the resistance in spreading of the L. monocytogenes . Key words: Listeria monocytogenes ; detection; serotypes; antibiotic resistance; Tn916 conjugative transposon

单核细胞增生李斯特 菌是一种 革兰氏阳性短杆 菌，它广泛分布在自然界中，如土壤、污水、饲料、 动物、人和动物的粪便中等，并且该菌对外界环境适 应能力很强，在不利因素如低温、高渗透压、酸性环 境、抗菌物质中仍能生长。 据WHO报道：4~8%的水产 品， 5~10%的奶与奶制品， 30%以上的肉与肉制品， 15% 以上的家禽均被其污染。该菌可引起人和动物多种疾

收稿日期：2013-08-17 基金项目：华南理工大学中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 (2012ZZ0083)；国家自然科学基金青年科学基金项目（31201363） ；广州市科 技计划项目（11C12080718） 作者简介：石磊（1961-） ，男，教授，博导 通讯作者：闫鹤（1972-） ，女，讲师，主要从事细菌耐药机制及食品安全

病，人畜感染后主要表现为脑膜炎、败血症等，对于 人类，特别是新生儿、孕妇、老年人以及免疫功能缺 陷者，很容易发病，致死率达20~30%[1]。自上世纪80 年代以来，欧州等国家多次因食品污染爆发人李斯特 菌病，目前我国还没有由该菌引起的疾病爆发流行报 告，但多年来该病在我国猪、羊、鸡、牛、兔等家畜 家禽中有流行 [2]。2002 年单核细胞增生李 斯特菌 被 WHO列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏 菌后的第四大重要的食源性致病菌[3]。 20世纪50年代，美国FDA和大部分欧洲国家允许 使用抗生素作为动物饲料添加剂，造成食源性致病菌 耐药性明显提高。自1988年首次报道单核细胞增生李 斯特菌耐受四环素以来，此后不断的从食物、环境、

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人、动物中分离到对一种或多种抗生素耐药的单核细 胞增生李斯特菌。细菌对四环素类抗生素耐药的分子 机理主要是编码外输泵蛋白、核糖体保护蛋白、灭活 或钝化四环素的酶， 已知的四环素耐药基因有20余种， 在革兰氏阳性菌中发现6类四环素耐药基因：tet(K)、 tet(L)、 tet(M)、 tet(O)、 tet(P)、 tet(S)。 接合转座子Tn916 是散播tet(M)介导的四环素耐药的重要载体，能在不 同的菌间转移[4]。 单核细胞增生李斯特菌有13个血清型，不同的血 清型致病力不同，98%以上的人李斯特菌病病例由 1/2a、1/2b、1/2c和4b血清型引起。在这13个血清型中， 1/2a型在食物中最普遍， 而4b型是最常在患有李斯特菌 病的人身上检测到。这些血清型可以分为三个谱系， 其中谱系I包括1/2b、3b、4a、4b、4d、4e和7血清型， 主要来自人类李斯特菌病；谱系Ⅱ包括1/2a、1/2c 、3a 和3c 血清型， 主要来自食品及动物李斯特菌病； 谱系Ⅲ 菌株很少， 包括4a和4c血清型， 主要来自动物和环境样 本[5]。 本研究主要对广州市及厦门市猪肉中单核细胞增 生李斯特菌的污染情况、血清型和耐药性进行监测分 析，且研究四环素耐药菌的耐药机制，为预防和控制 李斯特菌病提供科学的依据。

1.3 方法 1.3.1 单核细胞增生李斯特鉴定方法

参照GB 4789.30-2010《食品卫生微生物学检验单 核细胞增生李斯特氏菌检验》 方法检测[6]，获得阳性菌 株，用80%甘油保存。

1.3.2 多重PCR鉴定血清型

参考Michel等的方法，设计4对引物分别特异性扩 增单核细胞增生李斯特菌基因Lmo0737、Lmo11180、 ORF 2819和ORF2110，引物信息参考文献[7]。

1.3.3 药敏试验

采用标准琼脂扩散法（Kirby- Bauer） ，结果按照 CLSI(2012) 标准进行结果判断[8]（对单核细胞增生李斯 特菌CLSI 无抑菌圈直径折点判读标准的药物，参见葡 萄球菌和肠球菌） 。

1.3.4 四环素耐药基因tet (M)和接合型转座子 Tn916检测

所有耐四环素的菌株PCR扩增检测四环素耐药基 因tet(M)， 引物序列及条件参考文献[9]；对tet(M)阳性菌 株，PCR检测接合型转座子Tn916，引物序列及条件参 考文献[10]。 在www.ncbi.nlm.nih.gov 网站对测得的序列 进行分析，用Standard Nucleotide BLAST 对获得的基因 序列进行同源性检索。

1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 样本来源

在广州天河区超市和菜市场及厦门的某养殖场共 采猪肉样本273份。 其中在广州天河区的超市和菜市场 采样145份，分别为：生猪肉100份，包括腿肉、里脊 肉、方肉、夹心肉、五花肉、肉糜、小排、大排、肋 排、尾骨等；猪内脏25份，包括猪肝、猪肾、猪大肠、 猪肚、猪心；熟肉20份。在厦门某养殖场，采样128 份，包括生猪肉和猪内脏。

2 结果与分析 2.1 猪肉中单核细胞增生李斯特菌的检测结 果

表1 猪肉中单核细胞增生李斯特菌污染情况 Table 1 Contamination of Listeria monocytogenes in pork 采样 点 广州 广州 广州 厦门 厦门 合计 采样时间 2012.8~2012.10 2012.8~2012.10 2012.8~2012.10 2012.11~2012.12 2012.11~2012.12 样品 生猪肉 猪内脏 熟肉 生猪肉 猪内脏 检测 件数 100 25 20 113 15 273 检出 样本检 件数 出率/% 40 0 4 8 0 52 40 0 20 7.07 0 19.05

1.1.2 菌株

药敏质控菌株Staphylococcus aureus A TCC25923、 Escherichia coli A TCC25922 和 Pseudomonas aeruginosa A TCC27853。

1.2 仪器和试剂

LB1、 LB2增菌液、单增李斯特菌显色培养基、 PALCAM 琼脂、单核细胞增生李斯特生化鉴定试剂 盒，广东环凯微生物科技有限公司；M-H培养基，美 国Oxoid公司； 抗生素纸片， 杭州微生物试剂有限公司； 选择目前临床用药和兽药共17种抗生素。

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从表1中知273份猪肉有52个样本受到单核细胞增 生李斯特菌的污染，共得到 78株菌，样本检出率为 19.05%。广州的145份猪肉中，有44个样本检出单核 细胞增生李斯特菌，样本检出率为30.34%，生猪肉、 猪内脏、熟肉的测出率分别为40%、0、20%。从这44 个样本中得到65株菌， 其中60株来自生肉， 其余5株菌

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来自熟肉。厦门某养殖场的128份猪肉有8个样本检出 13株单核细胞增生李斯特菌，样本检出率为6.25%， 生猪肉、猪内脏的检出率分别为7.07%、0。 本研究中，单核细胞增生李斯特菌的检出率为 19.05%，略高于之前的研究，如有报道2000年生肉中 单核细胞增生李斯特菌的检出率为2.47%，2003~2005

年 为 7.1% ， 2005~2006 年 为 28% ， 2006~2009 年 为 11.67%， 2008~2009年为12%[11~12]。 养殖场的单核细胞 增生李斯特检出率低于超市和零售市场，这与猪肉的 运输和销售过程长时间暴露在空气中有关。20%的熟 肉样本受单核细胞增生李斯特菌的污染可能是由于此 次熟肉样

表2 猪肉中单核细胞增生李斯特菌对抗生素敏感性结果 Table 2 Antibiotic susceptibility of Listeria monocytogenes from pork 药物种类 抗生素名称 氨苄西林 青霉素 β-内酰胺类 氨苄西林/舒巴坦 头孢噻吩 头孢噻肟 亚胺培能 喹诺酮 环丙沙星 左氧氟沙星 四环素 强力霉素 红霉素 链霉素 庆大霉素 万古霉素 利福平 氯霉素 甲氧苄啶 抑菌圈直径折点 S ≥17 ≥15 ≥15 ≥18 ≥23 ≥16 ≥21 ≥19 ≥19 ≥16 ≥23 ≥10 ≥15 ≥17 ≥20 ≥18 ≥16 I 12~14 15~17 15~22 14~15 16~20 16~18 15~18 13~15 14~22 7~9 13~14 15~16 17~19 13~17 11~15 R ≤16 ≤14 ≤11 ≤14 ≤14 ≤13 ≤15 ≤15 ≤14 ≤12 ≤13 ≤6 ≤12 ≤14 ≤16 ≤12 ≤10 耐药菌 株数 0 1 0 4 7 0 0 0 16 4 3 5 5 0 2 1 4 耐药率 /% 0 1.28 0 5.13 8.97 0 0 0 20.51 5.13 3.85 6.41 6.41 0 2.56 1.28 5.13

四环素 大环内酯 氨基糖苷 糖肽 利福平 氯霉素类 磺胺类

本全部来自零售市场且为家庭式的小作坊生产， 原料、生产、运输和销售各环节缺乏严格的卫生质量 监控。因此，需要加强和规范猪肉的运输、销售和加 工等各环节的卫生监督和管理。

力霉素、甲氧苄啶、氯霉素、链霉素、庆大霉素、利 福平；一株分离自广州某超市，1/2c血清型，分别耐受 四环素、强力霉素、红霉素、庆大霉素、头孢噻吩、 头孢噻肟、链霉素。 药敏 试验结果 表明所有 菌株对四 环素耐 药 （20.51%）最严重，这与前人的研究是一致的[11]，并 且在厦门某养殖场检出的单核细胞增生李斯特菌有 6 株耐药，这6株菌仅有一株耐四环素和红霉素，其他只 耐四环素。单核细胞增生李斯特菌耐四环素严重是因 为四环素作为动物生长促进剂添加在动物饲料中。一 般临床治疗人的李斯特菌病把氨苄西林、利福平或青 霉素和庆大霉素作为首选的抗生素，其次是甲氧苄氨 嘧啶和磺胺类抗生素，红霉素和万古霉素也会使用， 本研究中分离到了耐青霉 （1.28%） 、 庆大霉素 （6.41%） 、 利福平（2.56%）的单核细胞增生李斯特菌。另一个值 得注意的是发现多重耐药菌（6.41%） ，单核细胞增生 李斯特菌的多重耐药性会导致临床治疗李斯特菌病失 败，密切关注单核细胞增生李斯特菌的耐药情况，以

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2.2 单核细胞增生李斯特菌药敏试验结果

表2概述了78株菌对17种抗生素的耐药情况，试验 中的药敏质控菌株均在参考标准给定的范围内。所有 菌株对氨苄西林、 氨苄西林/舒巴坦、亚胺培能、环丙 沙星、左氧氟沙星、万古霉素都敏感。78株菌中有24 （30.77%）株耐药，其中有2株来自熟肉，其耐受抗生 素为四环素、强力霉素、头孢噻肟、链霉素、庆大霉 素、氯霉素、红霉素、利福平、头孢噻吩、甲氧苄啶、 青霉素。试验菌株耐四环素最为严重，耐药率达到 20.51%；其次为头孢噻肟（8.97%） 。耐受一种抗生素 的有13（16.67%）株，耐受三类或三类以上的抗生素 有5（6.41%）株。一株分离自广州某零售市场，1/2a 血清型，分别耐受头孢噻肟、头孢噻吩、四环素、强

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便找到切实可行的方法，消除这些耐药菌对人类健康 的危害。

在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间传递，人类和动 物的肠道细菌是获得可移动质粒和接合型转座子的场 所[11]。

2.3 单核细胞增生李斯特菌血清型分型结果

实验得到的单核细胞增生李斯特菌被分属为五组 血清型。 33株 （42.31%） 属于第一组 （血清型1/2a和3a） （42.31%） ， 第二组 （1/2b和3b） （30.71%） ， 第三组 （1/2c 和3c)（20.51%） ，第四组（4a和4c） （3.85%） ，第五组 （4b和4d和4e） （2.56%） 。谱系Ⅱ（1/2a，1/2c,3a和3c ） 为主要的占62.82%，谱系I（1/2b、3b、4b、4d、4e） 占33.27%，谱系Ⅲ（4a和4c）占3.85%（图1） 。

3 结论

对广州市及厦门市猪肉样本检测结果表明，单核 细胞增生李斯特菌检出率为19.05% ，血清型主要为 1/2a、1/2b和1/2c ，且存在具有强致病性4b性，这几种 血清型能引起严重的李斯特病，该批菌株对临床治疗 李斯特菌病常用药物如庆大霉素、红霉素等存在一定 的耐药性。转座子Tn916是造成该批菌对四环素耐受的 主要原因，关注可移动基因元件介导的耐药性在各种 食源性细菌间传播极为重要，持续监测这些不断出现 的耐药菌株及研究各种耐药机制，以确保有效的人类 李斯特菌病的治疗。

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多重PCR无法区分1/2a与3a、 1/2c与3c、 1/2b和3b、 4b与4d或者4e。但是在食物中属于3a、3b、3c4a、4c 、 4e和4d这几种血清型的单核细胞增生李斯特菌是很少 的。分离得到的实验菌株的血清型主要为1/2a、1/2c 和1/2b（93.53%） ，这和国内外报道是一致的 。1/2a 型的单核细胞增生李斯特菌具有较强的耐细菌素能 力，且带有更多的质粒，这些质粒赋予它对环境中的 抗生素和重金属更强的抵抗力，因此其在环境中有很 好的适应能力[14]。1/2a、1/2b和4b这三种血清型的单 核细胞增生李斯特菌能引起人类李斯特病。因此，需 要加强对单核细胞增生李斯特菌以上几种血清型的检 测力度，重点防治李斯特病的爆发。所得到的菌株大 部分是属于谱系I（33.27%）和谱系Ⅱ（62.82%） 。

[13]

2.4 四环素耐药基因和转座子Tn916 检测结果

16株四环素耐药菌株中有l2株检出tet(M)基因，且 这12株菌的耐药基因tet(M)均位于转座子Tn916上。Tet （M） 是最常见的四环素耐药基因， 临床分离18种革兰 [9] 氏阳性菌均已检tet(M)基因 。 本研究中检测到tet（M） 基因均位于转座子Tn916上。研究表明，细菌主要是通 过质粒和接合型转座子（Tn916-Tn1545）两种可移动 基因元件携带的抗生素耐药基因而产生耐药性，且这 两种可移动元件在肠球菌和链球菌中普遍存在，并能

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