486 中国科学 C 辑 生命科学 2006, 36 (6): 486~492
间充质干细胞的特性与分化诱导研究进展
唐文洁
①②
*
李玛琳 洪 岸
①
②**
(① 昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室, 昆明 650031; ② 暨南大学生物工程研究所, 广州 510632)
摘要 间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞的一种, 广泛存在于人体的间充质组织中, 具有自我复制能力和多项分化潜能. 单独或联合使用某些细胞因子、生长因子、激素、维生素、抗氧化剂和抗肿瘤药物等, 可诱导MSCs 在体外培养条件下向某一谱系细胞分化. 鉴于MSCs 的上述特点, 使其有着非常诱人的临床应用前景, 可以用于许多种疾病的治疗. 本文从MSCs 的生物学特性、MSCs 的分化诱导、分化调节机制及应用前景等方面进行了评述. 关键词 间充质干细胞 分化 诱导 调节机制 应用 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种多潜能成体干细胞, 在人体发生、发育过程中存在于许多种组织中. 20世纪70年代中期, Frieden-stein 等人
[1]
1 间充质干细胞的生物学特性
MSCs 具有干细胞的一般生物学特点: 具有自我复制能力和多项分化潜能; 属非终末分化细胞, 终生保持未分化或低分化特征, 缺乏分化标记; 分化情况受所处微环境(干细胞壁龛) 的影响; 通过对称性和非对称性分裂两种方式生长; 具有分裂的慢周期性, 绝大多数干细胞处于G 0期等
从骨髓中获得了少数能贴壁生长的细胞,
这些细胞能分化为成骨或软骨样的沉着物, 该发现被认为首次证实了MSCs 的存在. 目前, 已经从成人的多种间充质组织中分离得到MSCs, 这些细胞在体外可以扩增并且可以分化为骨、软骨、骨髓基质、肌腱、韧带、脂肪等多种结缔组织细胞, 以及骨骼肌细胞、神经细胞和神经胶质细胞等等
[2~4]
. MSCs在体外增殖过程
中, 能形成成纤维细胞样集落形成单位(CFU-F), 一般可扩增10~15代. 随着代次的增加, 传代间隔逐渐延长, 细胞增殖速度逐渐降低. 约10代以后, 细胞出现衰老症状: 细胞逐渐停止分裂、由纺锤体形变得宽大扁平, 培养液中的细胞碎片和纤维逐渐增加. 随着细胞群体倍增次数的增加, CFU-F的数目和大小逐渐降低, 直至消失, CFU-F内的细胞形态逐渐宽大扁平,
. 而且, 不论
是自体的还是同种异源的MSCs 一般都不会引起宿主的免疫反应. 因此, MSCs可以作为组织工程的种子细胞, 用于组织构建以治疗一些机体无法自然修复的组织细胞损伤, 有着良好的临床应用前景.
收稿日期: 2006-05-11; 接受日期: 2006-07-07
* 国家重点基础研究发展规划(973计划)(批准号: 2001CB510106)资助项目 ** 联系人, E-mail: [email protected]
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细胞汇合程度逐渐降低.
利用免疫沉淀印迹技术、荧光激活的细胞分选 术(FACS)、免疫磁珠分选技术等已鉴定了许多MSCs 的表面抗原. STRO-1是最早被发现的、非特异性识 别骨髓单个核细胞表面抗原分子的抗体分子之一, 可富集人骨髓中能形成CFU-F 的细胞. STRO-1联合使用血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)/CD106的抗体可以筛选出STRO-1+ VCAM-1+的亚细胞群, 这些细胞形成CFU-F 的几率接近50%. 多潜能的MSCs 就存在于STRO-1+细胞群中. SH2抗体可以识别MSCs 表面的转化生长因子β(TGFβ) 受体Ⅲ, 也即CD105; SH3和SH4抗体识别CD73; SB10抗体识别活化的白细胞黏附分子(ALCAM)/CD166. 实验显示, 人MSCs 除了表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1), ICAM-2, VCAM-1, CD72, 白细胞功能相关抗原-3(LFA-3)外, 还表达整合素α1(CD49a), α2(CD49b), α3(CD49c), α5(CD49e), α6(CD49f), αV , β1, β3和β4(CD104), 低度表达CD44, 而不表达CD34, CD45, CD117(cKit), Ⅰ型HLA 和HLA-DR . 但是, 上述MSCs 阳性的表面抗原也表达于其它细胞表面, 因此, 阻碍了对体内MSCs 的增殖、动员和归巢的研究工作, 亟需发现一个特异性的人MSCs 表面标记. 研究者一般联合应用多种抗体分子来鉴别人MSCs, 如STRO-1, SH2, SH3, SH4等, 同时MSCs 缺少造血细胞的特异性标志, 如CD45, CD34和CD14.
干细胞分离纯化的方法有多种, 包括: (ⅰ) 利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法; (ⅱ) 选择性的细胞凝聚; (ⅲ) 基于不同黏附特性的细胞分离方法; (ⅳ) 利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法等
培养瓶底分离, 而巨噬细胞、单核细胞等仍然贴附. 随着传代次数的增加, MSCs逐步得到纯化. 除了骨髓, 也可从脂肪、脐血、胎盘组织中分离得到MSCs , 与骨髓来源者比较, 它们具有相似的细胞形态、表面抗原、基因表达和增殖、分化能力, 因取材方便, 这些组织有望代替骨髓成为成体干细胞的来源. 另外, 研究者还分别从胎儿、成人、老年人的皮肤和骨骼肌的结缔组织中、脐静脉内皮下层、成人膝关节滑膜等处分离出多潜能性的MSCs .
关于MSCs 的分化潜能: 一则, 体外实验显示在特定培养条件下, MSCs可分化为中胚层起源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞; 内胚层起源的肝细胞、胰岛β细胞; 外胚层起源的视网膜细胞、神经细胞和神经胶质细胞等. 二则, 动物实验和临床实验表明, 将全骨髓或初步纯化的骨髓MSCs 移植入损伤或转基因动物以及病人体内, 骨髓干细胞可以迁移并分化为骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、胆管细胞、表皮细胞、消化管细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡细胞、胰岛β细胞、肾细胞、神经细胞和神经胶质细胞等[14].
2 间充质干细胞的分化诱导
2.1 向成骨细胞的分化诱导
在生长培养液中添加一定浓度范围的地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸可以使人骨髓MSCs 分化为成骨细胞, 表现为碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和骨钙蛋白等基因表达增强, 以及细胞外基质钙盐沉积、骨结节形成. 单独使用骨形态形成蛋白7(BMP-7)即可诱导人骨髓MSCs 分化为成骨细胞
.
.
以骨髓MSCs 的分离纯化为例, 骨髓细胞经Percoll (1.073 g/mL)或Ficoll-Paque(1.077 g/mL)密度梯度离心获得单个核细胞后, 再用FACS 或免疫磁珠分选技术去除CD45和血型糖蛋白-A (GlyA) 细胞, 可使 MSCs 得到进一步纯化. 即使经多级分离步骤得到的原代培养物中, 除了呈成纤维细胞样的MSCs 外, 还混杂有一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等. 对于红细胞, 因其不贴壁, 可通过换液除去. 对于贴壁细胞, 可根据其黏附能力的不同, 通过控制胰蛋白酶-EDTA 的消化时间, 保证MSCs 在短时间内与
+
+
+
甲状旁腺激素(PTH)和1,25-二羟维生素D3在人骨髓MSCs 分化过程中, 能使骨钙蛋白和碱性磷酸酶基因处于高表达状态, BMP-6可以增强它们的作用, BMP-6和BMP-4还可加强PTH 和维生素D3引起的钙盐沉积[17].
2.2 向软骨细胞的分化诱导
首先将人骨髓MSCs 离心使其成为细胞团, 然后在无血清培养液中添加转化生长因子β3(TGFβ3) [17]或者再添加BMP-6, 地塞米松和抗坏血酸等
可使
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细胞具有软骨细胞的特征: 细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白聚糖增加. 成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)可以增强人骨髓MSCs 的增殖能力和软骨分化潜能骨细胞
[20]
和β-巯基乙醇, 可使大鼠骨髓MSCs 分化为分泌胰岛素和巢蛋白的胰岛β细胞
[27]
; 激活素A, 氨基乙磺酸
.
和EGF 可诱导骨髓CD90+ MSCs 在体外分化为光感受器细胞, 有视紫红质、视蛋白等特异性基因表 达
[28]
TGF β还可使大鼠骨髓MSCs 分化为髓核或椎间盘软
. 在TGF β3和地塞米松的基础上再分别添
[21]
; 在肝细胞生长因子和制瘤素M 作用下人骨髓
加BMP-2, BMP-4或BMP-6, 均可增加人骨髓MSCs 向软骨细胞分化, 其中以BMP-2作用最强烈的软骨形成诱导作用.
. 联合
TGF β3和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)也具有非常强
MSCs 在体外可分化为骰状的肝细胞, 具有分泌白蛋白、尿素, 贮存糖原, 摄取低密度脂蛋白等功能[29].
3 间充质干细胞的分化调节机制
至今对MSCs 的分化调节机制尚不十分清楚. 基因的随机阻遏或诱导模型可能与MSCs 分化调节有关
2.3 向肌细胞的分化诱导
人骨髓MSCs 在含有2% FBS, 表皮生长因子(EGF), 血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)和5-氮胞苷的培养液中培养一段时间后, 可检测到MYO-D 和myogenin 转录因子
. 体内的某种信号分子, 可以增强或抑制MSCs 分
化信号通路中一些蛋白分子(包括各种激酶和转录因子) 的活性而诱导某些基因的表达, 进而使干细胞向某一类型细胞分化. 上述MSCs 的分化诱导剂可能就是通过改变这些蛋白分子的活性而起作用的.
. 5-氮胞苷还可使人骨髓
MSCs 在体外分化为心肌细胞, 合成心肌细胞特征性蛋白如β肌球蛋白重链、结蛋白、α-心肌肌动蛋白和心脏肌钙蛋白T 等[23].
3.1 参与MSCs 分化过程的主要蛋白分子
(1) ERK: 细胞外信号调节激酶(ERK)在其上游激酶MEK(MAPK/ERKK)的作用下发生磷酸化后被激活. Jaiswal等人
2.4 向神经细胞和神经胶质细胞的分化诱导
在生长培养液中加入β-巯基乙醇可以使人骨髓MSCs 分化为神经元
报道, 人骨髓MSCs 是向成骨细
, 有神经元特异性烯醇化酶和
胞还是向脂肪细胞分化是由ERK 调节的, 在用MEK 特异性抑制剂PD98059抑制了MAPK 通路后, MSCs则分化为成熟的脂肪细胞. 骨质疏松病人的p-ERK 水平比正常人明显提高, 对成骨刺激物的反应性下降
神经丝-M 和tau 等基因表达, 第一次证实了MSCs 在体外可分化为神经元. 异丁基甲基黄嘌呤和双丁酰环磷腺苷也可以促进人骨髓MSCs 体外分化为神经细胞, 各种神经营养因子如脑源性神经营养因子(BDNF), EGF, FGF-2等也具有这种作用
, 也证明了ERK 在骨形成中的重要作用. (2) Runx2和Cbf β: 在MSCs 向成骨细胞分化、骨
. EGF 联合
FGF-2还可使人骨髓MSCs 体外分化为Schwann 细 胞.
形成过程中, Runx2和Cbf β互相影响, 共同起着重要作用. Runx2与DNA 的有效结合以及Runx2依赖的转录激活必须有Cbf β的存在, Cbfβ缺失时, Runx2只能局限调节骨形成. Runx2能通过与含有PuCCPuCA 核心序列的特异性增强子区域相结合而直接激活成骨细胞相关基因的转录, 如编码骨钙蛋白、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和胶原酶3等的基因. 过度表达Runx2虽然可以促进软骨内骨化, 但只能使成骨细胞处于不成熟的前体细胞状态[33,34].
MAPK 通路激活, 活化的ERK 可使Runx2磷酸化而具有活性; cAMP-蛋白激酶途径激活, 则可通过泛素的作用使Runx2浓度降低; 磷酸化不同部位的氨基
2.5 向脂肪细胞的分化诱导
在生长培养液中加入异丁基甲基黄嘌呤、地塞 米松或氢化可的松、吲哚美辛以及胰岛素可使人骨髓MSCs 在体外分化为脂肪细胞
[15,18]
. 分化过程中, 细
胞表现为脂肪空泡累积, 过氧化物酶增殖激活受体 γ (PPARγ) 、脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白等基因 表达增加.
2.6 向其它类型细胞的分化诱导
先后在含有血清和无血清培养液中加入烟酰胺
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酸残基, Runx2的转录活性不同, 如磷酸化Runx2的一个保守性丝氨酸残基(Ser104), 则抑制Runx2的转录活性及其与Cbf β形成异源二聚体.
(3) Osx: Osterix(Osx)是一个含有锌指结构的转录因子, 在体内成骨细胞分化过程中, 具有比Runx2/ Cbfa1更高的特异性, 在Runx2的下游发挥作用. Osx可以使表达Runx2的骨原细胞定向分化为成骨细胞, 因此, Osx在软骨内成骨过程中具有分离成骨细胞系和软骨细胞系的作用. 可以认为, Runx2和Cbf β主要在MSCs 向成骨细胞分化的早期起作用, 而Osx 使不成熟的前体成骨细胞进一步分化为成熟的成骨细胞.
(4) Sox9: 人骨髓MSCs 体外分化为软骨细胞过程中, Sox9表达增加. Sox9是MSCs 向软骨细胞 谱系分化的转录因子, Runx2的活化需要Sox9参与, 而Osx 能抑制Sox9的活化.
(5) PPARγ和C/EBPs: PPARγ和CCAAT-增强子 结合蛋白(C/EBPs)都是核激素受体家族的成员. 噻唑烷二酮是PPAR γ的特异性配体, 可诱导人MSCs 向脂肪细胞分化. C/EBPβ和C/EBPγ在脂肪细胞形成的早期过程中表达, 它们可诱导PPAR γ表达和/或活化, 活化的PPAR γ则可引起脂肪细胞特异性基因表达. 与PPAR γ同时表达的C/EBPα可与其协同作用, 诱导其它的靶基因, 并维持PPAR γ在成熟脂肪细胞的高水平表达
[37,38]
成骨细胞, 表现为减少基质矿化, 降低碱性磷酸酶的表达和活性
[42]
. Wnt家族的非经典成员Wnt5a 可促进
MSCs 分化为成骨细胞.
(7) RB: 视网膜母细胞瘤蛋白(RB)在体内与Runx2相互作用, 以Runx2依赖的形式与骨形成特异性启动子结合, 两者协同激活骨形成特异性基因的表达, 因此, RB是促进MCSs 向成骨细胞分化的协 同蛋白. RB和RB2/P130可诱导大鼠MSCs 神经特异性基因表达, 使其分化为神经样细胞, 而且该作用与组蛋白脱乙酰基酶(HDACs)的活性有关[43].
3.2 部分分化诱导剂在MSCs 分化中的调节作用机制
TGF βs 和BMPs 都是TGF β超家族的成员. 它们分别作用于细胞表面的Ⅱ或Ⅰ型跨膜丝/苏氨酸激酶受体, 使其与两种受体Smad 蛋白分子(R-Smads)及一个共有的Smad4蛋白分子结合形成异三聚复合物(R-Smads-Smad4), 然后转位于细胞核, 可以直接与靶基因的增强子序列(Smad结合组件, SBEs)结合, 或是与CBP 或p300等共同作用, 也可上调Runx2和Osx 的活性而调节软骨和骨形成
[32,44]
. TGF-βs 在MSCs 向
软骨细胞和成骨细胞分化的早期过程中具有重要作用, 但却抑制MSCs 向成骨细胞的晚期分化过程, 同时还抑制MSCs 向脂肪细胞、肌细胞分化. BMPs可抑制MSCs 向脂肪细胞、肌细胞分化, 但能有效促进MSCs 向成骨细胞分化[45].
FGF-2可通过激活MEK 使ERK1和ERK2磷酸化, 继而使Runx2磷酸化, 磷酸化的Runx2即与骨钙蛋白(OC)启动子的特异性位点结合, 使MSCs 编码OC 的基因进行转录, 提高OC mRNA的水平[32,34].
IGF-1可以上调Osx 的活性, 与BMP-2具有协同作用, 但对Runx2的活性无影响. MAPK被认为是BMP-2和IGF-1信号通路的共同调节因素. 抑制ERK1/2的活性不影响Runx2表达, 但却抑制Osx 表达并影响基质矿化.
地塞米松可通过持续激活ERK(主要是ERK2) 来诱导MSCs 向成骨细胞分化
[30]
. 激活MAPK 通路可使PPAR γ磷酸化, 其转
录活性下降.
最新研究表明, C/EBPβ可与Runx2协同作用, 促进MSCs 向成骨细胞系分化. 肝富集抑制因子(LIP)是C/EBPβ的一个亚基, 它缺乏转录激活区, 但可与Runx2相联, 从而与骨钙蛋白基因启动子部位的C/EBP结合组件结合. 因此, LIP在控制MSCs 向成 骨细胞或脂肪细胞定向分化中具有重要作用[39].
(6) Wnt: Wnts是调节机体生长过程的信号蛋白, Wnt 信号通路可能由Wnt10b 介导, Wnt10b是控制脂肪形成的分子开关. Wnt信号通路通过抑制PPAR γ和C/EBPα而使前脂肪细胞处于未分化状态
[40]
. 实验证
明, 体外培养人骨髓MCSs 表达的蛋白分子与Wnt 信号通路中的分子相符, Wnt3a通过抑制GSK-3β而激活Wnt 信号通路
[41]
. 甲状旁腺激素(PTH)
可通过PKA 依赖的信号传导通路上调c-Fos/c- Jun的活性, 促使Runx2磷酸化, 激活胶原酶3启动子, 从
, 可促进MSCs 增殖而抑制其分化为
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而调节骨形成
. 1α,25-二羟维生素D3可以活化成
从囊性纤维化病人骨髓中分离出的MSCs, 经囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)基因修饰后仍可分化为气管上皮细胞
骨细胞OC 启动子, 而Runx2则能增强1 α,25-二羟维生素D3受体(VDR)与维生素D3受体应答组件(VDRE)相互作用的稳定性胞分化.
, 因此, MSCs有可能用于治疗视
. 另外, 1 α,25-二羟维生素D3网膜病变和肺囊性纤维化.
可以降低PPAR γ2的活性, 从而抑制MSCs 向脂肪细
5 问题和展望
综上所述, 人们已经对MSCs 的生物学特点、分化诱导条件及其机制等有了较深入的认识, 但是对MSCs 分化的研究仍存在许多问题. 首先, 对于 MSCs 表面抗原的研究, 大多采用MSCs 体外培养后传代的第一代细胞, 而这些抗原在原代培养的细胞表面大多没有表达; 同时, 各实验室报道的MSCs 表型也并不完全一致, 因此, 目前仍缺乏识别MSCs 的特异性标记以证实体内MSCs 的存在, 从而限制了MSCs 的纯化程度. 其次, 目前的实验研究并不能完全证明MSCs 的“可塑性”, 因为它们不能排除骨髓中的造血细胞如巨噬细胞和体内分化成熟的特有组织细胞发生融合的可能性, 而且缺少重复性, 亟需更精确、更灵敏的实验技术和方法. 再者, MSCs体外分 化的培养体系中大都含有血清, 干扰了对其分化诱导剂确切作用的研究, 有必要建立完善的无血清培养体系. 同时, 对MSCs 分化机制的研究主要集中于向成骨细胞分化、向软骨细胞分化和向脂肪细胞分 化, 体内实验多是应用转基因或基因敲除的动物模型为依据, 尚缺少人MSCs 体内分化机制的直接证据. 即使研究较多的骨形成分化机制也有许多不清楚的问题, 如Osx 下游基因的活化是否需要Runx2和Osx 的共同作用; 如果是, Runx2和Osx 又是如何相互作用的; 是否有其它转录因子的参与等等. 至于各种生长因子、细胞因子和激素是如何在体内共同发挥调 节作用的, 也并不清楚. 最后, 如何序贯使用各种生长因子和细胞因子等, 使MSCs 在体内外形成有功能的组织或器官, 仍是一个重大问题.
细胞与分子生物学理论和技术的快速发展将会使上述问题的解决成为可能, MSCs在多种组织、器官的修复和替代上的作用会越来越重要. 另外, 还可应用自体MSCs 来测试病人对转录因子、细胞因子、生长因子和药物等的敏感性, 这将有助于疾病的预测和诊断. 总之, MSCs给21世纪的医学带来了新希
4 间充质干细胞分化诱导的应用前景
由于MSCs 的增殖能力和定向诱导分化潜能, 使其在矫形外科、心血管和神经系统等疾病的治疗中 均显示出良好的应用前景.
将MSCs 复合于骨组织工程支架材料, 可以修复动物体内大段的骨缺损
[49]
; 在将MSCs 和明胶复合物
植入山羊膝关节的全层软骨缺损处后, MSCs仍保持多项分化潜能并修复了软骨缺损
; 损伤的大鼠骨
[51]
骼肌可以诱导骨髓MSCs 分化为肌细胞潜能. 已有临床研究
[52]
. 上述实验
说明MSCs 在骨、软骨、骨骼肌损伤中有很好的应用
应用同种异体骨髓移植术治
疗儿童成骨不全症, 取得了显著的疗效. 另外, MSCs可以用于修复肌腱、韧带、椎间盘、半月板及其它结缔组织损伤[53], 还可用于脊柱融合术[54].
骨髓MSCs 移植联合使用血管内皮生长因子
(VEGF), MSCs在小鼠体内可分化为血管内皮细胞,
促进新生血管的形成肌细胞, 改善心肌功能修复中的血管再生.
; 在小鼠心肌缺血模型中, . 显示出MSCs 有望用于治
将异种或自体骨髓MSCs 植入心肌, 发现可分化为心
[56]
疗冠状动脉疾病, 如急性心肌梗死, 以及组织、器官
应用MSCs 可促进动物脊髓和坐骨神经损伤的修复
, 说明MSCs 有望用于治疗脊髓和外周神经损
伤性疾病. 在输入新生小鼠侧脑室后, MSCs可以增殖, 能够迁移至纹状体、大脑皮层和小脑区域, 并可分化为星形胶质细胞和神经元变性疾病.
另外, 骨髓干细胞移植术在治疗糖尿病、 Duchenne 肌营养不良症、肝、肾、皮肤损伤中都显示出较好的疗效. 实验显示, 将CD90+ MSCs 植入大鼠视网膜下, 可融入视网膜形成光感受器细胞层
[59]
, 提示MSCs 有可能
用于治疗脑中风、创伤性损伤和帕金森氏病等神 经
;
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望, 对MSCs 的深入研究和应用必将在不远的将来造福人类.
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486 中国科学 C 辑 生命科学 2006, 36 (6): 486~492
间充质干细胞的特性与分化诱导研究进展
唐文洁
①②
*
李玛琳 洪 岸
①
②**
(① 昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室, 昆明 650031; ② 暨南大学生物工程研究所, 广州 510632)
摘要 间充质干细胞(MSCs)是成体干细胞的一种, 广泛存在于人体的间充质组织中, 具有自我复制能力和多项分化潜能. 单独或联合使用某些细胞因子、生长因子、激素、维生素、抗氧化剂和抗肿瘤药物等, 可诱导MSCs 在体外培养条件下向某一谱系细胞分化. 鉴于MSCs 的上述特点, 使其有着非常诱人的临床应用前景, 可以用于许多种疾病的治疗. 本文从MSCs 的生物学特性、MSCs 的分化诱导、分化调节机制及应用前景等方面进行了评述. 关键词 间充质干细胞 分化 诱导 调节机制 应用 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种多潜能成体干细胞, 在人体发生、发育过程中存在于许多种组织中. 20世纪70年代中期, Frieden-stein 等人
[1]
1 间充质干细胞的生物学特性
MSCs 具有干细胞的一般生物学特点: 具有自我复制能力和多项分化潜能; 属非终末分化细胞, 终生保持未分化或低分化特征, 缺乏分化标记; 分化情况受所处微环境(干细胞壁龛) 的影响; 通过对称性和非对称性分裂两种方式生长; 具有分裂的慢周期性, 绝大多数干细胞处于G 0期等
从骨髓中获得了少数能贴壁生长的细胞,
这些细胞能分化为成骨或软骨样的沉着物, 该发现被认为首次证实了MSCs 的存在. 目前, 已经从成人的多种间充质组织中分离得到MSCs, 这些细胞在体外可以扩增并且可以分化为骨、软骨、骨髓基质、肌腱、韧带、脂肪等多种结缔组织细胞, 以及骨骼肌细胞、神经细胞和神经胶质细胞等等
[2~4]
. MSCs在体外增殖过程
中, 能形成成纤维细胞样集落形成单位(CFU-F), 一般可扩增10~15代. 随着代次的增加, 传代间隔逐渐延长, 细胞增殖速度逐渐降低. 约10代以后, 细胞出现衰老症状: 细胞逐渐停止分裂、由纺锤体形变得宽大扁平, 培养液中的细胞碎片和纤维逐渐增加. 随着细胞群体倍增次数的增加, CFU-F的数目和大小逐渐降低, 直至消失, CFU-F内的细胞形态逐渐宽大扁平,
. 而且, 不论
是自体的还是同种异源的MSCs 一般都不会引起宿主的免疫反应. 因此, MSCs可以作为组织工程的种子细胞, 用于组织构建以治疗一些机体无法自然修复的组织细胞损伤, 有着良好的临床应用前景.
收稿日期: 2006-05-11; 接受日期: 2006-07-07
* 国家重点基础研究发展规划(973计划)(批准号: 2001CB510106)资助项目 ** 联系人, E-mail: [email protected]
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唐文洁等: 间充质干细胞的特性与分化诱导研究进展 487
细胞汇合程度逐渐降低.
利用免疫沉淀印迹技术、荧光激活的细胞分选 术(FACS)、免疫磁珠分选技术等已鉴定了许多MSCs 的表面抗原. STRO-1是最早被发现的、非特异性识 别骨髓单个核细胞表面抗原分子的抗体分子之一, 可富集人骨髓中能形成CFU-F 的细胞. STRO-1联合使用血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)/CD106的抗体可以筛选出STRO-1+ VCAM-1+的亚细胞群, 这些细胞形成CFU-F 的几率接近50%. 多潜能的MSCs 就存在于STRO-1+细胞群中. SH2抗体可以识别MSCs 表面的转化生长因子β(TGFβ) 受体Ⅲ, 也即CD105; SH3和SH4抗体识别CD73; SB10抗体识别活化的白细胞黏附分子(ALCAM)/CD166. 实验显示, 人MSCs 除了表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1), ICAM-2, VCAM-1, CD72, 白细胞功能相关抗原-3(LFA-3)外, 还表达整合素α1(CD49a), α2(CD49b), α3(CD49c), α5(CD49e), α6(CD49f), αV , β1, β3和β4(CD104), 低度表达CD44, 而不表达CD34, CD45, CD117(cKit), Ⅰ型HLA 和HLA-DR . 但是, 上述MSCs 阳性的表面抗原也表达于其它细胞表面, 因此, 阻碍了对体内MSCs 的增殖、动员和归巢的研究工作, 亟需发现一个特异性的人MSCs 表面标记. 研究者一般联合应用多种抗体分子来鉴别人MSCs, 如STRO-1, SH2, SH3, SH4等, 同时MSCs 缺少造血细胞的特异性标志, 如CD45, CD34和CD14.
干细胞分离纯化的方法有多种, 包括: (ⅰ) 利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法; (ⅱ) 选择性的细胞凝聚; (ⅲ) 基于不同黏附特性的细胞分离方法; (ⅳ) 利用细胞表面标志分离纯化细胞的方法等
培养瓶底分离, 而巨噬细胞、单核细胞等仍然贴附. 随着传代次数的增加, MSCs逐步得到纯化. 除了骨髓, 也可从脂肪、脐血、胎盘组织中分离得到MSCs , 与骨髓来源者比较, 它们具有相似的细胞形态、表面抗原、基因表达和增殖、分化能力, 因取材方便, 这些组织有望代替骨髓成为成体干细胞的来源. 另外, 研究者还分别从胎儿、成人、老年人的皮肤和骨骼肌的结缔组织中、脐静脉内皮下层、成人膝关节滑膜等处分离出多潜能性的MSCs .
关于MSCs 的分化潜能: 一则, 体外实验显示在特定培养条件下, MSCs可分化为中胚层起源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞; 内胚层起源的肝细胞、胰岛β细胞; 外胚层起源的视网膜细胞、神经细胞和神经胶质细胞等. 二则, 动物实验和临床实验表明, 将全骨髓或初步纯化的骨髓MSCs 移植入损伤或转基因动物以及病人体内, 骨髓干细胞可以迁移并分化为骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞、胆管细胞、表皮细胞、消化管细胞、Ⅰ型和Ⅱ型肺泡细胞、胰岛β细胞、肾细胞、神经细胞和神经胶质细胞等[14].
2 间充质干细胞的分化诱导
2.1 向成骨细胞的分化诱导
在生长培养液中添加一定浓度范围的地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸可以使人骨髓MSCs 分化为成骨细胞, 表现为碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和骨钙蛋白等基因表达增强, 以及细胞外基质钙盐沉积、骨结节形成. 单独使用骨形态形成蛋白7(BMP-7)即可诱导人骨髓MSCs 分化为成骨细胞
.
.
以骨髓MSCs 的分离纯化为例, 骨髓细胞经Percoll (1.073 g/mL)或Ficoll-Paque(1.077 g/mL)密度梯度离心获得单个核细胞后, 再用FACS 或免疫磁珠分选技术去除CD45和血型糖蛋白-A (GlyA) 细胞, 可使 MSCs 得到进一步纯化. 即使经多级分离步骤得到的原代培养物中, 除了呈成纤维细胞样的MSCs 外, 还混杂有一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等. 对于红细胞, 因其不贴壁, 可通过换液除去. 对于贴壁细胞, 可根据其黏附能力的不同, 通过控制胰蛋白酶-EDTA 的消化时间, 保证MSCs 在短时间内与
+
+
+
甲状旁腺激素(PTH)和1,25-二羟维生素D3在人骨髓MSCs 分化过程中, 能使骨钙蛋白和碱性磷酸酶基因处于高表达状态, BMP-6可以增强它们的作用, BMP-6和BMP-4还可加强PTH 和维生素D3引起的钙盐沉积[17].
2.2 向软骨细胞的分化诱导
首先将人骨髓MSCs 离心使其成为细胞团, 然后在无血清培养液中添加转化生长因子β3(TGFβ3) [17]或者再添加BMP-6, 地塞米松和抗坏血酸等
可使
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细胞具有软骨细胞的特征: 细胞外基质Ⅱ型胶原和蛋白聚糖增加. 成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)可以增强人骨髓MSCs 的增殖能力和软骨分化潜能骨细胞
[20]
和β-巯基乙醇, 可使大鼠骨髓MSCs 分化为分泌胰岛素和巢蛋白的胰岛β细胞
[27]
; 激活素A, 氨基乙磺酸
.
和EGF 可诱导骨髓CD90+ MSCs 在体外分化为光感受器细胞, 有视紫红质、视蛋白等特异性基因表 达
[28]
TGF β还可使大鼠骨髓MSCs 分化为髓核或椎间盘软
. 在TGF β3和地塞米松的基础上再分别添
[21]
; 在肝细胞生长因子和制瘤素M 作用下人骨髓
加BMP-2, BMP-4或BMP-6, 均可增加人骨髓MSCs 向软骨细胞分化, 其中以BMP-2作用最强烈的软骨形成诱导作用.
. 联合
TGF β3和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)也具有非常强
MSCs 在体外可分化为骰状的肝细胞, 具有分泌白蛋白、尿素, 贮存糖原, 摄取低密度脂蛋白等功能[29].
3 间充质干细胞的分化调节机制
至今对MSCs 的分化调节机制尚不十分清楚. 基因的随机阻遏或诱导模型可能与MSCs 分化调节有关
2.3 向肌细胞的分化诱导
人骨髓MSCs 在含有2% FBS, 表皮生长因子(EGF), 血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)和5-氮胞苷的培养液中培养一段时间后, 可检测到MYO-D 和myogenin 转录因子
. 体内的某种信号分子, 可以增强或抑制MSCs 分
化信号通路中一些蛋白分子(包括各种激酶和转录因子) 的活性而诱导某些基因的表达, 进而使干细胞向某一类型细胞分化. 上述MSCs 的分化诱导剂可能就是通过改变这些蛋白分子的活性而起作用的.
. 5-氮胞苷还可使人骨髓
MSCs 在体外分化为心肌细胞, 合成心肌细胞特征性蛋白如β肌球蛋白重链、结蛋白、α-心肌肌动蛋白和心脏肌钙蛋白T 等[23].
3.1 参与MSCs 分化过程的主要蛋白分子
(1) ERK: 细胞外信号调节激酶(ERK)在其上游激酶MEK(MAPK/ERKK)的作用下发生磷酸化后被激活. Jaiswal等人
2.4 向神经细胞和神经胶质细胞的分化诱导
在生长培养液中加入β-巯基乙醇可以使人骨髓MSCs 分化为神经元
报道, 人骨髓MSCs 是向成骨细
, 有神经元特异性烯醇化酶和
胞还是向脂肪细胞分化是由ERK 调节的, 在用MEK 特异性抑制剂PD98059抑制了MAPK 通路后, MSCs则分化为成熟的脂肪细胞. 骨质疏松病人的p-ERK 水平比正常人明显提高, 对成骨刺激物的反应性下降
神经丝-M 和tau 等基因表达, 第一次证实了MSCs 在体外可分化为神经元. 异丁基甲基黄嘌呤和双丁酰环磷腺苷也可以促进人骨髓MSCs 体外分化为神经细胞, 各种神经营养因子如脑源性神经营养因子(BDNF), EGF, FGF-2等也具有这种作用
, 也证明了ERK 在骨形成中的重要作用. (2) Runx2和Cbf β: 在MSCs 向成骨细胞分化、骨
. EGF 联合
FGF-2还可使人骨髓MSCs 体外分化为Schwann 细 胞.
形成过程中, Runx2和Cbf β互相影响, 共同起着重要作用. Runx2与DNA 的有效结合以及Runx2依赖的转录激活必须有Cbf β的存在, Cbfβ缺失时, Runx2只能局限调节骨形成. Runx2能通过与含有PuCCPuCA 核心序列的特异性增强子区域相结合而直接激活成骨细胞相关基因的转录, 如编码骨钙蛋白、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和胶原酶3等的基因. 过度表达Runx2虽然可以促进软骨内骨化, 但只能使成骨细胞处于不成熟的前体细胞状态[33,34].
MAPK 通路激活, 活化的ERK 可使Runx2磷酸化而具有活性; cAMP-蛋白激酶途径激活, 则可通过泛素的作用使Runx2浓度降低; 磷酸化不同部位的氨基
2.5 向脂肪细胞的分化诱导
在生长培养液中加入异丁基甲基黄嘌呤、地塞 米松或氢化可的松、吲哚美辛以及胰岛素可使人骨髓MSCs 在体外分化为脂肪细胞
[15,18]
. 分化过程中, 细
胞表现为脂肪空泡累积, 过氧化物酶增殖激活受体 γ (PPARγ) 、脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白等基因 表达增加.
2.6 向其它类型细胞的分化诱导
先后在含有血清和无血清培养液中加入烟酰胺
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唐文洁等: 间充质干细胞的特性与分化诱导研究进展 489
酸残基, Runx2的转录活性不同, 如磷酸化Runx2的一个保守性丝氨酸残基(Ser104), 则抑制Runx2的转录活性及其与Cbf β形成异源二聚体.
(3) Osx: Osterix(Osx)是一个含有锌指结构的转录因子, 在体内成骨细胞分化过程中, 具有比Runx2/ Cbfa1更高的特异性, 在Runx2的下游发挥作用. Osx可以使表达Runx2的骨原细胞定向分化为成骨细胞, 因此, Osx在软骨内成骨过程中具有分离成骨细胞系和软骨细胞系的作用. 可以认为, Runx2和Cbf β主要在MSCs 向成骨细胞分化的早期起作用, 而Osx 使不成熟的前体成骨细胞进一步分化为成熟的成骨细胞.
(4) Sox9: 人骨髓MSCs 体外分化为软骨细胞过程中, Sox9表达增加. Sox9是MSCs 向软骨细胞 谱系分化的转录因子, Runx2的活化需要Sox9参与, 而Osx 能抑制Sox9的活化.
(5) PPARγ和C/EBPs: PPARγ和CCAAT-增强子 结合蛋白(C/EBPs)都是核激素受体家族的成员. 噻唑烷二酮是PPAR γ的特异性配体, 可诱导人MSCs 向脂肪细胞分化. C/EBPβ和C/EBPγ在脂肪细胞形成的早期过程中表达, 它们可诱导PPAR γ表达和/或活化, 活化的PPAR γ则可引起脂肪细胞特异性基因表达. 与PPAR γ同时表达的C/EBPα可与其协同作用, 诱导其它的靶基因, 并维持PPAR γ在成熟脂肪细胞的高水平表达
[37,38]
成骨细胞, 表现为减少基质矿化, 降低碱性磷酸酶的表达和活性
[42]
. Wnt家族的非经典成员Wnt5a 可促进
MSCs 分化为成骨细胞.
(7) RB: 视网膜母细胞瘤蛋白(RB)在体内与Runx2相互作用, 以Runx2依赖的形式与骨形成特异性启动子结合, 两者协同激活骨形成特异性基因的表达, 因此, RB是促进MCSs 向成骨细胞分化的协 同蛋白. RB和RB2/P130可诱导大鼠MSCs 神经特异性基因表达, 使其分化为神经样细胞, 而且该作用与组蛋白脱乙酰基酶(HDACs)的活性有关[43].
3.2 部分分化诱导剂在MSCs 分化中的调节作用机制
TGF βs 和BMPs 都是TGF β超家族的成员. 它们分别作用于细胞表面的Ⅱ或Ⅰ型跨膜丝/苏氨酸激酶受体, 使其与两种受体Smad 蛋白分子(R-Smads)及一个共有的Smad4蛋白分子结合形成异三聚复合物(R-Smads-Smad4), 然后转位于细胞核, 可以直接与靶基因的增强子序列(Smad结合组件, SBEs)结合, 或是与CBP 或p300等共同作用, 也可上调Runx2和Osx 的活性而调节软骨和骨形成
[32,44]
. TGF-βs 在MSCs 向
软骨细胞和成骨细胞分化的早期过程中具有重要作用, 但却抑制MSCs 向成骨细胞的晚期分化过程, 同时还抑制MSCs 向脂肪细胞、肌细胞分化. BMPs可抑制MSCs 向脂肪细胞、肌细胞分化, 但能有效促进MSCs 向成骨细胞分化[45].
FGF-2可通过激活MEK 使ERK1和ERK2磷酸化, 继而使Runx2磷酸化, 磷酸化的Runx2即与骨钙蛋白(OC)启动子的特异性位点结合, 使MSCs 编码OC 的基因进行转录, 提高OC mRNA的水平[32,34].
IGF-1可以上调Osx 的活性, 与BMP-2具有协同作用, 但对Runx2的活性无影响. MAPK被认为是BMP-2和IGF-1信号通路的共同调节因素. 抑制ERK1/2的活性不影响Runx2表达, 但却抑制Osx 表达并影响基质矿化.
地塞米松可通过持续激活ERK(主要是ERK2) 来诱导MSCs 向成骨细胞分化
[30]
. 激活MAPK 通路可使PPAR γ磷酸化, 其转
录活性下降.
最新研究表明, C/EBPβ可与Runx2协同作用, 促进MSCs 向成骨细胞系分化. 肝富集抑制因子(LIP)是C/EBPβ的一个亚基, 它缺乏转录激活区, 但可与Runx2相联, 从而与骨钙蛋白基因启动子部位的C/EBP结合组件结合. 因此, LIP在控制MSCs 向成 骨细胞或脂肪细胞定向分化中具有重要作用[39].
(6) Wnt: Wnts是调节机体生长过程的信号蛋白, Wnt 信号通路可能由Wnt10b 介导, Wnt10b是控制脂肪形成的分子开关. Wnt信号通路通过抑制PPAR γ和C/EBPα而使前脂肪细胞处于未分化状态
[40]
. 实验证
明, 体外培养人骨髓MCSs 表达的蛋白分子与Wnt 信号通路中的分子相符, Wnt3a通过抑制GSK-3β而激活Wnt 信号通路
[41]
. 甲状旁腺激素(PTH)
可通过PKA 依赖的信号传导通路上调c-Fos/c- Jun的活性, 促使Runx2磷酸化, 激活胶原酶3启动子, 从
, 可促进MSCs 增殖而抑制其分化为
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而调节骨形成
. 1α,25-二羟维生素D3可以活化成
从囊性纤维化病人骨髓中分离出的MSCs, 经囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)基因修饰后仍可分化为气管上皮细胞
骨细胞OC 启动子, 而Runx2则能增强1 α,25-二羟维生素D3受体(VDR)与维生素D3受体应答组件(VDRE)相互作用的稳定性胞分化.
, 因此, MSCs有可能用于治疗视
. 另外, 1 α,25-二羟维生素D3网膜病变和肺囊性纤维化.
可以降低PPAR γ2的活性, 从而抑制MSCs 向脂肪细
5 问题和展望
综上所述, 人们已经对MSCs 的生物学特点、分化诱导条件及其机制等有了较深入的认识, 但是对MSCs 分化的研究仍存在许多问题. 首先, 对于 MSCs 表面抗原的研究, 大多采用MSCs 体外培养后传代的第一代细胞, 而这些抗原在原代培养的细胞表面大多没有表达; 同时, 各实验室报道的MSCs 表型也并不完全一致, 因此, 目前仍缺乏识别MSCs 的特异性标记以证实体内MSCs 的存在, 从而限制了MSCs 的纯化程度. 其次, 目前的实验研究并不能完全证明MSCs 的“可塑性”, 因为它们不能排除骨髓中的造血细胞如巨噬细胞和体内分化成熟的特有组织细胞发生融合的可能性, 而且缺少重复性, 亟需更精确、更灵敏的实验技术和方法. 再者, MSCs体外分 化的培养体系中大都含有血清, 干扰了对其分化诱导剂确切作用的研究, 有必要建立完善的无血清培养体系. 同时, 对MSCs 分化机制的研究主要集中于向成骨细胞分化、向软骨细胞分化和向脂肪细胞分 化, 体内实验多是应用转基因或基因敲除的动物模型为依据, 尚缺少人MSCs 体内分化机制的直接证据. 即使研究较多的骨形成分化机制也有许多不清楚的问题, 如Osx 下游基因的活化是否需要Runx2和Osx 的共同作用; 如果是, Runx2和Osx 又是如何相互作用的; 是否有其它转录因子的参与等等. 至于各种生长因子、细胞因子和激素是如何在体内共同发挥调 节作用的, 也并不清楚. 最后, 如何序贯使用各种生长因子和细胞因子等, 使MSCs 在体内外形成有功能的组织或器官, 仍是一个重大问题.
细胞与分子生物学理论和技术的快速发展将会使上述问题的解决成为可能, MSCs在多种组织、器官的修复和替代上的作用会越来越重要. 另外, 还可应用自体MSCs 来测试病人对转录因子、细胞因子、生长因子和药物等的敏感性, 这将有助于疾病的预测和诊断. 总之, MSCs给21世纪的医学带来了新希
4 间充质干细胞分化诱导的应用前景
由于MSCs 的增殖能力和定向诱导分化潜能, 使其在矫形外科、心血管和神经系统等疾病的治疗中 均显示出良好的应用前景.
将MSCs 复合于骨组织工程支架材料, 可以修复动物体内大段的骨缺损
[49]
; 在将MSCs 和明胶复合物
植入山羊膝关节的全层软骨缺损处后, MSCs仍保持多项分化潜能并修复了软骨缺损
; 损伤的大鼠骨
[51]
骼肌可以诱导骨髓MSCs 分化为肌细胞潜能. 已有临床研究
[52]
. 上述实验
说明MSCs 在骨、软骨、骨骼肌损伤中有很好的应用
应用同种异体骨髓移植术治
疗儿童成骨不全症, 取得了显著的疗效. 另外, MSCs可以用于修复肌腱、韧带、椎间盘、半月板及其它结缔组织损伤[53], 还可用于脊柱融合术[54].
骨髓MSCs 移植联合使用血管内皮生长因子
(VEGF), MSCs在小鼠体内可分化为血管内皮细胞,
促进新生血管的形成肌细胞, 改善心肌功能修复中的血管再生.
; 在小鼠心肌缺血模型中, . 显示出MSCs 有望用于治
将异种或自体骨髓MSCs 植入心肌, 发现可分化为心
[56]
疗冠状动脉疾病, 如急性心肌梗死, 以及组织、器官
应用MSCs 可促进动物脊髓和坐骨神经损伤的修复
, 说明MSCs 有望用于治疗脊髓和外周神经损
伤性疾病. 在输入新生小鼠侧脑室后, MSCs可以增殖, 能够迁移至纹状体、大脑皮层和小脑区域, 并可分化为星形胶质细胞和神经元变性疾病.
另外, 骨髓干细胞移植术在治疗糖尿病、 Duchenne 肌营养不良症、肝、肾、皮肤损伤中都显示出较好的疗效. 实验显示, 将CD90+ MSCs 植入大鼠视网膜下, 可融入视网膜形成光感受器细胞层
[59]
, 提示MSCs 有可能
用于治疗脑中风、创伤性损伤和帕金森氏病等神 经
;
SCIENCE IN CHINA Ser. C Life Sciences
第6期
唐文洁等: 间充质干细胞的特性与分化诱导研究进展 491
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