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第一章1.1何谓生化分离技术的集成化概念？请举例加以说明。
1) 利用已有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成);2) 或把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标；例子⑪多种分离、纯化技术相结合，包括新、老技术的相互渗透与融合，形成所谓融合技术；⑫生化分离技术（下游技术）与发酵工艺（上游技术）相结合或称耦合，形成系统工程；
1.2说明生化分离的主要步骤并指出胞内产物和胞外产物的分离纯化流程不同之处
①材料及处理来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少②目的物的提取状态释放出来，方法与存在部位及状态有关③分离纯化性质及具体条件定④浓缩，结晶，干燥⑤保存（收率、纯度）（胞内外的区别就是在于破壁）
2.1 ①胞捣碎法，原理：机械运动产生剪切力 适用于动植物组织
用高压使细胞悬浮液通过针型阀，适用于：较柔软、 适用于细菌（G-） （细菌病毒等热不敏感的物质）适用于不稳定的酶）⑨化学法，1、 溶剂处理法 质化合物，使细胞结构破坏。2细胞膜而破碎细胞，释放目的物。 1．自溶法，将欲破碎细胞在一定条件（pH、T内物质释放。 2．外加酶法 加溶菌酶（结合反复冻融或加β-葡聚糖酶 霉菌：添加几丁质酶 植物材料： 多种破碎方法相结合㈡ 与上游过程相结合㈢ 与下游过程相结合(如:,发酵生产A蛋白。通常A蛋白结合于菌体胞壁上,需要进行细胞破碎,,过程繁琐,难度大。若用生物技术培养出A蛋白分泌型菌来生产,A.)
2.2
P8，回收率和纯度考虑。纯酶的分级范围比粗酶宽在采用盐析时更注重回收率，可以适当加宽分级范围，而粗酶
?
⑪ 温度尽可能低；⑫ 提取液的量要保证“充分浸入”；⑬ 加入足量酚类吸附剂；（天然清蛋白，合成聚丙乙烯）⑭ 加入足量氧化酶抑制剂； 2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，又是醌的清除剂；⑮ 搅拌转速要恰当；⑯ pH要控制在合适范围，一般5.5～7
2.4、分离技术的主要种类：细胞破碎 (cell disruption)沉淀分离(precipitation膜过滤(membrane filtration) 层析分离(chromatography) 电泳分离(electrophoresis) 离心分离（centrifugation）1形状和大小 ： 凝胶过滤、超滤、透析⑫电离性质 离交色谱、电泳（除SDS）⑬极性（疏水性） 分配、吸附、疏水色谱⑭生物功能或特殊化学
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基团 亲和色谱⑮等电点pI 色谱聚焦、电聚焦⑯溶解性 盐析、有机溶剂提取、结晶⑰密度、大小 超离心 SDS-凝胶电泳
2.5怎样选择细胞破碎的方法？总原则：最大提取、不易变性、减少干扰
具体须从材料特性和目的物特性综合考虑 。1．材料细胞的特性 动物细胞易破碎，只需用温和方法 植物细胞较难破碎，须用中等或强度大的方法，微生物细胞较复杂，一般用较强方法2.目的物的特性⑪ 细胞中的位置 游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。 结合状：可能结合在膜或细胞器内 需先收集膜或细胞器，再破碎 ⑫ 敏感性 温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响 ⑬ 处理量 有些处理量少，如超声波破碎等。
3.1膜分离1、何谓“浓度极化”现象，怎样避免膜过滤中的“浓度极化”现象？
浓差极化 concentration polarization 被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度的现象。是指在超滤过程中， 溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。 透过膜，引起膜表面附近的溶液浓度升高，
(1)增高流速 线速度，其中也包括采用层流薄层流道法。(2)的小球放入被处理的流体中，而言，加填料的方法是不适宜的。(3)装设油液促进器 所谓湍流促进器一般是指可强化流态的多种障碍物，内部可安装螺旋挡板，对板式或卷 ，这些湍流促进 器的效果很好。 (4)脉冲法 主脉冲的振幅和频率25---50%，但是，换来了透过速度提高了70%的得益，特别是在测试装置中必定使用的一种也可以和在磁力搅拌器上回转使用，试验表明，传质(6) 为防止反渗透膜结垢，某厂过去曾以加硫酸或盐酸调节PHPTP-0100的高效阻
3.2种类 据材质分成：1）有机微滤膜， 具韧2 无机陶瓷膜具备化学稳定性好、机械强度大、抗污染能力强、 3）复合微滤膜 1）2）通过不同的工艺手段实现有机3）将微滤膜技术与生物处理法相结合的新型复合式膜生物反应器(IMBR) 分离机理 筛分，膜将尺寸大于孔径的颗粒截留。(2) 吸附，膜将尺寸小于孔径的颗粒吸附截留。
(3) 架桥，固体颗粒在膜微孔入口处因架桥而被截留。(4) 网络，截留发生在膜内部，因膜孔的曲折而形成。(5) 静电，分离悬浮液带电颗粒时，可采用带相反电荷的微滤膜。能用孔径比待分离的颗粒尺寸大许多的微滤膜，不仅可达到较好的分离效果，还可获较高通量。
3.3、膜选择和使用时考虑的主要参数是什么？影响流率的主要因素是什么？
不管微滤、超滤还是纳滤，选择时，一般应注意以下指标。⒈截留分子量---指截流率达90%以上的
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最小被截留物质的分子量。（以球形分子测）*一般选用的膜的额定截留值应稍低于所分离或浓缩的溶质分子量。2.流动速率--- 指在一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量。(ml/cm2.min) 。 其它还有操作温度、化学耐受性、膜的吸附性能、膜的无菌处理等等。
影响流率的因素：⒈溶质的分子性质，比重大的纤维分子扩散性差， 比重较小的球形分子易扩散 ⒉溶质浓度：一定压力下，稀比浓流率高； ⒊压力：不同溶质应选择不同的操作压力；⒋搅拌：加快扩散，减少浓度极化，提高流率；*对切力敏感的大分子（酶、核酸）须控制搅拌速度; ⒌温度：升温能提高流率（不同溶质区别对待）; ⒍其它：如溶液pH、离子强度及溶剂因素等对流率均有影
链RNA、杂链RNA、双链DNA，为什么？DNA与羟基磷灰石的相互作用基于DNA磷酸酯骨架与羟基磷灰石中的钙离子间的作用。洗脱时用磷酸缓冲液，核酸分子的亲和性受其分子中磷酸集团的控制。单链rNA分子的结构可变无序，它与刚性有序的双链DNA分子相比，亲和力要小。杂交的双链DNA及部分变性的DNA分子的亲和力适中。因此单链DNA分子结合弱，结合的双链DNA分子可以通过增加磷酸洗脱缓冲液的浓度使之解离。
胶过滤层析5.1、名词解释1）排阻极限 用A类分子中最小分子量表示Mwamin2）分级范围 实
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际是B类分子的分子量范围 3）死体积4）外水体积(V0) 间隙液体体积5）内水体积(Vi) 孔隙体积
5.2、Kd的意义是什么？为什么它一般在0和1之间，大于1和小于0的反常情况可能是什么原因？怎样处理？Kd 是分配系数=固定相溶质的浓度/流动相溶质的浓度 ， A类分子只走外水体积，所以Kd=0 ;C类分子走所有的外水体积和内水体积 Kd = Ve —V0/ Vi所以Kd大于0小于1. 溶质洗脱的异常 ⑪. Kd〈0 因装柱不好，发生沟流（短路） ⑫. Kd〉1 凝胶对溶质分子可能有吸附作用
5.3、请判断分子量为1千和3千的一组分子，或分子量为8万和10G-75柱中分开？为什么？
因为sephadeG-75的分离范围为10000到50000
5.4么？
但是以上三种大分子物质的结构不同，蛋白走的快，因此分离的最后效果，所以不能直
5.5Vi 要大⑫亲水 ⑬惰性。 ⑭稳定 ⑮色谱性能好
填料有以下几种：
1.交联葡聚糖（sephadex）dextranα-1,6糖苷键 （约95%）分支：α-1,3糖苷键（约5% ，特点：化学稳定性较好PH范围为2~12，在强酸下凝聚糖苷键易水解，热稳定性较好，可以高压灭菌。使用范围：总的工作范围为分子量。
2、聚丙烯酰胺（bio-gelp-x甲叉双丙烯酰胺铰链而成，其中x为2~300，x=工作范围/1000.特点：稳定2~11sephadex相同，总工作范围为100~40万。吸附性：I>0.02
3甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基右旋糖苷 形成的凝胶，较2~11较Sephadex 抗压 色谱性能 作范围：1000～7亿 吸附性： I 〉 4-D半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线性多聚糖糖浓度、4B…表示糖浓2%… Bio-Gel A 0.5～150M 表示工作范围上限 4.5~9.0，抗热性差，抗压性好，总工作范围：103～4×107 吸附性： 需I5、. 2,3—二溴丙醇或环氧氯丙烷进行交联㈡.稳定性 ⒈化性： pH 3～14 ⒉.色谱性能 1.工作范围： 同Sepharose ⒉吸附性： 下降
6、一种具高分辨率，高机械强度，很宽分级范围的新型凝胶过滤介质，是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的，适合于组分分子量差异较大的混合物的分离。Superose具体特点：⑪. 机械和物理稳定性很好，适合于高速分离过程，即使用高粘度的洗脱剂如8mol/L尿素仍能保持较高的流速，在pH7，121℃反复高压灭菌不会对凝胶结构产生明显影响;
⑫.化学稳定性也很好，能够耐受0.2mol/L的NaOH，0.01mol/L的盐酸，1mol/L的醋酸，去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素和6mol/L盐酸胍等。
7、 Superdex颗粒很小且均匀，柱效非常高，很高的流速下仍能获得非常高的分辨率；物理稳定性良好，pH7条件下能承受高压灭菌； pH稳定性良好，清洗时（短程）可暴露在极端pH（1～14）
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下而不会对层析行为产生影响；凝胶的分离行为不受去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍的影响。该介质同样能在有机溶剂中使用。
5.6、请按凝胶层析流程顺序分析说明主要操作要点。
实验设计的总的要求：高分辨率、回收率高、减少稀释、短时间、最好保证样品为组别分离，已知目的物的Mw ：原则：选斜率大即 Kd大，效果好； 选排阻极限低的凝胶，可早些洗出。 未知目的物的Mw 先用中等工作范围的，再据结果进行选择。样品的浓度＜70mg/ml ；离子强度；综合考虑种种因素：分级分离时，Vs一般选1～3% Vt； 组别分离时，Vs可选30%15～20% Vt ；据样品量确定 分级分离： Vt = 30～100 Vs 组别分离： Vt = 3～6 VsH/D可选择在30～100 ； 组别分离：H/D 相对可低些。H/D 但流速大； H/D 大，抗流变性好，区带不易发生崎变但流速小。洗脱剂 选择 洗脱剂应与平衡液一致，以免体积变化； 吸附较强的，调节pH需冷冻干燥的，选挥发性盐类； 对脱盐操作，可选用蒸馏水；流速 纵向扩散增加
Gel的选择和准备1. 凝胶溶涨
一般湿胶∶洗脱剂（v/v）=3∶1 g）＝πr2h / 膨胀度（床体积mL/g干胶）⒉倾析 ⒊ 一般控制沉积体积为总体积70～75% ⒋ 脱气
仪器的准备装柱：要求：均匀、无裂缝、无气泡、 安柱 充填 平衡 检验**对软胶，装前须先校对操作压力！
加样：要求： 不能干扰Gel沉淀表面 洗脱 速控制
收集、检测 紫外连续检测 清洗 若被脂肪污染，可用0.1～0.5mol/LNaOH（除Sepharose） 须加化学试剂防腐，0.02～0.05%的叠氮钠
离子交换层析
6.1要？
α，效率n，和 k′
容量因子三个参数。
容量因子k′注意不要将其与离子交换剂的吸附容量（k′的取值与蛋白质在固定相（离子交换须满足以下条件：
（112时α＝1，两峰完全重叠，分辨率为0），α的值越大，两峰相距越远，2
）k′＝0，无法实现分离，分辨率为0，需选合适层析条件，使至少一种蛋白质在离k ′≠0，增加k′的值将提高分辨率RS，有利于分离。
6.2
㈠.柱尺寸（H/D）;连续梯度：H/D 4～5；阶段式梯度：H/D1～2；㈡. 充填；㈢. 平衡：2～3Vt始缓平衡，测定电导、pH是否平衡完毕：目的：①.床体积稳定②.流出液pH、I一致
样品 ； 测完后清洗
6.3、离子交换剂由哪几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂？
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离子交换剂是离子交换技术的核心和基础： 基质+功能基团+平衡离子 离子交换时平衡离子发生交换 为阴离子，是阴离子交换剂 ；为阳离子，是阳离子交换剂
6.4、弱酸性和弱碱性的离子交换剂分别适宜在哪些pH范围内使用？为什么？
强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽；弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小；弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱；弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱。流动相的酸度：离子交换树脂就是固体酸碱，对于强型而言pH型则显著。强酸型阳离子，pH>2；弱酸型阳离子，pH>6；强碱型阴离子，pH
6.5、已知目标蛋白是分子量约200,000，等电点为6.8，pH稳定范围在选择离子交换剂并设定层析条件？10万-20万 用SepharoseCM(pH3.5-6)，流动相的ph5,流速 1cm/min
6.6NaCl终浓度为1mol/L，如何根据此层析结果优化层析条件？（*
亲和层
7.1、试
特异性
洗脱的析 比较亲和层析的洗脱和非特异性优缺点。
（1）.上样 亲和层析柱一般很短，通常10cm左 pH、离子强度、温度等，以使一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢，所以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。杂质较多时，可以在上样后停止流动，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。另外样品缓冲液中配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。生物分子间的通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以选择适当较低的温度，能够充分的结合；而在后面的洗脱过程可以选择适当较高以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。上样后平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显
（2）.洗脱：亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。
（1）特异性洗脱 特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。特异性洗脱也可以分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，
如这
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种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。后一种方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择NAD+进行洗脱，NAD+是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与NAD+结合而从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强，从而得到较高的分辨率。另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况，较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性，才能够洗脱下来，使用特异性洗脱则可以避免这种情况。性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件，物质洗脱、加大洗脱液浓度等等，来缩小洗脱时间和洗脱体积。
（2）非特异性洗脱
非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH和力而将待分离物质洗脱下来。离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，强时，可以通过选择适当的pH要在实验中摸索。可以选择梯度洗脱方式，如果希望得到较高浓度的待分离物质，这样在较小的对于待分离物质与配体结合非常牢固时，胍等变性剂使蛋白质
7.2手臂”？
“或具氨基、羧基的亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大） ⑪ 分离物质分子量大小 ⑫ 亲和势大小 ⑬ 过长6-氨基己酸、1,6-己二胺和3,3’-二氨基二丙胺。
7.3
一、要求 ㈠. L-S结合无干扰； ㈡. L为小分子有的需“手臂”，使L-S结 合. 以免吸附杂质；L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。二、 偶 ㈠. L上可供偶联的基团㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH 三、 由CNBr 商品名：CNBr-Sepharose
㈠ 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子
㈡. 注意： 前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH
㈢. 偶联后有部分氰酸酯未偶联上L，常利用 含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其掩蔽。
㈣. 洗去未结合L 用高-低交叉pH来洗（4～5次）
7.4、亲和层析的特殊类型有哪些？简述它们的基本原理和应用范围
一、 共价色谱:利用形成和破坏共价键能力的差异分离,其共价键常为二硫键—S-S—,主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽。二、金属螯合色谱原理：His Cys Trp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。原理：蛋白质分子表面的组氨酸咪唑基、半
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胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物 四、有机染料亲和色谱：有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力五 凝集素亲和层析：凝集素是一类来自于霉菌、植物和动物的蛋白质，能可逆地、选择性地同特定的糖残基结合；不同的凝集素结合不同的糖分子用于分离含糖基的化合物，如多糖、糖蛋白、糖脂、细胞内颗粒、细胞等
反相层析
8.1、简要说明反相层析的原理，并解释何谓疏溶剂理论（solvophobic theory）。
基于溶质分子与固定相中键合在基质上的疏水性配基间的疏水相互作用 论来解释。于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的非极性配基上，间不存在其他任何相互作用。
8.2、何谓“亲硅醇基效应”（silanophilic interaction）？ ; ;
硅胶表面均匀覆盖非极性配基，对残余硅醇基屏蔽，新型反相层
8.3反向层析的优化①层析过程中PH 。反相层析多数在低pHpH
②p143)，可同时起维持流动相pH的作用。或10~100mmol/L。往流动相中添加离子对试剂可对于带正电荷的溶质应选择带负电荷的离子
③因具较小的颗粒直径，普遍有较高的柱效；（硅胶有高ph应用最广泛的基质是硅胶 开发新的更分离的规模及对分辨率的要求、流动相条件：待分离物分子量，样品组分的疏水性质决定采用何种配基；分离的规模及对分 ；反相层析时的流动相 ④层析柱的尺寸由内径和柱长所界定，其取值主要取其中内径的取值与分离规模相关，而柱长和分辨率之间则存在一 ，人们可据所选预装柱平衡后可直接使用；层析柱的平衡 A对层析柱进行充分的平衡。⑤乙腈和甲醇是最常用的，条件摸索阶段以其中一种作为修饰剂，溶质在固定相上吸附较为牢固时，可考虑更换洗脱能力较强的修饰剂如异丙醇等；溶质分子，特别是蛋白质等生物大分子在所用溶剂中的稳定性是须考虑的因素；分离样品性质不明的情况下，一般流动相A为水相，不含修饰剂，而流动相B为100%有机相；
⑥样品的处理理想情况下应将样品溶于流动相A后加样，如样品在流动相A中溶解不好，可考虑添加有机酸、盐类等试剂来增加样品的溶解性；样品在加样前应当通过10000g离心10min或用0.22μm微孔滤膜过滤除去任何可能存在的颗粒物；反相层析柱通常是预装柱或带有可调接头的自装柱，连接于HPLC系统，加样操作按HPLC系统提供的标准进行。
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⑦洗脱模式的选择和条件控制在洗脱模式方面，反相层析和离子交换等层析技术具相似性，分为阶段洗脱和梯度洗脱；
⑧样品的检测和收集和其他层析技术一样，反相层析中最常用的也是紫外检测（很多情况下，有机溶剂或添加剂等的存在总会对样品的检测产生一定的影响 ）对于能产生荧光的物质，使用荧光监测器往往比紫外检测有更高的选择性和灵敏度。此外，视差折光检测器、电导检测器等也都能用于层析样品的在线检测。⑨层析柱的再生、清洗和贮存再生常用2～5个柱体积的流动相B流经层析柱移去残留在层析柱上的物质；清洗常运行线性梯度从0.1%TFA到0.1%TFA异丙醇，再几个柱体积的0.1%TFA异丙醇溶液，最后运行线性梯度从0.1%TFA异丙醇溶液重新回到水溶液；基于硅胶的介质常保存在纯的甲醇中，基于聚苯乙烯的介质常保存在甲醇或20% 8.4、试解释线性梯度洗脱的反相层析中溶质得到浓缩的机理
疏水层析
9.1
介质：在HPLC孔径小的基质甚至非孔型基质
HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4～C8π-π 。 A中基本一致，并调节样品溶液的pHHIC对于稀释样品无需浓缩可以直接加样 流动相A与流动相B流动相ApH ，盐的种类和浓度的选择： 缓冲液种类据所需的pH选择，0.01~0.05mol/L； 不同盐类对疏水作用的强度有(NH4)2SO4常用0.75～2mol/L，NaCl为1～B为不含盐的缓冲液，缓冲液与流动相A一致
9.2
原理： 反响层析：基于溶质分子与固定相中 ，疏溶剂理论假设反相层析介质是表面均匀密集的溶质分子由于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的非
C8以下，
-有机溶剂体系中具有良好稳HIC过程洗脱条件温和，通常降低洗脱剂的盐浓度就能达到目的，在蛋白质的纯化中有较广泛的应用。
电泳
10.1、简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的主要方法和特点并说明影响聚合的主要因素。
所用原料：丙烯酰胺Acr,双丙烯酰胺Bis
1.化学聚合法：催化剂，过硫酸铵（AP）加速剂，NNNN-四甲基乙二胺（TEMED） 影响聚合的
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因素：⑪.O2会淬灭自由基，所以需脱气；
⑫.加速剂叔胺处在自由碱基状态，需高pH; ⑬.温度t t ↓ 慢 t ↑ 快 ⑭.避免不纯物的影响：有机玻璃、赤血盐（铁氰化钾）等会造成无法聚合。
2 .光聚合法，VB2 光解 无色基 02 自由基 引发聚合 常采用来制备大孔胶
10.2、等电聚焦IEF的主要原理是什么？为什么等电聚焦过程一般都采用高电压、恒功率方式？ 原理：在一种特殊的两性电解质两端施加直流电场，可形成线性的pH梯度。利用Pr的pI差别，可在其上不同处聚焦分离。
聚焦在pH0.01范围， 所以分辨率很高。
特点：高电压，地电流，冷却
原因：等电聚焦电泳中，通常采用恒功率方式。 流的乘积，所以为加快分离，提高分辨率, 的冷却系统、载体两性电解质的导电性和pH、凝胶介质及样品的质量、。恒功率，在最后有个安全区。
10.3、请比较Native PAGE 与SDS-PAGE 。
一、常规的PAGE缓冲液系统：
⑪ pH决定 生物分子溶解性、稳定性、 酸性蛋白质——阳极电泳（pH8.0～
碱性蛋白质——阴极电泳（pH4.0左右 三种不连续系统：高pH系统（9.5、8.9）
“中性”pH系统（8.0） 低pH5.5、4.83.6）
⑫ 离子强度 一般控制在7.5%的均匀胶，理想的Rf范围在0.25～0.85之间；
测定蛋白质分子量：天然
具体方法： 质分子，直线的斜率为阻滞系数；用已知分子量的蛋白质得到一条直线，在此直线上根据未知蛋白质的阻滞系数可查得它的分子量。 二、 十二烷基硫酸钠 CH3(CH2)11OSO3Na
原理：
的还原剂，打开Pr分子二硫键
Pr-SDS复合物
.Pr电荷密度相同⑫.球状 Pr 变成雪茄状，长轴∝MW（3）（长轴）有关。
注意：的加量：一般10gSDS/gPr 2. Gel浓度 3.多亚基的Pr……
SDS凝胶分离高分子化合物后失活，需要进行生物活性的修复从蛋白中去除SDS，许多蛋白可恢复活性或局部恢复活性，其影响因素为：①SDS纯度；②蛋白酶；③二硫键；④其它：去除速度、辅因子、DTT等（胶中进行，局限于单肽链或亚基相同）
SDS凝胶分为，连续电泳，和不连续电泳均匀胶，不连续电泳梯度胶。
10.4、归纳凝胶电泳技术中检测条带的主要染色方法和特点，分析条带变形的主要原因。 一、(1)考马斯亮蓝染色 分为R-250和G-250，常用R-250染色后颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系，在一定pH值时，蛋白质-染料复合物又可解聚 染色灵敏度达0.2~0.5 g/带
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(2)银染色 先固定，蛋白带上的AgNO3被还原成金属Ag而沉积在蛋白带上而显色，显色有化学显色和光显色 ，敏度达2ng/带
(3)其他染色方法 荧光染料法、苯胺黑、氨基黑、丽春红S、快绿FCF，蛋白质与2,4-DNFB的反应 等等二、条带在试验操作不当时会出现异常现象，
①“微笑”现象常在厚胶和垂直电泳中出现，原因：凝胶中间冷却不均匀；②“皱眉”原因 （垂直电泳中可能出现） 电泳装置不合适，靠近隔板处凝胶未聚合完全或凝胶底部有气泡。③原因：样品溶解不佳，凝胶浓度过高。克服：加样前离心，选合适缓冲液，加增溶辅助试剂，“纹理”现象原因：常常是样品中不溶颗粒造成的克服：增加溶解度，离心除不溶颗粒
10.5、常用测定蛋白质分子量的方法有哪些？（手写板第③页）
①sds-page ②天然PAGE: ③凝胶过滤色谱：有效分配系数Kav或Ve离天然非变性的蛋白质分子分子量，且不受带点和量的影响。
④超速离心在离心力场中，沉降系数，
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第一章1.1何谓生化分离技术的集成化概念？请举例加以说明。
1) 利用已有的和新近开发的生化分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成);2) 或把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标；例子⑪多种分离、纯化技术相结合，包括新、老技术的相互渗透与融合，形成所谓融合技术；⑫生化分离技术（下游技术）与发酵工艺（上游技术）相结合或称耦合，形成系统工程；
1.2说明生化分离的主要步骤并指出胞内产物和胞外产物的分离纯化流程不同之处
①材料及处理来源丰富，含量相对较高，杂质尽可能少②目的物的提取状态释放出来，方法与存在部位及状态有关③分离纯化性质及具体条件定④浓缩，结晶，干燥⑤保存（收率、纯度）（胞内外的区别就是在于破壁）
2.1 ①胞捣碎法，原理：机械运动产生剪切力 适用于动植物组织
用高压使细胞悬浮液通过针型阀，适用于：较柔软、 适用于细菌（G-） （细菌病毒等热不敏感的物质）适用于不稳定的酶）⑨化学法，1、 溶剂处理法 质化合物，使细胞结构破坏。2细胞膜而破碎细胞，释放目的物。 1．自溶法，将欲破碎细胞在一定条件（pH、T内物质释放。 2．外加酶法 加溶菌酶（结合反复冻融或加β-葡聚糖酶 霉菌：添加几丁质酶 植物材料： 多种破碎方法相结合㈡ 与上游过程相结合㈢ 与下游过程相结合(如:,发酵生产A蛋白。通常A蛋白结合于菌体胞壁上,需要进行细胞破碎,,过程繁琐,难度大。若用生物技术培养出A蛋白分泌型菌来生产,A.)
2.2
P8，回收率和纯度考虑。纯酶的分级范围比粗酶宽在采用盐析时更注重回收率，可以适当加宽分级范围，而粗酶
?
⑪ 温度尽可能低；⑫ 提取液的量要保证“充分浸入”；⑬ 加入足量酚类吸附剂；（天然清蛋白，合成聚丙乙烯）⑭ 加入足量氧化酶抑制剂； 2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)及二硫赤藓糖醇(DTE)是常用的抗氧化剂，又是醌的清除剂；⑮ 搅拌转速要恰当；⑯ pH要控制在合适范围，一般5.5～7
2.4、分离技术的主要种类：细胞破碎 (cell disruption)沉淀分离(precipitation膜过滤(membrane filtration) 层析分离(chromatography) 电泳分离(electrophoresis) 离心分离（centrifugation）1形状和大小 ： 凝胶过滤、超滤、透析⑫电离性质 离交色谱、电泳（除SDS）⑬极性（疏水性） 分配、吸附、疏水色谱⑭生物功能或特殊化学
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基团 亲和色谱⑮等电点pI 色谱聚焦、电聚焦⑯溶解性 盐析、有机溶剂提取、结晶⑰密度、大小 超离心 SDS-凝胶电泳
2.5怎样选择细胞破碎的方法？总原则：最大提取、不易变性、减少干扰
具体须从材料特性和目的物特性综合考虑 。1．材料细胞的特性 动物细胞易破碎，只需用温和方法 植物细胞较难破碎，须用中等或强度大的方法，微生物细胞较复杂，一般用较强方法2.目的物的特性⑪ 细胞中的位置 游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。 结合状：可能结合在膜或细胞器内 需先收集膜或细胞器，再破碎 ⑫ 敏感性 温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响 ⑬ 处理量 有些处理量少，如超声波破碎等。
3.1膜分离1、何谓“浓度极化”现象，怎样避免膜过滤中的“浓度极化”现象？
浓差极化 concentration polarization 被截留于膜表面，并逐渐形成浓度梯度的现象。是指在超滤过程中， 溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。 透过膜，引起膜表面附近的溶液浓度升高，
(1)增高流速 线速度，其中也包括采用层流薄层流道法。(2)的小球放入被处理的流体中，而言，加填料的方法是不适宜的。(3)装设油液促进器 所谓湍流促进器一般是指可强化流态的多种障碍物，内部可安装螺旋挡板，对板式或卷 ，这些湍流促进 器的效果很好。 (4)脉冲法 主脉冲的振幅和频率25---50%，但是，换来了透过速度提高了70%的得益，特别是在测试装置中必定使用的一种也可以和在磁力搅拌器上回转使用，试验表明，传质(6) 为防止反渗透膜结垢，某厂过去曾以加硫酸或盐酸调节PHPTP-0100的高效阻
3.2种类 据材质分成：1）有机微滤膜， 具韧2 无机陶瓷膜具备化学稳定性好、机械强度大、抗污染能力强、 3）复合微滤膜 1）2）通过不同的工艺手段实现有机3）将微滤膜技术与生物处理法相结合的新型复合式膜生物反应器(IMBR) 分离机理 筛分，膜将尺寸大于孔径的颗粒截留。(2) 吸附，膜将尺寸小于孔径的颗粒吸附截留。
(3) 架桥，固体颗粒在膜微孔入口处因架桥而被截留。(4) 网络，截留发生在膜内部，因膜孔的曲折而形成。(5) 静电，分离悬浮液带电颗粒时，可采用带相反电荷的微滤膜。能用孔径比待分离的颗粒尺寸大许多的微滤膜，不仅可达到较好的分离效果，还可获较高通量。
3.3、膜选择和使用时考虑的主要参数是什么？影响流率的主要因素是什么？
不管微滤、超滤还是纳滤，选择时，一般应注意以下指标。⒈截留分子量---指截流率达90%以上的
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最小被截留物质的分子量。（以球形分子测）*一般选用的膜的额定截留值应稍低于所分离或浓缩的溶质分子量。2.流动速率--- 指在一定压力下每分钟通过单位面积膜的液体量。(ml/cm2.min) 。 其它还有操作温度、化学耐受性、膜的吸附性能、膜的无菌处理等等。
影响流率的因素：⒈溶质的分子性质，比重大的纤维分子扩散性差， 比重较小的球形分子易扩散 ⒉溶质浓度：一定压力下，稀比浓流率高； ⒊压力：不同溶质应选择不同的操作压力；⒋搅拌：加快扩散，减少浓度极化，提高流率；*对切力敏感的大分子（酶、核酸）须控制搅拌速度; ⒌温度：升温能提高流率（不同溶质区别对待）; ⒍其它：如溶液pH、离子强度及溶剂因素等对流率均有影
链RNA、杂链RNA、双链DNA，为什么？DNA与羟基磷灰石的相互作用基于DNA磷酸酯骨架与羟基磷灰石中的钙离子间的作用。洗脱时用磷酸缓冲液，核酸分子的亲和性受其分子中磷酸集团的控制。单链rNA分子的结构可变无序，它与刚性有序的双链DNA分子相比，亲和力要小。杂交的双链DNA及部分变性的DNA分子的亲和力适中。因此单链DNA分子结合弱，结合的双链DNA分子可以通过增加磷酸洗脱缓冲液的浓度使之解离。
胶过滤层析5.1、名词解释1）排阻极限 用A类分子中最小分子量表示Mwamin2）分级范围 实
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际是B类分子的分子量范围 3）死体积4）外水体积(V0) 间隙液体体积5）内水体积(Vi) 孔隙体积
5.2、Kd的意义是什么？为什么它一般在0和1之间，大于1和小于0的反常情况可能是什么原因？怎样处理？Kd 是分配系数=固定相溶质的浓度/流动相溶质的浓度 ， A类分子只走外水体积，所以Kd=0 ;C类分子走所有的外水体积和内水体积 Kd = Ve —V0/ Vi所以Kd大于0小于1. 溶质洗脱的异常 ⑪. Kd〈0 因装柱不好，发生沟流（短路） ⑫. Kd〉1 凝胶对溶质分子可能有吸附作用
5.3、请判断分子量为1千和3千的一组分子，或分子量为8万和10G-75柱中分开？为什么？
因为sephadeG-75的分离范围为10000到50000
5.4么？
但是以上三种大分子物质的结构不同，蛋白走的快，因此分离的最后效果，所以不能直
5.5Vi 要大⑫亲水 ⑬惰性。 ⑭稳定 ⑮色谱性能好
填料有以下几种：
1.交联葡聚糖（sephadex）dextranα-1,6糖苷键 （约95%）分支：α-1,3糖苷键（约5% ，特点：化学稳定性较好PH范围为2~12，在强酸下凝聚糖苷键易水解，热稳定性较好，可以高压灭菌。使用范围：总的工作范围为分子量。
2、聚丙烯酰胺（bio-gelp-x甲叉双丙烯酰胺铰链而成，其中x为2~300，x=工作范围/1000.特点：稳定2~11sephadex相同，总工作范围为100~40万。吸附性：I>0.02
3甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基右旋糖苷 形成的凝胶，较2~11较Sephadex 抗压 色谱性能 作范围：1000～7亿 吸附性： I 〉 4-D半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线性多聚糖糖浓度、4B…表示糖浓2%… Bio-Gel A 0.5～150M 表示工作范围上限 4.5~9.0，抗热性差，抗压性好，总工作范围：103～4×107 吸附性： 需I5、. 2,3—二溴丙醇或环氧氯丙烷进行交联㈡.稳定性 ⒈化性： pH 3～14 ⒉.色谱性能 1.工作范围： 同Sepharose ⒉吸附性： 下降
6、一种具高分辨率，高机械强度，很宽分级范围的新型凝胶过滤介质，是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的，适合于组分分子量差异较大的混合物的分离。Superose具体特点：⑪. 机械和物理稳定性很好，适合于高速分离过程，即使用高粘度的洗脱剂如8mol/L尿素仍能保持较高的流速，在pH7，121℃反复高压灭菌不会对凝胶结构产生明显影响;
⑫.化学稳定性也很好，能够耐受0.2mol/L的NaOH，0.01mol/L的盐酸，1mol/L的醋酸，去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素和6mol/L盐酸胍等。
7、 Superdex颗粒很小且均匀，柱效非常高，很高的流速下仍能获得非常高的分辨率；物理稳定性良好，pH7条件下能承受高压灭菌； pH稳定性良好，清洗时（短程）可暴露在极端pH（1～14）
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下而不会对层析行为产生影响；凝胶的分离行为不受去污剂如1%SDS，促溶盐类，变性剂如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍的影响。该介质同样能在有机溶剂中使用。
5.6、请按凝胶层析流程顺序分析说明主要操作要点。
实验设计的总的要求：高分辨率、回收率高、减少稀释、短时间、最好保证样品为组别分离，已知目的物的Mw ：原则：选斜率大即 Kd大，效果好； 选排阻极限低的凝胶，可早些洗出。 未知目的物的Mw 先用中等工作范围的，再据结果进行选择。样品的浓度＜70mg/ml ；离子强度；综合考虑种种因素：分级分离时，Vs一般选1～3% Vt； 组别分离时，Vs可选30%15～20% Vt ；据样品量确定 分级分离： Vt = 30～100 Vs 组别分离： Vt = 3～6 VsH/D可选择在30～100 ； 组别分离：H/D 相对可低些。H/D 但流速大； H/D 大，抗流变性好，区带不易发生崎变但流速小。洗脱剂 选择 洗脱剂应与平衡液一致，以免体积变化； 吸附较强的，调节pH需冷冻干燥的，选挥发性盐类； 对脱盐操作，可选用蒸馏水；流速 纵向扩散增加
Gel的选择和准备1. 凝胶溶涨
一般湿胶∶洗脱剂（v/v）=3∶1 g）＝πr2h / 膨胀度（床体积mL/g干胶）⒉倾析 ⒊ 一般控制沉积体积为总体积70～75% ⒋ 脱气
仪器的准备装柱：要求：均匀、无裂缝、无气泡、 安柱 充填 平衡 检验**对软胶，装前须先校对操作压力！
加样：要求： 不能干扰Gel沉淀表面 洗脱 速控制
收集、检测 紫外连续检测 清洗 若被脂肪污染，可用0.1～0.5mol/LNaOH（除Sepharose） 须加化学试剂防腐，0.02～0.05%的叠氮钠
离子交换层析
6.1要？
α，效率n，和 k′
容量因子三个参数。
容量因子k′注意不要将其与离子交换剂的吸附容量（k′的取值与蛋白质在固定相（离子交换须满足以下条件：
（112时α＝1，两峰完全重叠，分辨率为0），α的值越大，两峰相距越远，2
）k′＝0，无法实现分离，分辨率为0，需选合适层析条件，使至少一种蛋白质在离k ′≠0，增加k′的值将提高分辨率RS，有利于分离。
6.2
㈠.柱尺寸（H/D）;连续梯度：H/D 4～5；阶段式梯度：H/D1～2；㈡. 充填；㈢. 平衡：2～3Vt始缓平衡，测定电导、pH是否平衡完毕：目的：①.床体积稳定②.流出液pH、I一致
样品 ； 测完后清洗
6.3、离子交换剂由哪几部分组成？何为阳离子和阴离子交换剂？
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离子交换剂是离子交换技术的核心和基础： 基质+功能基团+平衡离子 离子交换时平衡离子发生交换 为阴离子，是阴离子交换剂 ；为阳离子，是阳离子交换剂
6.4、弱酸性和弱碱性的离子交换剂分别适宜在哪些pH范围内使用？为什么？
强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽；弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小；弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱；弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱。流动相的酸度：离子交换树脂就是固体酸碱，对于强型而言pH型则显著。强酸型阳离子，pH>2；弱酸型阳离子，pH>6；强碱型阴离子，pH
6.5、已知目标蛋白是分子量约200,000，等电点为6.8，pH稳定范围在选择离子交换剂并设定层析条件？10万-20万 用SepharoseCM(pH3.5-6)，流动相的ph5,流速 1cm/min
6.6NaCl终浓度为1mol/L，如何根据此层析结果优化层析条件？（*
亲和层
7.1、试
特异性
洗脱的析 比较亲和层析的洗脱和非特异性优缺点。
（1）.上样 亲和层析柱一般很短，通常10cm左 pH、离子强度、温度等，以使一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢，所以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。杂质较多时，可以在上样后停止流动，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。另外样品缓冲液中配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。生物分子间的通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以选择适当较低的温度，能够充分的结合；而在后面的洗脱过程可以选择适当较高以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。上样后平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显
（2）.洗脱：亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。
（1）特异性洗脱 特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。特异性洗脱也可以分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，
如这
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种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。后一种方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择NAD+进行洗脱，NAD+是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与NAD+结合而从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强，从而得到较高的分辨率。另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况，较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性，才能够洗脱下来，使用特异性洗脱则可以避免这种情况。性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件，物质洗脱、加大洗脱液浓度等等，来缩小洗脱时间和洗脱体积。
（2）非特异性洗脱
非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH和力而将待分离物质洗脱下来。离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，强时，可以通过选择适当的pH要在实验中摸索。可以选择梯度洗脱方式，如果希望得到较高浓度的待分离物质，这样在较小的对于待分离物质与配体结合非常牢固时，胍等变性剂使蛋白质
7.2手臂”？
“或具氨基、羧基的亲水性手臂（其长短对吸附的影响不大） ⑪ 分离物质分子量大小 ⑫ 亲和势大小 ⑬ 过长6-氨基己酸、1,6-己二胺和3,3’-二氨基二丙胺。
7.3
一、要求 ㈠. L-S结合无干扰； ㈡. L为小分子有的需“手臂”，使L-S结 合. 以免吸附杂质；L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。二、 偶 ㈠. L上可供偶联的基团㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH 三、 由CNBr 商品名：CNBr-Sepharose
㈠ 用1mol/L HCl 溶胀洗涤除细碎粒子
㈡. 注意： 前处理、偶联密度、缓冲液种类及pH
㈢. 偶联后有部分氰酸酯未偶联上L，常利用 含-NH2的缓冲液或含-NH2的分子处理，将其掩蔽。
㈣. 洗去未结合L 用高-低交叉pH来洗（4～5次）
7.4、亲和层析的特殊类型有哪些？简述它们的基本原理和应用范围
一、 共价色谱:利用形成和破坏共价键能力的差异分离,其共价键常为二硫键—S-S—,主要用于分离分子中含巯基的Pr、多肽。二、金属螯合色谱原理：His Cys Trp能与某些金属离子形成复合物，若将金属离子固定，可将含这些外露AA的Pr吸附。原理：蛋白质分子表面的组氨酸咪唑基、半
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胱氨酸巯基和色氨酸吲哚环能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物 四、有机染料亲和色谱：有机染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具类似于NAD+的结构。一些需核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具一定亲和力五 凝集素亲和层析：凝集素是一类来自于霉菌、植物和动物的蛋白质，能可逆地、选择性地同特定的糖残基结合；不同的凝集素结合不同的糖分子用于分离含糖基的化合物，如多糖、糖蛋白、糖脂、细胞内颗粒、细胞等
反相层析
8.1、简要说明反相层析的原理，并解释何谓疏溶剂理论（solvophobic theory）。
基于溶质分子与固定相中键合在基质上的疏水性配基间的疏水相互作用 论来解释。于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的非极性配基上，间不存在其他任何相互作用。
8.2、何谓“亲硅醇基效应”（silanophilic interaction）？ ; ;
硅胶表面均匀覆盖非极性配基，对残余硅醇基屏蔽，新型反相层
8.3反向层析的优化①层析过程中PH 。反相层析多数在低pHpH
②p143)，可同时起维持流动相pH的作用。或10~100mmol/L。往流动相中添加离子对试剂可对于带正电荷的溶质应选择带负电荷的离子
③因具较小的颗粒直径，普遍有较高的柱效；（硅胶有高ph应用最广泛的基质是硅胶 开发新的更分离的规模及对分辨率的要求、流动相条件：待分离物分子量，样品组分的疏水性质决定采用何种配基；分离的规模及对分 ；反相层析时的流动相 ④层析柱的尺寸由内径和柱长所界定，其取值主要取其中内径的取值与分离规模相关，而柱长和分辨率之间则存在一 ，人们可据所选预装柱平衡后可直接使用；层析柱的平衡 A对层析柱进行充分的平衡。⑤乙腈和甲醇是最常用的，条件摸索阶段以其中一种作为修饰剂，溶质在固定相上吸附较为牢固时，可考虑更换洗脱能力较强的修饰剂如异丙醇等；溶质分子，特别是蛋白质等生物大分子在所用溶剂中的稳定性是须考虑的因素；分离样品性质不明的情况下，一般流动相A为水相，不含修饰剂，而流动相B为100%有机相；
⑥样品的处理理想情况下应将样品溶于流动相A后加样，如样品在流动相A中溶解不好，可考虑添加有机酸、盐类等试剂来增加样品的溶解性；样品在加样前应当通过10000g离心10min或用0.22μm微孔滤膜过滤除去任何可能存在的颗粒物；反相层析柱通常是预装柱或带有可调接头的自装柱，连接于HPLC系统，加样操作按HPLC系统提供的标准进行。
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⑦洗脱模式的选择和条件控制在洗脱模式方面，反相层析和离子交换等层析技术具相似性，分为阶段洗脱和梯度洗脱；
⑧样品的检测和收集和其他层析技术一样，反相层析中最常用的也是紫外检测（很多情况下，有机溶剂或添加剂等的存在总会对样品的检测产生一定的影响 ）对于能产生荧光的物质，使用荧光监测器往往比紫外检测有更高的选择性和灵敏度。此外，视差折光检测器、电导检测器等也都能用于层析样品的在线检测。⑨层析柱的再生、清洗和贮存再生常用2～5个柱体积的流动相B流经层析柱移去残留在层析柱上的物质；清洗常运行线性梯度从0.1%TFA到0.1%TFA异丙醇，再几个柱体积的0.1%TFA异丙醇溶液，最后运行线性梯度从0.1%TFA异丙醇溶液重新回到水溶液；基于硅胶的介质常保存在纯的甲醇中，基于聚苯乙烯的介质常保存在甲醇或20% 8.4、试解释线性梯度洗脱的反相层析中溶质得到浓缩的机理
疏水层析
9.1
介质：在HPLC孔径小的基质甚至非孔型基质
HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4～C8π-π 。 A中基本一致，并调节样品溶液的pHHIC对于稀释样品无需浓缩可以直接加样 流动相A与流动相B流动相ApH ，盐的种类和浓度的选择： 缓冲液种类据所需的pH选择，0.01~0.05mol/L； 不同盐类对疏水作用的强度有(NH4)2SO4常用0.75～2mol/L，NaCl为1～B为不含盐的缓冲液，缓冲液与流动相A一致
9.2
原理： 反响层析：基于溶质分子与固定相中 ，疏溶剂理论假设反相层析介质是表面均匀密集的溶质分子由于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合至固定相的非
C8以下，
-有机溶剂体系中具有良好稳HIC过程洗脱条件温和，通常降低洗脱剂的盐浓度就能达到目的，在蛋白质的纯化中有较广泛的应用。
电泳
10.1、简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的主要方法和特点并说明影响聚合的主要因素。
所用原料：丙烯酰胺Acr,双丙烯酰胺Bis
1.化学聚合法：催化剂，过硫酸铵（AP）加速剂，NNNN-四甲基乙二胺（TEMED） 影响聚合的
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因素：⑪.O2会淬灭自由基，所以需脱气；
⑫.加速剂叔胺处在自由碱基状态，需高pH; ⑬.温度t t ↓ 慢 t ↑ 快 ⑭.避免不纯物的影响：有机玻璃、赤血盐（铁氰化钾）等会造成无法聚合。
2 .光聚合法，VB2 光解 无色基 02 自由基 引发聚合 常采用来制备大孔胶
10.2、等电聚焦IEF的主要原理是什么？为什么等电聚焦过程一般都采用高电压、恒功率方式？ 原理：在一种特殊的两性电解质两端施加直流电场，可形成线性的pH梯度。利用Pr的pI差别，可在其上不同处聚焦分离。
聚焦在pH0.01范围， 所以分辨率很高。
特点：高电压，地电流，冷却
原因：等电聚焦电泳中，通常采用恒功率方式。 流的乘积，所以为加快分离，提高分辨率, 的冷却系统、载体两性电解质的导电性和pH、凝胶介质及样品的质量、。恒功率，在最后有个安全区。
10.3、请比较Native PAGE 与SDS-PAGE 。
一、常规的PAGE缓冲液系统：
⑪ pH决定 生物分子溶解性、稳定性、 酸性蛋白质——阳极电泳（pH8.0～
碱性蛋白质——阴极电泳（pH4.0左右 三种不连续系统：高pH系统（9.5、8.9）
“中性”pH系统（8.0） 低pH5.5、4.83.6）
⑫ 离子强度 一般控制在7.5%的均匀胶，理想的Rf范围在0.25～0.85之间；
测定蛋白质分子量：天然
具体方法： 质分子，直线的斜率为阻滞系数；用已知分子量的蛋白质得到一条直线，在此直线上根据未知蛋白质的阻滞系数可查得它的分子量。 二、 十二烷基硫酸钠 CH3(CH2)11OSO3Na
原理：
的还原剂，打开Pr分子二硫键
Pr-SDS复合物
.Pr电荷密度相同⑫.球状 Pr 变成雪茄状，长轴∝MW（3）（长轴）有关。
注意：的加量：一般10gSDS/gPr 2. Gel浓度 3.多亚基的Pr……
SDS凝胶分离高分子化合物后失活，需要进行生物活性的修复从蛋白中去除SDS，许多蛋白可恢复活性或局部恢复活性，其影响因素为：①SDS纯度；②蛋白酶；③二硫键；④其它：去除速度、辅因子、DTT等（胶中进行，局限于单肽链或亚基相同）
SDS凝胶分为，连续电泳，和不连续电泳均匀胶，不连续电泳梯度胶。
10.4、归纳凝胶电泳技术中检测条带的主要染色方法和特点，分析条带变形的主要原因。 一、(1)考马斯亮蓝染色 分为R-250和G-250，常用R-250染色后颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系，在一定pH值时，蛋白质-染料复合物又可解聚 染色灵敏度达0.2~0.5 g/带
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(2)银染色 先固定，蛋白带上的AgNO3被还原成金属Ag而沉积在蛋白带上而显色，显色有化学显色和光显色 ，敏度达2ng/带
(3)其他染色方法 荧光染料法、苯胺黑、氨基黑、丽春红S、快绿FCF，蛋白质与2,4-DNFB的反应 等等二、条带在试验操作不当时会出现异常现象，
①“微笑”现象常在厚胶和垂直电泳中出现，原因：凝胶中间冷却不均匀；②“皱眉”原因 （垂直电泳中可能出现） 电泳装置不合适，靠近隔板处凝胶未聚合完全或凝胶底部有气泡。③原因：样品溶解不佳，凝胶浓度过高。克服：加样前离心，选合适缓冲液，加增溶辅助试剂，“纹理”现象原因：常常是样品中不溶颗粒造成的克服：增加溶解度，离心除不溶颗粒
10.5、常用测定蛋白质分子量的方法有哪些？（手写板第③页）
①sds-page ②天然PAGE: ③凝胶过滤色谱：有效分配系数Kav或Ve离天然非变性的蛋白质分子分子量，且不受带点和量的影响。
④超速离心在离心力场中，沉降系数，
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