附件5：
提高缺氧耐受力功能评价方法（征求意见稿） 保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定
Items, Principles and Result Assessment
1 试验项目 1.1 体重
1.2 常压耐缺氧实验：存活时间
1.3常压缺氧模型实验：红细胞数和血红蛋白，丙二醛（MDA ），总抗氧化能力（T-AOC ）
1.4 亚硝酸钠中毒缺氧实验：
1.4.1 缺氧损伤实验: 高铁血红蛋白含量（MetHb ） 1.4.2 缺氧存活实验: 存活时间 2 试验原则
所列指标均为必做项目 3 结果判定
3.1常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒缺氧实验、常压缺氧模型实验三项实验中任两项结果阳性可判定受试样品具有提高缺氧耐受力功能。
3.2其中缺氧存活实验、缺氧损伤实验的结果均为阳性可判定亚硝酸钠中毒缺氧实验结果阳性。
提高缺氧耐受力功能检验方法
Method for the Assessment of Enhancing Anoxia Endurance Function
1. 常压耐缺氧实验 1.1 原理
缺氧对机体是一种紧张性刺激，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化供能，最终会导致机体的心、脑等主要器官缺氧供能不足而死亡。 1.2 材料
250mL 磨口瓶、秒表、凡士林、钠石灰（或等量氢氧化钠和碳酸钙）。 1.3 实验动物
推荐用近交系成年小鼠，单一性别，小鼠体重18－22克，每组10-15只。 1.4 实验方法 1.4.1 剂量和分组
至少设三个剂量组，同时设对照组。以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量的30倍。 1.4.2受试样品的给予
经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料，并记录每只动物的饲料摄入量。受试样品给予时间30天，必要时可以延长至45天。 1.4.3 实验步骤
每日经口灌胃给予受试样品，对照组给予纯净水。将动物每周称重两次，按体重调整给予受试样品的量。各组于末次灌胃后1小时，将各组小鼠分别放入盛有5g 钠石灰的250mL 磨口瓶内（每瓶1只），用凡士林封瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠死亡的时间。 1.4.4 检测指标
小鼠因缺氧而死亡的时间。 1.5 数据处理
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，F 值F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 1.6 结果判定
受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性。 1.7 注意事项：
1.7.1每个磨口瓶内只放1只小鼠。
1.7.2磨口瓶一定要密闭封严，以防漏气，否则会影响实验结果。 1.7.3磨口瓶必须等容量(误差 1ml) ，实验前先用水加以校正。 1.7.4每批实验动物的体重应尽量保持一致。 2 常压缺氧损伤模型实验 2.1 原理
在总大气压保持不变的情况下，降低空气中氧的百分含量，机体吸入氧量降低，导致血液中氧含量降低，组织细胞不能从血液中获得充足的氧而使能量代谢障碍，导致重要脏器组织细胞的损伤。 2.2 仪器
低氧分压呼吸效应实验系统、血细胞分析仪、可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器。 2.3 实验动物
推荐用近交系成年小鼠，单一性别，体重18－22g ，每组10-15只。 2.4 实验方法 2.4.1 剂量和分组
至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组二个对照组。以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，最高剂量不得超过人体推
荐量的30倍。 2.4.2受试样品的给予
经口灌胃给予受试样品，受试样品给予时间30天，必要时可以延长至45天。
2.4.3 实验步骤 2.4.3.1造模方法
每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予同等容量溶剂。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。每次给予样品后，将模型对照组与各剂量组的实验动物依次放入常压缺氧装置中，通过充入氮气方法把装置内的氧含量从21%大气氧含量调整下降至10.0±0.5 % 氧含量，维持此低氧含量处理样品组和模型对照组动物6～8 h/天，每周5～6次，连续2～3周。末次缺氧处理后，采血并取脑进行各项指标的检测。 2.4.4指标检测
体重、血红蛋白含量（Hb ）、脑匀浆丙二醛（MDA ）、总抗氧化能力（T-AOC ）。 2.4.4.1血红蛋白含量测定方法
EDTA ·K 2能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝固，全血抗凝后用一般血常规检验的血细胞分析仪检测(仪器法) 。 2.4.4.1.1试剂配制
乙二胺四乙酸二钾（EDTA ·K 2·2H 2O ，MW404.47）, 称量8mg EDTA·K 2加纯净水至100ml 制成抗凝剂，50μl抗凝剂可抗凝1ml 小鼠全血。1.5～2.2mg 的EDTA ·K 2可阻止1ml 血液凝固。 2.4.4.1.2 采血
以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml 离心管（或商品化的抗凝管）中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml 。
2.4.4.1.3 检测分析
上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。在24h 内以全血细胞分析仪检测血液红Hb 。上机操作参照仪器说明书。
2.4.4.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA ）含量测定
2.4.4.2.1 原理
MDA （malondiadehycle ）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA ）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA ）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm 有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。 2.4.4.2.2试剂
0.2M 乙酸盐缓冲液 pH3.5
0.2M 乙酸溶液 185mL 0.2M 乙酸钠溶液 15mL
1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释
成40nmol/mL
8.1%十二烷基硫酸钠SDS 0.8%硫代巴比妥酸TBA 0.2M 磷酸盐缓冲液 pH7.4
0.2M 磷酸氢二钠 1920mL 0.2M 磷酸二氢钾 480mL
2.4.4.2.3 实验步骤 2.4.4.2.3.1 样品制备
组织匀浆样品：取一定量的大脑组织，生理盐水冲洗、拭干、称重，置匀浆器中，加入0.2M 磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s ，间歇30s ，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5－10min ，取上清液待测。 2.4.4.2.3.2样品测定
试剂 10％脑组织匀浆 40nmol/mL四乙氧基丙烷
8.1%SDS 0.2M 乙酸盐缓冲液
0.8%TBA H 2O
空白管
0.2mL 1.5mL 1.5mL 0.8mL
样品管 0.2mL 0.2mL 1.5mL 1.5mL 0.7mL
标准管
0.2mL 0.2mL 1.5mL 1.5mL 0.7mL
混匀，避光沸水浴60min ，流水冷却，于532nm 比色
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行
2.4.4.2.3.3计算
B - A B- A 1
过氧化脂质含量 ＝ ————×C ×K = ———×40×———————— （nmol/mg组织） F - A F - A 0.2×10%×1000
A : 空白管吸光度 B ：样品管吸光度
F ：四乙氧基丙烷吸光度
C ：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL） K ：稀释倍数
2.4.4.3 组织中总抗氧化能力（T-AOC ）测定方法 2.4.4.3.1 原理
机体中有许多抗氧化物质，能使Fe 2+还原成Fe 3+，后者可与菲啉类物质形成稳定的橙黄色络合物，通过在520nm 比色可测出其抗氧化能力的高低。 2.4.4.3.2 试剂
采用商品试剂盒：抗氧化能力（T-AOC ）测定试剂盒。 2.4.4.3.3 样品制备
准确称取脑组织重量，按重量体积比加9倍生理盐水，以20000r/min匀浆10s ，间歇30s ，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），2000～2500r/min离心10min ，取上清液待测。同时用双缩脲试剂测定10%脑组织匀浆蛋白。 2.4.4.3.4 样品测定：按试剂盒的操作要求进行。
如：
试剂 10％脑组织匀浆
试剂一 试剂二 试剂三应用液 试剂四 待测样本 试剂五
对照管（mL ）
1.0 2.0mL 0.5mL 0.2mL ａ 0.2 mL
*
样品管（mL ）
ａ 1.0 2.0mL 0.5mL 0.2mL 0.2 mL
*
漩涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟
混匀，放置10分钟，蒸馏水调零1cm 光径，520nm 测各管吸光度。 * 参考取样量：10%组织匀浆参考取样量：0.1～0.2ml
2.4.4.3.5计算
ODU -OD C 总抗氧化能力 ＝ ——————÷30×N ÷C prot （单位/mg蛋白） 0.01
OD U : 测定管吸光度 OD C ：对照管吸光度
N ：反应体系稀释倍数（反应液总体积/取样量） C prot ：稀释倍数待测样本蛋白浓度（mg/ml）
2.5 数据处理
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。方差齐，计算F 值，F 值F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 2.6 结果判定
模型对照组与阴性对照组比较， Hb、MDA 升高、T-AOC 含量降低有统计学显著性意义（P
注: 红细胞增多症评价标准参考值Hb ＞210g/L。 3 亚硝酸钠中毒缺氧实验 3.1 原理
亚硝酸钠使二价铁血红蛋白转变为三价铁血红蛋白，生成高铁血红蛋白（MetHb ），破坏血红蛋白携氧能力，造成组织细胞缺氧，随着亚硝酸钠剂量的增加，MetHb 含量增加，导致组织缺氧直至死亡。 3.2 实验动物
推荐使用近交系成年雄性小鼠，体重18～22g ，每组10～15只。 3.3 材料
亚硝酸钠, 20μl 毛细管, 1ml注射器 ，秒表。 3.4 剂量分组
实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组。受试样品给予时间30天。 3.5缺氧损伤实验 3.5.1 实验步骤
各剂量组经口给予不同浓度受试样品，阴性对照组按等同容量灌胃给予溶
剂，连续30天, 于末次给样后1小时，各组按80～100mg/kg BW 剂量腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.1ml/10g BW ），1h 、2h 各采血一次，测全血高铁血红蛋白(MetHb)含量。
3.5.2全血高铁血红蛋白(MetHb)含量测定方法
(参照GB 8788—1988高铁血红蛋白定量测定法) 3.5.2.1原理
高铁血红蛋白在波长630nm 处有一特有的吸收光带，当加入氰化物后，高铁血红蛋白即转化为氰化血红蛋白，此吸收光带亦随即消失。因此加入氰化物前后用分光光度计（或光电比色计）测定其吸光度之差，按标准计算高铁血红蛋白的含量。 3.5.2.2试剂
1/15M磷酸氢二钠溶液：准确称取Na 2HPO 4·12H 2O 23.87g ，用蒸馏水溶解稀释至1L 。
1/15M磷酸二氢钾溶液：准确称取KH 2PO 4 9.07g ，用蒸馏水溶解稀释至1L 。
1/60MpH6.6磷酸盐缓冲液：量取1/15M磷酸氢二钠溶液3.75ml ，1/15M磷酸二氢钾溶液6.25ml ，蒸馏水30m1，混合后即可使用（此液用时配制）。 5％（W/V）氰化钾（钠）溶液。 5％（W/V）高铁氰化钾溶液。
1％triton X－100（辛烷基酚聚氧乙烯醚）溶液。 3.5.2.3 操作步骤
取2支小试管，以 “A” 、“B” 编号，各加1/60M pH6.6磷酸盐缓冲液4.5ml ，被检查末梢血40μl，0.5ml 1％triton X－100。“A” 管于630nm 波长，以磷酸盐缓冲液或蒸馏水调零测得吸光度为D 1后，加入5％氰化钾（钠）溶液50μl，混匀，放置2min ，以同样波长测得吸光度为D 2。 “B” 管加入5％高铁氰化钾溶液50μl，在2～5min 后，在630nm 波长处测得吸光度为D 3，然后加入5％氰化钾（钠）液50μl，混匀，放置2min ，以同样波长测得吸光度为D 4。
3.5.2.4 计算方法
D 1－D 2
高铁血红蛋白/总血红蛋白(%) － --------- × 100
D 3－D 4
3.5.2.5 方法说明
高铁血红蛋白形成后，由于红细胞中还原酶的存在，可使高铁血红蛋白逐渐
还原消退，因此必须立即采样，若现场不能分析，可将抗凝血直接采于缓冲液内，贮存在2～4℃冰壶内（保存期不超过10h ），带回实验室测定。抗凝剂以肝素为佳，禁用草酸盐，因其会导致高铁血红蛋白生成。
本法必须使用分辨能力强的分光光度计，而且在使用前必须校验分光器的波长是否准确。
全血在加入试剂后，血细胞破坏。由于少量碎片的存在，使溶液发生混浊，影响吸光度（尤其是正常人会出现负值），使用非离子表面活性剂triton X－100稀释液，或经过离心步骤可克服血红蛋白的混浊。 3.6 缺氧存活实验 3.6.1 实验步骤
各剂量组经口给予不同浓度受试样品，阴性对照组按等同容量灌胃给予溶剂，连续30天, 于末次给样后1小时，各组按200～240mg/kg BW剂量腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.1ml/10g），立即计时，记录动物存活时间。 3.7 统计方法
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。方差齐，计算F 值，F 值F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 3.8结果判定
亚硝酸钠中毒缺氧实验：缺氧损伤实验、缺氧存活实验结果均为阳性可判定实验结果阳性。
其中受试样品组MetHb 含量在1h 和2h 任一时点的降低与阴性对照组比较，差异有统计学意义，判定缺氧损伤实验结果阳性。受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定缺氧存活实验结果阳性。 4 提高缺氧耐受力结果断定:
常压耐缺氧实验、常压缺氧模型实验和亚硝酸钠缺氧实验中的任二项阳性，可判定受试样品具有提高缺氧耐受力功能作用。
提高缺氧耐受力功能评价方法修订说明
一、承担单位
广东省疾病预防控制中心为主要承担单位。任务来源于国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司的委托，对《保健食品检验与评价技术规范（2003年版）》中“提高缺氧耐受力功能评价程序和检验方法”进行修订。
二、主要工作过程
国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于2009年4月召开了“保健食品功能评方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院东直门医院和国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家近15人，会上对“保健食品功能评价方法及有关程序修订”修订的原则和框架作了充分的讨论，又分别征求了相关专家对修订内容的意见。为了做好本次检验方法的修订工作，广东省疾病预防控制中心成立了“提高缺氧耐受力功能评价和检验方法”修订的起草工作小组，经查阅国内外相关资料，参考国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司召开的工作会议的精神，咨询有关专家和实验室同行的意见和建议，形成了本次任务的工作方案，总体上要提高检验方法的科学性、准确性和客观性，提高保健食品功能的技术标准；修订的方法要与当前国内外研究的理论基础相一致。本次修订在去除“急性脑缺血性缺氧模型”的基础上，新增“常压缺氧”模型，并改良“亚硝酸钠中毒存活模型”，以反映保健食品对缺氧耐受力功能的辅助保护作用。经过起草工作小组开展的大量条件探索和实验方法研究，对各种实验结果进行了比较和取舍，形成了修订初稿后，起草工作小组召开了多次专家研讨会，征求专家意见，对初稿进行了反复修改，形成征求意见稿。方法验证工作由广东省疾病预防控制中心、湖南省疾病预防控制中心、湖北省疾病预防控制中心、福建省疾病预防控制中心分别进行验证试验。在此基础上，征集、整理和归纳了相关意见。
国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于2010年8月再次召开了“保健食品功能评价方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院西苑医院的专家近10人，会上针对验证过程中存在的技术问题及可操作性作了充分讨论并提出修改意见，起草工作小组根据会议精神对修订方案做了进一步完善，综合了方法验证单位的意见后形成了征求意见稿。
2011年7月22日国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司在北京宣武门商务酒店召开了“保健食品功能评价方法及有关程序修订”定稿专家研讨会，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北京大学、广东省疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、中国中药研究院、中国中医研究院西苑医院、北京医院、国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家14人，会上对修订后的“提高缺氧耐受力功能评价和检验方法”的科学性、客观性和可操作性给予肯定，并提出修改意见，对征求意见稿做了进一步完善。
三、编制原则
1、总原则，提高保健食品“提高缺氧耐受力功能检验方法”的科学性、准确性和规范性，适应当前法规对加强保健食品监管的要求。
2、要符合当前缺氧损伤的基础理论，既考虑原规范合理的方法，又要提高保健食品功能检验的技术标准，选择保留、改良或新增加的指标要在国内外已经广泛应用并得到普遍的认可，可以反映保健食品的对缺氧损伤的辅助保护作用。
3、在撰写过程中，注意科学性、合理性、和适用性。
四、确定相关技术内容及新旧方法的对比
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- 14 -
附件5：
提高缺氧耐受力功能评价方法（征求意见稿） 保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定
Items, Principles and Result Assessment
1 试验项目 1.1 体重
1.2 常压耐缺氧实验：存活时间
1.3常压缺氧模型实验：红细胞数和血红蛋白，丙二醛（MDA ），总抗氧化能力（T-AOC ）
1.4 亚硝酸钠中毒缺氧实验：
1.4.1 缺氧损伤实验: 高铁血红蛋白含量（MetHb ） 1.4.2 缺氧存活实验: 存活时间 2 试验原则
所列指标均为必做项目 3 结果判定
3.1常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒缺氧实验、常压缺氧模型实验三项实验中任两项结果阳性可判定受试样品具有提高缺氧耐受力功能。
3.2其中缺氧存活实验、缺氧损伤实验的结果均为阳性可判定亚硝酸钠中毒缺氧实验结果阳性。
提高缺氧耐受力功能检验方法
Method for the Assessment of Enhancing Anoxia Endurance Function
1. 常压耐缺氧实验 1.1 原理
缺氧对机体是一种紧张性刺激，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化供能，最终会导致机体的心、脑等主要器官缺氧供能不足而死亡。 1.2 材料
250mL 磨口瓶、秒表、凡士林、钠石灰（或等量氢氧化钠和碳酸钙）。 1.3 实验动物
推荐用近交系成年小鼠，单一性别，小鼠体重18－22克，每组10-15只。 1.4 实验方法 1.4.1 剂量和分组
至少设三个剂量组，同时设对照组。以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量的30倍。 1.4.2受试样品的给予
经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料，并记录每只动物的饲料摄入量。受试样品给予时间30天，必要时可以延长至45天。 1.4.3 实验步骤
每日经口灌胃给予受试样品，对照组给予纯净水。将动物每周称重两次，按体重调整给予受试样品的量。各组于末次灌胃后1小时，将各组小鼠分别放入盛有5g 钠石灰的250mL 磨口瓶内（每瓶1只），用凡士林封瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠死亡的时间。 1.4.4 检测指标
小鼠因缺氧而死亡的时间。 1.5 数据处理
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F 值，F 值F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 1.6 结果判定
受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性。 1.7 注意事项：
1.7.1每个磨口瓶内只放1只小鼠。
1.7.2磨口瓶一定要密闭封严，以防漏气，否则会影响实验结果。 1.7.3磨口瓶必须等容量(误差 1ml) ，实验前先用水加以校正。 1.7.4每批实验动物的体重应尽量保持一致。 2 常压缺氧损伤模型实验 2.1 原理
在总大气压保持不变的情况下，降低空气中氧的百分含量，机体吸入氧量降低，导致血液中氧含量降低，组织细胞不能从血液中获得充足的氧而使能量代谢障碍，导致重要脏器组织细胞的损伤。 2.2 仪器
低氧分压呼吸效应实验系统、血细胞分析仪、可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器。 2.3 实验动物
推荐用近交系成年小鼠，单一性别，体重18－22g ，每组10-15只。 2.4 实验方法 2.4.1 剂量和分组
至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组二个对照组。以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，最高剂量不得超过人体推
荐量的30倍。 2.4.2受试样品的给予
经口灌胃给予受试样品，受试样品给予时间30天，必要时可以延长至45天。
2.4.3 实验步骤 2.4.3.1造模方法
每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予同等容量溶剂。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。每次给予样品后，将模型对照组与各剂量组的实验动物依次放入常压缺氧装置中，通过充入氮气方法把装置内的氧含量从21%大气氧含量调整下降至10.0±0.5 % 氧含量，维持此低氧含量处理样品组和模型对照组动物6～8 h/天，每周5～6次，连续2～3周。末次缺氧处理后，采血并取脑进行各项指标的检测。 2.4.4指标检测
体重、血红蛋白含量（Hb ）、脑匀浆丙二醛（MDA ）、总抗氧化能力（T-AOC ）。 2.4.4.1血红蛋白含量测定方法
EDTA ·K 2能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝固，全血抗凝后用一般血常规检验的血细胞分析仪检测(仪器法) 。 2.4.4.1.1试剂配制
乙二胺四乙酸二钾（EDTA ·K 2·2H 2O ，MW404.47）, 称量8mg EDTA·K 2加纯净水至100ml 制成抗凝剂，50μl抗凝剂可抗凝1ml 小鼠全血。1.5～2.2mg 的EDTA ·K 2可阻止1ml 血液凝固。 2.4.4.1.2 采血
以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml 离心管（或商品化的抗凝管）中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml 。
2.4.4.1.3 检测分析
上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。在24h 内以全血细胞分析仪检测血液红Hb 。上机操作参照仪器说明书。
2.4.4.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA ）含量测定
2.4.4.2.1 原理
MDA （malondiadehycle ）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA ）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA ）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm 有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。 2.4.4.2.2试剂
0.2M 乙酸盐缓冲液 pH3.5
0.2M 乙酸溶液 185mL 0.2M 乙酸钠溶液 15mL
1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释
成40nmol/mL
8.1%十二烷基硫酸钠SDS 0.8%硫代巴比妥酸TBA 0.2M 磷酸盐缓冲液 pH7.4
0.2M 磷酸氢二钠 1920mL 0.2M 磷酸二氢钾 480mL
2.4.4.2.3 实验步骤 2.4.4.2.3.1 样品制备
组织匀浆样品：取一定量的大脑组织，生理盐水冲洗、拭干、称重，置匀浆器中，加入0.2M 磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s ，间歇30s ，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5－10min ，取上清液待测。 2.4.4.2.3.2样品测定
试剂 10％脑组织匀浆 40nmol/mL四乙氧基丙烷
8.1%SDS 0.2M 乙酸盐缓冲液
0.8%TBA H 2O
空白管
0.2mL 1.5mL 1.5mL 0.8mL
样品管 0.2mL 0.2mL 1.5mL 1.5mL 0.7mL
标准管
0.2mL 0.2mL 1.5mL 1.5mL 0.7mL
混匀，避光沸水浴60min ，流水冷却，于532nm 比色
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行
2.4.4.2.3.3计算
B - A B- A 1
过氧化脂质含量 ＝ ————×C ×K = ———×40×———————— （nmol/mg组织） F - A F - A 0.2×10%×1000
A : 空白管吸光度 B ：样品管吸光度
F ：四乙氧基丙烷吸光度
C ：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL） K ：稀释倍数
2.4.4.3 组织中总抗氧化能力（T-AOC ）测定方法 2.4.4.3.1 原理
机体中有许多抗氧化物质，能使Fe 2+还原成Fe 3+，后者可与菲啉类物质形成稳定的橙黄色络合物，通过在520nm 比色可测出其抗氧化能力的高低。 2.4.4.3.2 试剂
采用商品试剂盒：抗氧化能力（T-AOC ）测定试剂盒。 2.4.4.3.3 样品制备
准确称取脑组织重量，按重量体积比加9倍生理盐水，以20000r/min匀浆10s ，间歇30s ，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），2000～2500r/min离心10min ，取上清液待测。同时用双缩脲试剂测定10%脑组织匀浆蛋白。 2.4.4.3.4 样品测定：按试剂盒的操作要求进行。
如：
试剂 10％脑组织匀浆
试剂一 试剂二 试剂三应用液 试剂四 待测样本 试剂五
对照管（mL ）
1.0 2.0mL 0.5mL 0.2mL ａ 0.2 mL
*
样品管（mL ）
ａ 1.0 2.0mL 0.5mL 0.2mL 0.2 mL
*
漩涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟
混匀，放置10分钟，蒸馏水调零1cm 光径，520nm 测各管吸光度。 * 参考取样量：10%组织匀浆参考取样量：0.1～0.2ml
2.4.4.3.5计算
ODU -OD C 总抗氧化能力 ＝ ——————÷30×N ÷C prot （单位/mg蛋白） 0.01
OD U : 测定管吸光度 OD C ：对照管吸光度
N ：反应体系稀释倍数（反应液总体积/取样量） C prot ：稀释倍数待测样本蛋白浓度（mg/ml）
2.5 数据处理
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。方差齐，计算F 值，F 值F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 2.6 结果判定
模型对照组与阴性对照组比较， Hb、MDA 升高、T-AOC 含量降低有统计学显著性意义（P
注: 红细胞增多症评价标准参考值Hb ＞210g/L。 3 亚硝酸钠中毒缺氧实验 3.1 原理
亚硝酸钠使二价铁血红蛋白转变为三价铁血红蛋白，生成高铁血红蛋白（MetHb ），破坏血红蛋白携氧能力，造成组织细胞缺氧，随着亚硝酸钠剂量的增加，MetHb 含量增加，导致组织缺氧直至死亡。 3.2 实验动物
推荐使用近交系成年雄性小鼠，体重18～22g ，每组10～15只。 3.3 材料
亚硝酸钠, 20μl 毛细管, 1ml注射器 ，秒表。 3.4 剂量分组
实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组。受试样品给予时间30天。 3.5缺氧损伤实验 3.5.1 实验步骤
各剂量组经口给予不同浓度受试样品，阴性对照组按等同容量灌胃给予溶
剂，连续30天, 于末次给样后1小时，各组按80～100mg/kg BW 剂量腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.1ml/10g BW ），1h 、2h 各采血一次，测全血高铁血红蛋白(MetHb)含量。
3.5.2全血高铁血红蛋白(MetHb)含量测定方法
(参照GB 8788—1988高铁血红蛋白定量测定法) 3.5.2.1原理
高铁血红蛋白在波长630nm 处有一特有的吸收光带，当加入氰化物后，高铁血红蛋白即转化为氰化血红蛋白，此吸收光带亦随即消失。因此加入氰化物前后用分光光度计（或光电比色计）测定其吸光度之差，按标准计算高铁血红蛋白的含量。 3.5.2.2试剂
1/15M磷酸氢二钠溶液：准确称取Na 2HPO 4·12H 2O 23.87g ，用蒸馏水溶解稀释至1L 。
1/15M磷酸二氢钾溶液：准确称取KH 2PO 4 9.07g ，用蒸馏水溶解稀释至1L 。
1/60MpH6.6磷酸盐缓冲液：量取1/15M磷酸氢二钠溶液3.75ml ，1/15M磷酸二氢钾溶液6.25ml ，蒸馏水30m1，混合后即可使用（此液用时配制）。 5％（W/V）氰化钾（钠）溶液。 5％（W/V）高铁氰化钾溶液。
1％triton X－100（辛烷基酚聚氧乙烯醚）溶液。 3.5.2.3 操作步骤
取2支小试管，以 “A” 、“B” 编号，各加1/60M pH6.6磷酸盐缓冲液4.5ml ，被检查末梢血40μl，0.5ml 1％triton X－100。“A” 管于630nm 波长，以磷酸盐缓冲液或蒸馏水调零测得吸光度为D 1后，加入5％氰化钾（钠）溶液50μl，混匀，放置2min ，以同样波长测得吸光度为D 2。 “B” 管加入5％高铁氰化钾溶液50μl，在2～5min 后，在630nm 波长处测得吸光度为D 3，然后加入5％氰化钾（钠）液50μl，混匀，放置2min ，以同样波长测得吸光度为D 4。
3.5.2.4 计算方法
D 1－D 2
高铁血红蛋白/总血红蛋白(%) － --------- × 100
D 3－D 4
3.5.2.5 方法说明
高铁血红蛋白形成后，由于红细胞中还原酶的存在，可使高铁血红蛋白逐渐
还原消退，因此必须立即采样，若现场不能分析，可将抗凝血直接采于缓冲液内，贮存在2～4℃冰壶内（保存期不超过10h ），带回实验室测定。抗凝剂以肝素为佳，禁用草酸盐，因其会导致高铁血红蛋白生成。
本法必须使用分辨能力强的分光光度计，而且在使用前必须校验分光器的波长是否准确。
全血在加入试剂后，血细胞破坏。由于少量碎片的存在，使溶液发生混浊，影响吸光度（尤其是正常人会出现负值），使用非离子表面活性剂triton X－100稀释液，或经过离心步骤可克服血红蛋白的混浊。 3.6 缺氧存活实验 3.6.1 实验步骤
各剂量组经口给予不同浓度受试样品，阴性对照组按等同容量灌胃给予溶剂，连续30天, 于末次给样后1小时，各组按200～240mg/kg BW剂量腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.1ml/10g），立即计时，记录动物存活时间。 3.7 统计方法
数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。方差齐，计算F 值，F 值F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。 3.8结果判定
亚硝酸钠中毒缺氧实验：缺氧损伤实验、缺氧存活实验结果均为阳性可判定实验结果阳性。
其中受试样品组MetHb 含量在1h 和2h 任一时点的降低与阴性对照组比较，差异有统计学意义，判定缺氧损伤实验结果阳性。受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定缺氧存活实验结果阳性。 4 提高缺氧耐受力结果断定:
常压耐缺氧实验、常压缺氧模型实验和亚硝酸钠缺氧实验中的任二项阳性，可判定受试样品具有提高缺氧耐受力功能作用。
提高缺氧耐受力功能评价方法修订说明
一、承担单位
广东省疾病预防控制中心为主要承担单位。任务来源于国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司的委托，对《保健食品检验与评价技术规范（2003年版）》中“提高缺氧耐受力功能评价程序和检验方法”进行修订。
二、主要工作过程
国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于2009年4月召开了“保健食品功能评方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院东直门医院和国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家近15人，会上对“保健食品功能评价方法及有关程序修订”修订的原则和框架作了充分的讨论，又分别征求了相关专家对修订内容的意见。为了做好本次检验方法的修订工作，广东省疾病预防控制中心成立了“提高缺氧耐受力功能评价和检验方法”修订的起草工作小组，经查阅国内外相关资料，参考国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司召开的工作会议的精神，咨询有关专家和实验室同行的意见和建议，形成了本次任务的工作方案，总体上要提高检验方法的科学性、准确性和客观性，提高保健食品功能的技术标准；修订的方法要与当前国内外研究的理论基础相一致。本次修订在去除“急性脑缺血性缺氧模型”的基础上，新增“常压缺氧”模型，并改良“亚硝酸钠中毒存活模型”，以反映保健食品对缺氧耐受力功能的辅助保护作用。经过起草工作小组开展的大量条件探索和实验方法研究，对各种实验结果进行了比较和取舍，形成了修订初稿后，起草工作小组召开了多次专家研讨会，征求专家意见，对初稿进行了反复修改，形成征求意见稿。方法验证工作由广东省疾病预防控制中心、湖南省疾病预防控制中心、湖北省疾病预防控制中心、福建省疾病预防控制中心分别进行验证试验。在此基础上，征集、整理和归纳了相关意见。
国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司于2010年8月再次召开了“保健食品功能评价方法及有关程序修订”课题协作组工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心、四川大学华西公共卫生学院、中国中医研究院西苑医院的专家近10人，会上针对验证过程中存在的技术问题及可操作性作了充分讨论并提出修改意见，起草工作小组根据会议精神对修订方案做了进一步完善，综合了方法验证单位的意见后形成了征求意见稿。
2011年7月22日国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司在北京宣武门商务酒店召开了“保健食品功能评价方法及有关程序修订”定稿专家研讨会，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、北京大学、广东省疾病预防控制中心、北京市疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心、中国中药研究院、中国中医研究院西苑医院、北京医院、国家食品药品监督管理局保健食品审评中心的专家14人，会上对修订后的“提高缺氧耐受力功能评价和检验方法”的科学性、客观性和可操作性给予肯定，并提出修改意见，对征求意见稿做了进一步完善。
三、编制原则
1、总原则，提高保健食品“提高缺氧耐受力功能检验方法”的科学性、准确性和规范性，适应当前法规对加强保健食品监管的要求。
2、要符合当前缺氧损伤的基础理论，既考虑原规范合理的方法，又要提高保健食品功能检验的技术标准，选择保留、改良或新增加的指标要在国内外已经广泛应用并得到普遍的认可，可以反映保健食品的对缺氧损伤的辅助保护作用。
3、在撰写过程中，注意科学性、合理性、和适用性。
四、确定相关技术内容及新旧方法的对比
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