日立L-8900全自动氨基酸分析仪
简易操作规程
一、联机
1、打开电脑。 2、打开主机电源。
3、双击桌面的图
标，进入1-1画面，双
击图标，进入程序。
1-1
4、在菜单栏中依次点击
和
，出现1-2画面，单
击
联机。大约两分钟，初始化完毕
。中Uninitialized变
成
Idle，图1-2变成了图1-3，各个组件可以进行控制了。初始化完毕
后，分离柱的温度逐渐上升。分离柱的温度会升到50℃。
1-2
1-3
二、手动各组件控制操作
1、泵1和泵2
点
击，出现2-1的画面。设置泵1，流量0.ml/min，B1 100%。点
击
打开泵1。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-1
点击，出现2-2的画面，设置泵2，流量0.1ml/分钟，R3 100%。点
击
打开泵2。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-2
2、自动进样器
点击，出现2-3的画面，设置Sampler Wash不少于3次。
2-3 2-4
3、反应柱柱温箱
点击，出现2-5画面，设置柱温135℃，设置ON，打开柱温箱。柱温箱打开后，背景颜
色由灰色变为黄色。
2-5 2-6
三、编辑方法
1、依次点
击
现3-1-1的画面。
、
、
出
3-1-1
2、选
中
，点
击
，出现3-1-2的画面。
。再依次点
击
、
3-1-2
3、
在设置中选中各个柱，其余参数默认。
4、将方法另存为L8900分析方法，文件名及路径均可自选。注意一定不要覆盖原来的方法，一定得另存。
注意将梯度设为3-3-1所示，其余参数默认。
3-3-1
2、保存方法。
四、编辑Sequence 1、依次点
击其余参数默认。
、
、
，出现4-1画面。选
中
，
4-1
2、点
击
，出现4-2画面，根据需要填写各个参数。
4-2
3、点
击
，出现4-3画面，根据需要填写各个参数。
4-3
4、点
击
，出现4-4画面，根据需要填写各个参数。
4-4
5、点击
，出现4-5画面。
4-5
6、通过复制、编辑，最终将Sequence编辑如图4-6所示。注意此时第一行是再生程序（RG），进样体积为0，Run Type是Unknown，第二行是标准样品，三行起是未知样。
7、将Sequence另存为Test。
五、采集数据
点击Control Single Run,运行Stand－By方法，进样体积为0。
点击Control、Sequence Run，运行Test。
数据采集完后，机器自动进入清洗程序，清洗一个小时，自动关泵，关灯，关柱温箱。
六、关机
点
击
七、试剂的准备
断开连接，关闭程序，关闭主机电源。
反应液R1、R2：醋酸钠(CH3COONa·2H2O)、冰醋酸(CH3COOH)、茚三酮(C9H6O4)、乙二醇单甲醚（CH3CH(OH)·CH2OCH3）、硼氢化钠 （NaBH4）
缓冲液B1到B6：柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)、柠檬酸(C6H8O7·H2O)、氯化钠(NaCl)、无水乙醇(C2H5OH)、氢氧化钠(NaOH)、硫代双乙醇（硫二甘醇）(S(C2H4OH)2)、苯甲醇
（brij-35(聚氧乙烯十二烷基谜)、辛酸(C7H15COOH)
）、
八、出峰情况
Asp： 天门冬氨酸 Thr：苏氨酸 Ser： 丝氨酸 Glu：谷氨酸 Pro： 脯氨酸 Gly：甘氨酸 Ala：丙氨酸 Cys：胱氨酸 Val： 缬氨酸 Met：蛋氨酸 Ile： 异亮氨酸 Leu： 亮氨酸 Tyr： 酪氨酸 Phe：苯基丙氨酸 Lys：赖氨酸 NN3： 氨气
His： 组氨酸 Trp：色氨酸（标准品中不含该组分） Arg：精氨酸
九、仪器使用注意事项
1、氮气压力：仪器需要的压力为0.05—0.1Mpa，压力过高会损坏仪器。 2、为避免堵塞，注意泵1泵2的打开顺序。
3、电脑严禁更改设置，严禁安装其他程序，严禁上网。注意避免染上病毒。
4、进样浓度范围：0.4—10 nmol， 过高的浓度会影响分析结果，且容易堵塞反应柱。
十、 样品的前处理
准备想做测试的样品，在开动氨基酸分析仪之前，需要进行适合该项检测目的的处理，在这上分有两大系统，一个是将氨基酸以及和它有关连的化合物为对象对游离氨基酸的测定法（以下称生物液分析法），另一个是由蛋白质加水分解而得到的氨基酸对它的分析法（以下称蛋白质加水分解物分析法）在此对其中的几个作介绍。另外，作为原则请用0.45um的过滤器对样品过滤。
（1） 生物液分析法的前处理：
主要目的是做氨基酸成分的提取（萃取），除去蛋白质以及不溶性物质。
（a） 血液
① 把血液用7,000~10,000rpm(7000~10000G)离心分离15分钟 ② 在澄清液中加入5~10%三氯醋酸，稀释2~3倍。
③ 用7,000~10,000rpm（7000~10000G）离心分离15分钟。 ④ 将澄清液作为样品。
注意事项：
1）澄清液有混
2）虽然三氯醋
右。
3）将血液就这
4）最终样品量
蚀时，要么提高离心分离的转速，要么进一步使用过滤器。 酸的浓度根据蛋白质的量而不一样，通常把添加后的浓度做为3%左样做除蛋白操作，回收率很低，特别是Arg的消失明显。 做成0.05~0.1ml
（b） 滤纸提取血液（直径10mm的点约30ul，最少也是直径3mm×5片）
① 剪开滤纸，沿着离心管的管壁放入（例如：
② 加入0.5ml的1%三氯醋酸
③ 用超声波清洗器震动2分钟
④ 用7,000~10,000rpm（7000~10000G）离心分离15分钟
⑤ 用0.45um的过滤器将澄清液过滤，使用微量小玻璃瓶装进自动进样器
注意事项：样品的混浊多的时候，不要使用三氯醋酸，用水/乙醇提取（萃取），待减压干硬后，用0.02N-HCI稀释的话，分析柱的污染将减少。
（c） 尿
① 在原
所以
② 有混
③ 把得尿要浊到中提时的加高，液入稀进体1%三氯醋酸再稀释2~5倍（由于有异常的尿有大量的氨基酸出来，释倍率）。 行过滤或者离心分离。 的0.05~0.1ml作样品。
注意事项：检测微量成分的良好灵敏度时，在除蛋白后，减压干硬之后用稀释液再溶解。浓度就和原液吻合。
（d） 酱汁（调味汁）、果汁等含有蔬菜原料的食品类 ① 用1~5%三氯醋酸溶液稀释10倍
② 用7,000~10,000rpm（7000~10000G）离心分离15分钟
③ 把澄清液作样品
（e） 酱油、酒等设有沉淀物的水系食品类
① 在0.02NHCI稀释做样品（和PH的关系在3倍以上）
注意事项：食醋等虽然在低稀释度就可以，但酱汕等由于氨基酸浓度高，要稀释200~300倍左右再作样品。
（f） 从植物叶的提取（萃取）
① 用研钵将样品搓碎，或是截断成细小状。
② 在含有乙醇的20%~30%水中让其散开（1g样品/3ml乙醇/水）
③ 在水浴器上用80℃，约20分钟以上提取（萃取）。
④ 将澄清液过滤提取，提取（萃取）要反复3次。
⑤ 使用漏斗将剩下的样品用酒精清洗。
⑥ 由④以及⑤的液体在水浴器上除去酒精。
⑦ 往残留下来的水溶液中加入乙醚提取（萃取）后，采取水层
⑧ 把水层减压干硬
⑨ 在0.02 N HCI给一定的容量
（2） 蛋白质加水分解物分析法的前处理
把混合了药液的氨基酸，以及用蛋白质加水分解得到的氨基酸作对象。
（a） 药液
① 由0.02 N HCI稀释3倍以上（根据氨基酸的浓度）作样品，包含有糖、核酸、维
生素等水溶性物质，也不妨碍。
（b） 盐酸加水分解
① 将样品在加水分解用的玻璃试管上秤
② 加入6N-HCI
③ 在减压状态下封管，此时，若置换N2的话，将更正确。
④ 在加水分解炉中，用110℃、22小时加热分解。分解时间以上面为准，根据目的
而变更。
⑤ 减压干硬，除去HCI
⑥ 在0.02NHCI稀释一定的容量作样品 注意事项：
1）最终浓度以0.5mg蛋白质/ml为标准。
2）加水分解时的容量以6NHCI1mg中，样品在3mg以下为基准。
3）减压干硬之际，在40~80℃之间加温。
（c） 以回收Trp为目的的加水分解
① 代替6N-HCI的是使用4N甲烷磺酸，依从前面所述，盐酸加水分解的方法让其分
解。
② 分解后，由于不能减压干硬，加入4N-NaOH, 在PH=2调节。 ③ 在0.02N-HCI给一定的容量作样品。
注意事项：
1）甲烷磺酸是用1ml小玻璃瓶装入，由技术化学制品株式会社出售，其组成是在4N甲烷磺酸中含有0.2% 3-(2-氨基乙烷)吲哚[氮（杂）茚]
2）中和时的PH，使用PH试纸
3）分析了20个被检体后，将分解柱用再生液清洗4小时左右，这是为除去从树脂中混入到试剂的吸附物质。
4）对氢硫基乙烷磺也有效
（d） 以回收Cys 、Met为目的的加水分解
① 精确秤量1~2mg样品。
② 加入2ml过蚁酸，在0℃放置4~24小时。
③ 添加48%HBr0.3ml。
④ 减压干硬。
⑤ 依从盐酸加水分解的方法，减压进行到干硬为止。
⑥ 加入1ml的a2N-NaOH，放置1小时。
⑦ 在0.05N~a1NCHI，进行PH调制和给一定的容量。
日立L-8900全自动氨基酸分析仪
简易操作规程
一、联机
1、打开电脑。 2、打开主机电源。
3、双击桌面的图
标，进入1-1画面，双
击图标，进入程序。
1-1
4、在菜单栏中依次点击
和
，出现1-2画面，单
击
联机。大约两分钟，初始化完毕
。中Uninitialized变
成
Idle，图1-2变成了图1-3，各个组件可以进行控制了。初始化完毕
后，分离柱的温度逐渐上升。分离柱的温度会升到50℃。
1-2
1-3
二、手动各组件控制操作
1、泵1和泵2
点
击，出现2-1的画面。设置泵1，流量0.ml/min，B1 100%。点
击
打开泵1。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-1
点击，出现2-2的画面，设置泵2，流量0.1ml/分钟，R3 100%。点
击
打开泵2。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。
2-2
2、自动进样器
点击，出现2-3的画面，设置Sampler Wash不少于3次。
2-3 2-4
3、反应柱柱温箱
点击，出现2-5画面，设置柱温135℃，设置ON，打开柱温箱。柱温箱打开后，背景颜
色由灰色变为黄色。
2-5 2-6
三、编辑方法
1、依次点
击
现3-1-1的画面。
、
、
出
3-1-1
2、选
中
，点
击
，出现3-1-2的画面。
。再依次点
击
、
3-1-2
3、
在设置中选中各个柱，其余参数默认。
4、将方法另存为L8900分析方法，文件名及路径均可自选。注意一定不要覆盖原来的方法，一定得另存。
注意将梯度设为3-3-1所示，其余参数默认。
3-3-1
2、保存方法。
四、编辑Sequence 1、依次点
击其余参数默认。
、
、
，出现4-1画面。选
中
，
4-1
2、点
击
，出现4-2画面，根据需要填写各个参数。
4-2
3、点
击
，出现4-3画面，根据需要填写各个参数。
4-3
4、点
击
，出现4-4画面，根据需要填写各个参数。
4-4
5、点击
，出现4-5画面。
4-5
6、通过复制、编辑，最终将Sequence编辑如图4-6所示。注意此时第一行是再生程序（RG），进样体积为0，Run Type是Unknown，第二行是标准样品，三行起是未知样。
7、将Sequence另存为Test。
五、采集数据
点击Control Single Run,运行Stand－By方法，进样体积为0。
点击Control、Sequence Run，运行Test。
数据采集完后，机器自动进入清洗程序，清洗一个小时，自动关泵，关灯，关柱温箱。
六、关机
点
击
七、试剂的准备
断开连接，关闭程序，关闭主机电源。
反应液R1、R2：醋酸钠(CH3COONa·2H2O)、冰醋酸(CH3COOH)、茚三酮(C9H6O4)、乙二醇单甲醚（CH3CH(OH)·CH2OCH3）、硼氢化钠 （NaBH4）
缓冲液B1到B6：柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)、柠檬酸(C6H8O7·H2O)、氯化钠(NaCl)、无水乙醇(C2H5OH)、氢氧化钠(NaOH)、硫代双乙醇（硫二甘醇）(S(C2H4OH)2)、苯甲醇
（brij-35(聚氧乙烯十二烷基谜)、辛酸(C7H15COOH)
）、
八、出峰情况
Asp： 天门冬氨酸 Thr：苏氨酸 Ser： 丝氨酸 Glu：谷氨酸 Pro： 脯氨酸 Gly：甘氨酸 Ala：丙氨酸 Cys：胱氨酸 Val： 缬氨酸 Met：蛋氨酸 Ile： 异亮氨酸 Leu： 亮氨酸 Tyr： 酪氨酸 Phe：苯基丙氨酸 Lys：赖氨酸 NN3： 氨气
His： 组氨酸 Trp：色氨酸（标准品中不含该组分） Arg：精氨酸
九、仪器使用注意事项
1、氮气压力：仪器需要的压力为0.05—0.1Mpa，压力过高会损坏仪器。 2、为避免堵塞，注意泵1泵2的打开顺序。
3、电脑严禁更改设置，严禁安装其他程序，严禁上网。注意避免染上病毒。
4、进样浓度范围：0.4—10 nmol， 过高的浓度会影响分析结果，且容易堵塞反应柱。
十、 样品的前处理
准备想做测试的样品，在开动氨基酸分析仪之前，需要进行适合该项检测目的的处理，在这上分有两大系统，一个是将氨基酸以及和它有关连的化合物为对象对游离氨基酸的测定法（以下称生物液分析法），另一个是由蛋白质加水分解而得到的氨基酸对它的分析法（以下称蛋白质加水分解物分析法）在此对其中的几个作介绍。另外，作为原则请用0.45um的过滤器对样品过滤。
（1） 生物液分析法的前处理：
主要目的是做氨基酸成分的提取（萃取），除去蛋白质以及不溶性物质。
（a） 血液
① 把血液用7,000~10,000rpm(7000~10000G)离心分离15分钟 ② 在澄清液中加入5~10%三氯醋酸，稀释2~3倍。
③ 用7,000~10,000rpm（7000~10000G）离心分离15分钟。 ④ 将澄清液作为样品。
注意事项：
1）澄清液有混
2）虽然三氯醋
右。
3）将血液就这
4）最终样品量
蚀时，要么提高离心分离的转速，要么进一步使用过滤器。 酸的浓度根据蛋白质的量而不一样，通常把添加后的浓度做为3%左样做除蛋白操作，回收率很低，特别是Arg的消失明显。 做成0.05~0.1ml
（b） 滤纸提取血液（直径10mm的点约30ul，最少也是直径3mm×5片）
① 剪开滤纸，沿着离心管的管壁放入（例如：
② 加入0.5ml的1%三氯醋酸
③ 用超声波清洗器震动2分钟
④ 用7,000~10,000rpm（7000~10000G）离心分离15分钟
⑤ 用0.45um的过滤器将澄清液过滤，使用微量小玻璃瓶装进自动进样器
注意事项：样品的混浊多的时候，不要使用三氯醋酸，用水/乙醇提取（萃取），待减压干硬后，用0.02N-HCI稀释的话，分析柱的污染将减少。
（c） 尿
① 在原
所以
② 有混
③ 把得尿要浊到中提时的加高，液入稀进体1%三氯醋酸再稀释2~5倍（由于有异常的尿有大量的氨基酸出来，释倍率）。 行过滤或者离心分离。 的0.05~0.1ml作样品。
注意事项：检测微量成分的良好灵敏度时，在除蛋白后，减压干硬之后用稀释液再溶解。浓度就和原液吻合。
（d） 酱汁（调味汁）、果汁等含有蔬菜原料的食品类 ① 用1~5%三氯醋酸溶液稀释10倍
② 用7,000~10,000rpm（7000~10000G）离心分离15分钟
③ 把澄清液作样品
（e） 酱油、酒等设有沉淀物的水系食品类
① 在0.02NHCI稀释做样品（和PH的关系在3倍以上）
注意事项：食醋等虽然在低稀释度就可以，但酱汕等由于氨基酸浓度高，要稀释200~300倍左右再作样品。
（f） 从植物叶的提取（萃取）
① 用研钵将样品搓碎，或是截断成细小状。
② 在含有乙醇的20%~30%水中让其散开（1g样品/3ml乙醇/水）
③ 在水浴器上用80℃，约20分钟以上提取（萃取）。
④ 将澄清液过滤提取，提取（萃取）要反复3次。
⑤ 使用漏斗将剩下的样品用酒精清洗。
⑥ 由④以及⑤的液体在水浴器上除去酒精。
⑦ 往残留下来的水溶液中加入乙醚提取（萃取）后，采取水层
⑧ 把水层减压干硬
⑨ 在0.02 N HCI给一定的容量
（2） 蛋白质加水分解物分析法的前处理
把混合了药液的氨基酸，以及用蛋白质加水分解得到的氨基酸作对象。
（a） 药液
① 由0.02 N HCI稀释3倍以上（根据氨基酸的浓度）作样品，包含有糖、核酸、维
生素等水溶性物质，也不妨碍。
（b） 盐酸加水分解
① 将样品在加水分解用的玻璃试管上秤
② 加入6N-HCI
③ 在减压状态下封管，此时，若置换N2的话，将更正确。
④ 在加水分解炉中，用110℃、22小时加热分解。分解时间以上面为准，根据目的
而变更。
⑤ 减压干硬，除去HCI
⑥ 在0.02NHCI稀释一定的容量作样品 注意事项：
1）最终浓度以0.5mg蛋白质/ml为标准。
2）加水分解时的容量以6NHCI1mg中，样品在3mg以下为基准。
3）减压干硬之际，在40~80℃之间加温。
（c） 以回收Trp为目的的加水分解
① 代替6N-HCI的是使用4N甲烷磺酸，依从前面所述，盐酸加水分解的方法让其分
解。
② 分解后，由于不能减压干硬，加入4N-NaOH, 在PH=2调节。 ③ 在0.02N-HCI给一定的容量作样品。
注意事项：
1）甲烷磺酸是用1ml小玻璃瓶装入，由技术化学制品株式会社出售，其组成是在4N甲烷磺酸中含有0.2% 3-(2-氨基乙烷)吲哚[氮（杂）茚]
2）中和时的PH，使用PH试纸
3）分析了20个被检体后，将分解柱用再生液清洗4小时左右，这是为除去从树脂中混入到试剂的吸附物质。
4）对氢硫基乙烷磺也有效
（d） 以回收Cys 、Met为目的的加水分解
① 精确秤量1~2mg样品。
② 加入2ml过蚁酸，在0℃放置4~24小时。
③ 添加48%HBr0.3ml。
④ 减压干硬。
⑤ 依从盐酸加水分解的方法，减压进行到干硬为止。
⑥ 加入1ml的a2N-NaOH，放置1小时。
⑦ 在0.05N~a1NCHI，进行PH调制和给一定的容量。