(一)Western-blot 实验
1. Western blot主要实验试剂
溴酚蓝(Bromphenol Blue)
丽春红(Ponceau S)
考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250)
吐温-20(Tween-20) β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol) 十二烷基硫酸钠(SDS )
过硫酸铵(APS )
TEMED
聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液
4×浓缩胶缓冲液
4×浓缩胶缓冲液
甘氨酸
Tris 碱
脱脂奶粉
牛血清白蛋白(BSA )
硝酸纤维素膜(NC 膜) 蛋白质Marker 和预染 Marker
通用蛋白裂解/提取试剂
BCA 法蛋白定量试剂盒
Bradford 法蛋白定量试剂盒 兔源性抗抗体
辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG ECL 超敏发光液
定影液、显影液、X 光胶片曝光盒
其他试剂(乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等)
2. Western-blot主要实验试剂的配制方法
(1)10%SDS溶液: SDS粉末1g, 加双蒸水10mL 使其溶解,室温保存。
(2)10%APS:APS 20mg,加双蒸水200μL,混匀,现配现用。
(3)10×电极缓冲液(PH8.3): SDS粉末10g 、Tris 碱30.4g 、甘氨酸144g ,双蒸水定溶至1000mL ,4℃保存,用时10倍稀释。
(4)考马斯亮蓝固定液:乙醇500mL 、冰醋酸10mL 、双蒸水定溶至1000mL 。
(5)考马斯亮蓝脱色溶液:95%乙醇250mL 、冰醋酸80mL ,双蒸水定溶至1000mL 。
(6)考马斯亮蓝染色溶液:0.29g 考马斯亮蓝, 溶解于250mL 脱色液中,过滤后室温保存。
(7)转移缓冲液:甘氨酸2.93g 、Tris 碱5.812g 、甲醇200mL 、去离子水定溶至1000mL ,4℃保存。
(8)10×TBS 溶液:Nacl87.75g 、Tris 碱12.1g ,用双蒸水溶至1000mL ,4℃保存,用时10倍稀释。
(9)TBST 溶液: 1×TBS 溶液1000mL 、Tween-20溶液1mL ,混匀。
(9)丽春红溶液:100g 丽春红,5mL 冰醋酸,双蒸水定溶至100mL ,室温保存。
(11)5×上样缓冲液:1mol/LTris-HCl(pH6.8) 0.6mL、甘油2.5mL 、10% SDS溶液2mL 、β-巯基乙醇(使用前加)0.5mL 、1%溴酚蓝溶液1mL ,去离子水定溶至10mL ,4℃保存。
(12)12%分离胶:聚丙烯酰胺单体贮备液3.2mL 、4×分离胶缓冲液0.5mL 、10%SDS溶液80μL、10%APS溶液25μL、TEMED 原液10μL、双蒸水溶至8mL 。
(13)5%浓缩胶:聚丙烯酰胺单体贮备液0.68mL 、4×浓缩胶贮备液0.25mL 、10%SDS溶液40μL、10%APS溶液15μL、TEMED 原液5μL、双蒸水溶至4mL 。
(14)NC 膜封闭液:脱脂奶粉1g ,TBST 溶液20mL 中溶解,4℃保存。
(15)抗体稀释液:TBST 溶液20mL 、小牛血清白蛋白1g ,混匀,4℃保存。
(16)Striping Buffer:β-巯基乙醇 35μL、10%SDS 溶液1mL 、0.5MTris 溶液(pH6.7) 625μL,去离子水定溶至5mL ,室温保存。
3. Western-blot实验步骤
(1)总蛋白的提取 (采用北京普利莱公司蛋白质抽提试剂盒抽提)
①电子天平精确称取组织50mg (±2mg ),放入含有1mL 细胞裂解液和适量的PMSF (终浓度为1mmoL/mL)的预冷玻璃匀浆器内,冰上匀浆。
②取0.5mL 匀浆液移入新的2mLEP 管内,加1mL 蛋白抽提试剂并混匀,静置
10min 后(偶有颠倒混匀),12000g 4℃离心10min 。
③弃去上清保留蛋白质膜,加2%SDS溶液500μL,100℃水浴10min ,4℃放置2小时使蛋白质膜充分溶解。
(2)总蛋白浓度的测定(BCA 法)
①配制统一的蛋白质标准品:以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 的标准品溶液(浓度为1mg/mL)制作蛋白质标准曲线。分别吸取BSA 标准品溶液0、100、200、400、800、1200、1600和2000μL,各自加入0.01MPBS 溶液补足到2000μL,配成梯度浓度的标准品溶液,分装后-20℃备用。
②配制BCA 工作液:按50:1的比例将BCA 试剂盒内的A 试剂与B 试剂进行混合,配成BCA 工作液。室温保存,1d 内使用。
③样品处理:取各样品10μL,加0.01MPBS 溶液490μL,配成待测样品。
④加样:先于酶标板上样孔内加入200μL BCA 工作液,再分别加入倍比稀释的标准品及待测样品各20μL,酶标仪上震荡3min ,充分混匀。
⑤测定:将酶标板置于恒温水浴箱中,37℃孵育30min 。用MRK3型酶标仪测定562nm 波长下各孔吸光度值(optical density,OD ),采用Softmax5.2软件计算各样本蛋白质浓度。
(3)样品浓度的配平和制备
①配平:按测定的各样品蛋白质浓度,用2%SDS溶液配平各样品总蛋白浓度。根据预实验结果,将组织的总蛋白浓度调为1mg/mL。
②制备:将配平后的样品与5×上样缓冲液按4:1的比例混合。 100℃水浴10min ,部分4℃保存用于电泳,部分-20℃保存备用。
(4)样品内蛋白含量的检测
①凝胶的配制:配制12%分离胶和5%浓缩胶(配制方法见附录)。
②上样:分别用Eppendorf 微量移液器吸取蛋白质Marker 或样品各10μL,将枪尖的插入加样孔的底部,缓慢地将样品或Marker 加入加样孔,避免有气泡产生。 ③电泳:浓缩胶:电压100V 、电流400mA ,电泳20min ;分离胶:120V ,400mA ,电泳50min ,待溴酚蓝到达凝胶底部,关闭电源。
④蛋白质转膜:恒压转移,转膜参数:电压100V ,电流350mA ,转移23min 。结束后,将硝酸纤维素膜(nitrocellulose ,NC 膜)于丽春红染液中染色10 min,可
见清晰的红色条带,表明转膜成功。去离子水冲洗,根据蛋白质Marker 的位置将含有目的蛋白的膜条带上下各0.5cm )裁下。
⑤封闭:把NC 膜置于封闭液内室温封闭4h (摇床上进行),TBST 液洗膜2min×3次。
⑥免疫反应:将封闭好的膜置于一抗溶液中4℃孵育过夜,TBST 溶液洗3min×5次后,NC 膜再于辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 溶液中孵4℃育1h ,用TBST 溶液洗膜3min×5次。以上步骤均在摇床上进行。
⑦曝光:将ECL 超敏发光液中的A 液和B 液按1:1比例混合后滴于NC 膜上,暗室内曝光30s ,X-光片在显影液中显影2min ,定影液中定影5min 。
⑧分析结果:将NC 膜上肌动蛋白染色条带结果扫描后输入电脑,IPP5.0图像分析系统分析结果。
(二)免疫组化(荧光)染色实验
1. 免疫组化(荧光)染色主要实验试剂
防脱片剂
一抗抗体
免疫组化试剂盒(SP 或SABC )
DAB 试剂盒
罗丹明标记的羊抗兔IgG 组织自身荧光淬灭剂 其他试剂(乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等)均为国产分析纯
2. 常用试剂的配制
(1)0.01MPBS 溶液:中衫公司的PBS 粉末一包,加蒸馏水2000mL ,混匀,室温保存。
(2)4%多聚甲醛溶液:500ml 0.01MPBS液加40g 多聚甲醛在2000 ml的烧杯内加热至60℃,边搅拌边加热,至溶液呈澄清,另加500 ml 0.01MPBS液至1000 ml。冷却后过滤, 4℃冰箱保存备用。
(3)苏木素:
(4)伊红:
3. HE染色方法
(1)二甲苯I 脱蜡10min
(2)二甲苯II 、III 脱蜡各5min
(3)无水乙醇洗1min ×2次
(4)95%酒精1min
(5)90%酒精1min
(6)85%酒精1min
(7)自来水洗2min
(8)苏木素染色1~5min
(9)自来水洗1min
(10)1%盐酸酒精分化20s
(11)自来水洗1min
(12)稀氨水(1%)反蓝30s
(13)自来水洗或蒸馏水洗1min
(14)伊红染色20s ~5min
(15)自来水洗30s
(16)85%酒精脱水20s
(17)90%酒精30s
(18)95%酒精1min
(19)95%酒精1min
(20)无水乙醇2min
(21)无水乙醇2min
(22)二甲苯I 、II 、III 透明各5min
(23)中性树胶封片
4. 免疫组化染色
(1)制作切片:组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE 染色步骤进行;
(2)抗原修复:0.01M 的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min ,冷却至室温后,PBS 溶液洗3min×3次;
(3)封闭:封闭液室温封闭30min ,弃去封闭液,不洗;
(4)免疫反应:滴加一抗抗体,4℃孵育过夜(保湿盒内进行),PBS 溶液洗切片
3min×5次后,滴加二抗,室温4℃孵育30min ,PBS 溶液洗切片3min×5次;滴加DAB 试剂、显色。显微镜观察切片,蒸馏水终止显色反应。脱水、透明、封片。
(5)观察:每张切片随机选5个视野,扫描记录,并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。
5. 免疫荧光染色
(1)制作切片:组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE 染色步骤进行;
(2)抗原修复:0.01M 的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min ,冷却至室温后,PBS 溶液洗3min×3次;
(3)封闭:封闭液室温封闭30min ,弃去封闭液,不洗;
(4)免疫反应:滴加一抗抗体,4℃孵育过夜(保湿盒内进行),PBS 溶液洗切片3min×5次后,滴加罗丹明标记IgG ,室温避光4℃孵育30min ,PBS 溶液洗切片3min×5次;滴加组织自发荧光淬灭剂,室温孵育30min ,PBS 溶液洗3min×3次;滴加抗荧光淬灭封片剂封片,4℃避光保存。
(5)观察:荧光显微镜观察切片,每张切片随机选5个视野,扫描记录,并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。
(三)RT-PCR 实验
1. RT-PCR主要实验试剂
TRIzol Reagent
DEPC
One Step RNA PCR Kit (AMV)
DNA Marker
琼脂糖
Tris
MOPS
MGP 试剂
去离子甲酞胺
去离子甲醛
其他试剂(乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等)均为国产分析纯
2. 常用试剂的配制
(1)DEPC 水(v/v):在1000 ml去离子水中加入DEPC 1ml,37℃充分振荡过夜,高压灭菌。浸泡实验器具的DEPC 水:在1000 m 去离子水中加入DEPC 1ml ,充分振荡后即可使用。
(2)75%乙醇(DEPC水配制):无水乙醉375ml ,加入DEPC 水定容至500ml 。
(3)0.5M EDAT (pH8.0): EDAT-2Na 186.1g,加DEPC 水至800ml ,充分搅拌。用NaOH 约20g 调pH 至8.0,用DEPC 水定容至1000ml 。高温高压灭菌后分装, 室温保存。
(4)1×Tri-HCl(pH8.0):Tris 121.1g ,加DEPC 水800ml 搅拌溶解后,用浓HCl 约42ml 调pH 至8.0,用DEPC 水定容至1000ml 。高温高压灭菌后分装,室温保存"
(5)10×TE(pH8.0): 100mM Tris-HCI(pH8.0), 1mM EDAT(pH8.0), 加800mlDEPC 水混合均匀后定容至IL 。高温高压灭菌后分装, 室温保存。
(6)EB 染液(200μg/μl)I:澳化乙锭2.0mg ,, 加DEPC 水至10ml, 充分搅拌数小时完全溶解后室温避光保存。
(7)1MM 乙酸钠: 68g乙酸钠, 加DEPC 水400ml ,搅拌, 用DEPC 水定容至500ml 。
(8)10×MOPS 电泳缓冲液:41.8gMOPS溶解于700ml 灭菌的DEPC 水中, 用2M 的NaOH 调整到pH7.0, 加20ml 乙酸钠和20 ml MEDAT(pH8.0), 用DEPC 水调整到1L, 避光保存。
(9)10×甲醛变性琼脂糖凝胶:加1.5g 琼脂糖到72ml 灭菌去离子水中,煮沸溶解琼脂糖,将溶液冷却到55℃同时加入10ml 10xMOPS电泳缓冲液和18ml 去离子甲醛后灌胶。
(10)10×甲醛凝胶缓冲液:甘油5ml, 25mg固体澳酚蓝, 25mg二甲苯青FF, 10mM EDAT(PH8.0) 5ml定容至10m 。
(11)1.5%琼脂糖凝胶:琼脂糖1.5g ,加入100ml l×TBE 电泳缓冲液P(H8.3)后在微波炉内加热溶解,冷却至55℃左右加入EB 染液(终浓度0.5μg/μl) 充分混匀后灌胶。
(12)5×TBE 电泳缓冲液(pH8.3): 54gTris碱,27.59硼酸,20ml 0.5M EDAT(pH8.0),定容至1L 。
(13)6×凝胶载样缓冲液:0.25%嗅酚蓝(m/v)、0.25%二甲苯青(m/V), 30%甘油
水溶液,4℃保存。
3. RNA提取方法
(1)组织取出后立刻至于液氮中。
(2)脑组织称取后在液氮存在下研磨3次成粉末状(需要磨成非常细的粉末, 否则抽提效率会降低)。
(3)待液氮挥发干,立即加入TRIzol ,每100mg 组织加1ml TRIzol,用加样枪吹吸,使样品充分裂解,移入1.5 ml EP管中,静止5min ,以使核酸蛋白复合体完全分离。
(4)在EP 管中加200μL 氯仿,剧烈振荡15秒,静置5min 。
(5)将EP 管在4℃ 12000g ,离心15min ,离心后混合物分离成一个较低的红色苯酚-氯仿的有机相,一个中间相和一个无色的上层的水相。
(6)用移液器小心吸出上层水相(不要吸取中间白色的中间层)300ml ,加入另一EP 管中。
(7)加入500 μL 预冷过的异丙醇,振荡混匀。-20℃沉淀过夜。
(8)4℃ 12000g ,离心15min ,此时在EP 管中常常能看到白色沉淀,小自移出 上清。
(9)沉淀中加入lml 预冷过的75%乙醇,振荡混匀后4℃ 7500g ,离心5min 。
(10)重复用75%乙醇洗涤RNA 沉淀一次。
(11)去上清,RNA 沉淀于空气干燥5-10min ,, 加入DEPC 水充分济解(难溶时可在55-60℃孵育10min 助溶。
4. RNA定量检测
(1)提取适量总RNA 用1×xTE 稀释200倍,以1xTE 作为空白对照。
(2)分别测定在260nm 和280nm 处的吸光值,纯RNA 的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.7-2.0之间) 。
(3)在260nm 处的吸光度,1OD=40μg/ml NRA。浓度计算公式如下:A260光密度值×40×稀释倍数/1000=μg/μl RNA。
5、琼脂糖变性凝胶电泳质检RNA
(1)在EP 管内建立变性反应:
对照组总RNA (约5μg )2.0 μl
10×MOPS 电泳缓冲液 2.0 μl
去离子甲醛 4.0 μl
去离子甲酰胺 10.0μl
澳化乙锭(200μg/μl) 1.0 μl
(2)将EP 管置于水浴恒温器中65℃ 温育5min ,取出立刻置丁冰上10min ,然后离心5s ,将所有液体沉淀到EP 管内底部。
(3)加2.0 μl 10×甲醛凝胶缓冲液并重新置于冰上。
(4)将1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽内,加入足量1×MOPS 电泳缓冲液覆盖凝胶约lmm ,加RNA 样品到凝胶加样孔中。
(5)5V/cm电压下电泳,直到溴酚蓝移出约8厘米,由于电泳过程中电泳缓冲液的pH 值会发生变化,需每小时人工转变缓冲液。
(6)紫外线下观察,拍照。提取质量较好RNA 电泳结果为5s 、18s 和28s 三条带清晰,没有明显的降解,28s RNA条带是18s RNA条带亮度的两倍。
6、RT-PCR 反应
(1)按照试剂盒说明书加入试剂。
(2)RT-PCR 反应。
(3)反应结束后,取PCR 反应液各5μl 进行1.5%琼脂糖凝胶(含EB )电泳。
(4)5V/em电压下电泳40min 。
(5)紫外线下观察,拍照。
(四)ElISA 实验
1. RT-PCR主要实验试剂
2. ElISA 操作步骤
(1)取右心血液, 在4℃下2000r/min离心10min, 取上层血清。
(2)取出ELISA 试剂盒平衡至室温。
(3)取出反应板每孔分别加入20μl 标准品、20μl 血清于反应板孔中。
(4)每孔加入100μl Zero Buffer,轻轻混匀30秒, 室温温育30min 。
(5)洗板:甩尽板内液体, 用蒸馏水或者洗涤液洗涤反应板, 并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干), 这样反复洗涤5次。
(6)每孔加入150ul 酶联物(Reagent),轻轻混匀10秒, 室温温育30min 。
(7)洗板:与步骤5相同。
(8)每孔加入IO0μl TMB显色液,轻轻混匀10秒钟,置暗处室温温育20 min。
(9)每孔加入50μl 终止液(stop solution),轻轻混匀30s ;确定兰色变为黄色(重要) ,30min 内在45Onm 处读OD 值。
(10)以OD 值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据豚鼠血清样品的OD 值可在标准曲线上查出其浓度。
(五)原位杂交实验
1. 原位杂交实验所需试剂
TriS
曲拉通X-100
吐温-20
DEPC
mRNA 原位杂交试剂盒及专用盖玻片
原位杂交寡核昔酸探针
2. 原位杂交所需试剂的配制方法
(1)DEPC 水:在1000ml 去离子水中加入DEPC 1ml,37℃下充分振荡过夜,高温高压灭菌,浸泡实验器具的DEPC 水:在1000ml 去离子水中加入DEPC1ml 而,充分振荡后即可使用。
(2)组织细胞打孔液:DEPC 处理的构椽酸缓冲液(0.01mol)99.5ml,加入曲拉通X-100 0.5ml,混匀即可。
(3)DEPC 处理的PBS 缓冲液:1000 ml PBS缓冲液(0.01mol)中加入DEPC 1ml, 荡过夜,高温高压灭菌。
(4)0.1 mol TBS: 8.5g NaCI、l.2g Tris用DEPC 处理的去离子水定容至I000ml, 混匀, 用乙酸调pH 至7.5。
(5)过氧化氢封闭液: 市售30%的过氧化氢10ml ,加DEPC 处理的PBS 缓冲液定容至100ml, 此液现用现配。
(6)4%多聚甲醛: 4g多聚甲醛溶于DEPC 处理的双蒸水100ml 中, 50℃加热搅拌,滴加IN 氢氧化钠直至白色的多聚甲醛完全溶解,3号定性滤纸过滤备用。
(7)20×SSC 缓冲液的配制:氯化钠 175.3g 、柠檬酸三钠 88.2g 加 DEPC 处
理的去离子水混合均匀后定容至 1L 。2×SSC 、0.2×SSC 依次稀释 10 倍。
3. 原位杂交实验步骤
(1)取组织,于DEPC 处理的4%多聚甲醛中固定2h ,15%蔗糖(4℃) 脱水1天, 冰冻切片12μm 。
(2)原位杂交合成探针(8μg/ml, 地高辛标记)
(3)切片丙酮中浸泡10min ,DEPC 处理的PBS(0.01M, pH7.4)冲洗3min 。
(4)置打孔液中室温10分钟,以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利地穿透细胞膜,0.01 M PBS冲洗3次, 每次3min 。
(5)加过氧化氢封闭液室温20分钟,以封闭内源性过氧化氢酶,0.01 M PBS冲洗3min 。
(6)滴加复合消化工作液覆盖组织表面,4℃ 20min ,0.01M PBS冲洗3次,0.2× SSC 冲洗一次(室温3min) 。
(7)滴加预杂交工作液(25μl/张) 覆盖组织,37℃孵育盒孵育过夜。
(8)预杂交后,揭去盖玻片,以0.2×SSC 37℃洗3次, 每次5min 。以上步骤所 用洗液均经DEPC 处理。
(9)滴加杂交工作液(25μl/张) 覆盖组织,37℃孵育盒孵育6h 。
(10)揭去盖玻片以2×SSC 37℃洗3次, 每次5min ;0.2×SSC 37℃洗3次, 每次5min ;0.l mol TBS 37℃洗4次, 每次5分钟。
(11)滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液,37℃孵育30 min,0.0l M PBS
冲洗3次, 每次5min 。
(12)滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合工作液,37℃孵育30 min,0.0l M PBS 冲洗3次, 每次5min 。
(13)DAB 显色,光镜下观察,当细胞浆内阳性颜色与细胞外背景色对比度反差明显时,蒸馏水洗终止反应。胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应。80%酒精-90%酒精-无水乙醇-二甲苯脱水, 每步4分钟, 中性树胶封片,4℃保存。
或(13) 滴加高敏荧光链亲和素复合物(FITC )工作液,4℃湿盒孵育 2h 。 0.01M PBS 冲洗,5min ×3 次。甘油封片。
(一)Western-blot 实验
1. Western blot主要实验试剂
溴酚蓝(Bromphenol Blue)
丽春红(Ponceau S)
考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue R-250)
吐温-20(Tween-20) β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol) 十二烷基硫酸钠(SDS )
过硫酸铵(APS )
TEMED
聚丙烯酰胺凝胶单体贮备溶液
4×浓缩胶缓冲液
4×浓缩胶缓冲液
甘氨酸
Tris 碱
脱脂奶粉
牛血清白蛋白(BSA )
硝酸纤维素膜(NC 膜) 蛋白质Marker 和预染 Marker
通用蛋白裂解/提取试剂
BCA 法蛋白定量试剂盒
Bradford 法蛋白定量试剂盒 兔源性抗抗体
辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG ECL 超敏发光液
定影液、显影液、X 光胶片曝光盒
其他试剂(乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等)
2. Western-blot主要实验试剂的配制方法
(1)10%SDS溶液: SDS粉末1g, 加双蒸水10mL 使其溶解,室温保存。
(2)10%APS:APS 20mg,加双蒸水200μL,混匀,现配现用。
(3)10×电极缓冲液(PH8.3): SDS粉末10g 、Tris 碱30.4g 、甘氨酸144g ,双蒸水定溶至1000mL ,4℃保存,用时10倍稀释。
(4)考马斯亮蓝固定液:乙醇500mL 、冰醋酸10mL 、双蒸水定溶至1000mL 。
(5)考马斯亮蓝脱色溶液:95%乙醇250mL 、冰醋酸80mL ,双蒸水定溶至1000mL 。
(6)考马斯亮蓝染色溶液:0.29g 考马斯亮蓝, 溶解于250mL 脱色液中,过滤后室温保存。
(7)转移缓冲液:甘氨酸2.93g 、Tris 碱5.812g 、甲醇200mL 、去离子水定溶至1000mL ,4℃保存。
(8)10×TBS 溶液:Nacl87.75g 、Tris 碱12.1g ,用双蒸水溶至1000mL ,4℃保存,用时10倍稀释。
(9)TBST 溶液: 1×TBS 溶液1000mL 、Tween-20溶液1mL ,混匀。
(9)丽春红溶液:100g 丽春红,5mL 冰醋酸,双蒸水定溶至100mL ,室温保存。
(11)5×上样缓冲液:1mol/LTris-HCl(pH6.8) 0.6mL、甘油2.5mL 、10% SDS溶液2mL 、β-巯基乙醇(使用前加)0.5mL 、1%溴酚蓝溶液1mL ,去离子水定溶至10mL ,4℃保存。
(12)12%分离胶:聚丙烯酰胺单体贮备液3.2mL 、4×分离胶缓冲液0.5mL 、10%SDS溶液80μL、10%APS溶液25μL、TEMED 原液10μL、双蒸水溶至8mL 。
(13)5%浓缩胶:聚丙烯酰胺单体贮备液0.68mL 、4×浓缩胶贮备液0.25mL 、10%SDS溶液40μL、10%APS溶液15μL、TEMED 原液5μL、双蒸水溶至4mL 。
(14)NC 膜封闭液:脱脂奶粉1g ,TBST 溶液20mL 中溶解,4℃保存。
(15)抗体稀释液:TBST 溶液20mL 、小牛血清白蛋白1g ,混匀,4℃保存。
(16)Striping Buffer:β-巯基乙醇 35μL、10%SDS 溶液1mL 、0.5MTris 溶液(pH6.7) 625μL,去离子水定溶至5mL ,室温保存。
3. Western-blot实验步骤
(1)总蛋白的提取 (采用北京普利莱公司蛋白质抽提试剂盒抽提)
①电子天平精确称取组织50mg (±2mg ),放入含有1mL 细胞裂解液和适量的PMSF (终浓度为1mmoL/mL)的预冷玻璃匀浆器内,冰上匀浆。
②取0.5mL 匀浆液移入新的2mLEP 管内,加1mL 蛋白抽提试剂并混匀,静置
10min 后(偶有颠倒混匀),12000g 4℃离心10min 。
③弃去上清保留蛋白质膜,加2%SDS溶液500μL,100℃水浴10min ,4℃放置2小时使蛋白质膜充分溶解。
(2)总蛋白浓度的测定(BCA 法)
①配制统一的蛋白质标准品:以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 的标准品溶液(浓度为1mg/mL)制作蛋白质标准曲线。分别吸取BSA 标准品溶液0、100、200、400、800、1200、1600和2000μL,各自加入0.01MPBS 溶液补足到2000μL,配成梯度浓度的标准品溶液,分装后-20℃备用。
②配制BCA 工作液:按50:1的比例将BCA 试剂盒内的A 试剂与B 试剂进行混合,配成BCA 工作液。室温保存,1d 内使用。
③样品处理:取各样品10μL,加0.01MPBS 溶液490μL,配成待测样品。
④加样:先于酶标板上样孔内加入200μL BCA 工作液,再分别加入倍比稀释的标准品及待测样品各20μL,酶标仪上震荡3min ,充分混匀。
⑤测定:将酶标板置于恒温水浴箱中,37℃孵育30min 。用MRK3型酶标仪测定562nm 波长下各孔吸光度值(optical density,OD ),采用Softmax5.2软件计算各样本蛋白质浓度。
(3)样品浓度的配平和制备
①配平:按测定的各样品蛋白质浓度,用2%SDS溶液配平各样品总蛋白浓度。根据预实验结果,将组织的总蛋白浓度调为1mg/mL。
②制备:将配平后的样品与5×上样缓冲液按4:1的比例混合。 100℃水浴10min ,部分4℃保存用于电泳,部分-20℃保存备用。
(4)样品内蛋白含量的检测
①凝胶的配制:配制12%分离胶和5%浓缩胶(配制方法见附录)。
②上样:分别用Eppendorf 微量移液器吸取蛋白质Marker 或样品各10μL,将枪尖的插入加样孔的底部,缓慢地将样品或Marker 加入加样孔,避免有气泡产生。 ③电泳:浓缩胶:电压100V 、电流400mA ,电泳20min ;分离胶:120V ,400mA ,电泳50min ,待溴酚蓝到达凝胶底部,关闭电源。
④蛋白质转膜:恒压转移,转膜参数:电压100V ,电流350mA ,转移23min 。结束后,将硝酸纤维素膜(nitrocellulose ,NC 膜)于丽春红染液中染色10 min,可
见清晰的红色条带,表明转膜成功。去离子水冲洗,根据蛋白质Marker 的位置将含有目的蛋白的膜条带上下各0.5cm )裁下。
⑤封闭:把NC 膜置于封闭液内室温封闭4h (摇床上进行),TBST 液洗膜2min×3次。
⑥免疫反应:将封闭好的膜置于一抗溶液中4℃孵育过夜,TBST 溶液洗3min×5次后,NC 膜再于辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG 溶液中孵4℃育1h ,用TBST 溶液洗膜3min×5次。以上步骤均在摇床上进行。
⑦曝光:将ECL 超敏发光液中的A 液和B 液按1:1比例混合后滴于NC 膜上,暗室内曝光30s ,X-光片在显影液中显影2min ,定影液中定影5min 。
⑧分析结果:将NC 膜上肌动蛋白染色条带结果扫描后输入电脑,IPP5.0图像分析系统分析结果。
(二)免疫组化(荧光)染色实验
1. 免疫组化(荧光)染色主要实验试剂
防脱片剂
一抗抗体
免疫组化试剂盒(SP 或SABC )
DAB 试剂盒
罗丹明标记的羊抗兔IgG 组织自身荧光淬灭剂 其他试剂(乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等)均为国产分析纯
2. 常用试剂的配制
(1)0.01MPBS 溶液:中衫公司的PBS 粉末一包,加蒸馏水2000mL ,混匀,室温保存。
(2)4%多聚甲醛溶液:500ml 0.01MPBS液加40g 多聚甲醛在2000 ml的烧杯内加热至60℃,边搅拌边加热,至溶液呈澄清,另加500 ml 0.01MPBS液至1000 ml。冷却后过滤, 4℃冰箱保存备用。
(3)苏木素:
(4)伊红:
3. HE染色方法
(1)二甲苯I 脱蜡10min
(2)二甲苯II 、III 脱蜡各5min
(3)无水乙醇洗1min ×2次
(4)95%酒精1min
(5)90%酒精1min
(6)85%酒精1min
(7)自来水洗2min
(8)苏木素染色1~5min
(9)自来水洗1min
(10)1%盐酸酒精分化20s
(11)自来水洗1min
(12)稀氨水(1%)反蓝30s
(13)自来水洗或蒸馏水洗1min
(14)伊红染色20s ~5min
(15)自来水洗30s
(16)85%酒精脱水20s
(17)90%酒精30s
(18)95%酒精1min
(19)95%酒精1min
(20)无水乙醇2min
(21)无水乙醇2min
(22)二甲苯I 、II 、III 透明各5min
(23)中性树胶封片
4. 免疫组化染色
(1)制作切片:组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE 染色步骤进行;
(2)抗原修复:0.01M 的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min ,冷却至室温后,PBS 溶液洗3min×3次;
(3)封闭:封闭液室温封闭30min ,弃去封闭液,不洗;
(4)免疫反应:滴加一抗抗体,4℃孵育过夜(保湿盒内进行),PBS 溶液洗切片
3min×5次后,滴加二抗,室温4℃孵育30min ,PBS 溶液洗切片3min×5次;滴加DAB 试剂、显色。显微镜观察切片,蒸馏水终止显色反应。脱水、透明、封片。
(5)观察:每张切片随机选5个视野,扫描记录,并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。
5. 免疫荧光染色
(1)制作切片:组织切片的制作、切片脱蜡、脱水过程按HE 染色步骤进行;
(2)抗原修复:0.01M 的枸橼酸缓冲液内、中火微波修复15min ,冷却至室温后,PBS 溶液洗3min×3次;
(3)封闭:封闭液室温封闭30min ,弃去封闭液,不洗;
(4)免疫反应:滴加一抗抗体,4℃孵育过夜(保湿盒内进行),PBS 溶液洗切片3min×5次后,滴加罗丹明标记IgG ,室温避光4℃孵育30min ,PBS 溶液洗切片3min×5次;滴加组织自发荧光淬灭剂,室温孵育30min ,PBS 溶液洗3min×3次;滴加抗荧光淬灭封片剂封片,4℃避光保存。
(5)观察:荧光显微镜观察切片,每张切片随机选5个视野,扫描记录,并采用IPP5.0图像分析软件分析图像。
(三)RT-PCR 实验
1. RT-PCR主要实验试剂
TRIzol Reagent
DEPC
One Step RNA PCR Kit (AMV)
DNA Marker
琼脂糖
Tris
MOPS
MGP 试剂
去离子甲酞胺
去离子甲醛
其他试剂(乙醇、甲醇、冰醋酸、二甲苯、戊二醛等)均为国产分析纯
2. 常用试剂的配制
(1)DEPC 水(v/v):在1000 ml去离子水中加入DEPC 1ml,37℃充分振荡过夜,高压灭菌。浸泡实验器具的DEPC 水:在1000 m 去离子水中加入DEPC 1ml ,充分振荡后即可使用。
(2)75%乙醇(DEPC水配制):无水乙醉375ml ,加入DEPC 水定容至500ml 。
(3)0.5M EDAT (pH8.0): EDAT-2Na 186.1g,加DEPC 水至800ml ,充分搅拌。用NaOH 约20g 调pH 至8.0,用DEPC 水定容至1000ml 。高温高压灭菌后分装, 室温保存。
(4)1×Tri-HCl(pH8.0):Tris 121.1g ,加DEPC 水800ml 搅拌溶解后,用浓HCl 约42ml 调pH 至8.0,用DEPC 水定容至1000ml 。高温高压灭菌后分装,室温保存"
(5)10×TE(pH8.0): 100mM Tris-HCI(pH8.0), 1mM EDAT(pH8.0), 加800mlDEPC 水混合均匀后定容至IL 。高温高压灭菌后分装, 室温保存。
(6)EB 染液(200μg/μl)I:澳化乙锭2.0mg ,, 加DEPC 水至10ml, 充分搅拌数小时完全溶解后室温避光保存。
(7)1MM 乙酸钠: 68g乙酸钠, 加DEPC 水400ml ,搅拌, 用DEPC 水定容至500ml 。
(8)10×MOPS 电泳缓冲液:41.8gMOPS溶解于700ml 灭菌的DEPC 水中, 用2M 的NaOH 调整到pH7.0, 加20ml 乙酸钠和20 ml MEDAT(pH8.0), 用DEPC 水调整到1L, 避光保存。
(9)10×甲醛变性琼脂糖凝胶:加1.5g 琼脂糖到72ml 灭菌去离子水中,煮沸溶解琼脂糖,将溶液冷却到55℃同时加入10ml 10xMOPS电泳缓冲液和18ml 去离子甲醛后灌胶。
(10)10×甲醛凝胶缓冲液:甘油5ml, 25mg固体澳酚蓝, 25mg二甲苯青FF, 10mM EDAT(PH8.0) 5ml定容至10m 。
(11)1.5%琼脂糖凝胶:琼脂糖1.5g ,加入100ml l×TBE 电泳缓冲液P(H8.3)后在微波炉内加热溶解,冷却至55℃左右加入EB 染液(终浓度0.5μg/μl) 充分混匀后灌胶。
(12)5×TBE 电泳缓冲液(pH8.3): 54gTris碱,27.59硼酸,20ml 0.5M EDAT(pH8.0),定容至1L 。
(13)6×凝胶载样缓冲液:0.25%嗅酚蓝(m/v)、0.25%二甲苯青(m/V), 30%甘油
水溶液,4℃保存。
3. RNA提取方法
(1)组织取出后立刻至于液氮中。
(2)脑组织称取后在液氮存在下研磨3次成粉末状(需要磨成非常细的粉末, 否则抽提效率会降低)。
(3)待液氮挥发干,立即加入TRIzol ,每100mg 组织加1ml TRIzol,用加样枪吹吸,使样品充分裂解,移入1.5 ml EP管中,静止5min ,以使核酸蛋白复合体完全分离。
(4)在EP 管中加200μL 氯仿,剧烈振荡15秒,静置5min 。
(5)将EP 管在4℃ 12000g ,离心15min ,离心后混合物分离成一个较低的红色苯酚-氯仿的有机相,一个中间相和一个无色的上层的水相。
(6)用移液器小心吸出上层水相(不要吸取中间白色的中间层)300ml ,加入另一EP 管中。
(7)加入500 μL 预冷过的异丙醇,振荡混匀。-20℃沉淀过夜。
(8)4℃ 12000g ,离心15min ,此时在EP 管中常常能看到白色沉淀,小自移出 上清。
(9)沉淀中加入lml 预冷过的75%乙醇,振荡混匀后4℃ 7500g ,离心5min 。
(10)重复用75%乙醇洗涤RNA 沉淀一次。
(11)去上清,RNA 沉淀于空气干燥5-10min ,, 加入DEPC 水充分济解(难溶时可在55-60℃孵育10min 助溶。
4. RNA定量检测
(1)提取适量总RNA 用1×xTE 稀释200倍,以1xTE 作为空白对照。
(2)分别测定在260nm 和280nm 处的吸光值,纯RNA 的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.7-2.0之间) 。
(3)在260nm 处的吸光度,1OD=40μg/ml NRA。浓度计算公式如下:A260光密度值×40×稀释倍数/1000=μg/μl RNA。
5、琼脂糖变性凝胶电泳质检RNA
(1)在EP 管内建立变性反应:
对照组总RNA (约5μg )2.0 μl
10×MOPS 电泳缓冲液 2.0 μl
去离子甲醛 4.0 μl
去离子甲酰胺 10.0μl
澳化乙锭(200μg/μl) 1.0 μl
(2)将EP 管置于水浴恒温器中65℃ 温育5min ,取出立刻置丁冰上10min ,然后离心5s ,将所有液体沉淀到EP 管内底部。
(3)加2.0 μl 10×甲醛凝胶缓冲液并重新置于冰上。
(4)将1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽内,加入足量1×MOPS 电泳缓冲液覆盖凝胶约lmm ,加RNA 样品到凝胶加样孔中。
(5)5V/cm电压下电泳,直到溴酚蓝移出约8厘米,由于电泳过程中电泳缓冲液的pH 值会发生变化,需每小时人工转变缓冲液。
(6)紫外线下观察,拍照。提取质量较好RNA 电泳结果为5s 、18s 和28s 三条带清晰,没有明显的降解,28s RNA条带是18s RNA条带亮度的两倍。
6、RT-PCR 反应
(1)按照试剂盒说明书加入试剂。
(2)RT-PCR 反应。
(3)反应结束后,取PCR 反应液各5μl 进行1.5%琼脂糖凝胶(含EB )电泳。
(4)5V/em电压下电泳40min 。
(5)紫外线下观察,拍照。
(四)ElISA 实验
1. RT-PCR主要实验试剂
2. ElISA 操作步骤
(1)取右心血液, 在4℃下2000r/min离心10min, 取上层血清。
(2)取出ELISA 试剂盒平衡至室温。
(3)取出反应板每孔分别加入20μl 标准品、20μl 血清于反应板孔中。
(4)每孔加入100μl Zero Buffer,轻轻混匀30秒, 室温温育30min 。
(5)洗板:甩尽板内液体, 用蒸馏水或者洗涤液洗涤反应板, 并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干), 这样反复洗涤5次。
(6)每孔加入150ul 酶联物(Reagent),轻轻混匀10秒, 室温温育30min 。
(7)洗板:与步骤5相同。
(8)每孔加入IO0μl TMB显色液,轻轻混匀10秒钟,置暗处室温温育20 min。
(9)每孔加入50μl 终止液(stop solution),轻轻混匀30s ;确定兰色变为黄色(重要) ,30min 内在45Onm 处读OD 值。
(10)以OD 值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据豚鼠血清样品的OD 值可在标准曲线上查出其浓度。
(五)原位杂交实验
1. 原位杂交实验所需试剂
TriS
曲拉通X-100
吐温-20
DEPC
mRNA 原位杂交试剂盒及专用盖玻片
原位杂交寡核昔酸探针
2. 原位杂交所需试剂的配制方法
(1)DEPC 水:在1000ml 去离子水中加入DEPC 1ml,37℃下充分振荡过夜,高温高压灭菌,浸泡实验器具的DEPC 水:在1000ml 去离子水中加入DEPC1ml 而,充分振荡后即可使用。
(2)组织细胞打孔液:DEPC 处理的构椽酸缓冲液(0.01mol)99.5ml,加入曲拉通X-100 0.5ml,混匀即可。
(3)DEPC 处理的PBS 缓冲液:1000 ml PBS缓冲液(0.01mol)中加入DEPC 1ml, 荡过夜,高温高压灭菌。
(4)0.1 mol TBS: 8.5g NaCI、l.2g Tris用DEPC 处理的去离子水定容至I000ml, 混匀, 用乙酸调pH 至7.5。
(5)过氧化氢封闭液: 市售30%的过氧化氢10ml ,加DEPC 处理的PBS 缓冲液定容至100ml, 此液现用现配。
(6)4%多聚甲醛: 4g多聚甲醛溶于DEPC 处理的双蒸水100ml 中, 50℃加热搅拌,滴加IN 氢氧化钠直至白色的多聚甲醛完全溶解,3号定性滤纸过滤备用。
(7)20×SSC 缓冲液的配制:氯化钠 175.3g 、柠檬酸三钠 88.2g 加 DEPC 处
理的去离子水混合均匀后定容至 1L 。2×SSC 、0.2×SSC 依次稀释 10 倍。
3. 原位杂交实验步骤
(1)取组织,于DEPC 处理的4%多聚甲醛中固定2h ,15%蔗糖(4℃) 脱水1天, 冰冻切片12μm 。
(2)原位杂交合成探针(8μg/ml, 地高辛标记)
(3)切片丙酮中浸泡10min ,DEPC 处理的PBS(0.01M, pH7.4)冲洗3min 。
(4)置打孔液中室温10分钟,以改变组织细胞的通透性使探针快速顺利地穿透细胞膜,0.01 M PBS冲洗3次, 每次3min 。
(5)加过氧化氢封闭液室温20分钟,以封闭内源性过氧化氢酶,0.01 M PBS冲洗3min 。
(6)滴加复合消化工作液覆盖组织表面,4℃ 20min ,0.01M PBS冲洗3次,0.2× SSC 冲洗一次(室温3min) 。
(7)滴加预杂交工作液(25μl/张) 覆盖组织,37℃孵育盒孵育过夜。
(8)预杂交后,揭去盖玻片,以0.2×SSC 37℃洗3次, 每次5min 。以上步骤所 用洗液均经DEPC 处理。
(9)滴加杂交工作液(25μl/张) 覆盖组织,37℃孵育盒孵育6h 。
(10)揭去盖玻片以2×SSC 37℃洗3次, 每次5min ;0.2×SSC 37℃洗3次, 每次5min ;0.l mol TBS 37℃洗4次, 每次5分钟。
(11)滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液,37℃孵育30 min,0.0l M PBS
冲洗3次, 每次5min 。
(12)滴加高敏过氧化物酶链亲和素复合工作液,37℃孵育30 min,0.0l M PBS 冲洗3次, 每次5min 。
(13)DAB 显色,光镜下观察,当细胞浆内阳性颜色与细胞外背景色对比度反差明显时,蒸馏水洗终止反应。胞浆显棕黄色颗粒为阳性反应。80%酒精-90%酒精-无水乙醇-二甲苯脱水, 每步4分钟, 中性树胶封片,4℃保存。
或(13) 滴加高敏荧光链亲和素复合物(FITC )工作液,4℃湿盒孵育 2h 。 0.01M PBS 冲洗,5min ×3 次。甘油封片。