第十五章 丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和组氨酸发酵
第一节 丙氨酸发酵
丙氨酸(Alanine，A1a)，亦称α-氨基丙酸(α-aminopropionic acid)，具有甜味，常用作调味料。霉菌、酵母、细菌、放线菌等微生物都能够由糖类和无机氮源、有机氮源发酵生产L-丙氨酸。这就是所谓的直接发酵法。后来又开发了酶法及固定化法等，原料则使用延胡索酸或L-天冬氨酸。
发酵法生产L-丙氨酸，主要是以降解葡萄糖等碳源生成的丙酮酸为底物，经过氨基转移反应或还原氨基化反应完成的。酶法是以L-天冬氨酸为底物，经过L-天冬氨酸-β-脱羧酶的反应，生成L-丙氨酸。
1．氨基转移反应
氨基转移反应，很早就已为人所知，该反应广泛分布在植物、动物、微生物的代谢过程之中。北井等的研究表明，丙氨酸产生菌胶状棒杆菌(Corynebacterium gelatinosum)No.7183，是通过丙酮酸与L-谷氨酸之间的转氨作用生成丙氨酸的。最初由氨基移转反应生成的丙氨酸是L-丙氨酸，但是经丙氨酸消旋酶的作用，转变成D-丙氨酸，因此该菌株生成的最终产物是DL-丙氨酸。
2．还原氨基化反应
Wiame和Goldmann分别报导了枯草杆菌、肺结核小杆菌(Myeobacterium tuberculosis)有还原氨基化反应。鲛岛等在假单胞菌No.483的无细胞抽出液中，检出了丙氨酸脱氢酶活性，该酶以NAD为辅酶，最适pH为9.8。但是还原氨基化反应的氢并不是由乳酸脱氢酶反应提供，而是由丙糖磷酸脱氢酶反应供给。该菌株生产的丙氨酸是L-丙氨酸。
3．天冬氨酸-β-脱羧酶反应
由于大多数采用直接发酵法生产的丙氨酸是DL-型，而L-天冬氨酸可通过酶法由反丁烯二酸廉价生产，因此，可采用天冬氨酸为原料，利用天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-天冬氨酸-β-羧基的裂解来生产L-丙氨酸。Chibata等发现德阿昆哈假单孢菌（Pseudomonas dacunhae）具有很高的天冬氨酸-β-脱羧酶活性。L-丙氨酸可由L-天冬氨酸化学定量地酶法生产，100g L-天冬氨酸可生成66g L-丙氨酸，其摩尔转化率为99%。
Takamatsu等和Tosa等采用共同固定化大肠杆菌（天冬氨酸酶）和德德阿昆哈假单孢菌（天冬氨酸-β-脱羧酶），由反丁烯二酸直接酶法生产L-丙氨酸。
目前主要采用酶法来生产L-丙氨酸。
第二节 脯氨酸发酵
L-脯氨酸(L-Proline，L-Pro)是非必需氨基酸，具有特殊甜味，用于制作医药品、配制氨基酸输液、抗高血压药物甲巯丙脯氨酸等。工业制造L-脯氨酸，最早是用动物胶水解提取的。1965年前后，吉永、大和谷、千畑、野口等相继报导了L-脯氨酸的发酵生产法。发酵法主要采用谷氨酸产生菌的突变株，近来已引入基因工程技术，用非谷氨酸产生菌由糖质原料发酵生产L-脯氨酸。
一、脯氨酸生物合成途径及调节机制
在微生物中，L-脯氨酸的生物合成是由谷氨酸经过四步反应而生成的，其合成途径如下：
谷氨酸→γ-谷氨酰磷酸→L-谷氨酸-γ-半醛→Δ′-吡哆啉-5-羧酸→L-脯氨酸
上述四步反应中有三步反应是由酶催化进行的。但其中Δ′-吡哆啉-5-羧酸的合成是自发进行的。
据对黄色短杆菌No.14-5（异亮氨酸缺陷）代谢的研究，该菌株主要按上述途径合成L-脯氨酸，几乎没有鸟氨酸合成的乙酰化途径，也就是说几乎没有鸟氨酸-酮酸转氨酶的反应。
＋l967年，吉永等指出ATP及Mg2能够促进黄色短杆菌No.14-5由L-谷氨酸生成L-脯氨酸，而且
谷氨酸的磷酸化（活化）反应参与了脯氨酸的生物合成。还指出，No.14-5菌株的异亮氨酸缺陷突变的遗传变异部位是苏氨酸脱水酶的缺失，而且证明，恰恰是由于这种苏氨酸脱水酶的缺失才引起了脯氨酸的大量积累。因为菌体内苏氨酸脱水酶的缺失，而随着苏氨酸的积累，与赖氨酸一起协同反馈抑制了天冬氨酸激酶的活性，从而使ATP剩余。同时，由于苏氨酸的增多，也抑制了高丝氨酸激酶的活性，同样也使ATP剩余。上述两项ATP剩余，使以ATP为辅酶的谷氨酸激酶反应容易进行。而且作为谷氨酸激酶底物的谷氨酸，也因高浓度生物素存在，在菌体内异常地增加，也有利于该酶反应的进行，从而导致谷氨酸向脯氨酸转变。也就是说，产生菌是通过把难以透过的谷氨酸转换为容易透过的脯氨酸的方式，完成了菌体内大量谷氨酸的解毒，于是L-脯氨酸大量积累。
二、脯氨酸发酵
脯氨酸发酵所用菌株大体分为两类，即从谷氨酸产生菌诱导而来的和由非谷氨酸产生菌
－诱导来的，见表l5-1。从脯氨酸发酵产生菌的遗传特性来看，有异亮氨酸缺陷（Ile）、组氨
－－－－酸缺陷（His）、鸟氨酸缺陷（Orn）、丝氨酸缺陷（Ser）、苯丙氨酸缺陷（Phe）、酪氨酸
－缺陷（Tyr）、核酸碱基缺陷等；还有磺胺胍抗性（SG r）、青霉素抗性（Penr）、利福平抗性
（Rifr）、DL-3,4-脱氢脯氨酸抗性（DHPr）等。非谷氨酸产生菌链式寇氏杆菌(Kurthia
－catenaforma) No.45（L-Ser），是典型的来自非谷氨酸产生菌的脯氨酸产生菌，而且原始菌
株也有相当高的脯氨酸产率。
表15-1 L-脯氨酸产生菌
注：Ile异亮氨酸，His组氨酸，Pro脯氨酸，Ser丝氨酸，Orn鸟氨酸，Glu谷氨酸，SG磺胺孤，Suc琥珀酸，DHP DL-3,4-脱氢脯氨酸，AZC铃兰氨酸，TAC噻唑烷-4-羧酸，Km卡那霉素，－营养缺陷，g生长，r抗性
用L-谷氨酸产生菌突变株发酵生产L-脯氨酸，培养基都是在L-谷氨酸发酵的基本培养基中，添加高浓度的(NH4)2SO4、充分生长所需要的生物素及所需氨基酸或营养物质（按限制生长的浓度）。
Nakamori等将黄色短杆菌2247的异亮氨酸缺陷菌株，用亚硝基胍（NTG）处理后，获得的变异株No.199，在以10％葡萄糖为碳源的培养基中，培养72h，可生成L-脯氨酸45g/L。此变异株的胞内ATP较亲株高1.6～2.0倍。
方佩静等在选育产L-脯氨酸的变异株中，由北京棒杆菌ASl.299诱变获得一株鸟氨酸缺陷变异株AS l.727。在适宜条件下，该突变株可产L-脯氨酸25～27g/L。
郭慧珍等以谷氨酸棒状杆菌No.94为出发菌株，经诱变后获得磺胺胍和DL-3,4-脱氢脯氨酸双重抗性变异株。该菌株产酸率随着生物素的增加而增加，当生物素浓度达300μg/L时，产酸最高。最佳发酵培养基为葡萄糖18%，氯化铵6％，生物素300μg/L。该菌在5000L发酵罐中连续发酵6罐，产L-脯氨酸30～33g/L，对糖转化率为20%，提取收得率为44.4%。
张伟国等以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCCl3870为出发菌株，经硫酸二乙酯（DES）和NTG逐级诱变处理，药物平板定向筛选，获得l株L-脯氨酸产生菌ZQ-3(SGr、Sucg、DHPr)，在含16％葡萄糖的发酵培养基中，可产L-脯氨酸53～55g/L。
Sugiura等由粘质赛氏杆菌选育具有DHP和TAC双重抗性变异株SPl26，可产L-脯氨酸20g/L。继续以SPl26为出发菌株，用NTG(250μg/mL，30℃)处理15min，获得铃兰氨酸抗性变异株SPl87，在含15％蔗糖的培养基中产酸40g/L，当糖浓度增至20％时，产酸高达56g/L。
中西等以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870为出发菌株，用NTG进行诱变处理，在含有2%谷氨酸钠的培养基上进行筛选，获得一株在添加L-谷氨酸后高产L-脯氨酸菌株TA-20。该菌株以葡萄糖为碳源时，在添加6%L-谷氨酸和2.5%硫酸铵的发酵培养基中，发酵42h，可积累L-脯氨酸108.3g/L，而副生的其他氨基酸只有0.7g/L。
在L-脯氨酸发酵产生菌育种工作中，引入基因工程操作，主要是使从脯氨酸前体物谷氨酸到脯氨酸合成的酶系，或者说是使参与谷氨酸供给的酶增强，从而提高脯氨酸产量。伊藤等对乳糖发酵短杆菌缺失磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的谷氨酸缺陷突变株，进行基因操作。即以谷氨酸缺陷型的回复作为指标，把参与TCA循环草酰乙酸供给的PEPC基因克隆，得到重组质粒pAJ200，又使pAJ200自然发生缺失，获得了稳定的重组质粒pAJ201，然后将其导入乳糖发酵短杆菌的脯氨酸产生菌。结果PEPC活性提高1.5倍，使脯氨酸产量提高71%。
第三节 谷氨酰胺发酵
谷氨酰胺(L-Glutamine，L-Gln)是一种特殊的氨基酸，为快速繁殖细胞优先选择的呼吸燃料，如粘膜细胞和淋巴细胞；调节酸碱平衡；组织间的氮载体；核酸、核苷酸、氨基糖和蛋白质的重要前体。大量的证据表明，谷氨酰胺是一种条件性必需氨基酸。在应急情况下，机体对谷氨酰胺的需要超过其合成能力。因此，可以通过肠外营养或饲料中添加谷氨酰胺以营养凋控的方式加速动物体的康复。
谷氨酰胺也是一种极有发展前途的新药。作为药物，有增进脑神经机能的作用，可以用来治疗神经衰弱，改善脑出血后的记忆障碍，促进智力低下儿童的智力发育，防治癫痫病发作，治疗帕金森氏综合症。谷氨酰胺也是治疗胃溃疡、慢性胃炎的有效药物。
一、谷氨酰胺生物合成途径及调节机制
L-谷氨酰胺生物合成途径与调节机制如图15-1所示。
（1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，（2）丙酮酸激酶，（3）丙酮酸脱氢酶，
（4）异柠檬酸脱氢酶，（5）谷氨酸脱氢酶，（6）谷氨酰胺合成酶
图15-1 L-谷氨酰胺生物合成途径与调节机制
以葡萄糖为原料生物合成L-谷氨酰胺涉及到糖酵解途径（EMP）、磷酸戊糖途径（HMP）、三羧酸循环（TCA循环）、乙醛酸循环、伍德-沃克曼反应（Wood-Werkman reaction），以及谷氨酰胺合成水平和分支氨基酸合成水平的调控。葡萄糖→丙酮酸→α-酮戊二酸→谷氨酰胺是谷氨酰胺的主流代谢。因此选育谷氨酰胺高产菌株的基本思路为：强化葡萄糖→丙酮酸→α-酮戊二酸→谷氨酸→L-谷氨酰胺的代谢主流，减弱向天冬氨酸、缬氨酸、丙氨酸分支代谢流的强度。
谷氨酰胺产生菌合成谷氨酰胺的主流代谢中，有几个关键酶控制其强度，这几个酶分别受不同代谢物的反馈调节，活化这些酶有利于谷氨酰胺的生物合成。
（1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它是该反应中介于合成与分解代谢的无定向途径上的第一个酶，它受天冬氨酸的反馈抑制；
（2）丙酮酸激酶，它是一个别构酶，受乙酰CoA、丙氨酸、ATP的反馈抑制；
（3）丙酮酸脱氢酶，该酶是催化不可逆反应的酶，受乙酰CoA、NAD(P)H、GTP的反馈抑制；
（4）异柠檬酸脱氢酶，该酶受ADP和NAD(P)H的反馈抑制；
（5）谷氨酸脱氢酶，该酶受谷氨酸的反馈抑制和反馈阻遏；
（6）谷氨酰胺合成酶。
谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶是保证α-酮戊二酸向谷氨酰胺而不是向草酰乙酸的三羧酸循环方向代谢的关键酶。同时在该循环中还存在着向天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸的分支代谢，设法减弱分支代谢而强化主流代谢，主要的方法是减弱催化这些分支代谢酶的酶活。
二、谷氨酰胺发酵
在微生物中，L-谷氨酰胺通过谷氨酰胺合成酶由L-谷氨酸催化合成。
谷氨酰胺合成酶的最佳pH为6.5～7.0，而谷氨酰胺酶、N-乙酰谷氨酰胺脱乙酰酶的最
＋＋佳pH分别为7.5～8.0和7.5。谷氨酰胺合成酶在Mn2存在下添加Zn2可显著提高其酶活，
＋但N-乙酰谷氨酰胺合成酶不受影响。而Zn2抑制谷氨酰胺酶和N-乙酰谷氨酰胺脱乙酰酶的
活性。黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌，在高浓度(NH4)2SO4及弱酸条件下，可由葡萄糖发酵
生产L-谷氨酰胺。弱酸性条件提高谷氨酰胺合成酶的活性而抑制谷氨酰胺酶的活性；高浓度的(NH4)2SO4也抑制谷氨酰胺酶的活性。
谷氨酸产生菌野生菌株改变培养条件，使谷氨酸发酵转向谷氨酰胺发酵。其培养条件如
＋＋＋＋下：①NH4浓度必须超过用来生产谷氨酸时的量；②必须供给Mg2、Mn2和Zn2；③发酵
的pH，24h前维持在7.2左右，24h后直到发酵结束控制在5.6～6.5。中西透应用此法生产谷氨酰胺产量可达44.7g/L。
Tsuchida等将谷氨酸产生菌（如黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、谷氨酸棒杆菌，嗜氨小杆菌等）经过诱变后，有1株抗磺胺胍的菌株No.1-60（黄色短杆菌2247的变异株），在以
＋葡萄糖作为碳源的培养基中，于48h内可以累积L-谷氨酰胺41.0g/L。添加Mn2（2mg/kg）
于黄色短杆菌2247的培养基中，显著地减少了谷氨酰胺的产量，而增加了L-谷氨酸的产量。
2＋而添加Mn（2mg/kg）对抗性株No.1-60则完全无影响。抗磺胺胍变异株No.1-60的谷氨
酸激酶活性和胞内ATP含量高于亲株黄色短杆菌2247。试验证实，当对L-谷氨酰胺合成有利的谷氨酸激酶和胞内ATP增多时，可以促进L-谷氨酰胺生产变异株的谷氨酰胺的生成。
Yoskinaga等由黄色短杆菌选育磺胺胍和维生素B12双重抗性突变株，在葡萄糖培养基中可积累L-谷氨酰胺48g/L，对糖转化率达44%。
Nakanishi等由谷氨酸棒杆菌选育具有三甲氧苄二氨嘧啶(TMP)、氟化钠(NaF)和重氮丝氨酸（AzaSer）三重抗性突变株，在葡萄糖培养基可产L-谷氨酰胺51g/L。
Nabe等报导了以葡萄糖和反丁烯二酸为碳源，由里加黄杆菌可产L-谷氨酰胺25g/L。
表15-2 L-谷氨酰胺产生菌
注：VBl2—维生素B12
第四节 组氨酸发酵
L-组氨酸(L-Histidine, L-His)的化学名为L-α-氨基-β-咪唑丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸。L-组氨酸具有多种生理功能，广泛用于医药、饲料及食品行业，尤其在医学研究中的作用日益受到重视。L-组氨酸对婴幼儿为必需氨基酸，幼儿缺乏可导致贫血，发育迟缓，易生湿疹等疾病。它能降低胃液酸度，缓和胃肠手术时的疼痛，减轻妊娠期的呕吐及胃部灼烧感，抑制由植物神经引起的消化道溃疡，对过敏性疾病，如哮喘也有疗效。此外，组氨酸可扩张血管、降低血压，因而用于心绞痛、心功能不全等疾病，是一种重要的免疫化学物质。L-组氨酸可以减缓类风湿性关节炎患者的疼痛及炎症。对于慢性尿毒症患者，可以减轻其肾原性贫血，是尿毒症患者的必需氨基酸。L-组氨酸也是氨基酸输液及综合氨基酸制剂的主要成分。
一、组氨酸生物合成途径及调节机制
以葡萄糖为原料合成L-组氨酸涉及到EMP途径、TCA循环和HMP途径等。
由HMP途径的中间产物D-核酮糖经磷酸戊糖异构酶生成D-核糖，再由磷酸核糖焦磷酸激酶作用下生成磷酸核糖焦磷酸（PRPP），然后进入L-组氨酸的合成途径，如图15-2所
示。野生谷氨酸棒杆菌，葡萄糖的代谢途径主要有EMP和HMP两条途径，葡萄糖流入两条途径的比例大约是4:1，所以在野生菌中葡萄糖的代谢主要是经EMP途径和TCA循环分解，生成各种小分子物质，而只有在细胞生长初期，因需要大量核酸时才会增加HMP途径的流量。
5- ⑴ N′-核糖′-磷酸⑵ -ATP N′-核糖′-磷酸⑶ -AMP N′-核糖-5′-磷酸-亚胺甲基氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸 ⑷ N′-核酮糖-5′-磷酸--5--4-甲酰胺核苷酸 ⑸ 氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸 ⑹ ⑺ ⑻ ⑼
⑴磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶，⑵焦磷酸水解酶，⑶核糖磷酸-AMP环水解酶，⑷异构酶，⑸谷氨酰胺酰胺基转移酶，⑹咪唑甘油磷酸脱水酶，⑺组氨醇磷酸氨基转移酶，⑻组氨醇磷酸磷酸酯酶，⑼组氨醇脱氢酶
图15-2组氨酸的合成途径
当葡萄糖流入HMP途径后会生成一系列C3、C4、C5、C6、C7物质，经过一个循环后又回到6-磷酸果糖，一部分糖生成CO2被释放，另一部分糖生成甘油醛-3-磷酸进入EMP途径。经过这一循环会大量生成还原性辅酶Ⅱ（NADPH），NADPH再通过电子传递链产生大量ATP，其产生的ATP比TCA循环产生的还要多。
在微生物体内一般还存在较强的组氨酸分解代谢，主要由组氨酸酶（组氨酸解氨酶）、组氨酸脱羧酶和组氨酸转氨酶催化进行，这些酶将组氨酸转化为咪唑丙酮酸、咪唑乙酸、组胺、咪唑丙烯酸等物质。
在谷氨酸产生菌棒杆菌和短杆菌中，L-组氨酸的合成途径及相关代谢途径涉及到多个途径之间的相互关联（图15-3），这些都会影响到组氨酸能否大量积累的问题。
① EMP途径和HMP途径之间的关联。在野生型谷氨酸棒杆菌中EMP途径占有优势，其关键酶——磷酸果糖激酶受到ATP、O2和柠檬酸的抑制，被AMP所激活；同时葡萄糖磷酸异构酶会受到HMP途径上若干中间代谢产物（如6-磷酸葡萄糖酸、赤藓糖-4-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸等）的竞争性抑制。
② 不完整的HMP途径。HMP途径是把葡萄糖经过一个代谢循环回到果糖，或由中间产物甘油醛-3-磷酸进入EMP途径。组氨酸的合成并非要经过完整的HMP途径，而是通过其中间代谢产物D-核酮糖转化为D-核糖，然后再进一步合成组氨酸。
③ 核苷酸与组氨酸的关系。PRPP不仅是组氨酸的前体物，同时也是嘌呤、嘧啶的前体物，因此PRPP的合成不但要受到组氨酸的反馈调节，也要受到嘌呤、嘧啶的反馈调节。同时这些物质的合成途径作为组氨酸合成的支路，必然会影响到组氨酸的积累。尤其是与ATP的合成途径，有两次相交，相互联系，相互影响如图15-3所示。
④ 组氨酸的分解。组氨酸在组氨酸酶的作用下逐渐分解，最后转变为谷氨酸，从而被再次利用。
⑷ ⑴ ⑶
葡萄糖-5-磷酸
果糖
甘油醛嘌呤、嘧啶
⑴己糖激酶,⑵葡萄糖磷酸异构酶,⑶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,⑷6-磷酸葡萄糖脱氢酶,⑸转酮酶,⑹组氨酸酶
图15-3组氨酸相关代谢途径
二、L-组氨酸产生菌的代谢控制育种策略
根据上面对生物合成途径的分析得出，要使得组氨酸大量积累，必须增强HMP途径的流量，同时阻断转酮酶；解除组氨酸的反馈调节，通过解除嘌呤、嘧啶的反馈调节来增加组氨酸的前体物PRPP；阻断组氨酸的分解。
1． 解除组氨酸的反馈调节
在组氨酸的合成途径中，第一个酶——磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶是限速酶，组氨酸对其既有反馈抑制又有反馈阻遏，一般通过选育专属解除组氨酸对其反馈调节的结构类似物抗性突变株来完成；同时组氨酸对其合成途径上的酶都有抑制或阻遏作用，可通过选育其他一些组氨酸结构类似物抗性突变株来逐步解除反馈调节。
2． 解除组氨酸的分解代谢
在野生谷氨酸棒杆菌细胞内存在很强的组氨酸分解机制，包括脱羧、脱氨和转氨这几个方面，如图15-4所示。
脱羧
组氨酸
脱氨 转氨
咪唑乳酸
咪唑乙酸 β-咪唑乙酸
3
图15-4 组氨酸的分解代谢
组氨酸酶又称为组氨酸解氨酶，可以把L-组氨酸脱氨形成尿刊酸，再通过一系列的反应生成谷氨酸，从而被再次利用，这是组氨酸分解的主要途径。选育在以组氨酸为主要氮源或唯一氮源的基本培养基上生长微弱或不能生长的细胞，则能获得组氨酸酶缺失突变株。
此外还存在着一个分解途径——脱羧，在组氨酸发酵中一般认为这个分解途径相对较弱，研究很少，其主要产物为组胺。组氨酸脱羧酶和其它氨基酸脱羧的不同之处在于它起作用时不需要维生素B6和磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺作为辅酶，所以无法通过控制维生素B6的量来调节组氨酸脱羧酶的酶活。通过对乳糖发酵短杆菌中组氨酸脱羧酶的研究发现，组氨酸生成组胺后，组胺会被排出细胞。在这一过程中，电荷平衡的组氨酸变成带有正电荷的组胺并且排出胞外时，会在细胞壁的两侧形成电位差，可提高电子传递的能力，有利于ATP的合成。筛选组氨酸脱羧酶的缺失突变株可能会削弱ATP的形成，引起细胞生长缓慢等不利情况。通过对组氨酸脱羧酶的结构研究发现，半胱氨酸能够结合到其活性中心，改变其空间结构不可逆地抑制该酶的催化能力，另外在中性和弱碱性的条件下也能够改变酶的结构，达到对该酶的抑制作用。
3． 增加前体物的合成
PRPP不仅仅是组氨酸的前体物也是嘌呤和嘧啶的前体物，尤其是ATP，它还直接参与组氨酸的合成，所以利用嘌呤的结构类似物抗性突变株解除反馈调节可以达到增加组氨酸前体物的积累。
4． 增强HMP途径的流量
在谷氨酸棒杆菌的糖代谢中，HMP途径处于劣势。根据EMP和HMP途径的调节可以知道，选育能以HMP途径上的代谢产物为碳源，生长良好的菌株可以达到增加HMP途径流量的目的。同时通过削弱EMP途径也能增加HMP途径的流量。
5． HMP途径的阻断
由于合成组氨酸需要HMP途径的中间代谢产物，所以完整的HMP途径会减少D-核糖的生成，通过阻断转酮酶来破坏完整的HMP途径，从而使代谢流向D-核糖转移。根据D-核糖发酵的原理来看，通过选育不能利用D-葡萄糖酸的菌株可以得到转酮酶缺失突变株。
因此，若用微生物发酵法生产组氨酸，就必须解除组氨酸自身的反馈调节。由于组氨酸是终产物，用一般营养缺陷型的方法来积累像组氨酸这样非支链途径的终产物是不行的。必须选育适当地调节突变株，如选育抗结构类似物突变株或选育营养缺陷型的回复突变株等。据报道，抗1,2,4-三唑-3-丙氨酸（TRA）或抗2-噻唑丙氨酸（2-TA)的突变株，有抗反馈
抑制作用。从谷氨酸棒杆菌选育高抗2-TA和抗TRA的两株组氨酸产生菌，其磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶的抗L-组氨酸抑制作用，比野生型大100倍。
合成组氨酸的前体PRPP也是合成嘌呤核苷酸的前体。所以，PRPP的合成受各种嘌岭核苷酸、嘧啶核苷酸或色氨酸的调节，而从PRPP到嘌呤核苷酸的合成还受各种嘌呤核苷酸的调节，见图15-5。故对谷氨酸棒杆菌的组氨酸产生菌进一步赋与嘌呤结构类似物、嘧啶结构类似物、色氨酸结构类似物抗性，则可解除对合成PRPP及嘌呤核苷酸的调节，促进两者的生成，进而提高组氨酸生产。另外，进一步提高对组氨酸结构类似物的抗性，亦可增加产量。例如对KYl0260（TRAr）依次附加6-巯基嘌呤（6-MP）抗性、8-氮鸟嘌呤（8-AG）抗性、4-硫尿嘧啶（4-TU）抗性、1,2,4-三唑-3-丙氨酸高抗性（TRAhr）、5-甲基色氨酸（5-MT）抗性等，最终所得到的KY10522菌株生产组氨酸达15g/L（初始糖浓度10%）。
经改良后，KY10522菌株的磷酸核糖-ATP-焦磷酸化酶，不仅与其亲株有同样的抗反馈抑制性能，而且有两倍的抗阻遏作用。这样一来，由于解除了图15-5中对5-磷酸核糖焦磷酸和嘌呤核苷酸生物合成的反馈抑制，增加了L-组氨酸的生物合成，同时，也由于部分地解除了L-组氨酸对磷酸核糖-ATP-焦磷酸化酶的反馈阻遏，所以提高了组氨酸的产量。
据报道，将获得2-MH和TRA抗性的两株粘质赛氏杆菌突变株，通过噬菌体转导法，获得HJ-2604（2-MHr、TRAr)菌株，产组氨酸17g/L。经转导法获得的另一株粘质赛氏杆菌突变株H-2892，再附加6-MPr标记，获得MPr90(2-MHr、TRAr、6-MPr)菌株，该菌株可产L-组氨酸23g/L。
图15-5 嘌呤、嘧啶、色氨酸与组氨酸生物合成的关系
也有报道指出，在组氨酸产生菌（黄色短杆菌FEl564）的发酵中，添加1g/L的尿嘧啶、并补加含有2g/L KH2PO4和2g/L MgSO4·7H2O的流加液，可使组氨酸的产量提高到21.8g/L。
－－陈宁等以谷氨酸棒杆菌TQ2223[Phe+Tyr+5-MTr+SGr+5-FTr+CINr（肉桂酸抗性）]为出
发菌株，经硫酸二乙酯诱变处理，定向选育出5-甲基色氨酸抗性（5-MTr）、磺胺胍抗性（SGr）、5-氟色氨酸抗性（5-FTr）、8-氮鸟嘌呤抗性（8-AGr）、6-巯基嘌呤抗性(6-MPr)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)等遗传标记的突变株TL1105，在未经优化的摇瓶发酵条件下，L-组氨酸产量为12.02g/L，在5L发酵罐上发酵60h，L-组氨酸的产量达14.8g/L。经过种子、发酵培养基和培养条件优化，摇瓶发酵72h可积累L-组氨酸达23～24g/L。
用大肠杆菌的寄主载体系统，从粘质赛氏杆菌的组氨酸产生菌MPr90的染色体DNA，把hisG(APRT)基因克隆化，进一步又向来自miniF的载体pKTll24亚克隆化，获得重组质粒pSS503，再向MPr90株内导入重组质粒pSS503，使组氨酸产量由23g/L提高到32g/L，又向另外的L-组氨酸产生菌L120导入该重组质粒，则使组氨酸产量从28g/L提高到40g/L。
主要参考文献
[1] 张克旭．氨基酸发酵工艺学．北京：中国轻工业出版社，1992
[2] 张伟国，钱和．氨基酸生产技术及其应用．北京：中国轻工业出版社，1997
[3] 张克旭，陈宁，张蓓等．代谢控制发酵．北京：中国轻工业出版社，1998
张伟国） （执笔
第十五章 丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺和组氨酸发酵
第一节 丙氨酸发酵
丙氨酸(Alanine，A1a)，亦称α-氨基丙酸(α-aminopropionic acid)，具有甜味，常用作调味料。霉菌、酵母、细菌、放线菌等微生物都能够由糖类和无机氮源、有机氮源发酵生产L-丙氨酸。这就是所谓的直接发酵法。后来又开发了酶法及固定化法等，原料则使用延胡索酸或L-天冬氨酸。
发酵法生产L-丙氨酸，主要是以降解葡萄糖等碳源生成的丙酮酸为底物，经过氨基转移反应或还原氨基化反应完成的。酶法是以L-天冬氨酸为底物，经过L-天冬氨酸-β-脱羧酶的反应，生成L-丙氨酸。
1．氨基转移反应
氨基转移反应，很早就已为人所知，该反应广泛分布在植物、动物、微生物的代谢过程之中。北井等的研究表明，丙氨酸产生菌胶状棒杆菌(Corynebacterium gelatinosum)No.7183，是通过丙酮酸与L-谷氨酸之间的转氨作用生成丙氨酸的。最初由氨基移转反应生成的丙氨酸是L-丙氨酸，但是经丙氨酸消旋酶的作用，转变成D-丙氨酸，因此该菌株生成的最终产物是DL-丙氨酸。
2．还原氨基化反应
Wiame和Goldmann分别报导了枯草杆菌、肺结核小杆菌(Myeobacterium tuberculosis)有还原氨基化反应。鲛岛等在假单胞菌No.483的无细胞抽出液中，检出了丙氨酸脱氢酶活性，该酶以NAD为辅酶，最适pH为9.8。但是还原氨基化反应的氢并不是由乳酸脱氢酶反应提供，而是由丙糖磷酸脱氢酶反应供给。该菌株生产的丙氨酸是L-丙氨酸。
3．天冬氨酸-β-脱羧酶反应
由于大多数采用直接发酵法生产的丙氨酸是DL-型，而L-天冬氨酸可通过酶法由反丁烯二酸廉价生产，因此，可采用天冬氨酸为原料，利用天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-天冬氨酸-β-羧基的裂解来生产L-丙氨酸。Chibata等发现德阿昆哈假单孢菌（Pseudomonas dacunhae）具有很高的天冬氨酸-β-脱羧酶活性。L-丙氨酸可由L-天冬氨酸化学定量地酶法生产，100g L-天冬氨酸可生成66g L-丙氨酸，其摩尔转化率为99%。
Takamatsu等和Tosa等采用共同固定化大肠杆菌（天冬氨酸酶）和德德阿昆哈假单孢菌（天冬氨酸-β-脱羧酶），由反丁烯二酸直接酶法生产L-丙氨酸。
目前主要采用酶法来生产L-丙氨酸。
第二节 脯氨酸发酵
L-脯氨酸(L-Proline，L-Pro)是非必需氨基酸，具有特殊甜味，用于制作医药品、配制氨基酸输液、抗高血压药物甲巯丙脯氨酸等。工业制造L-脯氨酸，最早是用动物胶水解提取的。1965年前后，吉永、大和谷、千畑、野口等相继报导了L-脯氨酸的发酵生产法。发酵法主要采用谷氨酸产生菌的突变株，近来已引入基因工程技术，用非谷氨酸产生菌由糖质原料发酵生产L-脯氨酸。
一、脯氨酸生物合成途径及调节机制
在微生物中，L-脯氨酸的生物合成是由谷氨酸经过四步反应而生成的，其合成途径如下：
谷氨酸→γ-谷氨酰磷酸→L-谷氨酸-γ-半醛→Δ′-吡哆啉-5-羧酸→L-脯氨酸
上述四步反应中有三步反应是由酶催化进行的。但其中Δ′-吡哆啉-5-羧酸的合成是自发进行的。
据对黄色短杆菌No.14-5（异亮氨酸缺陷）代谢的研究，该菌株主要按上述途径合成L-脯氨酸，几乎没有鸟氨酸合成的乙酰化途径，也就是说几乎没有鸟氨酸-酮酸转氨酶的反应。
＋l967年，吉永等指出ATP及Mg2能够促进黄色短杆菌No.14-5由L-谷氨酸生成L-脯氨酸，而且
谷氨酸的磷酸化（活化）反应参与了脯氨酸的生物合成。还指出，No.14-5菌株的异亮氨酸缺陷突变的遗传变异部位是苏氨酸脱水酶的缺失，而且证明，恰恰是由于这种苏氨酸脱水酶的缺失才引起了脯氨酸的大量积累。因为菌体内苏氨酸脱水酶的缺失，而随着苏氨酸的积累，与赖氨酸一起协同反馈抑制了天冬氨酸激酶的活性，从而使ATP剩余。同时，由于苏氨酸的增多，也抑制了高丝氨酸激酶的活性，同样也使ATP剩余。上述两项ATP剩余，使以ATP为辅酶的谷氨酸激酶反应容易进行。而且作为谷氨酸激酶底物的谷氨酸，也因高浓度生物素存在，在菌体内异常地增加，也有利于该酶反应的进行，从而导致谷氨酸向脯氨酸转变。也就是说，产生菌是通过把难以透过的谷氨酸转换为容易透过的脯氨酸的方式，完成了菌体内大量谷氨酸的解毒，于是L-脯氨酸大量积累。
二、脯氨酸发酵
脯氨酸发酵所用菌株大体分为两类，即从谷氨酸产生菌诱导而来的和由非谷氨酸产生菌
－诱导来的，见表l5-1。从脯氨酸发酵产生菌的遗传特性来看，有异亮氨酸缺陷（Ile）、组氨
－－－－酸缺陷（His）、鸟氨酸缺陷（Orn）、丝氨酸缺陷（Ser）、苯丙氨酸缺陷（Phe）、酪氨酸
－缺陷（Tyr）、核酸碱基缺陷等；还有磺胺胍抗性（SG r）、青霉素抗性（Penr）、利福平抗性
（Rifr）、DL-3,4-脱氢脯氨酸抗性（DHPr）等。非谷氨酸产生菌链式寇氏杆菌(Kurthia
－catenaforma) No.45（L-Ser），是典型的来自非谷氨酸产生菌的脯氨酸产生菌，而且原始菌
株也有相当高的脯氨酸产率。
表15-1 L-脯氨酸产生菌
注：Ile异亮氨酸，His组氨酸，Pro脯氨酸，Ser丝氨酸，Orn鸟氨酸，Glu谷氨酸，SG磺胺孤，Suc琥珀酸，DHP DL-3,4-脱氢脯氨酸，AZC铃兰氨酸，TAC噻唑烷-4-羧酸，Km卡那霉素，－营养缺陷，g生长，r抗性
用L-谷氨酸产生菌突变株发酵生产L-脯氨酸，培养基都是在L-谷氨酸发酵的基本培养基中，添加高浓度的(NH4)2SO4、充分生长所需要的生物素及所需氨基酸或营养物质（按限制生长的浓度）。
Nakamori等将黄色短杆菌2247的异亮氨酸缺陷菌株，用亚硝基胍（NTG）处理后，获得的变异株No.199，在以10％葡萄糖为碳源的培养基中，培养72h，可生成L-脯氨酸45g/L。此变异株的胞内ATP较亲株高1.6～2.0倍。
方佩静等在选育产L-脯氨酸的变异株中，由北京棒杆菌ASl.299诱变获得一株鸟氨酸缺陷变异株AS l.727。在适宜条件下，该突变株可产L-脯氨酸25～27g/L。
郭慧珍等以谷氨酸棒状杆菌No.94为出发菌株，经诱变后获得磺胺胍和DL-3,4-脱氢脯氨酸双重抗性变异株。该菌株产酸率随着生物素的增加而增加，当生物素浓度达300μg/L时，产酸最高。最佳发酵培养基为葡萄糖18%，氯化铵6％，生物素300μg/L。该菌在5000L发酵罐中连续发酵6罐，产L-脯氨酸30～33g/L，对糖转化率为20%，提取收得率为44.4%。
张伟国等以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCCl3870为出发菌株，经硫酸二乙酯（DES）和NTG逐级诱变处理，药物平板定向筛选，获得l株L-脯氨酸产生菌ZQ-3(SGr、Sucg、DHPr)，在含16％葡萄糖的发酵培养基中，可产L-脯氨酸53～55g/L。
Sugiura等由粘质赛氏杆菌选育具有DHP和TAC双重抗性变异株SPl26，可产L-脯氨酸20g/L。继续以SPl26为出发菌株，用NTG(250μg/mL，30℃)处理15min，获得铃兰氨酸抗性变异株SPl87，在含15％蔗糖的培养基中产酸40g/L，当糖浓度增至20％时，产酸高达56g/L。
中西等以嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870为出发菌株，用NTG进行诱变处理，在含有2%谷氨酸钠的培养基上进行筛选，获得一株在添加L-谷氨酸后高产L-脯氨酸菌株TA-20。该菌株以葡萄糖为碳源时，在添加6%L-谷氨酸和2.5%硫酸铵的发酵培养基中，发酵42h，可积累L-脯氨酸108.3g/L，而副生的其他氨基酸只有0.7g/L。
在L-脯氨酸发酵产生菌育种工作中，引入基因工程操作，主要是使从脯氨酸前体物谷氨酸到脯氨酸合成的酶系，或者说是使参与谷氨酸供给的酶增强，从而提高脯氨酸产量。伊藤等对乳糖发酵短杆菌缺失磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的谷氨酸缺陷突变株，进行基因操作。即以谷氨酸缺陷型的回复作为指标，把参与TCA循环草酰乙酸供给的PEPC基因克隆，得到重组质粒pAJ200，又使pAJ200自然发生缺失，获得了稳定的重组质粒pAJ201，然后将其导入乳糖发酵短杆菌的脯氨酸产生菌。结果PEPC活性提高1.5倍，使脯氨酸产量提高71%。
第三节 谷氨酰胺发酵
谷氨酰胺(L-Glutamine，L-Gln)是一种特殊的氨基酸，为快速繁殖细胞优先选择的呼吸燃料，如粘膜细胞和淋巴细胞；调节酸碱平衡；组织间的氮载体；核酸、核苷酸、氨基糖和蛋白质的重要前体。大量的证据表明，谷氨酰胺是一种条件性必需氨基酸。在应急情况下，机体对谷氨酰胺的需要超过其合成能力。因此，可以通过肠外营养或饲料中添加谷氨酰胺以营养凋控的方式加速动物体的康复。
谷氨酰胺也是一种极有发展前途的新药。作为药物，有增进脑神经机能的作用，可以用来治疗神经衰弱，改善脑出血后的记忆障碍，促进智力低下儿童的智力发育，防治癫痫病发作，治疗帕金森氏综合症。谷氨酰胺也是治疗胃溃疡、慢性胃炎的有效药物。
一、谷氨酰胺生物合成途径及调节机制
L-谷氨酰胺生物合成途径与调节机制如图15-1所示。
（1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，（2）丙酮酸激酶，（3）丙酮酸脱氢酶，
（4）异柠檬酸脱氢酶，（5）谷氨酸脱氢酶，（6）谷氨酰胺合成酶
图15-1 L-谷氨酰胺生物合成途径与调节机制
以葡萄糖为原料生物合成L-谷氨酰胺涉及到糖酵解途径（EMP）、磷酸戊糖途径（HMP）、三羧酸循环（TCA循环）、乙醛酸循环、伍德-沃克曼反应（Wood-Werkman reaction），以及谷氨酰胺合成水平和分支氨基酸合成水平的调控。葡萄糖→丙酮酸→α-酮戊二酸→谷氨酰胺是谷氨酰胺的主流代谢。因此选育谷氨酰胺高产菌株的基本思路为：强化葡萄糖→丙酮酸→α-酮戊二酸→谷氨酸→L-谷氨酰胺的代谢主流，减弱向天冬氨酸、缬氨酸、丙氨酸分支代谢流的强度。
谷氨酰胺产生菌合成谷氨酰胺的主流代谢中，有几个关键酶控制其强度，这几个酶分别受不同代谢物的反馈调节，活化这些酶有利于谷氨酰胺的生物合成。
（1）磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，它是该反应中介于合成与分解代谢的无定向途径上的第一个酶，它受天冬氨酸的反馈抑制；
（2）丙酮酸激酶，它是一个别构酶，受乙酰CoA、丙氨酸、ATP的反馈抑制；
（3）丙酮酸脱氢酶，该酶是催化不可逆反应的酶，受乙酰CoA、NAD(P)H、GTP的反馈抑制；
（4）异柠檬酸脱氢酶，该酶受ADP和NAD(P)H的反馈抑制；
（5）谷氨酸脱氢酶，该酶受谷氨酸的反馈抑制和反馈阻遏；
（6）谷氨酰胺合成酶。
谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶是保证α-酮戊二酸向谷氨酰胺而不是向草酰乙酸的三羧酸循环方向代谢的关键酶。同时在该循环中还存在着向天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸的分支代谢，设法减弱分支代谢而强化主流代谢，主要的方法是减弱催化这些分支代谢酶的酶活。
二、谷氨酰胺发酵
在微生物中，L-谷氨酰胺通过谷氨酰胺合成酶由L-谷氨酸催化合成。
谷氨酰胺合成酶的最佳pH为6.5～7.0，而谷氨酰胺酶、N-乙酰谷氨酰胺脱乙酰酶的最
＋＋佳pH分别为7.5～8.0和7.5。谷氨酰胺合成酶在Mn2存在下添加Zn2可显著提高其酶活，
＋但N-乙酰谷氨酰胺合成酶不受影响。而Zn2抑制谷氨酰胺酶和N-乙酰谷氨酰胺脱乙酰酶的
活性。黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌，在高浓度(NH4)2SO4及弱酸条件下，可由葡萄糖发酵
生产L-谷氨酰胺。弱酸性条件提高谷氨酰胺合成酶的活性而抑制谷氨酰胺酶的活性；高浓度的(NH4)2SO4也抑制谷氨酰胺酶的活性。
谷氨酸产生菌野生菌株改变培养条件，使谷氨酸发酵转向谷氨酰胺发酵。其培养条件如
＋＋＋＋下：①NH4浓度必须超过用来生产谷氨酸时的量；②必须供给Mg2、Mn2和Zn2；③发酵
的pH，24h前维持在7.2左右，24h后直到发酵结束控制在5.6～6.5。中西透应用此法生产谷氨酰胺产量可达44.7g/L。
Tsuchida等将谷氨酸产生菌（如黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、谷氨酸棒杆菌，嗜氨小杆菌等）经过诱变后，有1株抗磺胺胍的菌株No.1-60（黄色短杆菌2247的变异株），在以
＋葡萄糖作为碳源的培养基中，于48h内可以累积L-谷氨酰胺41.0g/L。添加Mn2（2mg/kg）
于黄色短杆菌2247的培养基中，显著地减少了谷氨酰胺的产量，而增加了L-谷氨酸的产量。
2＋而添加Mn（2mg/kg）对抗性株No.1-60则完全无影响。抗磺胺胍变异株No.1-60的谷氨
酸激酶活性和胞内ATP含量高于亲株黄色短杆菌2247。试验证实，当对L-谷氨酰胺合成有利的谷氨酸激酶和胞内ATP增多时，可以促进L-谷氨酰胺生产变异株的谷氨酰胺的生成。
Yoskinaga等由黄色短杆菌选育磺胺胍和维生素B12双重抗性突变株，在葡萄糖培养基中可积累L-谷氨酰胺48g/L，对糖转化率达44%。
Nakanishi等由谷氨酸棒杆菌选育具有三甲氧苄二氨嘧啶(TMP)、氟化钠(NaF)和重氮丝氨酸（AzaSer）三重抗性突变株，在葡萄糖培养基可产L-谷氨酰胺51g/L。
Nabe等报导了以葡萄糖和反丁烯二酸为碳源，由里加黄杆菌可产L-谷氨酰胺25g/L。
表15-2 L-谷氨酰胺产生菌
注：VBl2—维生素B12
第四节 组氨酸发酵
L-组氨酸(L-Histidine, L-His)的化学名为L-α-氨基-β-咪唑丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸。L-组氨酸具有多种生理功能，广泛用于医药、饲料及食品行业，尤其在医学研究中的作用日益受到重视。L-组氨酸对婴幼儿为必需氨基酸，幼儿缺乏可导致贫血，发育迟缓，易生湿疹等疾病。它能降低胃液酸度，缓和胃肠手术时的疼痛，减轻妊娠期的呕吐及胃部灼烧感，抑制由植物神经引起的消化道溃疡，对过敏性疾病，如哮喘也有疗效。此外，组氨酸可扩张血管、降低血压，因而用于心绞痛、心功能不全等疾病，是一种重要的免疫化学物质。L-组氨酸可以减缓类风湿性关节炎患者的疼痛及炎症。对于慢性尿毒症患者，可以减轻其肾原性贫血，是尿毒症患者的必需氨基酸。L-组氨酸也是氨基酸输液及综合氨基酸制剂的主要成分。
一、组氨酸生物合成途径及调节机制
以葡萄糖为原料合成L-组氨酸涉及到EMP途径、TCA循环和HMP途径等。
由HMP途径的中间产物D-核酮糖经磷酸戊糖异构酶生成D-核糖，再由磷酸核糖焦磷酸激酶作用下生成磷酸核糖焦磷酸（PRPP），然后进入L-组氨酸的合成途径，如图15-2所
示。野生谷氨酸棒杆菌，葡萄糖的代谢途径主要有EMP和HMP两条途径，葡萄糖流入两条途径的比例大约是4:1，所以在野生菌中葡萄糖的代谢主要是经EMP途径和TCA循环分解，生成各种小分子物质，而只有在细胞生长初期，因需要大量核酸时才会增加HMP途径的流量。
5- ⑴ N′-核糖′-磷酸⑵ -ATP N′-核糖′-磷酸⑶ -AMP N′-核糖-5′-磷酸-亚胺甲基氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸 ⑷ N′-核酮糖-5′-磷酸--5--4-甲酰胺核苷酸 ⑸ 氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸 ⑹ ⑺ ⑻ ⑼
⑴磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶，⑵焦磷酸水解酶，⑶核糖磷酸-AMP环水解酶，⑷异构酶，⑸谷氨酰胺酰胺基转移酶，⑹咪唑甘油磷酸脱水酶，⑺组氨醇磷酸氨基转移酶，⑻组氨醇磷酸磷酸酯酶，⑼组氨醇脱氢酶
图15-2组氨酸的合成途径
当葡萄糖流入HMP途径后会生成一系列C3、C4、C5、C6、C7物质，经过一个循环后又回到6-磷酸果糖，一部分糖生成CO2被释放，另一部分糖生成甘油醛-3-磷酸进入EMP途径。经过这一循环会大量生成还原性辅酶Ⅱ（NADPH），NADPH再通过电子传递链产生大量ATP，其产生的ATP比TCA循环产生的还要多。
在微生物体内一般还存在较强的组氨酸分解代谢，主要由组氨酸酶（组氨酸解氨酶）、组氨酸脱羧酶和组氨酸转氨酶催化进行，这些酶将组氨酸转化为咪唑丙酮酸、咪唑乙酸、组胺、咪唑丙烯酸等物质。
在谷氨酸产生菌棒杆菌和短杆菌中，L-组氨酸的合成途径及相关代谢途径涉及到多个途径之间的相互关联（图15-3），这些都会影响到组氨酸能否大量积累的问题。
① EMP途径和HMP途径之间的关联。在野生型谷氨酸棒杆菌中EMP途径占有优势，其关键酶——磷酸果糖激酶受到ATP、O2和柠檬酸的抑制，被AMP所激活；同时葡萄糖磷酸异构酶会受到HMP途径上若干中间代谢产物（如6-磷酸葡萄糖酸、赤藓糖-4-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸等）的竞争性抑制。
② 不完整的HMP途径。HMP途径是把葡萄糖经过一个代谢循环回到果糖，或由中间产物甘油醛-3-磷酸进入EMP途径。组氨酸的合成并非要经过完整的HMP途径，而是通过其中间代谢产物D-核酮糖转化为D-核糖，然后再进一步合成组氨酸。
③ 核苷酸与组氨酸的关系。PRPP不仅是组氨酸的前体物，同时也是嘌呤、嘧啶的前体物，因此PRPP的合成不但要受到组氨酸的反馈调节，也要受到嘌呤、嘧啶的反馈调节。同时这些物质的合成途径作为组氨酸合成的支路，必然会影响到组氨酸的积累。尤其是与ATP的合成途径，有两次相交，相互联系，相互影响如图15-3所示。
④ 组氨酸的分解。组氨酸在组氨酸酶的作用下逐渐分解，最后转变为谷氨酸，从而被再次利用。
⑷ ⑴ ⑶
葡萄糖-5-磷酸
果糖
甘油醛嘌呤、嘧啶
⑴己糖激酶,⑵葡萄糖磷酸异构酶,⑶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,⑷6-磷酸葡萄糖脱氢酶,⑸转酮酶,⑹组氨酸酶
图15-3组氨酸相关代谢途径
二、L-组氨酸产生菌的代谢控制育种策略
根据上面对生物合成途径的分析得出，要使得组氨酸大量积累，必须增强HMP途径的流量，同时阻断转酮酶；解除组氨酸的反馈调节，通过解除嘌呤、嘧啶的反馈调节来增加组氨酸的前体物PRPP；阻断组氨酸的分解。
1． 解除组氨酸的反馈调节
在组氨酸的合成途径中，第一个酶——磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶是限速酶，组氨酸对其既有反馈抑制又有反馈阻遏，一般通过选育专属解除组氨酸对其反馈调节的结构类似物抗性突变株来完成；同时组氨酸对其合成途径上的酶都有抑制或阻遏作用，可通过选育其他一些组氨酸结构类似物抗性突变株来逐步解除反馈调节。
2． 解除组氨酸的分解代谢
在野生谷氨酸棒杆菌细胞内存在很强的组氨酸分解机制，包括脱羧、脱氨和转氨这几个方面，如图15-4所示。
脱羧
组氨酸
脱氨 转氨
咪唑乳酸
咪唑乙酸 β-咪唑乙酸
3
图15-4 组氨酸的分解代谢
组氨酸酶又称为组氨酸解氨酶，可以把L-组氨酸脱氨形成尿刊酸，再通过一系列的反应生成谷氨酸，从而被再次利用，这是组氨酸分解的主要途径。选育在以组氨酸为主要氮源或唯一氮源的基本培养基上生长微弱或不能生长的细胞，则能获得组氨酸酶缺失突变株。
此外还存在着一个分解途径——脱羧，在组氨酸发酵中一般认为这个分解途径相对较弱，研究很少，其主要产物为组胺。组氨酸脱羧酶和其它氨基酸脱羧的不同之处在于它起作用时不需要维生素B6和磷酸吡哆醛、磷酸吡哆胺作为辅酶，所以无法通过控制维生素B6的量来调节组氨酸脱羧酶的酶活。通过对乳糖发酵短杆菌中组氨酸脱羧酶的研究发现，组氨酸生成组胺后，组胺会被排出细胞。在这一过程中，电荷平衡的组氨酸变成带有正电荷的组胺并且排出胞外时，会在细胞壁的两侧形成电位差，可提高电子传递的能力，有利于ATP的合成。筛选组氨酸脱羧酶的缺失突变株可能会削弱ATP的形成，引起细胞生长缓慢等不利情况。通过对组氨酸脱羧酶的结构研究发现，半胱氨酸能够结合到其活性中心，改变其空间结构不可逆地抑制该酶的催化能力，另外在中性和弱碱性的条件下也能够改变酶的结构，达到对该酶的抑制作用。
3． 增加前体物的合成
PRPP不仅仅是组氨酸的前体物也是嘌呤和嘧啶的前体物，尤其是ATP，它还直接参与组氨酸的合成，所以利用嘌呤的结构类似物抗性突变株解除反馈调节可以达到增加组氨酸前体物的积累。
4． 增强HMP途径的流量
在谷氨酸棒杆菌的糖代谢中，HMP途径处于劣势。根据EMP和HMP途径的调节可以知道，选育能以HMP途径上的代谢产物为碳源，生长良好的菌株可以达到增加HMP途径流量的目的。同时通过削弱EMP途径也能增加HMP途径的流量。
5． HMP途径的阻断
由于合成组氨酸需要HMP途径的中间代谢产物，所以完整的HMP途径会减少D-核糖的生成，通过阻断转酮酶来破坏完整的HMP途径，从而使代谢流向D-核糖转移。根据D-核糖发酵的原理来看，通过选育不能利用D-葡萄糖酸的菌株可以得到转酮酶缺失突变株。
因此，若用微生物发酵法生产组氨酸，就必须解除组氨酸自身的反馈调节。由于组氨酸是终产物，用一般营养缺陷型的方法来积累像组氨酸这样非支链途径的终产物是不行的。必须选育适当地调节突变株，如选育抗结构类似物突变株或选育营养缺陷型的回复突变株等。据报道，抗1,2,4-三唑-3-丙氨酸（TRA）或抗2-噻唑丙氨酸（2-TA)的突变株，有抗反馈
抑制作用。从谷氨酸棒杆菌选育高抗2-TA和抗TRA的两株组氨酸产生菌，其磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶的抗L-组氨酸抑制作用，比野生型大100倍。
合成组氨酸的前体PRPP也是合成嘌呤核苷酸的前体。所以，PRPP的合成受各种嘌岭核苷酸、嘧啶核苷酸或色氨酸的调节，而从PRPP到嘌呤核苷酸的合成还受各种嘌呤核苷酸的调节，见图15-5。故对谷氨酸棒杆菌的组氨酸产生菌进一步赋与嘌呤结构类似物、嘧啶结构类似物、色氨酸结构类似物抗性，则可解除对合成PRPP及嘌呤核苷酸的调节，促进两者的生成，进而提高组氨酸生产。另外，进一步提高对组氨酸结构类似物的抗性，亦可增加产量。例如对KYl0260（TRAr）依次附加6-巯基嘌呤（6-MP）抗性、8-氮鸟嘌呤（8-AG）抗性、4-硫尿嘧啶（4-TU）抗性、1,2,4-三唑-3-丙氨酸高抗性（TRAhr）、5-甲基色氨酸（5-MT）抗性等，最终所得到的KY10522菌株生产组氨酸达15g/L（初始糖浓度10%）。
经改良后，KY10522菌株的磷酸核糖-ATP-焦磷酸化酶，不仅与其亲株有同样的抗反馈抑制性能，而且有两倍的抗阻遏作用。这样一来，由于解除了图15-5中对5-磷酸核糖焦磷酸和嘌呤核苷酸生物合成的反馈抑制，增加了L-组氨酸的生物合成，同时，也由于部分地解除了L-组氨酸对磷酸核糖-ATP-焦磷酸化酶的反馈阻遏，所以提高了组氨酸的产量。
据报道，将获得2-MH和TRA抗性的两株粘质赛氏杆菌突变株，通过噬菌体转导法，获得HJ-2604（2-MHr、TRAr)菌株，产组氨酸17g/L。经转导法获得的另一株粘质赛氏杆菌突变株H-2892，再附加6-MPr标记，获得MPr90(2-MHr、TRAr、6-MPr)菌株，该菌株可产L-组氨酸23g/L。
图15-5 嘌呤、嘧啶、色氨酸与组氨酸生物合成的关系
也有报道指出，在组氨酸产生菌（黄色短杆菌FEl564）的发酵中，添加1g/L的尿嘧啶、并补加含有2g/L KH2PO4和2g/L MgSO4·7H2O的流加液，可使组氨酸的产量提高到21.8g/L。
－－陈宁等以谷氨酸棒杆菌TQ2223[Phe+Tyr+5-MTr+SGr+5-FTr+CINr（肉桂酸抗性）]为出
发菌株，经硫酸二乙酯诱变处理，定向选育出5-甲基色氨酸抗性（5-MTr）、磺胺胍抗性（SGr）、5-氟色氨酸抗性（5-FTr）、8-氮鸟嘌呤抗性（8-AGr）、6-巯基嘌呤抗性(6-MPr)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)等遗传标记的突变株TL1105，在未经优化的摇瓶发酵条件下，L-组氨酸产量为12.02g/L，在5L发酵罐上发酵60h，L-组氨酸的产量达14.8g/L。经过种子、发酵培养基和培养条件优化，摇瓶发酵72h可积累L-组氨酸达23～24g/L。
用大肠杆菌的寄主载体系统，从粘质赛氏杆菌的组氨酸产生菌MPr90的染色体DNA，把hisG(APRT)基因克隆化，进一步又向来自miniF的载体pKTll24亚克隆化，获得重组质粒pSS503，再向MPr90株内导入重组质粒pSS503，使组氨酸产量由23g/L提高到32g/L，又向另外的L-组氨酸产生菌L120导入该重组质粒，则使组氨酸产量从28g/L提高到40g/L。
主要参考文献
[1] 张克旭．氨基酸发酵工艺学．北京：中国轻工业出版社，1992
[2] 张伟国，钱和．氨基酸生产技术及其应用．北京：中国轻工业出版社，1997
[3] 张克旭，陈宁，张蓓等．代谢控制发酵．北京：中国轻工业出版社，1998
张伟国） （执笔