·464·
DOI:10. 13461/j.cn k i . cja. 002297
中国抗生素杂志1998年12月第23卷第6期
用固定化细胞技术连续生产麦迪霉素的研究
Continuous production of midecamycin
by immobilized cells
王鲁燕 赵炎生 杨晓阳 武俊民
Wang Luyan, Zhao Ya nsheng , Ya ng Xiaoya ng and W u Junmin
(中国药科大学微生物制药教研室, 南京210009)
(Depa rtm ent o f M ic robia l Pha rmaceutics ,
China Phar maceutica l U niv esity , N anjing 210009)
固定化细胞技术在初级代谢产物的发酵工业
中已展示了巨大的生命力, 而对放线菌细胞固定化进行抗生素生产仍处在开发阶段。本试验选用生米卡链霉菌, 以不同方法进行固定化, 并对固定化颗粒用激光微束照射后, 作麦迪霉素的连续化生产, 本文报道初步探索性研究结果。1 材料和方法
1. 1 菌株及培养基成分
实验菌株为生米卡链霉菌(Streptomyces my -carofacieus ) , 培养基成分见文献[1]。1. 2 方法
1. 2. 1 卡拉胶固定菌丝
用生理盐水配制2. 5%的卡拉胶溶液, 灭菌冷却至45℃, 与适量菌丝混合, 冷却凝固后, 放入28℃恒温箱中干燥5h, 切成9mm 小块, 置于2%KCl 溶液中硬化过夜。1. 2. 2 海绵固定菌丝
将海绵切成4mm 3小块, 置于500ml 三角瓶中, 置入量应以能覆盖瓶底为宜, 加入50ml 培养基, 灭菌后备用。取一支新鲜斜面孢子接入其中, 于28℃, 摇床培养(150r /min ) 48h , 再将海绵移入含发酵培养基的摇瓶中, 继续培养。
1. 2. 3 海藻酸钠固定孢子
配制4%海藻酸钠溶液, 灭菌后与适量孢子悬液混匀, 将其用9号针头逐渐滴入0. 2mol /LCa Cl 2中, 不断搅拌, 即成珠状颗粒(直径3mm ) , 用Ca Cl 2溶液继续浸泡2h, 再置于含0. 05%戊二
本文参加第八次全国抗生素学术会议交流, [3]
3
[2]
醛的0. 05m ol /LCa Cl 2溶液中浸泡2h, 用蒸馏水
洗涤多次, 备用。1. 2. 4 激光微束照射
由三倍频YAG 激光器与倒置生物显微镜组成激光微束系统。将固定化细胞置于无菌平皿中, 平皿放置在倒置显微镜载物台上, 使用不同功率和波长的激光通过显微镜聚焦照射于固定化细胞颗粒上。1. 2. 5 固定化细胞的发酵
将适量固定化细胞移入装有50m l 种子培养基的500ml 三角瓶中。28℃摇床培养(150r /min)48h, 再将固定化细胞移入发酵培养基中进行发酵, 每24h 取样测定麦迪霉素含量, 并取出总体积1/3的发酵液, 加入等体积的新鲜培养基, 继续发酵。游离菌对照试验以同法操作。
1. 2. 6 效价测定
麦迪霉素发酵液经离心(3000r /min ) 20min , 上清液用管碟法测定效价。2 结果与讨论2. 1 卡拉胶固定菌丝
菌丝经卡拉胶固定后接入发酵培养基, 并定时更换发酵液进行连续培养, 检测其产生抗生素能力的变化情况, 其相对效价见表1。
由表1可知, 菌丝经卡拉胶包埋后进行发酵, 产生抗生素的水平较游离菌丝低得多, 可能是传质的影响较大, 表明该介质不适宜于麦迪霉素产生菌的固定化。
中国抗生素杂志1998年12月第23卷第6期
表1 麦迪霉素产生菌菌丝卡拉胶固定化发酵
的相对效价
发酵时间(h)
方 法
48
游离细胞 固定化细胞
10026. 8
9695. 632. 5
14449. 329. 5
19231. 211. 2
24010. 6
2883. 2
·465·
发酵液抑菌圈直径, 见图2。
结果表明, 0. 05%戊二醛对固定化孢子无明显毒害作用, 不影响孢子萌发后的产生抗生素能力。2. 3. 3 海藻酸钠固定化孢子的连续发酵
生米卡链霉菌孢子经5%海藻酸钠固定后, 发酵效价可达到游离细胞的66%, 若将固定化颗粒经激光微束照射后(波长530nm , 8×10s, 5MW ) 发酵水平及发酵周期都明显增大, 连续发酵中产生抗生素能力的变化情况见图3。
-9
2. 2 海绵固定菌丝
海绵是一种价廉、易得的化工原料, 且介质内部疏松呈多孔状, 传质效果好, 菌丝在其内部生长
后, 经摇床培养连续发酵, 结果见图1。
由图1可知, 经海绵固定后, 发酵效价仅为游离菌丝发酵效价的57%, 但周期可延长一倍。海绵经过一个发酵周期, 可回收再利用, 使生产成本降低, 且培养过程中通气、搅拌也较易控制
。
图2 海藻酸钠包埋细胞后经0. 05%戊二醛
浸泡对产生抗生素的影响
1:经戊二醛浸泡; 2:不经戊二醛浸泡
图1 麦迪霉素产生菌菌丝经海绵固定后发酵的
相对效价
1:游离细胞; 2:固定化细胞
从图3分析可知, 经激光作用后固定化细胞产抗生素能力为游离细胞发酵的75%, 比未经激光微束照射的固定化细胞提高了9%, 半衰期可达近一个月。分析其原因, 激光照射一方面增加了固定化介质的通透性, 还可能引起了细胞变异。试验中我们发现, 在固定化培养发酵液中, 可检出大量游离菌丝, 它的唯一来源是固定在介质中的孢子萌发所致, 因此, 固定相不仅本身含有菌丝, 可以产抗生素, 更重要的是它可作为一个持续、稳定的孢子源。因而它与初级代谢产物的细胞固定化
2. 3 海藻酸钠固定孢子
2. 3. 1 孢子经不同浓度海藻酸钠固定对发酵的影响
麦迪霉素产生菌孢子经2. 5%、3%、4%、5%、6%等5种不同浓度的海藻酸钠固定后对发酵效价影响不大。从实验观察到当海藻酸浓度≤3%时, 颗粒强度较弱, 经过4d 培养, 固定化颗粒已有部分破碎, 当浓度>4%时, 经摇床培养(150r /min ) 30d 后, 颗粒仍完好无损。但海藻酸钠浓度过高一方面会使得细胞固定化过程难度加大, 另一方面会影响载体内外物质交换。因此, 我们选用5%的含量。
2. 3. 2 戊二醛对固定化孢子产生抗生素能力的影响
海藻酸钠包埋细胞后, 用0. 05%戊二醛浸泡
, 图3 海藻酸钠固定化孢子的连续发酵
1:游离孢子; 2:固定化孢子; :
·466·
(加底物、依靠固定化酶进行转化) 有着本质的区别。3 小结
利用孢子固定化方法连续生产麦迪霉素是一项有益的探索。研究表明, 此法操作步骤简便, 不易染菌, 可增加产生抗生素的稳定性和连续性, 值得进一步深入研究。
中国抗生素杂志1998年12月第23卷第6期
参考文献
#
1杨生玉, 谢秉姿. 麦迪霉素产生菌880103菌株的选育. 中国抗生素杂志, 1990; 15(6):412
2冯立, 陈向东, 彭珍荣. 卡拉胶固定粘质赛氏菌产碱性
蛋白酶的研究. 生物工程学报, 1994; 10(1):663赵景联. 固定化大肠杆菌细胞生产γ-氨基丁酸的研究. 生物工程学报, 1989; 5(2):124
(1997年7月15日收稿)
(上接第442页)
根据本试验结果和上述分析, 可以认为头孢他美酯是一种高效、安全、易于服用的广谱抗生素, 适合于临床应用。
参考文献
1小林宏行, 山口和政, 宇土研二 他. Effect o f pro -benecid on the pha rmacokine tics o f DQ -2556, a new 3-quater na ry ammo nium cephalosporin a ntibio tic, in hu-ma ns. Chemo therapy , 1990; 38(6) ; 617, 38
2N eu H C , Chin N X , Labthaviknl P . In v itro activ ity a nd β-lactamase sta bility of tw o or al cephalosporins , cefte trame (Ro 19-5247) and ceftamet (Ro15-8074).
Antimicro b Ag ents Chemo ther , 1986; 30:423
3出口浩一, 横田のそみ, 古口昌美. 外来患者由来新鲜临床分离株に对するcefteram の抗菌力. J pn J A nti -biot, 1989; 42(5):1216
4Chang S C, Hsien W C, L uh K T et al . Antimic robia l ac tiv ities o f six new o ral cephem a ntibio tics. J For mos M ed Assoc , 1990; 89(8):661
5大泉耕太郎, 岩本英男, 中村浩 他. Basic and clinica l st udies on biapenem (L -627) in o bste trics a nd g yne-co lo gy . Jpn J Antibio t , 1994; 47(12):1613
6李光辉. 第三代口服头孢菌素特仑酯. 国外医药抗生素分册, 1996; 17(2):101
(1997年6月26日收稿)
Randomized comparative analysis of cefetamet pivoxil and
cefixime in the treatment of bacterial infections
Zhu Ning , Liu Demeng a nd Hu Wenzhi
(The 2nd Teaching H o spital , Tianjin M edical U niv ersity , Tianjin 300211)
Fo rty cases of low er respiratory tract bacterial infections and urina ry tract bacterial ABSTRACT
infectio ns w ere randomized and tested co mpa ra tiv ely w ith cefetam et piv oxil and cefixime. Clinical to tal efficacy rates w ere 95%and 100%(P >0. 05) , recov ery ra tes o f bo th tw o g roups w ere 85%(P =1).
%a nd 88. 9%(P >0. 05). Bo th cefetamet piv oxil and cefixime had The becterial cure ra tes w ere 100
no serious adv erse drug reactions found.
KEY WORDS Cefetam et piv ox il; Cefixime; Bacterial infectio n
·464·
DOI:10. 13461/j.cn k i . cja. 002297
中国抗生素杂志1998年12月第23卷第6期
用固定化细胞技术连续生产麦迪霉素的研究
Continuous production of midecamycin
by immobilized cells
王鲁燕 赵炎生 杨晓阳 武俊民
Wang Luyan, Zhao Ya nsheng , Ya ng Xiaoya ng and W u Junmin
(中国药科大学微生物制药教研室, 南京210009)
(Depa rtm ent o f M ic robia l Pha rmaceutics ,
China Phar maceutica l U niv esity , N anjing 210009)
固定化细胞技术在初级代谢产物的发酵工业
中已展示了巨大的生命力, 而对放线菌细胞固定化进行抗生素生产仍处在开发阶段。本试验选用生米卡链霉菌, 以不同方法进行固定化, 并对固定化颗粒用激光微束照射后, 作麦迪霉素的连续化生产, 本文报道初步探索性研究结果。1 材料和方法
1. 1 菌株及培养基成分
实验菌株为生米卡链霉菌(Streptomyces my -carofacieus ) , 培养基成分见文献[1]。1. 2 方法
1. 2. 1 卡拉胶固定菌丝
用生理盐水配制2. 5%的卡拉胶溶液, 灭菌冷却至45℃, 与适量菌丝混合, 冷却凝固后, 放入28℃恒温箱中干燥5h, 切成9mm 小块, 置于2%KCl 溶液中硬化过夜。1. 2. 2 海绵固定菌丝
将海绵切成4mm 3小块, 置于500ml 三角瓶中, 置入量应以能覆盖瓶底为宜, 加入50ml 培养基, 灭菌后备用。取一支新鲜斜面孢子接入其中, 于28℃, 摇床培养(150r /min ) 48h , 再将海绵移入含发酵培养基的摇瓶中, 继续培养。
1. 2. 3 海藻酸钠固定孢子
配制4%海藻酸钠溶液, 灭菌后与适量孢子悬液混匀, 将其用9号针头逐渐滴入0. 2mol /LCa Cl 2中, 不断搅拌, 即成珠状颗粒(直径3mm ) , 用Ca Cl 2溶液继续浸泡2h, 再置于含0. 05%戊二
本文参加第八次全国抗生素学术会议交流, [3]
3
[2]
醛的0. 05m ol /LCa Cl 2溶液中浸泡2h, 用蒸馏水
洗涤多次, 备用。1. 2. 4 激光微束照射
由三倍频YAG 激光器与倒置生物显微镜组成激光微束系统。将固定化细胞置于无菌平皿中, 平皿放置在倒置显微镜载物台上, 使用不同功率和波长的激光通过显微镜聚焦照射于固定化细胞颗粒上。1. 2. 5 固定化细胞的发酵
将适量固定化细胞移入装有50m l 种子培养基的500ml 三角瓶中。28℃摇床培养(150r /min)48h, 再将固定化细胞移入发酵培养基中进行发酵, 每24h 取样测定麦迪霉素含量, 并取出总体积1/3的发酵液, 加入等体积的新鲜培养基, 继续发酵。游离菌对照试验以同法操作。
1. 2. 6 效价测定
麦迪霉素发酵液经离心(3000r /min ) 20min , 上清液用管碟法测定效价。2 结果与讨论2. 1 卡拉胶固定菌丝
菌丝经卡拉胶固定后接入发酵培养基, 并定时更换发酵液进行连续培养, 检测其产生抗生素能力的变化情况, 其相对效价见表1。
由表1可知, 菌丝经卡拉胶包埋后进行发酵, 产生抗生素的水平较游离菌丝低得多, 可能是传质的影响较大, 表明该介质不适宜于麦迪霉素产生菌的固定化。
中国抗生素杂志1998年12月第23卷第6期
表1 麦迪霉素产生菌菌丝卡拉胶固定化发酵
的相对效价
发酵时间(h)
方 法
48
游离细胞 固定化细胞
10026. 8
9695. 632. 5
14449. 329. 5
19231. 211. 2
24010. 6
2883. 2
·465·
发酵液抑菌圈直径, 见图2。
结果表明, 0. 05%戊二醛对固定化孢子无明显毒害作用, 不影响孢子萌发后的产生抗生素能力。2. 3. 3 海藻酸钠固定化孢子的连续发酵
生米卡链霉菌孢子经5%海藻酸钠固定后, 发酵效价可达到游离细胞的66%, 若将固定化颗粒经激光微束照射后(波长530nm , 8×10s, 5MW ) 发酵水平及发酵周期都明显增大, 连续发酵中产生抗生素能力的变化情况见图3。
-9
2. 2 海绵固定菌丝
海绵是一种价廉、易得的化工原料, 且介质内部疏松呈多孔状, 传质效果好, 菌丝在其内部生长
后, 经摇床培养连续发酵, 结果见图1。
由图1可知, 经海绵固定后, 发酵效价仅为游离菌丝发酵效价的57%, 但周期可延长一倍。海绵经过一个发酵周期, 可回收再利用, 使生产成本降低, 且培养过程中通气、搅拌也较易控制
。
图2 海藻酸钠包埋细胞后经0. 05%戊二醛
浸泡对产生抗生素的影响
1:经戊二醛浸泡; 2:不经戊二醛浸泡
图1 麦迪霉素产生菌菌丝经海绵固定后发酵的
相对效价
1:游离细胞; 2:固定化细胞
从图3分析可知, 经激光作用后固定化细胞产抗生素能力为游离细胞发酵的75%, 比未经激光微束照射的固定化细胞提高了9%, 半衰期可达近一个月。分析其原因, 激光照射一方面增加了固定化介质的通透性, 还可能引起了细胞变异。试验中我们发现, 在固定化培养发酵液中, 可检出大量游离菌丝, 它的唯一来源是固定在介质中的孢子萌发所致, 因此, 固定相不仅本身含有菌丝, 可以产抗生素, 更重要的是它可作为一个持续、稳定的孢子源。因而它与初级代谢产物的细胞固定化
2. 3 海藻酸钠固定孢子
2. 3. 1 孢子经不同浓度海藻酸钠固定对发酵的影响
麦迪霉素产生菌孢子经2. 5%、3%、4%、5%、6%等5种不同浓度的海藻酸钠固定后对发酵效价影响不大。从实验观察到当海藻酸浓度≤3%时, 颗粒强度较弱, 经过4d 培养, 固定化颗粒已有部分破碎, 当浓度>4%时, 经摇床培养(150r /min ) 30d 后, 颗粒仍完好无损。但海藻酸钠浓度过高一方面会使得细胞固定化过程难度加大, 另一方面会影响载体内外物质交换。因此, 我们选用5%的含量。
2. 3. 2 戊二醛对固定化孢子产生抗生素能力的影响
海藻酸钠包埋细胞后, 用0. 05%戊二醛浸泡
, 图3 海藻酸钠固定化孢子的连续发酵
1:游离孢子; 2:固定化孢子; :
·466·
(加底物、依靠固定化酶进行转化) 有着本质的区别。3 小结
利用孢子固定化方法连续生产麦迪霉素是一项有益的探索。研究表明, 此法操作步骤简便, 不易染菌, 可增加产生抗生素的稳定性和连续性, 值得进一步深入研究。
中国抗生素杂志1998年12月第23卷第6期
参考文献
#
1杨生玉, 谢秉姿. 麦迪霉素产生菌880103菌株的选育. 中国抗生素杂志, 1990; 15(6):412
2冯立, 陈向东, 彭珍荣. 卡拉胶固定粘质赛氏菌产碱性
蛋白酶的研究. 生物工程学报, 1994; 10(1):663赵景联. 固定化大肠杆菌细胞生产γ-氨基丁酸的研究. 生物工程学报, 1989; 5(2):124
(1997年7月15日收稿)
(上接第442页)
根据本试验结果和上述分析, 可以认为头孢他美酯是一种高效、安全、易于服用的广谱抗生素, 适合于临床应用。
参考文献
1小林宏行, 山口和政, 宇土研二 他. Effect o f pro -benecid on the pha rmacokine tics o f DQ -2556, a new 3-quater na ry ammo nium cephalosporin a ntibio tic, in hu-ma ns. Chemo therapy , 1990; 38(6) ; 617, 38
2N eu H C , Chin N X , Labthaviknl P . In v itro activ ity a nd β-lactamase sta bility of tw o or al cephalosporins , cefte trame (Ro 19-5247) and ceftamet (Ro15-8074).
Antimicro b Ag ents Chemo ther , 1986; 30:423
3出口浩一, 横田のそみ, 古口昌美. 外来患者由来新鲜临床分离株に对するcefteram の抗菌力. J pn J A nti -biot, 1989; 42(5):1216
4Chang S C, Hsien W C, L uh K T et al . Antimic robia l ac tiv ities o f six new o ral cephem a ntibio tics. J For mos M ed Assoc , 1990; 89(8):661
5大泉耕太郎, 岩本英男, 中村浩 他. Basic and clinica l st udies on biapenem (L -627) in o bste trics a nd g yne-co lo gy . Jpn J Antibio t , 1994; 47(12):1613
6李光辉. 第三代口服头孢菌素特仑酯. 国外医药抗生素分册, 1996; 17(2):101
(1997年6月26日收稿)
Randomized comparative analysis of cefetamet pivoxil and
cefixime in the treatment of bacterial infections
Zhu Ning , Liu Demeng a nd Hu Wenzhi
(The 2nd Teaching H o spital , Tianjin M edical U niv ersity , Tianjin 300211)
Fo rty cases of low er respiratory tract bacterial infections and urina ry tract bacterial ABSTRACT
infectio ns w ere randomized and tested co mpa ra tiv ely w ith cefetam et piv oxil and cefixime. Clinical to tal efficacy rates w ere 95%and 100%(P >0. 05) , recov ery ra tes o f bo th tw o g roups w ere 85%(P =1).
%a nd 88. 9%(P >0. 05). Bo th cefetamet piv oxil and cefixime had The becterial cure ra tes w ere 100
no serious adv erse drug reactions found.
KEY WORDS Cefetam et piv ox il; Cefixime; Bacterial infectio n