生物技术复习资料
第一章 基因工程 一．专业符号
Tetr 四环素抗性 R/M体系
Ampr 氨苄青霉素抗性 pBR322 质粒载体 M13 单链噬菌体载体 cosmid 科斯质粒
IPTG 异丙基-β-D 硫代半乳糖苷 DNA ligase DNA连接酶 EcoRI 一种限制酶 host 宿主
Plasmid 质粒 Ori 复制起始位点 vector 载体 cDNA 互补DNA southern blot DNA印迹转移技术 MCS 多克隆位点
二．名词解释
生物工程bioengineering ——利用生物有机体（包括微生物和动、植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞、细胞器）和组织成分（包括DNA 、RNA 、蛋白质、酶、多糖、抗体等），形成新的技术手段来发展新产品和新工艺的一种技术体系。也是采用先进生物学和工程学技术，有目的、有计划定向加工制造生物产品的一个新兴技术领域。
免疫分析法——免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。
基因工程——指按照人们的意愿，在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之转入到原先没有这类分子的宿主细胞内，形成能持续稳定繁殖的新物种。其目的是为人类提供有用产品及服务。
感受态细胞——能从其周围摄入DNA 的细胞称为感受态细胞。
同聚物加尾法——利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP) 加到DNA 分子单链延伸末端的3‘-OH 上。如果在目的基因两侧加polydA ，则在载体两侧加polydT 。长度一般10~40个残基。可以连接任何两段DNA 分子的普遍性方法。
原位杂交技术——根据核酸杂交原理，利用基因探针检出培养板上重组 转化体菌落位置的技术称之为原位杂交技术。
DNA 接头——它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。
标记营救——SV40 DNA为载体的取代克隆方式又分为早期基因区域取代及晚期基因区域取代两种类型。晚期基因区域取代方式是以外源性DNA 片段取代晚期基因区域，构成的重组DNA 在宿主中可以复制，但不能产生重组病毒颗粒，因而采用早期基因缺失的SV40病毒突变种作为辅助病毒与晚期取代重组DNA 或和感染宿主，则晚期区域取代重组DNA 可获得标记营救，辅助病毒产生的晚期基因产物与重组病毒的早期基因产物一起可形成完整病毒颗粒。
早期区域取代方式是以外源性DNA 片段取代早期基因区域，但重组DNA 形成病毒颗粒与早期区域基因产物T 抗原供应有关，故同样可采用晚期基因区域缺失的SV40突变种作为辅助病毒进行标记营救，即可形成完整病毒颗粒。
R/M体系——大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制(restriction)和修饰(modification)现象，简称R/M体系。
衔接物——指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。
同尾酶——虽来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端的限制性内切酶，称为同尾酶。
基因文库——是将基因组DNA 通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA 片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA 的所有序列。
启动子——启动子是位于结构基因5' 端上游的DNA 序列，能活化RNA 聚合酶，使之与模板DNA 准确的结合并具有转录起始的特异性。
转化Transformation ——自然的转化是指将携带某种遗传信息的DNA 分子引入宿主细胞，通过同源重组作用获得具有新遗传性状的生物细胞的过程，基因工程操作中的转化是泛指将重组DNA 转入宿主中的方法。
多克隆位点——DNA 载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶的单一识别位点。能为外源DNA 提供多种可插入的位置或插入方案。
回文结构——双链DNA 中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称回文结构。
同裂酶——识别顺序与切割方式均相同的限制性内切酶。
安慰诱导物——能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的分子，如，IPTG 是一种乳糖类似物，再无乳糖的条件下，他可以诱导细胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG 被称为β半乳糖苷酶的安慰诱导物。
衔接物连接法（linker ）——将衔接物的5‘末端和待克隆的DNA 片段的5’末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA 连接酶的作用使两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA 分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。
DNA 接头法（adaptor ）——当DNA 接头的平末端与平末端的外源DNA 片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA 分子，而易于连接重组的方法。
插入灭活效应——在基因工程早期使的某些载体(如pBR322) ，这些载体本身有两个或更多个抗生素抗性基因和分布适宜的酶，即位点。用适当的酶处理DNA 及载体，进行重组，即将外源DNA 插入到某一抗性基因中，而使该基因失去抵抗某抗生素的表型。
DNA-蛋白质筛选法——是用来专门检测同DNA 特异结合的蛋白质因子的一种方法。这种方法能用于筛选并分离表达融合的克隆。合成这种融合蛋白的重组DNA 分子中的外源DNA 编码一种能专门同某一特定DNA 序列结合的DNA 结合蛋白质（DNA binding protein）。
蛋白质工程——是指通过蛋白质化学、晶体学和动力学的研究，获取关于蛋白质物理、化学等各方面的信息，在此基础上，对编码该蛋白质的基因进行有目的的改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终得到比天然蛋白质更好的产物。
三．填空题
基因工程载体的必备条件： 1、具有有效运载能力
2、携带外源性目的基因前后在宿主内功能自主复制 3、在宿主内能控制外源基因表达活动 4、鉴定方便，装卸手续简单
5、能携带大小不同的外源性目的基因、载体分子量要小, 运载能力要大 6、容易控制、安全可靠、稳定性好
常用的将重组DNA 转入宿主细胞的方法： 细菌转化与转染、高压电穿孔法、聚乙二醇介导的原生质体转化、磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、原生质体融合、脂质体法、细胞核的显微注射法、激光打孔技术、基因枪法
基因工程基本步骤： 1、获得目的基因
2、在体外获得形成重组DNA 分子。
3、将重组DNA 分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起增殖。
4、从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA 分子的宿主细胞克隆。
5、从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用。 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
E.coli 表达系统中常用的强启动子：Lac 、Trp 、λPL 、λPR [1）lac 启动子2）trp 启动子3）tac 启动子]
目的基因制备方法：一、基因分离的物理方法；二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法；三、cDNA 文库的建立与基因的分离；四、基因组文库法；五、基因的化学合成；六、聚合酶链反应技术（PCR ）
外源基因在宿主细胞中高效表达的关键因素：一、有效的转录起始；二、mRNA 的稳定性；
三、有效地翻译启始；四、遗传密码应用的偏倚性；五、 mRNA的加工；六、 mRNA序列上终止密码的选择；七、表达质粒拷贝数及稳定性；八、外源蛋白的稳定性
PCR 主要步骤：1、高温变性：2、低温退火：3、适温延伸
常用的克隆载体：细菌质粒（Col E1质粒载体、pSC101质粒载体、pBR322、pUC 质粒载体）、病毒DNA 、噬菌体DNA[λ噬菌体DNA 和柯斯载体(cosmid)及单链DNA 噬菌体载体(M13)]
DNA 片段的连接方法：一、DNA 连接酶和T4DNA 连接酶；二、粘性末端DNA 片段的连接（连接酶的作用）；三、平末端DNA 片段的连接（同聚物加尾法、衔接物连接法、DNA 接头连接法） 真核病毒载体的优点：（常用的有SV40病毒载体及昆虫杆状病毒载体。） 1、有很高的拷贝数；
2、强大的启动子，可保证外源基因的高效表达； 3、可保证糖基化。
四．问答题
基因获得的方法有哪些？各有哪些特点？
一、基因分离的物理方法：人们通过控制溶解温度使富A=T区解链变性，而富G ≡C 区仍维持双链。当利用单链核酸酶S ，酶去除解开的单链部分，得到富G ≡C 区的DNA 片段 。
二、鸟枪法(Shot gun)又称霰弹法：鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离，优点：操作简单，命中率较高。缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会漏。
三、cDNA 文库的建立与基因的分离：最关键的特征是它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA 的那些基因序列，局限性——并非所有的mRNA 分子都具有polyA 结构；
细菌或原核生物的mRNA 半衰期很短；mRNA 在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难；仅限于克隆蛋白质编码基因, 没有内含子，不能用于真核表达。
四、基因组文库法：从基因组文库所分离获得的基因序列包含有内含子，因此不能直接在原核细胞中表达，但更适合作为如转基因动物等的真核表达系统。
五、基因的化学合成：优点1、可以合成细菌偏爱的密码子2、可以定向改变个别氨基酸 3、可以在两端加上需要的限制酶切点4、可以通过自动化仪器合成。
六、聚合酶链反应技术（PCR ）优点：1、操作简单；2、通用性好；3、成功率高 cDNA 文库的建立有哪些步骤?
1、分离表达目的基因的组织或细胞。 2、从组织和细胞中制备总RNA 和mRNA 3、第一条cDNA 链的合成 4、第二条cDNA 链的合成 5、cDNA 上接头的加入
6、双链cDNA 与载体的连接
7、从众多的重组体中筛选出特定的基因
限制酶命名原则是什么?
属名（大写）+种名（小写）+株名+分离序号
外源基因在宿主细胞高效表达的关键问题及其解决方案
一、有效的转录起始与基因的高效表达：选择强的可调控的启动子；
二、mRNA 的稳定性与基因高效表达：1、利用RNase 缺失的受体菌，2、mRNA 的5’端与3’端的正确加工，提高mRNA 的稳定性；
三、有效地翻译启始与基因的高效表达：1、首选AUG 为起始密码子；2、正确的SD 序列；3、 SD序列与起始密码子之间的距离以9±3为宜；4、除SD 序列外，处于起始密码5’端的核苷酸应为A 和U ；5、如果在起始密码AUG 后的序列是GCAU 或AAAA ，能使翻译效率提高；6、在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构。
四、遗传密码应用的偏倚性与基因高效表达：不同表达系统中，使用偏倚性密码，尤其对于基因编码序列的5’端使用偏倚性密码，能有效提高表达效率。
五、 mRNA的加工与基因高效表达：绝大多数较高等的真核基因含有内含子，这些内含子在mRNA 的加工过程中，在细胞核中被加工去除而产生成熟的mRNA 。但许多哺乳动物类细胞中外源基因的表达需要内含子存在，如果在转基因动物中表达外源基因时，最好用基因组基因而非cDNA 。
六、 mRNA序列上终止密码的选择：1、首选UAA ；2、用一串连的终止密码，而不是只是一个终止密码，以保证翻译有效终止。
七、表达质粒拷贝数及稳定性与基因高效表达：一般来讲，质粒拷贝数多，基因表达水平高；质粒稳定性高，表达好。
八、外源蛋白的稳定性与基因高效表达：1、通过组建融合基因，产生融合蛋白；2、产生可分泌的蛋白质；3、以包含体的形式表达；4、选择合适的宿主表达系统。
假如用大肠杆菌生产人的β-珠蛋白，必须经过几个基本步骤
分离获得β-珠蛋白的基因——组成重组质粒——转化大肠杆菌——筛选阳性克隆——阳性克隆大量增殖——分离提纯目的蛋白 1）获得目的基因
2）在体外，将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA 分子。
3）将重组DNA 分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起增殖。
4）从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA 分子的宿主细胞克隆。
5）从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用。 6）将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人
类所需要的物质。
平末端DNA 片段的连接有哪些方法，各有什么特色？
1、同聚物加尾法是由美国斯坦福大学的P.Labban 和D.Kaiser1972年发展起来的，可以连接任何两段DNA 分子的普遍性方法。
原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP) 加到DNA 分子单链延伸末端的3‘-OH 上。如果在目的基因两侧加polydA ，则在载体两侧加polydT 。长度一般10~40个残基。
缺点：插入的片段难以回收。无法控制外源基因插入方向。
2、衔接物（linker) 连接法
所谓衔接物是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。 将衔接物的5‘末端和待克隆的DNA 片段的5’末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA 连接酶的作用使两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA 分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。 优点：克隆后还可回收原插入片断。 缺点：如果待克隆的DNA 片段或基因的内部也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把所克隆的基因切成不同的片段，从而对后继的亚克隆及其他操作造成麻烦。
3、DNA 接头(adaptor)连接法
DNA 接头是由美国康奈尔大学吴瑞博士于1977年发明的，它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA 片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA 分子，而易于连接重组。
问题：各个DNA 接头分子的粘性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA 衔接物一样的二聚体分子，失去接头的本来意义。克服的方法是将5‘末端的磷酸修饰移去，其结果为暴露出的5’-OH 所取代。如此一来，虽然两个接头分子粘性末端之间仍具有互补碱基配对的能力，但终因DNA 连接酶无法在5‘-OH 和3’–OH 之间形成磷酸二酯键而不会产生出稳定的二聚体分子。
蛋白质工程的主要步骤有哪些？ 1、分离纯化需改造的目的蛋白
2、了解其一级结构及高级结构，了解其结构-功能关系 3、获取编码该蛋白的基因序列 4、设计改造方案
5、对基因序列进行改造
6、将经过改造的基因序列重组入表达载体，进行表达 7、分离纯化表达产物，并对其功能进行检测
第二章 微生物工程 一、 专业符号
1.BOD 生化需氧量 2.COD 化学需氧量 3.UV 紫外线
4.FN 快中子 5.PEG 聚乙二醇 6.EDTA乙二胺四乙酸 7.GSH 谷胱甘肽 8.MFA 代谢通量分析 9.MCA 代谢控制分析
二、 名词解释
微生物工程（Microbial Engineering）
微生物工程又称为发酵工程，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术，是生物工程的重要组成部分。
自然选育
它是利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株
诱变育种
利用诱变剂处理微生物群体，使其中部分细胞的遗传物质结构发生改变，从而引起微生物性状发生改变，然后从群体中筛选出目的菌株的过程
葡萄糖效应
又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。
生理酸性物质：经微生物代谢后能形成酸性物质的无机N 源 生理碱性物质：经微生物代谢后能形成碱性物质的无机N 源
前体:在抗生素生物合成中，菌体用来构成抗生素分子而本身结构又没有显著改变的物质
生长因素 广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素) ，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。
诱变剂
用来处理微生物并能提高生物体突变频率的物理或化学因素，称为诱变因索，又称诱变剂。三类：物理、化学、生物诱变剂。
基因突变： DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变引起可遗传的突变。
基因重组：（Gene recombination）两个不同性状个体的遗传基因转移到一个体细胞内，并经过基因的重新组合后，造成菌种变异，形成新的遗传型个体的方式。
原生质体融合：用脱壁酶将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇(PEG)促进原生质体发生融合，从而获得融合子，它保持原细胞的一切活性
原生质体的再生：在再生培养基上使失去细胞壁的原生质体重新长出细胞壁来
表型变异：微生物在生活条件改变时，发生暂时的形态生理特性的改变，但随着环境条件的复原，他们又恢复了原有的特性，是不可遗传的
代谢工程
代谢工程 是一门利用分子生物原理系统分析代谢网络、并通过DNA 重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科
次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂，对该微生物生理功能和生长非必需的物质，如抗生素、毒素、激素等
初级代谢产物：微生物通过代谢活动所产生的自身生长和繁殖所必需的物质，例如氨基酸、核苷酸和多糖之类的物质。 三、填空题
1、微生物产品的下游加工过程包括（发酵液的预处理）、（初步提取）、（高度纯化）、（成品加工）。
2、发酵工业中常用的灭菌方法包括（加热灭菌法）、（辐射灭菌法）、（介质过滤除菌法）、（化学灭菌法）。
3、发酵过程中监控的化学参数主要有（PH ）、（基质浓度）、（溶解氧浓度）、（氧化还原电位）、（产物浓度）、（废气中氧浓度）、（废气中CO2浓度）和（ ）。 4、诱变育种中使用的诱变剂分为（物理诱变剂）、（生物诱变剂）和（化学诱变剂）。
四、问答题
1、 常见的菌种保藏方法有哪些? （1）斜面低温保藏法 （2）液体石蜡封藏法 （3）甘油冷冻保藏法 （4）冷冻干燥保藏法 （5）液氮超低温保藏法 （6）其他干燥保藏法
2、 发酵过程中产生泡沫会带来哪些不利因素，常用的消沫方法有哪几种？ 不利因素：培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和合成酶有关，泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收；妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵； 由于泡沫大量生成，致使培养液的容量一般只能等于种子罐容量的一半左右，大大影响了设备的利用率，甚至发生跑料，招致染菌，造成巨大损失。 消泡方法：机械法 • 化学法。
• 泡沫的控制除了添加消泡剂外，改进培养基成分也是相辅相成的一个重要方面。
3、发酵培养基由哪些成分组成？
发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。
4、培养基按照组成物质来源可分为哪两种，各自具有什么特点？ （1）天然培养基
是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等) 制成的。
适合于各类异养微生物生长，而一般自养微生物都不能生长。 （2）合成培养基
是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精 确，重复性强，可以减少不能控制的因素。适用于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。但一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长。 5、 下游处理过程分为那几个步骤？相应的分离方法有哪些？
下游加工过程（down stream processing）:从微生物发酵液中分离、精制生物产品的过程。 包括：发酵液预处理、初步纯化、高度纯化（精制）、成品加工 预处理：过滤
提取：吸附法、沉淀法、溶媒萃取法、离子交换法
精制：盐析法、交换树脂脱色、活性炭脱色、结晶、重结晶、晶体洗涤、蒸发浓缩、层析凝胶分离、无菌过滤和干燥等
6、简单叙述原生质融合的步骤。 1）标记菌株的筛选和稳定性验证。
2）原生质体制备。
3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 4）涂布于再生培养基，再生出菌落。
5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 6） 生产性能筛选。
7、原生质体制备过程中，加入渗透压稳定剂的作用是什么，常用的稳定剂有哪些？
等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl 和NaCl 等无机物 8、 原生质融合过程中PEG 和Ca2+分别起什么作用？
表面活性剂聚乙二醇及 Ca2*、Mg2*等阳离子，使融合频率出现突破性提高。PEG 分子量从1000到12000，融合时多用4000和6000两种。 9、 原生质体融合育种过程中，杂种菌株的筛选要注意什么？
融合子的选择主要依靠两个亲本的选择性遗传标记，在选择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。但是由于原生质体融合后会产生两种情况：一是真正融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体，二是暂时融合，形成异核体。两个均可在选择培养基上生长，前者较稳定而后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚者可以以异核状态移接几代。因此，必须在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定是否获得了真正融合子
10、诱变育种中使用的化学诱变剂根据作用方式分为哪几类？
烷化剂：氮芥、乙烯亚胺、亚硝基胍 它们与DNA 碱基起反应，引起碱基配对的转换而发生遗传变异 碱基类似物：它们掺入DNA 分子中而导致遗传变异，例如5-BU 、5-FU
移码诱变剂：吖啶黄、吖啶橙等，它们可插入DNA 双螺旋的邻近碱基对中，造成剪辑的插入和缺失，导致转录和翻译的移码突变
11、在发酵过程中引起溶解氧异常下降的常见原因有哪些？ 1）污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗 2）菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加 3）某些设备或工艺控制发生故障或变化
12、代谢网络中的节点是什么？可以分为几类？
微生物代谢网络中的途径的交叉点(代谢流的集散处) 叫做节点(node)，微生物自动抵制节点处代谢物流量分配比率的改变的特性叫做节点的刚性。节点的刚性取决于微生物代谢的自动调节机制。 如果某个代谢流的扰动对其下游代谢流未能造成可观察的影响，那么就可以认为该处的节点对上游扰动的反应是刚性（Rigid ）的，与之相反的情况则称为柔性（Fluxible ）。
第三章 酶工程
一、专业符号及名词解释
1. NADPH还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 2. DEAE二乙氨乙基葡聚糖 3. DNP二硝基苯酚
4. error prone PCR 易错PCR
从单一基因出发，通过改变PCR 反应条件，在基因扩增过程中使碱基配对出现错误而引起基因突变。
5. DNA shuffling DNA改组
又称为DNA 改组技术，是从2种以上同源正突变基因出发，用酶（DNaseI ）切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR 循环，使DNA 的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。
6. IU 酶活力国际单位
1个酶活力国际单位是指在特定条件下，1min 内生成1μmol 产物的酶量（或转化1μmol 底物的酶量）。
7. Katal 酶活力单位 在最适条件下，每秒钟可使1MOL 底物转化的酶量，1KAT=6*10^7IU
8. 酶工程
酶工程（Enzyme engineering ）是指通过化学方法、酶学方法和DNA 重组技术改善自然酶的形成、结构和性质，提高酶的催化活性、降低成本并在大规模工业化生产中应用。
9. 酶的活力单位
在最适条件下，单位时间内，酶催化的底物的减少量或产物的生成量
10. 酶的比活力
纯度的在量度，指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，一般用单位/毫克蛋白（U/mg蛋白质表示）。酶的比活力越高，酶的纯度也就越高。
11. 固定化酶
固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。
12. 固定化细胞
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。
固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学因素的约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。
13. 固定化酶的操作半衰期
在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历时间，以t1/2表示。
14. 固定化酶的偶联效率
15. 固定化酶的活力回收率
固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶（细胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞）总活力的百分数。
16. 固定化酶的相对活力
17. 酶反应器
以酶（游离酶或固定化酶）作为催化剂进行酶促反应所需的设备成为酶反应器。
18. 酶分子的化学修饰
酶的化学修饰，就是在分子水平上对酶的化学结构进行改变，以达到改构和改性的目的（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联）。
19. 生物传感器
使用固定化的生物分子(immobilized biomolecules), 与适当的化学换能器结合，用于快速侦测物理、化学、生物量的新型器件。
20. 酶的非水相催化
酶在非水相（也称非水介质）中也具备催化活性，可以在含有多种有机介质和微量水分的非水介质中发挥催化作用，并且具有催化活力、选择性和稳定性上表现出与常规水溶性介质中截然不同的催化性能。
21. 抗体酶
抗体酶 或催化抗体（Catalytic antibody) 是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。
22. 极端微生物
又称嗜极菌，是可以（或者需要）在“极端”环境中生长繁殖的生物，大多数极端菌属于古细菌。
二、填空题
1. 酶分子的化学修饰的具体方法包括（主链修饰）、（侧链基团修饰）、（化学交联修饰）、（大分子结合修饰）、（亲和标记修饰）、（基因修饰）、（与辅因子相关的修饰）和（ ）。 2. 抗体酶的制备方法有（诱导法）、（引入法）、（拷贝法）、和（抗体库法）。
3. 1961年国际生物化学联合会酶学委员会根据反映类型，将酶类分为（氧化-还原酶）、（水解酶）、（转移酶）、（连接酶）、（裂合酶）、（异构酶）。
三、问答题
1. 酶有什么特性？什么是酶工程？
酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂，按化学组成的不同主要分为核酸类酶（R 酶）和蛋白质类酶（P 酶）。①催化效率高 ②专一性强 ③反应条件温和 ④催化活性受到调节和控制 酶工程（Enzyme engineering ）是指通过化学方法、酶学方法和DNA 重组技术改善自然酶的形成、结构和性质，提高酶的催化活性、降低成本并在大规模工业化生产中应用。
2. 常用的固定化酶的方法有哪几种，试对各种方法进行综合比较 （右图）
3. 固定化酶的偶联效率的测定方法有哪几种？ 残留法（测定未结合酶量） 水解法（水解结合的酶并各种固定化方法的比较测含量） 吸附法
包埋法共价键结合法交联法
物理吸附法离子吸附法
4. 影响固定化酶反应动
制备易易较难难较难
力学的因素有哪几种？
结合程度弱中等强强强
空间效应（包括构象和屏
高高低中等
蔽） 扩散效应 分配效应 活力回收率高，但酶易流失
再生可能可能不可能不可能不可能
低低低高中等5. 常用的固定化酶的活固定化成本
底物专一性不变不变不变可变可变力测定方法有几种？
⒈分批测定法 ⒉连续测定法
6. 与天然酶相比，固定化酶具有哪些优点？
具有生物催化剂的功能，又有固相 催化剂的功能。
①可重复使用，降低成本；
②反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。
③稳定性提高，反复使用多次后，酶的活力无明显下降；
④反应条件易于控制，可以自动控制，节约劳动力。
7. 与固定化酶相比，固定化细胞具有哪些优点？
固定化活细胞的优越性
无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；
保持了酶的原始状态，比固定化酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；
细胞本身含多酶系统，可催化一系列反应，且不需添加辅助因子；
细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等。
缺点
必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；
必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；
胞内多酶的存在，会形成副产物；
载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。
8. 酶的抑制剂按照抑制作用方式分为哪几类?
竞争性抑制 竞争酶的活性中心结合位点
非竞争性抑制 竞争活性位点以外的酶的部位
反竞争性抑制 与ES 复合物结合
9. 酶分子定向进化的原理是什么？
在待进化酶基因的PCR 扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3’→5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变文库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质) ，从而排除其他突变体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
定向进化=随机突变+定向选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。
10. 酶分子的亲和标记物分为哪两类，各自具有什么特点？
Ks 型抑制剂：根据底物的结构设计的，具有和底物结构相似的结合基团，同时还具有能和活性部位氨基酸残基侧链基团反应的活性基团，导致酶不可逆失活。特点：底物，竞争性抑制剂等对修饰有保护作用。
Kcat:根据催化过程设计的，具有酶的底物性质，还有一个潜在的反应基团，在酶催化下活化后，不可逆的抑制酶的活性部位。Kcat 型也称为“自杀性抑制剂”，可以用来治疗某些疾病的药物。
11. 按照操作方式，酶反应器可以分为哪几类，各自具有什么特点？
间歇式搅拌罐反应器：这类反应器结构简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料和食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的固定化酶很少采用。常用于游离酶。
连续流动搅拌罐反应器优点：反应液混合良好，各部位的成分相同，并与流出液的组成也一致。连续流动搅拌罐反应器的开放结构使得调换固定化酶比较容易，而且有利于控制温度和调节pH ，还能够处理胶态或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用连续流动搅拌罐反应器有较高的转化率。缺点：由搅拌产生的剪切力较大，易打碎磨损固定化酶颗粒。需改良的连续流动搅拌罐反应器。
填充床反应器：流化床反应器反应时，底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其混合程度介于连续流动搅拌罐反应器的全混型和填充床的平推流型之间。由于反应器内混合程度高，因此，传热、传质情况良好，可处理粘性大、含有固体颗粒的底物。
连续搅拌罐-超滤膜反应器：连续流动搅拌罐反应器/连续搅拌罐适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。
循环式反应器：循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触机会，以达到所需的转化率。这种反应器可用于难溶或者不溶性底物的转化反应。
12. 与天然酶相比，抗体酶的优点有哪些？
1）抗体酶可经过精确的设计，专一性的催化某一底物转化的反应，而天然酶通过突变修饰也很困难
2）抗体酶可以催化那些理论上认为非常不利的反应
3）抗体酶可以催化天然酶不能催化的反应
13. 抗体酶的制备方法有哪些？
诱导法：即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。
引入法（抗体结合部位修饰法
将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术
拷贝法
用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，应获得具有原来酶活性的抗体酶。缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。
抗体库法
用基因克隆技术，将全套抗体重链和轻链可变区克隆出来，重组到原核表达载体。通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，从中筛选特异性的可变区基因。
第四章 动物细胞工程
一 专业符号
1 DMSO ：二甲基亚砜
2 HGPRT¯ ：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型
3 TK¯：胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型
4 HAT：含一定浓度的次黄嘌呤（H ）、氨基蝶呤（A ）、胸腺嘧啶（T ）的一种选择性培养基 5 MTT：四唑盐
6 McAb：单克隆抗体
7 PEG：聚乙二醇
8 Hela：供体患者的姓名，来源于宫颈癌
9 CHO：中国地(仓) 鼠卵细胞
二 名词解释
1 动物细胞工程：是按照人们预定的设计，根据细胞生物学及工程学原理定向改造动物细胞遗传性，创造新物种，通过工程化为人类提供名贵药品及服务的技术。
2 锚地依赖性（贴壁依赖性）：大多数动物细胞只能附着或贴在固体或半固体表面上培养才能生长的特性为贴壁依赖性，此细胞称为锚着依存性细胞。
3 接触抑制性：指当细胞长满附着物表面，相邻细胞表面间相互接触，使细胞对数生长期停止进入稳定期，细胞生长大大减慢，细胞生长、死亡处于动态平衡的特性。可作为区别正常细胞与癌细胞标志之一。
4 动物细胞培养技术：将动物机体的细胞或某一部分组织取出一小块，在体外经过表面消毒处理后，使其分散成单个游离的细胞，并放置在人工配制的培养基中进行培养，使之生长、分裂、繁殖的技术。
5 组织块培养法：将动物组织切成直径1～2mm ³ 立方小块，放在盛有培养基的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长进行培养的方法。
6 细胞单层培养法：动物组织块经过机械方法或酶解法消化分散成单个细胞或细胞团块后，粘附于培养容器表面培养成新生细胞单层的培养法，其过程包括组织块分散及培养。
7 单细胞分离培养：即细胞克隆培养，是将动物组织分散后，将一个单细胞从一个群体中分离出来单独培养，使之重新繁衍称为一个新的细胞群体的培养技术。
8 原代细胞培养（初代培养）：是指直接从机体取材（细胞、组织或器官）或经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA ）或机械方法处理，将其分散成细胞后置于体外合适条件下生长到第一次传代。
9 传代培养：当初代培养的贴壁细胞相互汇合而铺满瓶底时，细胞由原培养瓶经消化、收集、稀释后，转移一部分初代培养物到新的培养瓶，细胞才能继续生长的过程称为传代培养，常用酶消化法传代。
10 饲养细胞：在细胞培养中加入的活细胞（如小鼠胸腺细胞或腹腔细胞），能够促进单个或少数分散细胞的生长增殖，其本身无分裂能力，克隆形成后，本身死亡。
11 动物细胞融合：在外界因素作用下，两个或两个以上异源动物细胞的细胞质膜发生改变，导致细胞互相合并为一个多核细胞的过程，亦称动物体细胞杂交。
12 淋巴细胞杂交瘤：用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B 淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B 淋巴细胞产生特异性抗体能力的杂种细胞。
13 动物细胞大规模培养技术：是指在人工条件下，高密度大量培养基因工程、细胞融合或转化所形成的有用动物细胞，生产珍贵药品的技术，为细胞工程不可缺少的部分。
14 McAb：单克隆抗体，只针对某一抗原决定簇的抗体分子。
15 微载体培养法：是将细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法。
16 转基因动物：将某种外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并稳定遗传给后代的一类动物。
17 基因治疗：向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，纠正或补偿其基因缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，表达新产物达到治疗目的。
三 填空题
1 动物细胞培养基类型：天然培养基、基本合成培养基（基础培养基）、完全培养基、无血清培养基
2 保存动物种质细胞最有效的方法：超低温冷冻法
超低温法常用保护剂：二甲基亚砜DMSO （5%～12.5%）、甘油（5%～20%）
3 细胞融合及遗传物质转移方式有哪些：完整细胞之间的融合、核体、胞质体与完整细胞的融合、微细胞与完整细胞的融合、脂质体介导的细胞融合
4 杂种细胞的筛选有哪几类系统：HAT 选择系统、抗药性筛选系统、营养互补选择系统、温度敏感突变型杂种细胞选择系统、基因转化标志细胞的选择、标记基因的特异位点表达法
5 动物细胞大规模培养有哪些方法：悬浮培养法、固定化培养法、单层静置贴壁培养法
6 动物细胞所需营养因素：氨基酸（氮源）、 盐类、 葡萄糖（碳源、功能）、 缓冲系统 、生长因子 、其他成分
7 无血清培养基中加入的补充因子：必需因子（细胞生长因子与激素）、特殊因子如贴壁因子（纤粘连因子、层粘连因子）、蛋白酶抑制剂
8 细胞融合的促融因素：生物促融剂（病毒）、化学促融剂（PEG ）、物理促融剂（电场力、离心力）
9 动物细胞工程研究主要内容：动物细胞工程基础、动物细胞培养技术、动物细胞融合技术、单克隆抗体技术、动物细胞大规模培养技术
10 生理平衡盐溶液：Ringer 、PBS 、Earle 、Hanks 、D-Hanks
四 问答题
1 淋巴细胞杂交瘤的形成原理是什么？为什么HAT 培养基可用于筛选淋巴细胞杂交瘤（HAT 法具体原理教材p141）？
㈠ 用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B 淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B 淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又称为淋巴细胞杂交瘤。 ㈡ HGPRT¯ 或TK ¯骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合的杂种细胞，从两亲本细胞分别获得hgprt 或tk 基因，可应用HAT 选择培养基中的次黄嘌呤H 和胸腺嘧啶T ，通过补救途径合成DNA ，使杂种细胞存活下来，而HGPRT ¯ 或TK ¯骨髓瘤亲本细胞在HAT 培养基中死亡，淋巴细胞不能再体外长期分裂增殖亦逐渐死亡，从而可筛选出淋巴细胞杂交瘤。
2 什么叫McAb ？基本特征是什么？
McAb（monoclonal antibody ），即单克隆抗体，其基本特征为：专一性强，质地均一，检测灵敏度极高，可通过杂交瘤细胞的大规模培养进行生产。
3 简述制备杂交瘤的工艺路线？
细胞融合前的准备→细胞融合→HAT 选择杂交瘤→抗体的检测→杂交瘤的克隆→杂交瘤细胞的冻存→单克隆抗体的大量生产→单克隆抗体的鉴定
4 动物细胞培养过程的特点是什么?
⑴ 动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度差，适应环境能力差。
⑵ 倍增时间长，细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素（链霉素、青霉素）。 ⑶ 培养过程需氧量少，常采用5% CO2 培养箱。
⑷ 在机体中，动物细胞相互粘连以群体形式存在，在培养过程中有锚地依赖性（贴壁依赖性） 、接触抑制性、密度抑制性等特点。
⑸ 大规模培养时，不可套用微生物反应的经验。反应器应密封性好，对pH 、溶解氧要求高。 ⑹ 培养过程中产生的产物分布于细胞外，反应过程成本高，但产品价格昂贵，如疫苗、单抗、生长因子，甚至是细胞本身。
5 杂种细胞的筛选有哪几类系统？
杂种细胞筛选的原理是将融合混合物于选择培养基上，终止同型多核、异型多核及未融合亲本细胞的繁殖，而仅允许异型双核细胞繁殖的过程。其筛选方法有：
⑴ HAT选择系统，为生物化学选择法，在HAT 选择培养基上仅有HGPRT ¯ 或TK ¯骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合的杂种细胞才能存活，而其两亲本均死亡，从而筛选出杂种细胞。
⑵ 抗药性筛选系统， 利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞的方法，选择一种亲本细胞，其生长受药物A 抑制，对药物B 不敏感；选择另一种亲本，其受药物B 抑制，而对药物A 不敏感；当将这两种亲本细胞融合混合物置于含药物A 和B 的培养基中时，两亲本细胞均死亡，唯有融合子杂种细胞可存活，经分离和传代培养后可筛选出特定杂种细胞。
⑶ 营养互补选择系统 利用两种亲本细胞营养互补作用原理，如一种亲本细胞为色氨酸缺陷型，另一种亲本细胞为苏氨酸缺陷型，将这两种亲本细胞融合混合物置于不含色氨酸及苏氨酸的培养基中，两亲本细胞均死亡，唯有融合子杂种细胞可存活，经分离克隆培养后可筛选出杂种细胞。
⑷ 温度敏感突变型杂种细胞选择系统 一般的培养细胞能在32～40℃的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长，由此筛选杂种细胞。
⑸ 基因转化标志细胞的选择
⑹ 标记基因的特异位点表达法
6 基因工程抗体可以分为哪几类？
主要包括两大部分：
㈠ 对已知的单克隆抗体进行改造，包括
①单克隆抗体的人源化即大分子抗体（嵌合抗体、重构抗体）
②小分子抗体（Fab 抗体、单链抗体、单域抗体、双特异性抗体、微抗体等）
③抗体融合蛋白
㈡ 通过抗体库的构建，使得抗体不需抗原免疫即可筛选并克隆新的单克隆抗体。
①噬菌体抗体展示技术 将编码外源肽或蛋白质的DNA 片段插入噬菌体的基因组中，然后以融合的形式与噬菌体的外壳蛋白共同表达于噬菌体表面。
②抗体库技术 利用基因工程的方法克隆全套抗体可变区基因并在噬菌体表面表达，得到多样性噬菌体抗体的集合即噬菌体抗体库。
第五章 植物细胞工程
一、专业符号
PEG ：聚乙二醇 NAA：萘乙酸 DMSO：二甲亚砜 IAA：吲哚乙酸
2,4-D ：2,4-二氯苯氧乙酸 ABA：脱落酸 GA3：赤霉素 ZT：玉米素 NAA：萘乙酸
二、名词解释
1微室培养法
概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。
特点：（1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程
（2）培养基少，营养和水分难以保持，pH 值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
含义：即将细胞培养在很少量的培养基中。
用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。
微室培养特点：
在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。 微室培养要求：
（1）微室内不能有气泡。
（2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖玻片 的厚度要在0.17~0.18毫米左右。
（3）观察时要保持温度和培养时的一致
2植物体细胞胚胎发生途径
胚状体方式(somatic embryo) 指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。
由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：
1) 外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。
2) 胚状体形成 在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养
条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。
3) 胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。
3植物细胞分化：
是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
4器官发生途径，
器官发生
概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程。 发生方式：有两种发生方式
（1）直接发生：（具有初生分生能力的）外植体直接分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）
（2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。
5看护培养法
概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法
含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
用途；诱导形成单细胞系
基本技术：
（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。
（2）在无菌的条件下，先将一小块（1cm ）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm ²）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。
（3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。
（4）恒温培养。
要求：
（1）看护愈伤组织处于活跃生长状态；
（2）愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也可以不同。
特点：
（1）效果好，易于成功。
（2）简便易行。
（3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。
注意：要得到单细胞系必须保证接种材料是真正的单细胞。
6 Ti质粒，
在根癌农杆菌的染色体DNA 之外有一种叫做Ti 质粒的环形的DNA 分子，它是诱导植物产生根癌的直接原因
Ti-plasmid, ——（short for tumor-inducing plasmid ）is a large (150~200 kb) double-stranded circular DNA plasmid in a soil bacterium called Agrobacterium tumefaciens, which causes what is known as produces uncontrolled growths (tumors, or galls), normally at the base (crown) of the plant. Ti-plasmid is the key to this tumor production.
7植物细胞脱分化
离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程
8植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，
或获得有用物质的过程。
9脱分化：离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程。
10再分化：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件（离体培养）下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整生物体。
11细胞全能性：一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。
12外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。
13愈伤组织：脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团。
14细胞分化：是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
三、问答题
1、植物细胞融合过程如何？融合特点是什么？
•在外界因素作用下，使两个或两个以上植物细胞合并成一个多核细胞的过程叫植物细胞融合（cell fusion ），也称植物体细胞杂交（somatic hybridization）。但植物与微生物一样，其细胞皆有坚硬的细胞壁，不能直接融合，须经酶消化出去细胞壁释放出原生质体，后者生理、生化及遗传学特性与完整细胞基本相同。在适当条件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用，并可再生细胞壁，恢复成完整细胞。因此，植物细胞融合实质是其原生质体融合。
•原生质体融合的过程包括3个主要阶段：
（1）凝聚作用阶段，其间两个或两个以上的原生质体的质膜彼此靠近；
（2）在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在两个原生质体之间细胞质呈现连续状态，或是出现桥；
（3）由于细胞质桥的扩展，融合完成，形成球形的异核体或同核体。
•特点：
（1） 可实现远源杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲和性；
（2） 可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，获得种间杂种，获得的遗传变异范围极广；
（3） 一次操作可实现两个以上亲本的融合作用；
（4） 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种；
（5） 可形成有性增殖障碍植物种间杂种；
（6） 获得具有不同后生遗传变化亲本的杂种。
2、PEG 融合与电融合的基本原理是什么？各有何特点？
（1）PEG 的作用机理： 由于PEG 分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H 键，当PEG 分子链足够长时，在相邻原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连。与膜相连的PEG 分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配。当两层膜紧密接触的区域电荷重新分配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连接到另一种原生质体的带负电荷的基团上，进而促使原生质体的融合；另外，PEG 能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。
•PEG 特点：融合频率高；可重复性强；诱发融合无特异性（植物+植物、植物+动物、动物+酵母）；毒性较低
•PEG 诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。
（2）电融合原理：交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠；施加直流电场
后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流；
•与PEG 融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题； 二是融合效率高； 三是融合技术操作简便。
•电融合仪的结构特点： 一是交变电场部分； 一是高频直流电击部分。
•电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。
四、填空
1、植物细胞大规模培养方式主要有（分批培养法）、（半连续培养法）、（连续培养法）和（固定化培养法）。
2、诱导植物细胞融合的因素主要有（无机盐）、（高pH-高Ca 离子）、（聚乙二醇(PEG)）和（电融合技术）。？
3、一般认为形成的器官的类型受培养基中两类激素的相对浓度的控制，较高浓度的（生长素）有利于根的形成而抑制芽的形成，相反，较高浓度的（激动素）则促进芽的形成而抑制根的形成。
4、植物原生质体发育及植株再生途径主要有：（ ），（ ），（ ），（ ）等途径。
过程是：细胞壁再生；细胞分裂与生长；愈伤组织形成与分化；植株再生。途径课件和书上找不到„„
5、制备植物原生质体过程中，酶解去除细胞壁时，为保证原生质体的稳定，通常加入（渗透稳定剂），（细胞质膜稳定剂）等。
6、植物原生质体制备需要的酶有：（纤维素酶），（果胶酶）等。
分离植物细胞原生质体所必须的两种酶是纤维素酶和果胶酶，后者的作用主要是细胞间的果胶质降解，前者是消化细胞壁纤维素。
7 植物组织培养形成的愈伤组织进行培养，又可分化成根、芽等器官，这一过程称为 _器官发生_。
8常用的生长素有__________、__________、__________ 、__________等，常用的细胞分裂素__________ 、__________、__________。
生长素类：
1）吲哚类：IAA （吲哚乙酸）、 IBA（吲哚丁酸） 、IPA （吲哚丙酸）
2）萘酸类： NAA（萘乙酸）
3）苯氧羧酸类：2,4-D （2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T （ 2,4,5-三氯苯氧乙酸）、 2,4,5-TP（ 2,4,5-三氯苯氧丙酸）
细胞分裂素类：
是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（ 6-糠基氨基嘌呤KT ）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA ）和玉米素（ZT ）等。其中最常用的是6—苄基氨基嘌呤
9由愈伤组织再生植株有两条途径__器官发生__ 和__体细胞胚胎发生___ 。？
10在植物组织培养中，培养基的pH 值一般为 （大多在5.5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8）。
生物技术复习资料
第一章 基因工程 一．专业符号
Tetr 四环素抗性 R/M体系
Ampr 氨苄青霉素抗性 pBR322 质粒载体 M13 单链噬菌体载体 cosmid 科斯质粒
IPTG 异丙基-β-D 硫代半乳糖苷 DNA ligase DNA连接酶 EcoRI 一种限制酶 host 宿主
Plasmid 质粒 Ori 复制起始位点 vector 载体 cDNA 互补DNA southern blot DNA印迹转移技术 MCS 多克隆位点
二．名词解释
生物工程bioengineering ——利用生物有机体（包括微生物和动、植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞、细胞器）和组织成分（包括DNA 、RNA 、蛋白质、酶、多糖、抗体等），形成新的技术手段来发展新产品和新工艺的一种技术体系。也是采用先进生物学和工程学技术，有目的、有计划定向加工制造生物产品的一个新兴技术领域。
免疫分析法——免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。
基因工程——指按照人们的意愿，在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之转入到原先没有这类分子的宿主细胞内，形成能持续稳定繁殖的新物种。其目的是为人类提供有用产品及服务。
感受态细胞——能从其周围摄入DNA 的细胞称为感受态细胞。
同聚物加尾法——利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP) 加到DNA 分子单链延伸末端的3‘-OH 上。如果在目的基因两侧加polydA ，则在载体两侧加polydT 。长度一般10~40个残基。可以连接任何两段DNA 分子的普遍性方法。
原位杂交技术——根据核酸杂交原理，利用基因探针检出培养板上重组 转化体菌落位置的技术称之为原位杂交技术。
DNA 接头——它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。
标记营救——SV40 DNA为载体的取代克隆方式又分为早期基因区域取代及晚期基因区域取代两种类型。晚期基因区域取代方式是以外源性DNA 片段取代晚期基因区域，构成的重组DNA 在宿主中可以复制，但不能产生重组病毒颗粒，因而采用早期基因缺失的SV40病毒突变种作为辅助病毒与晚期取代重组DNA 或和感染宿主，则晚期区域取代重组DNA 可获得标记营救，辅助病毒产生的晚期基因产物与重组病毒的早期基因产物一起可形成完整病毒颗粒。
早期区域取代方式是以外源性DNA 片段取代早期基因区域，但重组DNA 形成病毒颗粒与早期区域基因产物T 抗原供应有关，故同样可采用晚期基因区域缺失的SV40突变种作为辅助病毒进行标记营救，即可形成完整病毒颗粒。
R/M体系——大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制(restriction)和修饰(modification)现象，简称R/M体系。
衔接物——指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。
同尾酶——虽来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端的限制性内切酶，称为同尾酶。
基因文库——是将基因组DNA 通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA 片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA 的所有序列。
启动子——启动子是位于结构基因5' 端上游的DNA 序列，能活化RNA 聚合酶，使之与模板DNA 准确的结合并具有转录起始的特异性。
转化Transformation ——自然的转化是指将携带某种遗传信息的DNA 分子引入宿主细胞，通过同源重组作用获得具有新遗传性状的生物细胞的过程，基因工程操作中的转化是泛指将重组DNA 转入宿主中的方法。
多克隆位点——DNA 载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶的单一识别位点。能为外源DNA 提供多种可插入的位置或插入方案。
回文结构——双链DNA 中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称回文结构。
同裂酶——识别顺序与切割方式均相同的限制性内切酶。
安慰诱导物——能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的分子，如，IPTG 是一种乳糖类似物，再无乳糖的条件下，他可以诱导细胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG 被称为β半乳糖苷酶的安慰诱导物。
衔接物连接法（linker ）——将衔接物的5‘末端和待克隆的DNA 片段的5’末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA 连接酶的作用使两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA 分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。
DNA 接头法（adaptor ）——当DNA 接头的平末端与平末端的外源DNA 片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA 分子，而易于连接重组的方法。
插入灭活效应——在基因工程早期使的某些载体(如pBR322) ，这些载体本身有两个或更多个抗生素抗性基因和分布适宜的酶，即位点。用适当的酶处理DNA 及载体，进行重组，即将外源DNA 插入到某一抗性基因中，而使该基因失去抵抗某抗生素的表型。
DNA-蛋白质筛选法——是用来专门检测同DNA 特异结合的蛋白质因子的一种方法。这种方法能用于筛选并分离表达融合的克隆。合成这种融合蛋白的重组DNA 分子中的外源DNA 编码一种能专门同某一特定DNA 序列结合的DNA 结合蛋白质（DNA binding protein）。
蛋白质工程——是指通过蛋白质化学、晶体学和动力学的研究，获取关于蛋白质物理、化学等各方面的信息，在此基础上，对编码该蛋白质的基因进行有目的的改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终得到比天然蛋白质更好的产物。
三．填空题
基因工程载体的必备条件： 1、具有有效运载能力
2、携带外源性目的基因前后在宿主内功能自主复制 3、在宿主内能控制外源基因表达活动 4、鉴定方便，装卸手续简单
5、能携带大小不同的外源性目的基因、载体分子量要小, 运载能力要大 6、容易控制、安全可靠、稳定性好
常用的将重组DNA 转入宿主细胞的方法： 细菌转化与转染、高压电穿孔法、聚乙二醇介导的原生质体转化、磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、原生质体融合、脂质体法、细胞核的显微注射法、激光打孔技术、基因枪法
基因工程基本步骤： 1、获得目的基因
2、在体外获得形成重组DNA 分子。
3、将重组DNA 分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起增殖。
4、从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA 分子的宿主细胞克隆。
5、从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用。 6、将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
E.coli 表达系统中常用的强启动子：Lac 、Trp 、λPL 、λPR [1）lac 启动子2）trp 启动子3）tac 启动子]
目的基因制备方法：一、基因分离的物理方法；二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法；三、cDNA 文库的建立与基因的分离；四、基因组文库法；五、基因的化学合成；六、聚合酶链反应技术（PCR ）
外源基因在宿主细胞中高效表达的关键因素：一、有效的转录起始；二、mRNA 的稳定性；
三、有效地翻译启始；四、遗传密码应用的偏倚性；五、 mRNA的加工；六、 mRNA序列上终止密码的选择；七、表达质粒拷贝数及稳定性；八、外源蛋白的稳定性
PCR 主要步骤：1、高温变性：2、低温退火：3、适温延伸
常用的克隆载体：细菌质粒（Col E1质粒载体、pSC101质粒载体、pBR322、pUC 质粒载体）、病毒DNA 、噬菌体DNA[λ噬菌体DNA 和柯斯载体(cosmid)及单链DNA 噬菌体载体(M13)]
DNA 片段的连接方法：一、DNA 连接酶和T4DNA 连接酶；二、粘性末端DNA 片段的连接（连接酶的作用）；三、平末端DNA 片段的连接（同聚物加尾法、衔接物连接法、DNA 接头连接法） 真核病毒载体的优点：（常用的有SV40病毒载体及昆虫杆状病毒载体。） 1、有很高的拷贝数；
2、强大的启动子，可保证外源基因的高效表达； 3、可保证糖基化。
四．问答题
基因获得的方法有哪些？各有哪些特点？
一、基因分离的物理方法：人们通过控制溶解温度使富A=T区解链变性，而富G ≡C 区仍维持双链。当利用单链核酸酶S ，酶去除解开的单链部分，得到富G ≡C 区的DNA 片段 。
二、鸟枪法(Shot gun)又称霰弹法：鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离，优点：操作简单，命中率较高。缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会漏。
三、cDNA 文库的建立与基因的分离：最关键的特征是它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA 的那些基因序列，局限性——并非所有的mRNA 分子都具有polyA 结构；
细菌或原核生物的mRNA 半衰期很短；mRNA 在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难；仅限于克隆蛋白质编码基因, 没有内含子，不能用于真核表达。
四、基因组文库法：从基因组文库所分离获得的基因序列包含有内含子，因此不能直接在原核细胞中表达，但更适合作为如转基因动物等的真核表达系统。
五、基因的化学合成：优点1、可以合成细菌偏爱的密码子2、可以定向改变个别氨基酸 3、可以在两端加上需要的限制酶切点4、可以通过自动化仪器合成。
六、聚合酶链反应技术（PCR ）优点：1、操作简单；2、通用性好；3、成功率高 cDNA 文库的建立有哪些步骤?
1、分离表达目的基因的组织或细胞。 2、从组织和细胞中制备总RNA 和mRNA 3、第一条cDNA 链的合成 4、第二条cDNA 链的合成 5、cDNA 上接头的加入
6、双链cDNA 与载体的连接
7、从众多的重组体中筛选出特定的基因
限制酶命名原则是什么?
属名（大写）+种名（小写）+株名+分离序号
外源基因在宿主细胞高效表达的关键问题及其解决方案
一、有效的转录起始与基因的高效表达：选择强的可调控的启动子；
二、mRNA 的稳定性与基因高效表达：1、利用RNase 缺失的受体菌，2、mRNA 的5’端与3’端的正确加工，提高mRNA 的稳定性；
三、有效地翻译启始与基因的高效表达：1、首选AUG 为起始密码子；2、正确的SD 序列；3、 SD序列与起始密码子之间的距离以9±3为宜；4、除SD 序列外，处于起始密码5’端的核苷酸应为A 和U ；5、如果在起始密码AUG 后的序列是GCAU 或AAAA ，能使翻译效率提高；6、在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构。
四、遗传密码应用的偏倚性与基因高效表达：不同表达系统中，使用偏倚性密码，尤其对于基因编码序列的5’端使用偏倚性密码，能有效提高表达效率。
五、 mRNA的加工与基因高效表达：绝大多数较高等的真核基因含有内含子，这些内含子在mRNA 的加工过程中，在细胞核中被加工去除而产生成熟的mRNA 。但许多哺乳动物类细胞中外源基因的表达需要内含子存在，如果在转基因动物中表达外源基因时，最好用基因组基因而非cDNA 。
六、 mRNA序列上终止密码的选择：1、首选UAA ；2、用一串连的终止密码，而不是只是一个终止密码，以保证翻译有效终止。
七、表达质粒拷贝数及稳定性与基因高效表达：一般来讲，质粒拷贝数多，基因表达水平高；质粒稳定性高，表达好。
八、外源蛋白的稳定性与基因高效表达：1、通过组建融合基因，产生融合蛋白；2、产生可分泌的蛋白质；3、以包含体的形式表达；4、选择合适的宿主表达系统。
假如用大肠杆菌生产人的β-珠蛋白，必须经过几个基本步骤
分离获得β-珠蛋白的基因——组成重组质粒——转化大肠杆菌——筛选阳性克隆——阳性克隆大量增殖——分离提纯目的蛋白 1）获得目的基因
2）在体外，将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA 分子。
3）将重组DNA 分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起增殖。
4）从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA 分子的宿主细胞克隆。
5）从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用。 6）将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人
类所需要的物质。
平末端DNA 片段的连接有哪些方法，各有什么特色？
1、同聚物加尾法是由美国斯坦福大学的P.Labban 和D.Kaiser1972年发展起来的，可以连接任何两段DNA 分子的普遍性方法。
原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP) 加到DNA 分子单链延伸末端的3‘-OH 上。如果在目的基因两侧加polydA ，则在载体两侧加polydT 。长度一般10~40个残基。
缺点：插入的片段难以回收。无法控制外源基因插入方向。
2、衔接物（linker) 连接法
所谓衔接物是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。 将衔接物的5‘末端和待克隆的DNA 片段的5’末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA 连接酶的作用使两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA 分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。 优点：克隆后还可回收原插入片断。 缺点：如果待克隆的DNA 片段或基因的内部也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把所克隆的基因切成不同的片段，从而对后继的亚克隆及其他操作造成麻烦。
3、DNA 接头(adaptor)连接法
DNA 接头是由美国康奈尔大学吴瑞博士于1977年发明的，它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA 片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA 分子，而易于连接重组。
问题：各个DNA 接头分子的粘性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA 衔接物一样的二聚体分子，失去接头的本来意义。克服的方法是将5‘末端的磷酸修饰移去，其结果为暴露出的5’-OH 所取代。如此一来，虽然两个接头分子粘性末端之间仍具有互补碱基配对的能力，但终因DNA 连接酶无法在5‘-OH 和3’–OH 之间形成磷酸二酯键而不会产生出稳定的二聚体分子。
蛋白质工程的主要步骤有哪些？ 1、分离纯化需改造的目的蛋白
2、了解其一级结构及高级结构，了解其结构-功能关系 3、获取编码该蛋白的基因序列 4、设计改造方案
5、对基因序列进行改造
6、将经过改造的基因序列重组入表达载体，进行表达 7、分离纯化表达产物，并对其功能进行检测
第二章 微生物工程 一、 专业符号
1.BOD 生化需氧量 2.COD 化学需氧量 3.UV 紫外线
4.FN 快中子 5.PEG 聚乙二醇 6.EDTA乙二胺四乙酸 7.GSH 谷胱甘肽 8.MFA 代谢通量分析 9.MCA 代谢控制分析
二、 名词解释
微生物工程（Microbial Engineering）
微生物工程又称为发酵工程，是一门利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术，是生物工程的重要组成部分。
自然选育
它是利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株
诱变育种
利用诱变剂处理微生物群体，使其中部分细胞的遗传物质结构发生改变，从而引起微生物性状发生改变，然后从群体中筛选出目的菌株的过程
葡萄糖效应
又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。
生理酸性物质：经微生物代谢后能形成酸性物质的无机N 源 生理碱性物质：经微生物代谢后能形成碱性物质的无机N 源
前体:在抗生素生物合成中，菌体用来构成抗生素分子而本身结构又没有显著改变的物质
生长因素 广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素) ，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。
诱变剂
用来处理微生物并能提高生物体突变频率的物理或化学因素，称为诱变因索，又称诱变剂。三类：物理、化学、生物诱变剂。
基因突变： DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变引起可遗传的突变。
基因重组：（Gene recombination）两个不同性状个体的遗传基因转移到一个体细胞内，并经过基因的重新组合后，造成菌种变异，形成新的遗传型个体的方式。
原生质体融合：用脱壁酶将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇(PEG)促进原生质体发生融合，从而获得融合子，它保持原细胞的一切活性
原生质体的再生：在再生培养基上使失去细胞壁的原生质体重新长出细胞壁来
表型变异：微生物在生活条件改变时，发生暂时的形态生理特性的改变，但随着环境条件的复原，他们又恢复了原有的特性，是不可遗传的
代谢工程
代谢工程 是一门利用分子生物原理系统分析代谢网络、并通过DNA 重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科
次级代谢产物：微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂，对该微生物生理功能和生长非必需的物质，如抗生素、毒素、激素等
初级代谢产物：微生物通过代谢活动所产生的自身生长和繁殖所必需的物质，例如氨基酸、核苷酸和多糖之类的物质。 三、填空题
1、微生物产品的下游加工过程包括（发酵液的预处理）、（初步提取）、（高度纯化）、（成品加工）。
2、发酵工业中常用的灭菌方法包括（加热灭菌法）、（辐射灭菌法）、（介质过滤除菌法）、（化学灭菌法）。
3、发酵过程中监控的化学参数主要有（PH ）、（基质浓度）、（溶解氧浓度）、（氧化还原电位）、（产物浓度）、（废气中氧浓度）、（废气中CO2浓度）和（ ）。 4、诱变育种中使用的诱变剂分为（物理诱变剂）、（生物诱变剂）和（化学诱变剂）。
四、问答题
1、 常见的菌种保藏方法有哪些? （1）斜面低温保藏法 （2）液体石蜡封藏法 （3）甘油冷冻保藏法 （4）冷冻干燥保藏法 （5）液氮超低温保藏法 （6）其他干燥保藏法
2、 发酵过程中产生泡沫会带来哪些不利因素，常用的消沫方法有哪几种？ 不利因素：培养过程中产生的泡沫与微生物的生长和合成酶有关，泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收；妨碍二氧化碳的排除，因而破坏其生理代谢的正常进行，不利于发酵； 由于泡沫大量生成，致使培养液的容量一般只能等于种子罐容量的一半左右，大大影响了设备的利用率，甚至发生跑料，招致染菌，造成巨大损失。 消泡方法：机械法 • 化学法。
• 泡沫的控制除了添加消泡剂外，改进培养基成分也是相辅相成的一个重要方面。
3、发酵培养基由哪些成分组成？
发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的能源，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。对于大规模发酵生产，除考虑上述微生物的需要外，还必须重视培养基原料的价格和来源。
4、培养基按照组成物质来源可分为哪两种，各自具有什么特点？ （1）天然培养基
是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等) 制成的。
适合于各类异养微生物生长，而一般自养微生物都不能生长。 （2）合成培养基
是用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精 确，重复性强，可以减少不能控制的因素。适用于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。但一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长。 5、 下游处理过程分为那几个步骤？相应的分离方法有哪些？
下游加工过程（down stream processing）:从微生物发酵液中分离、精制生物产品的过程。 包括：发酵液预处理、初步纯化、高度纯化（精制）、成品加工 预处理：过滤
提取：吸附法、沉淀法、溶媒萃取法、离子交换法
精制：盐析法、交换树脂脱色、活性炭脱色、结晶、重结晶、晶体洗涤、蒸发浓缩、层析凝胶分离、无菌过滤和干燥等
6、简单叙述原生质融合的步骤。 1）标记菌株的筛选和稳定性验证。
2）原生质体制备。
3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 4）涂布于再生培养基，再生出菌落。
5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 6） 生产性能筛选。
7、原生质体制备过程中，加入渗透压稳定剂的作用是什么，常用的稳定剂有哪些？
等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl 和NaCl 等无机物 8、 原生质融合过程中PEG 和Ca2+分别起什么作用？
表面活性剂聚乙二醇及 Ca2*、Mg2*等阳离子，使融合频率出现突破性提高。PEG 分子量从1000到12000，融合时多用4000和6000两种。 9、 原生质体融合育种过程中，杂种菌株的筛选要注意什么？
融合子的选择主要依靠两个亲本的选择性遗传标记，在选择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。但是由于原生质体融合后会产生两种情况：一是真正融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体，二是暂时融合，形成异核体。两个均可在选择培养基上生长，前者较稳定而后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚者可以以异核状态移接几代。因此，必须在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定是否获得了真正融合子
10、诱变育种中使用的化学诱变剂根据作用方式分为哪几类？
烷化剂：氮芥、乙烯亚胺、亚硝基胍 它们与DNA 碱基起反应，引起碱基配对的转换而发生遗传变异 碱基类似物：它们掺入DNA 分子中而导致遗传变异，例如5-BU 、5-FU
移码诱变剂：吖啶黄、吖啶橙等，它们可插入DNA 双螺旋的邻近碱基对中，造成剪辑的插入和缺失，导致转录和翻译的移码突变
11、在发酵过程中引起溶解氧异常下降的常见原因有哪些？ 1）污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗 2）菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加 3）某些设备或工艺控制发生故障或变化
12、代谢网络中的节点是什么？可以分为几类？
微生物代谢网络中的途径的交叉点(代谢流的集散处) 叫做节点(node)，微生物自动抵制节点处代谢物流量分配比率的改变的特性叫做节点的刚性。节点的刚性取决于微生物代谢的自动调节机制。 如果某个代谢流的扰动对其下游代谢流未能造成可观察的影响，那么就可以认为该处的节点对上游扰动的反应是刚性（Rigid ）的，与之相反的情况则称为柔性（Fluxible ）。
第三章 酶工程
一、专业符号及名词解释
1. NADPH还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 2. DEAE二乙氨乙基葡聚糖 3. DNP二硝基苯酚
4. error prone PCR 易错PCR
从单一基因出发，通过改变PCR 反应条件，在基因扩增过程中使碱基配对出现错误而引起基因突变。
5. DNA shuffling DNA改组
又称为DNA 改组技术，是从2种以上同源正突变基因出发，用酶（DNaseI ）切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR 循环，使DNA 的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。
6. IU 酶活力国际单位
1个酶活力国际单位是指在特定条件下，1min 内生成1μmol 产物的酶量（或转化1μmol 底物的酶量）。
7. Katal 酶活力单位 在最适条件下，每秒钟可使1MOL 底物转化的酶量，1KAT=6*10^7IU
8. 酶工程
酶工程（Enzyme engineering ）是指通过化学方法、酶学方法和DNA 重组技术改善自然酶的形成、结构和性质，提高酶的催化活性、降低成本并在大规模工业化生产中应用。
9. 酶的活力单位
在最适条件下，单位时间内，酶催化的底物的减少量或产物的生成量
10. 酶的比活力
纯度的在量度，指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，一般用单位/毫克蛋白（U/mg蛋白质表示）。酶的比活力越高，酶的纯度也就越高。
11. 固定化酶
固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。
12. 固定化细胞
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。
固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学因素的约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。
13. 固定化酶的操作半衰期
在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历时间，以t1/2表示。
14. 固定化酶的偶联效率
15. 固定化酶的活力回收率
固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶（细胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞）总活力的百分数。
16. 固定化酶的相对活力
17. 酶反应器
以酶（游离酶或固定化酶）作为催化剂进行酶促反应所需的设备成为酶反应器。
18. 酶分子的化学修饰
酶的化学修饰，就是在分子水平上对酶的化学结构进行改变，以达到改构和改性的目的（侧链基团的取代、肽链的限制性水解、分子内或分子间的交联）。
19. 生物传感器
使用固定化的生物分子(immobilized biomolecules), 与适当的化学换能器结合，用于快速侦测物理、化学、生物量的新型器件。
20. 酶的非水相催化
酶在非水相（也称非水介质）中也具备催化活性，可以在含有多种有机介质和微量水分的非水介质中发挥催化作用，并且具有催化活力、选择性和稳定性上表现出与常规水溶性介质中截然不同的催化性能。
21. 抗体酶
抗体酶 或催化抗体（Catalytic antibody) 是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。
22. 极端微生物
又称嗜极菌，是可以（或者需要）在“极端”环境中生长繁殖的生物，大多数极端菌属于古细菌。
二、填空题
1. 酶分子的化学修饰的具体方法包括（主链修饰）、（侧链基团修饰）、（化学交联修饰）、（大分子结合修饰）、（亲和标记修饰）、（基因修饰）、（与辅因子相关的修饰）和（ ）。 2. 抗体酶的制备方法有（诱导法）、（引入法）、（拷贝法）、和（抗体库法）。
3. 1961年国际生物化学联合会酶学委员会根据反映类型，将酶类分为（氧化-还原酶）、（水解酶）、（转移酶）、（连接酶）、（裂合酶）、（异构酶）。
三、问答题
1. 酶有什么特性？什么是酶工程？
酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂，按化学组成的不同主要分为核酸类酶（R 酶）和蛋白质类酶（P 酶）。①催化效率高 ②专一性强 ③反应条件温和 ④催化活性受到调节和控制 酶工程（Enzyme engineering ）是指通过化学方法、酶学方法和DNA 重组技术改善自然酶的形成、结构和性质，提高酶的催化活性、降低成本并在大规模工业化生产中应用。
2. 常用的固定化酶的方法有哪几种，试对各种方法进行综合比较 （右图）
3. 固定化酶的偶联效率的测定方法有哪几种？ 残留法（测定未结合酶量） 水解法（水解结合的酶并各种固定化方法的比较测含量） 吸附法
包埋法共价键结合法交联法
物理吸附法离子吸附法
4. 影响固定化酶反应动
制备易易较难难较难
力学的因素有哪几种？
结合程度弱中等强强强
空间效应（包括构象和屏
高高低中等
蔽） 扩散效应 分配效应 活力回收率高，但酶易流失
再生可能可能不可能不可能不可能
低低低高中等5. 常用的固定化酶的活固定化成本
底物专一性不变不变不变可变可变力测定方法有几种？
⒈分批测定法 ⒉连续测定法
6. 与天然酶相比，固定化酶具有哪些优点？
具有生物催化剂的功能，又有固相 催化剂的功能。
①可重复使用，降低成本；
②反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。
③稳定性提高，反复使用多次后，酶的活力无明显下降；
④反应条件易于控制，可以自动控制，节约劳动力。
7. 与固定化酶相比，固定化细胞具有哪些优点？
固定化活细胞的优越性
无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；
保持了酶的原始状态，比固定化酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；
细胞本身含多酶系统，可催化一系列反应，且不需添加辅助因子；
细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等。
缺点
必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；
必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；
胞内多酶的存在，会形成副产物；
载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。
8. 酶的抑制剂按照抑制作用方式分为哪几类?
竞争性抑制 竞争酶的活性中心结合位点
非竞争性抑制 竞争活性位点以外的酶的部位
反竞争性抑制 与ES 复合物结合
9. 酶分子定向进化的原理是什么？
在待进化酶基因的PCR 扩增反应中，利用Taq DNA聚合酶不具有3’→5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变文库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质) ，从而排除其他突变体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
定向进化=随机突变+定向选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。
10. 酶分子的亲和标记物分为哪两类，各自具有什么特点？
Ks 型抑制剂：根据底物的结构设计的，具有和底物结构相似的结合基团，同时还具有能和活性部位氨基酸残基侧链基团反应的活性基团，导致酶不可逆失活。特点：底物，竞争性抑制剂等对修饰有保护作用。
Kcat:根据催化过程设计的，具有酶的底物性质，还有一个潜在的反应基团，在酶催化下活化后，不可逆的抑制酶的活性部位。Kcat 型也称为“自杀性抑制剂”，可以用来治疗某些疾病的药物。
11. 按照操作方式，酶反应器可以分为哪几类，各自具有什么特点？
间歇式搅拌罐反应器：这类反应器结构简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料和食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的固定化酶很少采用。常用于游离酶。
连续流动搅拌罐反应器优点：反应液混合良好，各部位的成分相同，并与流出液的组成也一致。连续流动搅拌罐反应器的开放结构使得调换固定化酶比较容易，而且有利于控制温度和调节pH ，还能够处理胶态或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用连续流动搅拌罐反应器有较高的转化率。缺点：由搅拌产生的剪切力较大，易打碎磨损固定化酶颗粒。需改良的连续流动搅拌罐反应器。
填充床反应器：流化床反应器反应时，底物溶液以足够大的流速，从反应器底部向上通过固定化酶柱床，便能使固定化酶颗粒始终处于流化状态。其混合程度介于连续流动搅拌罐反应器的全混型和填充床的平推流型之间。由于反应器内混合程度高，因此，传热、传质情况良好，可处理粘性大、含有固体颗粒的底物。
连续搅拌罐-超滤膜反应器：连续流动搅拌罐反应器/连续搅拌罐适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。
循环式反应器：循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触机会，以达到所需的转化率。这种反应器可用于难溶或者不溶性底物的转化反应。
12. 与天然酶相比，抗体酶的优点有哪些？
1）抗体酶可经过精确的设计，专一性的催化某一底物转化的反应，而天然酶通过突变修饰也很困难
2）抗体酶可以催化那些理论上认为非常不利的反应
3）抗体酶可以催化天然酶不能催化的反应
13. 抗体酶的制备方法有哪些？
诱导法：即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。
引入法（抗体结合部位修饰法
将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术
拷贝法
用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，应获得具有原来酶活性的抗体酶。缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。
抗体库法
用基因克隆技术，将全套抗体重链和轻链可变区克隆出来，重组到原核表达载体。通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，从中筛选特异性的可变区基因。
第四章 动物细胞工程
一 专业符号
1 DMSO ：二甲基亚砜
2 HGPRT¯ ：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型
3 TK¯：胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型
4 HAT：含一定浓度的次黄嘌呤（H ）、氨基蝶呤（A ）、胸腺嘧啶（T ）的一种选择性培养基 5 MTT：四唑盐
6 McAb：单克隆抗体
7 PEG：聚乙二醇
8 Hela：供体患者的姓名，来源于宫颈癌
9 CHO：中国地(仓) 鼠卵细胞
二 名词解释
1 动物细胞工程：是按照人们预定的设计，根据细胞生物学及工程学原理定向改造动物细胞遗传性，创造新物种，通过工程化为人类提供名贵药品及服务的技术。
2 锚地依赖性（贴壁依赖性）：大多数动物细胞只能附着或贴在固体或半固体表面上培养才能生长的特性为贴壁依赖性，此细胞称为锚着依存性细胞。
3 接触抑制性：指当细胞长满附着物表面，相邻细胞表面间相互接触，使细胞对数生长期停止进入稳定期，细胞生长大大减慢，细胞生长、死亡处于动态平衡的特性。可作为区别正常细胞与癌细胞标志之一。
4 动物细胞培养技术：将动物机体的细胞或某一部分组织取出一小块，在体外经过表面消毒处理后，使其分散成单个游离的细胞，并放置在人工配制的培养基中进行培养，使之生长、分裂、繁殖的技术。
5 组织块培养法：将动物组织切成直径1～2mm ³ 立方小块，放在盛有培养基的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长进行培养的方法。
6 细胞单层培养法：动物组织块经过机械方法或酶解法消化分散成单个细胞或细胞团块后，粘附于培养容器表面培养成新生细胞单层的培养法，其过程包括组织块分散及培养。
7 单细胞分离培养：即细胞克隆培养，是将动物组织分散后，将一个单细胞从一个群体中分离出来单独培养，使之重新繁衍称为一个新的细胞群体的培养技术。
8 原代细胞培养（初代培养）：是指直接从机体取材（细胞、组织或器官）或经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA ）或机械方法处理，将其分散成细胞后置于体外合适条件下生长到第一次传代。
9 传代培养：当初代培养的贴壁细胞相互汇合而铺满瓶底时，细胞由原培养瓶经消化、收集、稀释后，转移一部分初代培养物到新的培养瓶，细胞才能继续生长的过程称为传代培养，常用酶消化法传代。
10 饲养细胞：在细胞培养中加入的活细胞（如小鼠胸腺细胞或腹腔细胞），能够促进单个或少数分散细胞的生长增殖，其本身无分裂能力，克隆形成后，本身死亡。
11 动物细胞融合：在外界因素作用下，两个或两个以上异源动物细胞的细胞质膜发生改变，导致细胞互相合并为一个多核细胞的过程，亦称动物体细胞杂交。
12 淋巴细胞杂交瘤：用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B 淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B 淋巴细胞产生特异性抗体能力的杂种细胞。
13 动物细胞大规模培养技术：是指在人工条件下，高密度大量培养基因工程、细胞融合或转化所形成的有用动物细胞，生产珍贵药品的技术，为细胞工程不可缺少的部分。
14 McAb：单克隆抗体，只针对某一抗原决定簇的抗体分子。
15 微载体培养法：是将细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法。
16 转基因动物：将某种外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并稳定遗传给后代的一类动物。
17 基因治疗：向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，纠正或补偿其基因缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，表达新产物达到治疗目的。
三 填空题
1 动物细胞培养基类型：天然培养基、基本合成培养基（基础培养基）、完全培养基、无血清培养基
2 保存动物种质细胞最有效的方法：超低温冷冻法
超低温法常用保护剂：二甲基亚砜DMSO （5%～12.5%）、甘油（5%～20%）
3 细胞融合及遗传物质转移方式有哪些：完整细胞之间的融合、核体、胞质体与完整细胞的融合、微细胞与完整细胞的融合、脂质体介导的细胞融合
4 杂种细胞的筛选有哪几类系统：HAT 选择系统、抗药性筛选系统、营养互补选择系统、温度敏感突变型杂种细胞选择系统、基因转化标志细胞的选择、标记基因的特异位点表达法
5 动物细胞大规模培养有哪些方法：悬浮培养法、固定化培养法、单层静置贴壁培养法
6 动物细胞所需营养因素：氨基酸（氮源）、 盐类、 葡萄糖（碳源、功能）、 缓冲系统 、生长因子 、其他成分
7 无血清培养基中加入的补充因子：必需因子（细胞生长因子与激素）、特殊因子如贴壁因子（纤粘连因子、层粘连因子）、蛋白酶抑制剂
8 细胞融合的促融因素：生物促融剂（病毒）、化学促融剂（PEG ）、物理促融剂（电场力、离心力）
9 动物细胞工程研究主要内容：动物细胞工程基础、动物细胞培养技术、动物细胞融合技术、单克隆抗体技术、动物细胞大规模培养技术
10 生理平衡盐溶液：Ringer 、PBS 、Earle 、Hanks 、D-Hanks
四 问答题
1 淋巴细胞杂交瘤的形成原理是什么？为什么HAT 培养基可用于筛选淋巴细胞杂交瘤（HAT 法具体原理教材p141）？
㈠ 用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B 淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B 淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又称为淋巴细胞杂交瘤。 ㈡ HGPRT¯ 或TK ¯骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合的杂种细胞，从两亲本细胞分别获得hgprt 或tk 基因，可应用HAT 选择培养基中的次黄嘌呤H 和胸腺嘧啶T ，通过补救途径合成DNA ，使杂种细胞存活下来，而HGPRT ¯ 或TK ¯骨髓瘤亲本细胞在HAT 培养基中死亡，淋巴细胞不能再体外长期分裂增殖亦逐渐死亡，从而可筛选出淋巴细胞杂交瘤。
2 什么叫McAb ？基本特征是什么？
McAb（monoclonal antibody ），即单克隆抗体，其基本特征为：专一性强，质地均一，检测灵敏度极高，可通过杂交瘤细胞的大规模培养进行生产。
3 简述制备杂交瘤的工艺路线？
细胞融合前的准备→细胞融合→HAT 选择杂交瘤→抗体的检测→杂交瘤的克隆→杂交瘤细胞的冻存→单克隆抗体的大量生产→单克隆抗体的鉴定
4 动物细胞培养过程的特点是什么?
⑴ 动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度差，适应环境能力差。
⑵ 倍增时间长，细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素（链霉素、青霉素）。 ⑶ 培养过程需氧量少，常采用5% CO2 培养箱。
⑷ 在机体中，动物细胞相互粘连以群体形式存在，在培养过程中有锚地依赖性（贴壁依赖性） 、接触抑制性、密度抑制性等特点。
⑸ 大规模培养时，不可套用微生物反应的经验。反应器应密封性好，对pH 、溶解氧要求高。 ⑹ 培养过程中产生的产物分布于细胞外，反应过程成本高，但产品价格昂贵，如疫苗、单抗、生长因子，甚至是细胞本身。
5 杂种细胞的筛选有哪几类系统？
杂种细胞筛选的原理是将融合混合物于选择培养基上，终止同型多核、异型多核及未融合亲本细胞的繁殖，而仅允许异型双核细胞繁殖的过程。其筛选方法有：
⑴ HAT选择系统，为生物化学选择法，在HAT 选择培养基上仅有HGPRT ¯ 或TK ¯骨髓瘤细胞与淋巴细胞融合的杂种细胞才能存活，而其两亲本均死亡，从而筛选出杂种细胞。
⑵ 抗药性筛选系统， 利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞的方法，选择一种亲本细胞，其生长受药物A 抑制，对药物B 不敏感；选择另一种亲本，其受药物B 抑制，而对药物A 不敏感；当将这两种亲本细胞融合混合物置于含药物A 和B 的培养基中时，两亲本细胞均死亡，唯有融合子杂种细胞可存活，经分离和传代培养后可筛选出特定杂种细胞。
⑶ 营养互补选择系统 利用两种亲本细胞营养互补作用原理，如一种亲本细胞为色氨酸缺陷型，另一种亲本细胞为苏氨酸缺陷型，将这两种亲本细胞融合混合物置于不含色氨酸及苏氨酸的培养基中，两亲本细胞均死亡，唯有融合子杂种细胞可存活，经分离克隆培养后可筛选出杂种细胞。
⑷ 温度敏感突变型杂种细胞选择系统 一般的培养细胞能在32～40℃的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长，由此筛选杂种细胞。
⑸ 基因转化标志细胞的选择
⑹ 标记基因的特异位点表达法
6 基因工程抗体可以分为哪几类？
主要包括两大部分：
㈠ 对已知的单克隆抗体进行改造，包括
①单克隆抗体的人源化即大分子抗体（嵌合抗体、重构抗体）
②小分子抗体（Fab 抗体、单链抗体、单域抗体、双特异性抗体、微抗体等）
③抗体融合蛋白
㈡ 通过抗体库的构建，使得抗体不需抗原免疫即可筛选并克隆新的单克隆抗体。
①噬菌体抗体展示技术 将编码外源肽或蛋白质的DNA 片段插入噬菌体的基因组中，然后以融合的形式与噬菌体的外壳蛋白共同表达于噬菌体表面。
②抗体库技术 利用基因工程的方法克隆全套抗体可变区基因并在噬菌体表面表达，得到多样性噬菌体抗体的集合即噬菌体抗体库。
第五章 植物细胞工程
一、专业符号
PEG ：聚乙二醇 NAA：萘乙酸 DMSO：二甲亚砜 IAA：吲哚乙酸
2,4-D ：2,4-二氯苯氧乙酸 ABA：脱落酸 GA3：赤霉素 ZT：玉米素 NAA：萘乙酸
二、名词解释
1微室培养法
概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。
特点：（1）能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程
（2）培养基少，营养和水分难以保持，pH 值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
含义：即将细胞培养在很少量的培养基中。
用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。
微室培养特点：
在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。 微室培养要求：
（1）微室内不能有气泡。
（2）最好微室的厚度不要超过20微米，盖玻片 的厚度要在0.17~0.18毫米左右。
（3）观察时要保持温度和培养时的一致
2植物体细胞胚胎发生途径
胚状体方式(somatic embryo) 指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。
由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：
1) 外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。
2) 胚状体形成 在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养
条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。
3) 胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。
3植物细胞分化：
是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
4器官发生途径，
器官发生
概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的过程。 发生方式：有两种发生方式
（1）直接发生：（具有初生分生能力的）外植体直接分化成器官的过程。（由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等器官发生）
（2）间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。
5看护培养法
概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法
含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
用途；诱导形成单细胞系
基本技术：
（1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用。
（2）在无菌的条件下，先将一小块（1cm ）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm ²）已灭菌的滤纸，然后放置一个晚上。
（3）将分离出的单个细胞接种到培养基的滤纸上。
（4）恒温培养。
要求：
（1）看护愈伤组织处于活跃生长状态；
（2）愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也可以不同。
特点：
（1）效果好，易于成功。
（2）简便易行。
（3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。
注意：要得到单细胞系必须保证接种材料是真正的单细胞。
6 Ti质粒，
在根癌农杆菌的染色体DNA 之外有一种叫做Ti 质粒的环形的DNA 分子，它是诱导植物产生根癌的直接原因
Ti-plasmid, ——（short for tumor-inducing plasmid ）is a large (150~200 kb) double-stranded circular DNA plasmid in a soil bacterium called Agrobacterium tumefaciens, which causes what is known as produces uncontrolled growths (tumors, or galls), normally at the base (crown) of the plant. Ti-plasmid is the key to this tumor production.
7植物细胞脱分化
离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程
8植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，
或获得有用物质的过程。
9脱分化：离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程。
10再分化：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件（离体培养）下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整生物体。
11细胞全能性：一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。
12外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。
13愈伤组织：脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团。
14细胞分化：是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
三、问答题
1、植物细胞融合过程如何？融合特点是什么？
•在外界因素作用下，使两个或两个以上植物细胞合并成一个多核细胞的过程叫植物细胞融合（cell fusion ），也称植物体细胞杂交（somatic hybridization）。但植物与微生物一样，其细胞皆有坚硬的细胞壁，不能直接融合，须经酶消化出去细胞壁释放出原生质体，后者生理、生化及遗传学特性与完整细胞基本相同。在适当条件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用，并可再生细胞壁，恢复成完整细胞。因此，植物细胞融合实质是其原生质体融合。
•原生质体融合的过程包括3个主要阶段：
（1）凝聚作用阶段，其间两个或两个以上的原生质体的质膜彼此靠近；
（2）在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在两个原生质体之间细胞质呈现连续状态，或是出现桥；
（3）由于细胞质桥的扩展，融合完成，形成球形的异核体或同核体。
•特点：
（1） 可实现远源杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲和性；
（2） 可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，获得种间杂种，获得的遗传变异范围极广；
（3） 一次操作可实现两个以上亲本的融合作用；
（4） 可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种；
（5） 可形成有性增殖障碍植物种间杂种；
（6） 获得具有不同后生遗传变化亲本的杂种。
2、PEG 融合与电融合的基本原理是什么？各有何特点？
（1）PEG 的作用机理： 由于PEG 分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H 键，当PEG 分子链足够长时，在相邻原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连。与膜相连的PEG 分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配。当两层膜紧密接触的区域电荷重新分配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连接到另一种原生质体的带负电荷的基团上，进而促使原生质体的融合；另外，PEG 能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。
•PEG 特点：融合频率高；可重复性强；诱发融合无特异性（植物+植物、植物+动物、动物+酵母）；毒性较低
•PEG 诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG 可能对细胞有毒害。
（2）电融合原理：交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠；施加直流电场
后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流；
•与PEG 融合比较起来，电融合有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题； 二是融合效率高； 三是融合技术操作简便。
•电融合仪的结构特点： 一是交变电场部分； 一是高频直流电击部分。
•电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。
四、填空
1、植物细胞大规模培养方式主要有（分批培养法）、（半连续培养法）、（连续培养法）和（固定化培养法）。
2、诱导植物细胞融合的因素主要有（无机盐）、（高pH-高Ca 离子）、（聚乙二醇(PEG)）和（电融合技术）。？
3、一般认为形成的器官的类型受培养基中两类激素的相对浓度的控制，较高浓度的（生长素）有利于根的形成而抑制芽的形成，相反，较高浓度的（激动素）则促进芽的形成而抑制根的形成。
4、植物原生质体发育及植株再生途径主要有：（ ），（ ），（ ），（ ）等途径。
过程是：细胞壁再生；细胞分裂与生长；愈伤组织形成与分化；植株再生。途径课件和书上找不到„„
5、制备植物原生质体过程中，酶解去除细胞壁时，为保证原生质体的稳定，通常加入（渗透稳定剂），（细胞质膜稳定剂）等。
6、植物原生质体制备需要的酶有：（纤维素酶），（果胶酶）等。
分离植物细胞原生质体所必须的两种酶是纤维素酶和果胶酶，后者的作用主要是细胞间的果胶质降解，前者是消化细胞壁纤维素。
7 植物组织培养形成的愈伤组织进行培养，又可分化成根、芽等器官，这一过程称为 _器官发生_。
8常用的生长素有__________、__________、__________ 、__________等，常用的细胞分裂素__________ 、__________、__________。
生长素类：
1）吲哚类：IAA （吲哚乙酸）、 IBA（吲哚丁酸） 、IPA （吲哚丙酸）
2）萘酸类： NAA（萘乙酸）
3）苯氧羧酸类：2,4-D （2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T （ 2,4,5-三氯苯氧乙酸）、 2,4,5-TP（ 2,4,5-三氯苯氧丙酸）
细胞分裂素类：
是一类腺嘌呤衍生物。主要有激动素（ 6-糠基氨基嘌呤KT ）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA ）和玉米素（ZT ）等。其中最常用的是6—苄基氨基嘌呤
9由愈伤组织再生植株有两条途径__器官发生__ 和__体细胞胚胎发生___ 。？
10在植物组织培养中，培养基的pH 值一般为 （大多在5.5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8）。