实验一 细胞器的活体染色与观察
线粒体活体染色与观察
实验目的
1．掌握细胞器活体荧光标记技术。
2．观察和了解活细胞内线粒体的形态、结构与分布特点。
实验原理
对细胞的结构及功能的研究历来是细胞生物学的主要内容。活体染色是指使生活有机体的细胞或组织着色但对其又无毒害作用的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是将胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，使这些特殊结构易于被识别。体外活染又称超活染色，它是将活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，用染料溶液浸染，染料被选择性地固定在活细胞的某种结构上而显色。随着细胞生物学的实验研究技术发展，对细胞的研究正经历着从简单到复杂，从静态到动态，从单维度到多维度的发展。其中，细胞器的活体荧光标记技术是现代细胞生物学研究常用的重要实验技术。这种技术可以从分子水平上动态地研究活细胞中的各种生理活动，极大地增强了人们对细胞的认识能力。这种技术能够用来分析细胞的信号转导、物质运输、能量代谢和膜电位的变化等。现在，已经有许多细胞器特异的商业化荧光染料。
Golgi-Tracker Red是一种高尔基体红色荧光探针，可以用于活细胞高尔基体特异性荧光染色。Golgi-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的BODIPY TR进行了荧光标记的C5-ceramide 。Golgi-Tracker Red可以用于活细胞的高尔基体荧光标记，但不适合用于固定细胞的标记。Golgi-Tracker Red的最大激发光波长为589 nm，最大发射光波长为617 nm。BODIPY-FL-神经酰胺是一种脂类物质，能特异地标记高尔基体。BODIPY-FL-神经酰胺的最大激发光波长是464 nm，最大发射光波长为532 nm。DiO-C6( 3)是一种短链碳酸化氰苷染料，可以标记包括内质网在内的多种膜性细胞器。但是，根据形态、结构特征，内质网很容易被识别。D10-C6(3)的最大激发光波长为484 nm ，最大发射光波长为501 nm。罗丹明123是一种阳离子荧光染料。活体线粒体能够产生膜电位，可以吸引罗丹明123进入线粒体。因此，罗丹明123能够特异地标记线粒体。罗丹明123的最大激发光波长为504 nm，最大发射光波长为534 nm。Hoechst 33258是一种可以穿透细
胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。这种染料会结合到DNA 的A-T 富集区域，所以也常用于普通的细胞核染色或常规的DNA 染色。Hoechst 33258的最大激发光波长为346 nm，最大发射光波长为460 nm; Hoechst 33258和双链DNA 结合后，最大激发光波长为352 nm，最大发射光波长为461 nm。詹纳斯绿B(Janus green B)可专一性地对线粒体进行活性染色，这是由于线粒体内细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色。中性红( neutral red)对液泡和溶酶体的染色具有专一性，可将活细胞中的液泡和溶酶体染成红色。中性红也可作为荧光染料来标记液泡和溶酶体，其最大激发光波长为541 nm，最大发射光波长为640 nm。
实验用品
1．材料
小白鼠肝细胞
2．试剂
( 1) Ringer液 NaCl: 0.85%; KCI: 0.03%; CaCI2: 0.033%。
( 2) 0.02%詹纳斯绿B 水溶液。
3．器材
剪刀、镊子、解剖刀、眼科剪、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸。
实验程序
1．线粒体的活体染色与光学显微镜观察（詹纳斯绿B 染色法）
（1）人口腔黏膜上皮细胞线粒体的活体染色与观察’
1) 取干净的载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴两滴0.02%詹纳斯绿B 染液。
2) 实验者用牙签在自己口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的黏液状物放人载玻片上的染液中，染色10-15 min（注意不可使染液干燥，必要时可再加染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置于光学显微镜下观察。
3) 在低倍镜下，选择平展的口腔黏膜上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞细胞核周围的胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体。
（2）小白鼠肝细胞线粒体的活体染色与观察
1) 用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放人表面皿内。用吸管吸取Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。
2) 在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加0.02%詹纳斯绿B 染液，再将肝组织块移人染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上半部分露在染液外，这样细胞内的线
粒体酶系可充分氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即可（一般需染20-30 min）。
3) 吸去染液，滴加Ringer 液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。
4) 在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有1-2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。
(3)洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的活体染色与观察
1) 用吸管吸取0.020-/0詹纳斯绿B 染液，滴一滴于干净的载玻片上。然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10-15 min。
2) 用吸管吸去染液，加一滴Ringer 液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。
3) 在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处，仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。‘
实验二 细胞的原代培养
【实验目的】
1．熟悉并掌握原代培养中取材、消化及无菌操作等基本实验技术。
2．了解细胞原代培养的原理及其方法。
【实验原理】
原代培养( primary culture)是从供体取得组织或细胞后在体外进行的首次培养，是建立各种细胞系的第一步。原代培养的细胞由于刚刚离体，生物学特性与在体细胞接近，故在各种细胞生物学实验中有广泛应用，较适合进行药物测试、细胞分化等实验。 原代培养的方法很多，最基本的方法有两种，即组织块法和消化法。组织块法是最常用的原代培养方法，该方法利用刚刚离体的、有旺盛生长活力的组织作为实验材料，将其剪成小块接种在培养瓶中，大约24h 后，细胞即可从贴壁的组织块四周游出并生长。 利用组织块法进行的原代培养，操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，在对一些来源有限、数量较少的组织进行原代培养时，选择该法尤为合适。
消化法是一种结合化学与生化手段进行的原代培养方法。该方法的主要特点是利用消化试剂将较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质（基质、纤维等）加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离，形成含单细胞或细胞团的悬液，因
单细胞或细胞团易于从外界吸收养分和排出代谢产物，经体外适宜条件培养后，可以得到大量活细胞，在短时间内细胞即可生长成片。
酶是常用的消化试剂，在原代培养中，对于一些间质少、较软的组织，如上皮、肝、肾、胚胎等，选择胰蛋白酶来加以消化可收到较好的效果。胶原酶因其对胶原有较强的消化作用，因此适合用在对纤维性组织、一些较硬的癌组织等的消化中。本实验中将以胰蛋白酶为例，介绍原代培养的酶消化法。
【实验器材和试剂】
【分组形式】
2～3人一组。
【操作步骤】 （一）组织块法（以新生太鼠肝细胞的原代培养为例）
1．将新生大鼠全身用75%酒精棉球反复擦拭消毒。
2．将消毒后的大鼠移入超净工作台中，再用75%酒精消毒一次。
3．在培养皿中将大鼠处死（断头法），用眼科剪打开腹腔，取出肝组织，置于培养皿中。
4．用D-Hank 液反复冲洗肝组织，以去除血细胞。
5．用眼科镊将肝组织块上所附的结缔组织尽可能去除，以避免杂细胞的污染。
6．将肝组织移入一新的培养皿中，用吸管吸取0. 5ml 培养基置于肝组织上，用另一眼科剪将其剪成lrrirr13左右的小块。
7．用一弯头吸管小心地将剪碎的肝组织块吸人，放置于培养瓶底部。
8．并用弯头吸管头移动肝组织块，使其在培养瓶底部均匀分布，控制每小块间距在0. 5cm左右，25ml 培养瓶放置15～20块。
9．吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴入，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。
10. 轻轻将培养瓶置于培养箱中培养。
11. 24h后取出观察，即有少量细胞从组织块周围游离而出，视需要补以少量培养基。
（二）消化法（以胰蛋白酶消化为例）
1．取新生大鼠的肝组织，用D-Hank 液漂洗3次，用眼科剪、镊去除附着在肝组织上的结缔组织。
2．将肝组织剪成1~ 2mm 3左右的小块。
3．将肝组织块置入三角烧瓶内，放入磁力搅棒，再注入30～50倍组织量的预热到37℃的胰蛋白酶液。
4．将三角瓶放在磁力搅拌器上进行搅拌，速度要慢一些，消化时间控制在l0～ 20min 。也可将三角瓶放入水浴或温箱中，每隔5min 摇动一次。如需长时间消化，可每隔5min 取出2/3上清液移入另一离心管冰浴或离心后去除胰蛋白酶加入含血清培养基，然后再给原三角烧瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。
如果在4℃条件下进行冷消化，时间可长达12～24h 。从冰箱取出离心后，可再添加胰蛋白酶，放入37℃温箱中继续温热消化20～30min ，效果可能更好。
5．在消化过程中，可随时吸取少量消化液在倒置显微镜下观察，当发现组织已分散成小的细胞团或单个细胞，可终止消化。
6．消化完毕后将消化液和分次收集的细胞悬液通过不锈钢网滤过，以除掉未消化充分的大块组织。
7—800～1 000rpm离心3～5min 去除含胰蛋白酶的上清。
8．用D-Hank 液漂洗1～2次，每次800～1 000rpm离心3～5min ，去除上清。
9．加入含10%血清的DMEM 培养基，吹打沉淀制悬。
10. 进行细胞计数，一般按5×105～1×106的密度接种到培养瓶，于37℃条件下培养。
【观察与记录】
1．组织块法培养细胞的观察
培养24h 后，倒置显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游离出来；48h 后，可见大量的细胞放射状排列于组织块周围，这些细胞胞核较大，胞质内含物少、透明度高，彼此间排列紧密。靠近组织块的细胞胞体较小、较圆，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大，有些细胞的形态间于圆形与多角形之间。
2．胰蛋白酶消化法培养细胞的观察
在倒置显微镜下，可见刚接种于培养瓶中的细胞胞体均成圆形，悬浮于培养液中。24h 后，大多数细胞已贴附于培养瓶底部，胞体伸展，重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多角形上皮性细胞特征。48h 以后，细胞开始增殖，细胞的数量明显增多，在接种的细胞或细胞团的周围可见有新生的细胞，这些细胞胞体轮廓通常较浅，因内含物少而较为透明。96h 以后，新生的细胞将逐渐连接成片，胞体轮廓增强，核仁明显可见，透明度减弱。
【注意事项】
1．D-Hank 液对肝组织的冲洗要充分，尽量去除血细胞，避免其溶血后对肝细胞的生长产生影响。
2．严格无菌操作，避免细菌、霉菌等的污染。
3．组织块法中，组织块的体积应控制在lmm 3左右，以保证其中心部位的细胞可获得充足的养分。组织块体积过大，中心部位细胞会因营养不足而发生死亡：溶解，进而对周围细胞的生长产生影响。
培养瓶中组织块摆放的密度不能过大，否则细胞将会因为营养不足而活性不佳。此外，为了避免组织块漂浮、不贴壁，第一次加入培养基的量要少，而在移动和观察细胞时，动作也要轻，因为培养基的振荡也会影响组织块的贴壁。
4．消化法中，因Ca 2+和Mg 2+及血清均具有抑制胰蛋白酶活性的作用，消化过程中
使用的所有液体，应均不含有这些离子及血清，消化后可直接加含血清培养基使其灭活； 在选择消化时间时，应特别注意胰蛋白酶的浓度及pH 值对消化效果的影响；此外，对消化时环境的温度、组织块的大小和硬度也要加以考虑。胰蛋白酶浓度常用0. 25%，pH 值控制在8～9较好，消化时温度最好在37℃。
胰蛋白酶主要适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织，但对于纤维性组织和较硬的癌组织的效果差。
【试剂配制】
1．D-Hank 平衡液的配制及消毒
(1)取市售D-Hank 干粉一袋，剪开包装后将干粉溶于适量双蒸水中；
(2)在1 000ml容量瓶中调节pH 值为7.2～7.4，并将D-Hank 液定容至1 000ml;
(3)将1 000ml D-Hank 溶液分装到数个生理盐水瓶中，每个瓶塞上插入两只注射器针头，8磅高压蒸汽灭菌20～30分钟；
(4)从高压锅内取出装有D-Hank 溶液的生理盐水瓶后，立即拔出针头并在针孔处贴上胶布，以防溶液被细菌污染；
(5) 4℃保存，使用时可加入青霉素和链霉素双抗溶液，使二者的终浓度都达到 100U/ml。
2．DMEM ’培养基的配制及消毒
(1)取市售DMEM 培养基，小心剪开包装，将干粉溶于适量双蒸水中，并用适量双蒸水冲洗包装袋内侧面，将溶液定容至1 000ml;
(2)根据包装袋上的说明添加NaHCO 3；
(3)调节溶液pH 值7.4左右；
(4)加入青霉素和链霉素，使两者的最终浓度都达到100U/ml;
(5)采用0.22μm 孔径的滤膜正压过滤除菌并分装培养基：
1) 取出已消毒的微孔滤膜不锈钢滤器；
2) 在不锈钢滤器的上层与下层之间，放置孔径为0. 22μm 的滤膜，滤膜的光面朝上；
3) 向不锈钢滤器中轻轻加入培养基；
4) 向不锈钢滤器加压；
5) 将已经过滤的培养基分装于l00ml 小瓶中。
(6) -20℃保存，使用时再加入10%～20%的血清，并再次用上述方法过滤除菌。
3．胰蛋白酶消化液的配制及消毒
(1)将D-Hank 平衡液高压消毒，用NaHCO 3液调节pH 值至7.2左右；
(2)称取所需量的胰蛋白酶，加入少量D-Hank 平衡液，搅拌均匀后再补足D- Hank 平衡液，搅拌混匀；
(3)将配制的胰蛋白酶液加以粗滤后，再用注射滤器进行除菌及消毒：
1) 打开直径为25mm 的注射滤器；
2) 将孔径为0. 22μm 的微孔滤膜光面朝上放置于滤器中；
3) 将滤器安装在注射器上；
4) 向注射器中加入需过滤的胰蛋白酶液；
5) 推动注射器，使胰蛋白酶液经过滤膜过滤；
(4)将已过滤的胰蛋白酶液分装成小瓶；
(5)4℃或-20℃保存备用。
实验三 细胞中微丝的染色及形态观察
【实验目的】
1．掌握考马斯亮蓝R250染细胞骨架微丝的方法。
【实验原理】，
真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架( cytoskeleton) 。根据纤维直径、组成成分和组装结构的不同，分为微管(microtubule), MT) 、微丝(microfilament， MF) 和中间纤维(intermediate filament，IF) 。
目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标和组织化学等。 微丝是肌动蛋白构成的纤维( F-actin)。单根微丝直径约7nm ，在光学显微镜下看不到。在不同种类的细胞中，它们与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构, 如肌肉细丝、肠上皮微绒毛轴心、应力纤维(stress fiber)等。
本实验用考马斯亮蓝R250 (Coomassie brilliant blue ，R250) 显示微丝组成的应力纤维。应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤为发达，形态长而直，常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。
考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染微丝。但在该实验条件下，微管结构不稳定，有些类型的纤维太细，光镜下无法分辨。因此，我们看到的主要是由微丝组成的应力纤维。
【实验器材和试剂】
【分组形式】
4人一组。
【操作步骤】
（一）考马斯亮蓝R250染动物细胞的微丝
1．取材：细胞培养在盖玻片条（为区别细胞的正反面，剪掉一角）上，生长密度
达++～+++时取出，用6mmoI/L PBS洗3次。
2．抽提：用I%Triton X-I00处理25～30min ，室温或37 ℃均可。
3．冲洗：用M 缓冲液轻轻洗细胞3次。M 缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
4．固定：略晾干后，用3%戊二醛固定细胞5～15min 。
5．冲洗：用6mmol/L PBS轻轻洗细胞3次，滤纸吸干。
6．染色：用0. 2%考马斯亮蓝R250染片30min 。
7．冲洗：小心用蒸馏水漂洗，滤纸吸干标本边缘水分，空气干燥，直接观察或用树脂封片。
（二）考马斯亮蓝R250染植物细胞的微丝
1．取材：取洋葱鳞茎内表皮，大小约lcm2，放入盛有6mmol/L PBS的小烧杯中，使其下沉，处理5～l0min 。
2．抽提：吸去PBS ，用1%Triton X-100处理洋葱表皮30min （置37℃恒温箱中）。
3．冲洗：吸去1%Triton X-I00，用M 缓冲液充分洗3次，每次5min 。
4．固定：3%戊二醛固定20min 。
5．冲洗：吸去固定液，用6mmol/L PBS洗3次，每次5min 。滤纸吸去残液。
6．染色：0. 2%考马斯亮蓝R250染色20min 。
7．制片：蒸馏水洗数次。将标本平铺在载玻片上，加盖玻片。
【观察与记录】
1．光镜下动物细胞形态已不清楚，只见细胞轮廓。应力纤维呈深蓝色(图2-6，图2-7) 。
2．见洋葱表皮细胞轮廓，微丝束呈深蓝色。转换高倍镜观察，转动微调，可见细胞骨架的立体结构(图2-8) 。
【注意事项】
1．各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落。
2. l%Triton X-IOO抽提杂蛋白要做预实验，抽提时间长将破坏细胞结构，抽提时间短背景干扰大。
3．应力纤维是一种动态结构，细胞充分贴壁铺展时纤维挺直、丰富；反之，细胞收缩变圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显稀少。
【试剂配制】
1. 6mmol/L PBS、( pH值6.5):
A 液：NaH 2PO 4·.2H 2O 936mg/l 000ml
B 液：Na 2 HPO4·12H 2O 2 148mg/l 000ml
工作液：A 液68. 5ml+B液31. 5ml（用NaHCO 3调pH 值至6.5）
2．M 缓冲液（pH 值7.2）：
咪唑 3. 40g
KCI 3.7g
MgCI 2·6H 2O 101. 65mg
EGTA （乙二醇双醚四乙酸） 380. 35mg
EDTA （乙二胺四乙酸） 29. 22mg
巯基乙醇(mercaptoethanol) 0.07ml
甘油 292ml
加蒸馏水至1 000ml（用Imol/L HCI调pH 值至7.2）。
3. 1%Triton X-100:
Triton X-100 Iml
M-缓冲液 99ml
4.0.2%考马斯亮蓝R250染液：
考马斯亮蓝R250 ' 0.2g
甲醇 46．5ml
冰醋酸 7ml
蒸馏水 46. 5ml
5. 3%戊二醛
25%戊二醛 12ml
6mmol/L PBS 88ml
实验四 动物细胞融合
实验目的
1．了解动物细胞融合的常用方法。
2．学习化学融合和电融合的基本操作过程。
3．观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。
实验原理
细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。
1．病毒诱导融合
仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2．化学诱导融合
很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇( PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEC 是被广泛使用的化学融合剂。
3．电激诱导融合
包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
实验用品
1．材料
鸡血红细胞。
2．试剂
50% PEC、Hank's 溶液(pH 7.4)、Alsever's 细胞保存液（参见“实验十七”）、0.6 mol/L 甘露醇溶液、0.85%氯化钠溶液、詹纳斯绿B 染液。
3．器材
倒置显微镜、离心机、恒温水浴锅、电融合仪、血细胞计数器、量筒、注射器、烧杯、载玻片、盖玻片、200 μL 及l mL微量移液器、枪头、离心管、废液缸等。
实验程序
1．鸡血红细胞的制备和保存用无菌注射器先吸入Alsvers 溶液1 mL ，再从鸡翼下静脉取血0.5～1 mL ，取出后放入刻度离心管中，再加入2-3 mL Alsvers 溶液，使总量为4-5 mL，混匀并封口，置于4℃冰箱内（可供一周内使用）。
2．PEG 诱导融合
(1)取保存的鸡血，离心去除Alsvers 溶液，以0.85%氯化钠溶液制成5%- 10%的悬液。
(2)称取1 gPEG（相对分子质量4 000）放入试管内，在沸水浴中融化后，加入1 mL预热的Hank's 溶液，混匀，制成50%的PEC 溶液。放入37℃水浴中待用。
(3)取上述鸡红细胞悬液l mL放人离心管中，再加入5 mL Hank's溶液混匀，然后以 1 000 r/min离心5 min，小心弃去上清液，用指弹法将细胞团块弹散。
(4)取上述500-/0 PEC 溶液l mL ，在1 min 内滴加到鸡红细胞悬液中，边加边轻轻摇动混匀。待PEG 全部加入后静置2-5 min左右。此过程要求在37 0C水浴内进行。
(5)缓慢滴加6mL Hank's溶液以终止PEC 的作用，混匀，在37℃水浴内静置5min 。
(6)1 000r/min离心3 rmn ，弃上清液后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，可再滴加詹纳斯绿B 染液染色，加盖玻片镜检。
3．电诱导细胞融合
(1)鸡血红细胞融合液的制备储备的鸡血红细胞1 mL，加入4 mL 0.85%氯化钠溶液， 混匀后1 000 r/min离心5 min。去上清液，用0.6 moVL的甘露醇溶液混匀后以上述离心条件洗涤2次，最后用0.6 moVL的甘露醇溶液将鸡血红细胞稀释至每毫升2×105个。
(2)细胞融合仪操作步骤
1) 连接电源线插头至电源线插座。
2) 插入融合小室电极至电源线插座，将200 μL 鸡血红细胞融合液加入融合小室内，将融合小室板放于倒置显微镜下，调焦至细胞清晰。
3) 按下电源开关。
4) 用粗、中、细调节旋钮调节成串脉冲所需频率为350-450 kHz ，然后调节所需成串脉冲电压为30-40 V。
5) 调节融合脉冲脉宽为100 Hz ，调节融合脉冲个数为’1，选择闸门时间（一般为“中”）。
6) 调节融合脉冲电压至120-300 V。
7) 同时按下“成串脉冲”及“融合脉冲”开关，倒置显微镜下观察细胞移动并排列成串状的过程。
8) 按下“脉冲触发”开关，观察细胞被电脉冲击穿，并与相邻细胞发生融合的过程。
9) 取下融合小室，关闭电源。
(3)融合细胞观察用微量移液器吸取融合小室内的融合细胞液，滴片，加詹纳斯绿B 染液染色10 min后，镜下观察。
要点提示及注意事项
1、制备的鸡血红细胞悬液的浓度不宜过高，否则细胞容易聚集，融合效果受影响。浓度可根据具体情况调节。
2、电激诱导融合的过程中，脉冲的个数和脉冲触发不宜过多，否则细胞会破碎。 预期实验结果
可观察到两个或多个细胞发生质膜融合但核尚未融合，或者细胞间不仅发生了质膜融合，而且细胞核也发生了融合。
思考问题与作业
1、观察并拍摄（或绘制）融合细胞的形态。
2、思考细胞融合的理论和实际意义。
实验五 细胞的传代培养
【实验目的】
1．掌握无菌操作技术。
2．熟悉并完成传代各步骤的操作方法
3．解传代培养的原理及一般的方法。
【实验原理】
培养的细胞通过增殖达到一定数量后，为了避免因为生存空间不足或密度过大，造成细胞营养发生障碍进而影响其生长，需要对细胞加以及时的分离、稀释。将培养的细胞从原培养瓶中加以分离，经稀释后再接种子新的培养瓶中，这二过程即为传代(sub-culture)。
细胞类型不同，传代的方法也有差异。大多数贴壁细胞的传代，主要采用消化法，即：利用消化剂（常为0. 25%胰蛋白酶液）使贴壁细胞脱离培养器皿的表面，并使细胞彼此间发生分离，然后进行稀释、再培养。而悬浮细胞的传代过程相对较为简单，直接吹打或离心后，即可加以传代。
【实验器材和试剂】
【分组形式】
2～3人一组较为合适。
【操作步骤】
（一）贴壁细胞的传代培养 1．弃原代培养肝细胞培养瓶中的旧培养液；
2．加入适量的D-Hank 液，轻轻摇动、清洗残留在细胞表面的培养液，倒掉；
3．加入适量的消化液，使其覆盖整个细胞培养面，轻轻摇动培养瓶，并将培养瓶放于倒置显微镜下观察，当发现细胞胞质回缩、胞间间隙增大时，快速吸出消化液；
4．向培养瓶中加入D-Hank 液，轻轻转动培养瓶，倒掉，再加入含血清的培养液终止消化；
5．用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的过程应按一定的顺序进行，即从培养瓶底部的一边开始，到另一边结束，尽量使瓶底的各个部位的细胞均能被吹到。吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞；
6．在倒置显微镜下观察细胞，若发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，且细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止吹打；
7．将细胞悬液收集于l0ml 离心管中，1 000rpm离心3～5min ，去除上清；
8．细胞计数，按照1×105～1×106的密度接种细胞于新培养瓶中。
（二）悬浮细胞的传代
1．将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中；
2，离心800～1 000rpm 5min，去除上清液；
3．加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。将悬液按1:2或1:3的比例分别接种于新的培养瓶中。
【观察与记录】
在倒置显微镜下，可见接种24h 后，大多数肝细胞已贴附于培养瓶底部，48h 以后，细胞开始增殖，细胞的数量增多，在接种的肝细胞或肝细胞团的周围可见有新生的细胞长出，96h 以后，培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合。
【注意事项】
1．传代培养的过程通常较长，细胞被污染的可能增加，因此必须严格进行无菌操作。
2．用胰蛋白酶液进行消化前，需用D-Hank 液清洗培养细胞表面残留的培养液，以免其所含的血清抑制胰蛋白酶活性的发挥。
3．消化液作用的时间常随细胞的种类、消化液配制的时间及消化液加入的量的多少而发生变化，消化过程中应密切注意培养细胞形态的变化，发现胞质回缩、细胞间的连接变松散时，应立刻终止消化。通常上皮样细胞因细胞间连接较为紧密，其消化的时间较成纤维样细胞长一些。此外，首次传代的细胞与已建系的细胞相比，也需要更多的消化时间。
4．首次传代的细胞因需适应新的环境，可适当增加其接种量，以促进其生存与增殖。
【试剂配制】
D-Hank 液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM 培养基的配制方法同前一实验。
实验六 培养细胞的形态观察和计数
【实验目的】
1．熟悉培养细胞形态分类的特点。
2．掌握培养过程中细胞形态、结构变化的规律以及细胞计数的方法。
【实验原理】
体外培养的细胞根据其生长方式的特点可分为贴附型与悬浮型两大类型。能附着于支持物表面生长的细胞属贴附型细胞，大多数活体细胞在体外培养的条件下，均呈现出贴附型生长的特点。有些细胞在培养时可悬浮于培养基中生长，而不需贴附于支持物上，此类细胞即为悬浮型细胞。
贴附型细胞在体外培养时形态常出现类似于“返祖”的现象，即失去原有在体内的
特征、趋向于单一化，并反映出其胚层起源的情况。
体外培养的贴附型细胞在形态上主要可分为上皮细胞型与成纤维细胞型两大类（见图4-1）。属上皮细胞型的细胞形态与上皮细胞类似，呈扁平、不规则的多角形，胞核圆形、位于细胞中央，细胞间连接紧密、相嵌排列，相互衔接成单层，外胚层及内胚层来源的细胞，如表皮、乳腺、肝等组织细胞在体外培养时均属此型细胞。成纤维细胞型形态与成纤维细胞类似，胞体呈梭形或不规则的三角形，有数个长短不等的突起，细胞彼此间呈旋涡状、放射状的排列，起源于中胚层的组织细胞，如纤维结缔组织、血管内皮、平滑肌、心肌等组织细胞均属此型。
悬浮型细胞的形态较为单一，无论其来源如何，在体外培养条件卞均为圆形，如淋巴细胞、白血病细胞等。因此，本实验主要以贴附型细胞作为材料，对细胞的形态进行观察。
在倒置显微镜下观察到的生长状态良好的活细胞，其胞质是匀质、‘透明的，胞质中颗粒较少，细胞的轮廓不明显。随着培养时间的延长，细胞中的颗粒物质逐渐增多，细胞的透明度减弱，细胞轮廓增强，核仁数量增多，因此通过观察培养细胞内颗粒多少、透明度的高低及轮廓的清晰程度，可以对培养细胞的生长状态加以判定。
细胞计数法是细胞生物学实验的一项基本技术，是了解培养细胞生长状态以及测定培养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。
细胞计数主要利用血球计数板来完成。血球计数板每一大方格长为Imm ，宽为1mm ，高为0.1mm ，体积为0．lrrirr13，可容纳的溶液是0. I u I ，那么每ml 溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的10 000倍(图4-2) 。
【实验器材和试剂】
【分组形式】
2～3人一组。
【操作步骤】
（一）培养细胞形态类型的观察 1．从CO 2培养箱中取出已培养3d 的传代肝细胞；
2．在倒置相差显微镜，对培养细胞的形态、细胞排列方式及彼此间连接的程度加以观察；
3．记录观察的结果；
4．将肝细胞放回培养箱，取出已培养3d 的传代成纤维细胞；
5．在倒置相差显微镜下，观察成纤维细胞的形态、细胞排列方式及彼此间连接的程度；
6．记录观察的结果，并与肝细胞的形态特征加以比较。
（二）细胞形态结构及生长状况的观察
1．将传代培养3d 的肝细胞或成纤维细胞从培养箱中取出；
2．在倒置相差显微镜10X 的物镜下，先转动目镜使视野中央的双十字的八条线清晰，再调节物镜使观察的细胞形态清楚，对细胞的透明度、细胞的轮廓进行观察；
3．将倒置相差显微镜转换至40×物镜，对细胞结构、内容物等作进一步的观察；
4．记录上述观察结果，并将细胞放回培养箱，同时取出传代培养7d 的肝细胞或成纤维细胞；
．5．在倒置相差显微镜下，分别用10×及40×的物镜对细胞的透明度、轮廓及内容物等进行观察；
6．记录观察的结果，并与传代培养3d 的细胞加以比较’。
（三）细胞的计数
1．准备计数板：用酒精清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干；
2．制备细胞悬液：用胰蛋白酶消化单层培养细胞或收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于104/mI，若细胞数很少，应将悬液离心(1 000rpm，2min) ，
重悬浮于少量DMEM 培养基中；
3．加样：将盖玻片盖在计数板两槽中间。用尖嘴吸管轻轻吹打细胞悬液，吸取少量细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧边沿加细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。否则要将计数板和盖玻片擦干净重新加样；
4．计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。
【观察与记录】
1．培养细胞形态类型的观察
传代培养3d 的肝细胞具有典型的上皮型细胞的特点，即细胞呈不规则的多角形，细胞间连接紧密、彼此相嵌排列。
传代3d 的真皮成纤维细胞具有典型的成纤维型细胞的特点，胞体多呈梭形，部分细胞有数个长短不等的突起，细胞彼此间连接较为疏松，细胞呈放射状的排列。
2．培养细胞结构的观察
培养3d 的细胞，无论是上皮型或是成纤维型，细胞均具有较高的透明度，折光性强，胞质中颗粒较少，表明细胞处于良好的生长状态。但培养7d 的细胞在高倍镜下可见胞质中颗粒数明显增多，颗粒较为粗大，致使整个细胞的透明度降低，胞核中存在多个核仁，细胞的整体轮廓增强。
3．细胞计数
将记录的计数板四角大方格中的细胞数代人以下公式，可得出细胞密度。 细胞数／毫升原液=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数
【注意事项】
1．观察细胞形态时，应注意取放细胞时的无菌操作，以免污染。同时注意限制观察的时间，尤其是在对多瓶细胞进行观察时，应分批取放，以免细胞在培养箱外的时间过长影响细胞的状态。
2．细胞计数时，消化单层细胞应尽量使细胞分散良好，以制备单个细胞悬液，否则会影响细胞计数结果。
3．取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，特别应该注意这一点，否则前后计数结果会有很大误差。
4．镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占10%以上，说明消化不充分；或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当，需重制备细胞悬液、计数。
5．加样时，应尽量避免气泡的产生，否则不但会妨碍对计数细胞的观察，同时也会造成计数结果的误差。
【试剂配制】
D-Hank 液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM 培养基的配制方法同前一实验。
实验七
实验目的
1．了解溶血现象及其发生机制。 细胞膜的渗透性
2．了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
实验原理
细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障，是一种半透膜，可选择性地控制物质进出细胞。将红细胞放在低渗溶液中，水分子大量渗透到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，溶液由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血( hemolysis)。由于溶质渗透人细胞的速度不同，溶血时间也不同，因此，发生溶血现象所需的时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜渗透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。
实验用品
1．材料
兔血。
2．试剂
(1) 09%氯化钠溶液。
(2)2种低渗溶液0.017 mol/L氯化钠溶液和0.032 mol/L葡萄糖溶液。
(3) 7种等渗溶液0.17 mol/L氯化钠溶液、0.32 moI/L葡萄糖溶液、0.17 mol/L氯化铵溶液、0.17 moI/L乙酸铵溶液、0.12 mol/L草酸铵溶液、0.32 mol/L甘油、0.32 mol/L丙酮。
3．器材
50 mL烧杯、10 mL移液管、滴管、试管（12支）、试管架。
实验程序
1. 50%兔红细胞悬液的制备
以无菌方法抽取兔耳缘静脉血液1 mL，缓缓加入0.9%氯化钠溶液9 mL混匀，3 000
r/min离心5 min ，弃上清液。如此洗涤红细胞3次，最后使红细胞-0.9%氯化钠溶液的总体积为2 mL，制成50%兔红细胞悬液。 2．溶血现象的观察
取试管2支，分别加入0.017 mol/L氯化钠溶液和0.032 moVL葡萄糖溶液均为（低渗溶液）3 mL，再加入2滴制备好的50%兔红细胞悬液，注意观察溶液颜色的变化。当溶液由不透明的红细胞悬液变成透明的血红蛋白溶液（红细胞发生破裂，造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液），即发生溶血现象。 3．红细胞对不同物质的渗透性
(1)取试管1支，加入0.17 mol/L氯化钠溶液3 mL，再加入2滴制备好的50%兔红细胞悬液，轻轻摇动，混匀后静置于温室中，观察试管中发生溶血的时间及溶液颜色的变化。
(2)分别在下列几种等渗溶液中进行实验，步骤同(1)。
0.32 mol/L葡萄糖溶液 0.17 mol/L氯化铵溶液 0.17mol/L乙酸铵溶液 0.17 mol/L硝酸钠溶液 0.12 mol/L草酸铵溶液 0.12 mol/L硫酸钠洚一
0.32 mol/L甘油 0.32 mol/L乙醇 0.32丙酮 要点提示及注意事项
试管中红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。 预期实验结果
发生溶血后，由不透明的红细胞悬液变成透明的血红蛋白溶液。目测法判断标准：快速溶血：+++；慢速溶血：++或+；不溶血：-。
思考问题与作业
记录观察到的现象，并对实验结果进行分析和比较。
实验八 凋亡细胞的光镜下形态观察
一、凋亡细胞的普通光镜下形态观察
【实验目的】
1．熟悉普通光镜下凋亡细胞的形态变化。 2．熟悉苏木精一伊红(H．E) 染色方法。 3．了解染Giemsa 色方法。 【实验原理】
细胞发生凋亡时，其形态产生一系列变化，经相应的染色后在普通光镜下即可观察到的这些变化，如：核染色质固缩、边集，染色较深，或核破裂甚至出现凋亡小体等。 1 苏木精易溶于酒精、甘油及热水中，本身与组织亲和力小，不能成为染液，只有加入复盐和氧化剂方能成为染液，此时苏木精被氧化为苏木红，且与铝离子结合形成一种蓝色、带正电荷的碱性染料，可与细胞核中的脱氧核糖核酸根（带负电荷）结合完成染色。
伊红Y 是一种红色酸性染料，一般配成0.5%～1%的乙醇溶液。在苏木精染色后，经伊红复染，95%乙醇分色。
Giemsa 是一种复合染料，含天青Ⅱ和伊红，适于血涂片、体外培养细胞和染色体等的染色。
【实验器材和试剂】
【分组形式】 2～4人一组。 【操作步骤】
（一）细胞涂片的HE 染色
1．制备细胞涂片：培养细胞，诱导凋亡，然后消化细胞，制成单细胞悬液。将单细胞悬液移至离心管，离心(1 000g/min) 5min ，弃上清并用PBS 洗细胞1～2次后，制备细胞悬液，并调整细胞数至1×104～5×104／ril ，取100U l 细胞悬液，用细胞涂片离心机(1 000g/min，1～2min) 制成细胞涂片。4%甲醛（或多聚甲醛）固定l0min 后染色。 2．苏木精染液染色3min ，自来水洗Imin 。
3．在分化液中分化30s （提插数次）后用蒸馏水浸泡5～15min 。 4．伊红染液染色2min 。
5．脱水、透明：75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇(I)、100%乙醇 (Ⅱ) 、二甲苯（工）和二甲苯(Ⅱ) 各Imin 以脱水透明。 6．中性树脂封片。 7．普通显微镜观察。 （二）Giemsa 染色
1．制备细胞涂片：步骤同上。
2．甲醇一冰醋酸(3：1) 固定l0min 。充分晾干，或用吹风机吹干。
3．滴加Giemsa 稀释染液(Sorensen磷酸缓冲液：Giemsa 原液=10：1) ，染色3～
10min 。
4．流水冲洗。，磷酸缓冲液分色（镜下控制颜色），晾干。 5．透明：二甲苯（I ）和二甲苯(Ⅱ) 分别Imin 。 6．中性树脂封片。 7．显微镜下观察。 【观察与记录】
1．HE 染色标本：细胞核蓝色，细胞质红色。
2．Gierrisa 染色的标本：细胞核红紫色，细胞质蓝色。
3．观察记录细胞的形态变化。凋亡细胞的核染色质固缩、边集，染色较深，或核破裂；细胞膜皱褶、卷曲，或出泡、芽生形成凋亡小体。 4．写出观察结果报告 【注意事项】
1．甲醛、二甲苯均有毒，而且甲醛有致癌作用，所以相关操作应戴手套等在化学通风橱进行。
2．注意，制备细胞涂片过程中，应将在消化前已脱壁的细胞收集在内。
3．如进行Giemsa 染色，应注意，在Giemsa 染色的第二步一定要充分晾干，否则将影响染色结果。 【试剂配制】
1．苏木精染液：苏木精1g 、蒸馏水l00ml 、碘酸钠0.2g 、钾矾50g ，加温溶解后加入水合氯醛50g ，枸橼酸1g ，搅拌溶解后可长期保存。
2．Giemsa 染液原液：Giemsa 0.5g加入甘油33ml ，研磨后加入33ml 甲醇，放入37～40℃温箱中12h ，棕色瓶保存。
3．Sorensen 磷酸缓冲液(pH值6.8) ：M/15磷酸氢二钠49. 6ml ，M/15磷酸二氢钾50. 4ml。
实验一 细胞器的活体染色与观察
线粒体活体染色与观察
实验目的
1．掌握细胞器活体荧光标记技术。
2．观察和了解活细胞内线粒体的形态、结构与分布特点。
实验原理
对细胞的结构及功能的研究历来是细胞生物学的主要内容。活体染色是指使生活有机体的细胞或组织着色但对其又无毒害作用的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是将胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，使这些特殊结构易于被识别。体外活染又称超活染色，它是将活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，用染料溶液浸染，染料被选择性地固定在活细胞的某种结构上而显色。随着细胞生物学的实验研究技术发展，对细胞的研究正经历着从简单到复杂，从静态到动态，从单维度到多维度的发展。其中，细胞器的活体荧光标记技术是现代细胞生物学研究常用的重要实验技术。这种技术可以从分子水平上动态地研究活细胞中的各种生理活动，极大地增强了人们对细胞的认识能力。这种技术能够用来分析细胞的信号转导、物质运输、能量代谢和膜电位的变化等。现在，已经有许多细胞器特异的商业化荧光染料。
Golgi-Tracker Red是一种高尔基体红色荧光探针，可以用于活细胞高尔基体特异性荧光染色。Golgi-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的BODIPY TR进行了荧光标记的C5-ceramide 。Golgi-Tracker Red可以用于活细胞的高尔基体荧光标记，但不适合用于固定细胞的标记。Golgi-Tracker Red的最大激发光波长为589 nm，最大发射光波长为617 nm。BODIPY-FL-神经酰胺是一种脂类物质，能特异地标记高尔基体。BODIPY-FL-神经酰胺的最大激发光波长是464 nm，最大发射光波长为532 nm。DiO-C6( 3)是一种短链碳酸化氰苷染料，可以标记包括内质网在内的多种膜性细胞器。但是，根据形态、结构特征，内质网很容易被识别。D10-C6(3)的最大激发光波长为484 nm ，最大发射光波长为501 nm。罗丹明123是一种阳离子荧光染料。活体线粒体能够产生膜电位，可以吸引罗丹明123进入线粒体。因此，罗丹明123能够特异地标记线粒体。罗丹明123的最大激发光波长为504 nm，最大发射光波长为534 nm。Hoechst 33258是一种可以穿透细
胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。这种染料会结合到DNA 的A-T 富集区域，所以也常用于普通的细胞核染色或常规的DNA 染色。Hoechst 33258的最大激发光波长为346 nm，最大发射光波长为460 nm; Hoechst 33258和双链DNA 结合后，最大激发光波长为352 nm，最大发射光波长为461 nm。詹纳斯绿B(Janus green B)可专一性地对线粒体进行活性染色，这是由于线粒体内细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色。中性红( neutral red)对液泡和溶酶体的染色具有专一性，可将活细胞中的液泡和溶酶体染成红色。中性红也可作为荧光染料来标记液泡和溶酶体，其最大激发光波长为541 nm，最大发射光波长为640 nm。
实验用品
1．材料
小白鼠肝细胞
2．试剂
( 1) Ringer液 NaCl: 0.85%; KCI: 0.03%; CaCI2: 0.033%。
( 2) 0.02%詹纳斯绿B 水溶液。
3．器材
剪刀、镊子、解剖刀、眼科剪、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸。
实验程序
1．线粒体的活体染色与光学显微镜观察（詹纳斯绿B 染色法）
（1）人口腔黏膜上皮细胞线粒体的活体染色与观察’
1) 取干净的载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴两滴0.02%詹纳斯绿B 染液。
2) 实验者用牙签在自己口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的黏液状物放人载玻片上的染液中，染色10-15 min（注意不可使染液干燥，必要时可再加染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置于光学显微镜下观察。
3) 在低倍镜下，选择平展的口腔黏膜上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞细胞核周围的胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体。
（2）小白鼠肝细胞线粒体的活体染色与观察
1) 用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放人表面皿内。用吸管吸取Ringer 液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。
2) 在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加0.02%詹纳斯绿B 染液，再将肝组织块移人染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上半部分露在染液外，这样细胞内的线
粒体酶系可充分氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即可（一般需染20-30 min）。
3) 吸去染液，滴加Ringer 液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。
4) 在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有1-2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。
(3)洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的活体染色与观察
1) 用吸管吸取0.020-/0詹纳斯绿B 染液，滴一滴于干净的载玻片上。然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10-15 min。
2) 用吸管吸去染液，加一滴Ringer 液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。
3) 在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处，仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。‘
实验二 细胞的原代培养
【实验目的】
1．熟悉并掌握原代培养中取材、消化及无菌操作等基本实验技术。
2．了解细胞原代培养的原理及其方法。
【实验原理】
原代培养( primary culture)是从供体取得组织或细胞后在体外进行的首次培养，是建立各种细胞系的第一步。原代培养的细胞由于刚刚离体，生物学特性与在体细胞接近，故在各种细胞生物学实验中有广泛应用，较适合进行药物测试、细胞分化等实验。 原代培养的方法很多，最基本的方法有两种，即组织块法和消化法。组织块法是最常用的原代培养方法，该方法利用刚刚离体的、有旺盛生长活力的组织作为实验材料，将其剪成小块接种在培养瓶中，大约24h 后，细胞即可从贴壁的组织块四周游出并生长。 利用组织块法进行的原代培养，操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，在对一些来源有限、数量较少的组织进行原代培养时，选择该法尤为合适。
消化法是一种结合化学与生化手段进行的原代培养方法。该方法的主要特点是利用消化试剂将较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质（基质、纤维等）加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离，形成含单细胞或细胞团的悬液，因
单细胞或细胞团易于从外界吸收养分和排出代谢产物，经体外适宜条件培养后，可以得到大量活细胞，在短时间内细胞即可生长成片。
酶是常用的消化试剂，在原代培养中，对于一些间质少、较软的组织，如上皮、肝、肾、胚胎等，选择胰蛋白酶来加以消化可收到较好的效果。胶原酶因其对胶原有较强的消化作用，因此适合用在对纤维性组织、一些较硬的癌组织等的消化中。本实验中将以胰蛋白酶为例，介绍原代培养的酶消化法。
【实验器材和试剂】
【分组形式】
2～3人一组。
【操作步骤】 （一）组织块法（以新生太鼠肝细胞的原代培养为例）
1．将新生大鼠全身用75%酒精棉球反复擦拭消毒。
2．将消毒后的大鼠移入超净工作台中，再用75%酒精消毒一次。
3．在培养皿中将大鼠处死（断头法），用眼科剪打开腹腔，取出肝组织，置于培养皿中。
4．用D-Hank 液反复冲洗肝组织，以去除血细胞。
5．用眼科镊将肝组织块上所附的结缔组织尽可能去除，以避免杂细胞的污染。
6．将肝组织移入一新的培养皿中，用吸管吸取0. 5ml 培养基置于肝组织上，用另一眼科剪将其剪成lrrirr13左右的小块。
7．用一弯头吸管小心地将剪碎的肝组织块吸人，放置于培养瓶底部。
8．并用弯头吸管头移动肝组织块，使其在培养瓶底部均匀分布，控制每小块间距在0. 5cm左右，25ml 培养瓶放置15～20块。
9．吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴入，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。
10. 轻轻将培养瓶置于培养箱中培养。
11. 24h后取出观察，即有少量细胞从组织块周围游离而出，视需要补以少量培养基。
（二）消化法（以胰蛋白酶消化为例）
1．取新生大鼠的肝组织，用D-Hank 液漂洗3次，用眼科剪、镊去除附着在肝组织上的结缔组织。
2．将肝组织剪成1~ 2mm 3左右的小块。
3．将肝组织块置入三角烧瓶内，放入磁力搅棒，再注入30～50倍组织量的预热到37℃的胰蛋白酶液。
4．将三角瓶放在磁力搅拌器上进行搅拌，速度要慢一些，消化时间控制在l0～ 20min 。也可将三角瓶放入水浴或温箱中，每隔5min 摇动一次。如需长时间消化，可每隔5min 取出2/3上清液移入另一离心管冰浴或离心后去除胰蛋白酶加入含血清培养基，然后再给原三角烧瓶添加新的胰蛋白酶继续消化。
如果在4℃条件下进行冷消化，时间可长达12～24h 。从冰箱取出离心后，可再添加胰蛋白酶，放入37℃温箱中继续温热消化20～30min ，效果可能更好。
5．在消化过程中，可随时吸取少量消化液在倒置显微镜下观察，当发现组织已分散成小的细胞团或单个细胞，可终止消化。
6．消化完毕后将消化液和分次收集的细胞悬液通过不锈钢网滤过，以除掉未消化充分的大块组织。
7—800～1 000rpm离心3～5min 去除含胰蛋白酶的上清。
8．用D-Hank 液漂洗1～2次，每次800～1 000rpm离心3～5min ，去除上清。
9．加入含10%血清的DMEM 培养基，吹打沉淀制悬。
10. 进行细胞计数，一般按5×105～1×106的密度接种到培养瓶，于37℃条件下培养。
【观察与记录】
1．组织块法培养细胞的观察
培养24h 后，倒置显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游离出来；48h 后，可见大量的细胞放射状排列于组织块周围，这些细胞胞核较大，胞质内含物少、透明度高，彼此间排列紧密。靠近组织块的细胞胞体较小、较圆，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大，有些细胞的形态间于圆形与多角形之间。
2．胰蛋白酶消化法培养细胞的观察
在倒置显微镜下，可见刚接种于培养瓶中的细胞胞体均成圆形，悬浮于培养液中。24h 后，大多数细胞已贴附于培养瓶底部，胞体伸展，重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多角形上皮性细胞特征。48h 以后，细胞开始增殖，细胞的数量明显增多，在接种的细胞或细胞团的周围可见有新生的细胞，这些细胞胞体轮廓通常较浅，因内含物少而较为透明。96h 以后，新生的细胞将逐渐连接成片，胞体轮廓增强，核仁明显可见，透明度减弱。
【注意事项】
1．D-Hank 液对肝组织的冲洗要充分，尽量去除血细胞，避免其溶血后对肝细胞的生长产生影响。
2．严格无菌操作，避免细菌、霉菌等的污染。
3．组织块法中，组织块的体积应控制在lmm 3左右，以保证其中心部位的细胞可获得充足的养分。组织块体积过大，中心部位细胞会因营养不足而发生死亡：溶解，进而对周围细胞的生长产生影响。
培养瓶中组织块摆放的密度不能过大，否则细胞将会因为营养不足而活性不佳。此外，为了避免组织块漂浮、不贴壁，第一次加入培养基的量要少，而在移动和观察细胞时，动作也要轻，因为培养基的振荡也会影响组织块的贴壁。
4．消化法中，因Ca 2+和Mg 2+及血清均具有抑制胰蛋白酶活性的作用，消化过程中
使用的所有液体，应均不含有这些离子及血清，消化后可直接加含血清培养基使其灭活； 在选择消化时间时，应特别注意胰蛋白酶的浓度及pH 值对消化效果的影响；此外，对消化时环境的温度、组织块的大小和硬度也要加以考虑。胰蛋白酶浓度常用0. 25%，pH 值控制在8～9较好，消化时温度最好在37℃。
胰蛋白酶主要适用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等组织，但对于纤维性组织和较硬的癌组织的效果差。
【试剂配制】
1．D-Hank 平衡液的配制及消毒
(1)取市售D-Hank 干粉一袋，剪开包装后将干粉溶于适量双蒸水中；
(2)在1 000ml容量瓶中调节pH 值为7.2～7.4，并将D-Hank 液定容至1 000ml;
(3)将1 000ml D-Hank 溶液分装到数个生理盐水瓶中，每个瓶塞上插入两只注射器针头，8磅高压蒸汽灭菌20～30分钟；
(4)从高压锅内取出装有D-Hank 溶液的生理盐水瓶后，立即拔出针头并在针孔处贴上胶布，以防溶液被细菌污染；
(5) 4℃保存，使用时可加入青霉素和链霉素双抗溶液，使二者的终浓度都达到 100U/ml。
2．DMEM ’培养基的配制及消毒
(1)取市售DMEM 培养基，小心剪开包装，将干粉溶于适量双蒸水中，并用适量双蒸水冲洗包装袋内侧面，将溶液定容至1 000ml;
(2)根据包装袋上的说明添加NaHCO 3；
(3)调节溶液pH 值7.4左右；
(4)加入青霉素和链霉素，使两者的最终浓度都达到100U/ml;
(5)采用0.22μm 孔径的滤膜正压过滤除菌并分装培养基：
1) 取出已消毒的微孔滤膜不锈钢滤器；
2) 在不锈钢滤器的上层与下层之间，放置孔径为0. 22μm 的滤膜，滤膜的光面朝上；
3) 向不锈钢滤器中轻轻加入培养基；
4) 向不锈钢滤器加压；
5) 将已经过滤的培养基分装于l00ml 小瓶中。
(6) -20℃保存，使用时再加入10%～20%的血清，并再次用上述方法过滤除菌。
3．胰蛋白酶消化液的配制及消毒
(1)将D-Hank 平衡液高压消毒，用NaHCO 3液调节pH 值至7.2左右；
(2)称取所需量的胰蛋白酶，加入少量D-Hank 平衡液，搅拌均匀后再补足D- Hank 平衡液，搅拌混匀；
(3)将配制的胰蛋白酶液加以粗滤后，再用注射滤器进行除菌及消毒：
1) 打开直径为25mm 的注射滤器；
2) 将孔径为0. 22μm 的微孔滤膜光面朝上放置于滤器中；
3) 将滤器安装在注射器上；
4) 向注射器中加入需过滤的胰蛋白酶液；
5) 推动注射器，使胰蛋白酶液经过滤膜过滤；
(4)将已过滤的胰蛋白酶液分装成小瓶；
(5)4℃或-20℃保存备用。
实验三 细胞中微丝的染色及形态观察
【实验目的】
1．掌握考马斯亮蓝R250染细胞骨架微丝的方法。
【实验原理】，
真核细胞胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架( cytoskeleton) 。根据纤维直径、组成成分和组装结构的不同，分为微管(microtubule), MT) 、微丝(microfilament， MF) 和中间纤维(intermediate filament，IF) 。
目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标和组织化学等。 微丝是肌动蛋白构成的纤维( F-actin)。单根微丝直径约7nm ，在光学显微镜下看不到。在不同种类的细胞中，它们与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构, 如肌肉细丝、肠上皮微绒毛轴心、应力纤维(stress fiber)等。
本实验用考马斯亮蓝R250 (Coomassie brilliant blue ，R250) 显示微丝组成的应力纤维。应力纤维在体外培养的贴壁细胞中尤为发达，形态长而直，常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。
考马斯亮蓝R250可以染各种蛋白，并非特异染微丝。但在该实验条件下，微管结构不稳定，有些类型的纤维太细，光镜下无法分辨。因此，我们看到的主要是由微丝组成的应力纤维。
【实验器材和试剂】
【分组形式】
4人一组。
【操作步骤】
（一）考马斯亮蓝R250染动物细胞的微丝
1．取材：细胞培养在盖玻片条（为区别细胞的正反面，剪掉一角）上，生长密度
达++～+++时取出，用6mmoI/L PBS洗3次。
2．抽提：用I%Triton X-I00处理25～30min ，室温或37 ℃均可。
3．冲洗：用M 缓冲液轻轻洗细胞3次。M 缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
4．固定：略晾干后，用3%戊二醛固定细胞5～15min 。
5．冲洗：用6mmol/L PBS轻轻洗细胞3次，滤纸吸干。
6．染色：用0. 2%考马斯亮蓝R250染片30min 。
7．冲洗：小心用蒸馏水漂洗，滤纸吸干标本边缘水分，空气干燥，直接观察或用树脂封片。
（二）考马斯亮蓝R250染植物细胞的微丝
1．取材：取洋葱鳞茎内表皮，大小约lcm2，放入盛有6mmol/L PBS的小烧杯中，使其下沉，处理5～l0min 。
2．抽提：吸去PBS ，用1%Triton X-100处理洋葱表皮30min （置37℃恒温箱中）。
3．冲洗：吸去1%Triton X-I00，用M 缓冲液充分洗3次，每次5min 。
4．固定：3%戊二醛固定20min 。
5．冲洗：吸去固定液，用6mmol/L PBS洗3次，每次5min 。滤纸吸去残液。
6．染色：0. 2%考马斯亮蓝R250染色20min 。
7．制片：蒸馏水洗数次。将标本平铺在载玻片上，加盖玻片。
【观察与记录】
1．光镜下动物细胞形态已不清楚，只见细胞轮廓。应力纤维呈深蓝色(图2-6，图2-7) 。
2．见洋葱表皮细胞轮廓，微丝束呈深蓝色。转换高倍镜观察，转动微调，可见细胞骨架的立体结构(图2-8) 。
【注意事项】
1．各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落。
2. l%Triton X-IOO抽提杂蛋白要做预实验，抽提时间长将破坏细胞结构，抽提时间短背景干扰大。
3．应力纤维是一种动态结构，细胞充分贴壁铺展时纤维挺直、丰富；反之，细胞收缩变圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显稀少。
【试剂配制】
1. 6mmol/L PBS、( pH值6.5):
A 液：NaH 2PO 4·.2H 2O 936mg/l 000ml
B 液：Na 2 HPO4·12H 2O 2 148mg/l 000ml
工作液：A 液68. 5ml+B液31. 5ml（用NaHCO 3调pH 值至6.5）
2．M 缓冲液（pH 值7.2）：
咪唑 3. 40g
KCI 3.7g
MgCI 2·6H 2O 101. 65mg
EGTA （乙二醇双醚四乙酸） 380. 35mg
EDTA （乙二胺四乙酸） 29. 22mg
巯基乙醇(mercaptoethanol) 0.07ml
甘油 292ml
加蒸馏水至1 000ml（用Imol/L HCI调pH 值至7.2）。
3. 1%Triton X-100:
Triton X-100 Iml
M-缓冲液 99ml
4.0.2%考马斯亮蓝R250染液：
考马斯亮蓝R250 ' 0.2g
甲醇 46．5ml
冰醋酸 7ml
蒸馏水 46. 5ml
5. 3%戊二醛
25%戊二醛 12ml
6mmol/L PBS 88ml
实验四 动物细胞融合
实验目的
1．了解动物细胞融合的常用方法。
2．学习化学融合和电融合的基本操作过程。
3．观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。
实验原理
细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。
1．病毒诱导融合
仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒同宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。
2．化学诱导融合
很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇( PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEC 是被广泛使用的化学融合剂。
3．电激诱导融合
包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。
实验用品
1．材料
鸡血红细胞。
2．试剂
50% PEC、Hank's 溶液(pH 7.4)、Alsever's 细胞保存液（参见“实验十七”）、0.6 mol/L 甘露醇溶液、0.85%氯化钠溶液、詹纳斯绿B 染液。
3．器材
倒置显微镜、离心机、恒温水浴锅、电融合仪、血细胞计数器、量筒、注射器、烧杯、载玻片、盖玻片、200 μL 及l mL微量移液器、枪头、离心管、废液缸等。
实验程序
1．鸡血红细胞的制备和保存用无菌注射器先吸入Alsvers 溶液1 mL ，再从鸡翼下静脉取血0.5～1 mL ，取出后放入刻度离心管中，再加入2-3 mL Alsvers 溶液，使总量为4-5 mL，混匀并封口，置于4℃冰箱内（可供一周内使用）。
2．PEG 诱导融合
(1)取保存的鸡血，离心去除Alsvers 溶液，以0.85%氯化钠溶液制成5%- 10%的悬液。
(2)称取1 gPEG（相对分子质量4 000）放入试管内，在沸水浴中融化后，加入1 mL预热的Hank's 溶液，混匀，制成50%的PEC 溶液。放入37℃水浴中待用。
(3)取上述鸡红细胞悬液l mL放人离心管中，再加入5 mL Hank's溶液混匀，然后以 1 000 r/min离心5 min，小心弃去上清液，用指弹法将细胞团块弹散。
(4)取上述500-/0 PEC 溶液l mL ，在1 min 内滴加到鸡红细胞悬液中，边加边轻轻摇动混匀。待PEG 全部加入后静置2-5 min左右。此过程要求在37 0C水浴内进行。
(5)缓慢滴加6mL Hank's溶液以终止PEC 的作用，混匀，在37℃水浴内静置5min 。
(6)1 000r/min离心3 rmn ，弃上清液后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，可再滴加詹纳斯绿B 染液染色，加盖玻片镜检。
3．电诱导细胞融合
(1)鸡血红细胞融合液的制备储备的鸡血红细胞1 mL，加入4 mL 0.85%氯化钠溶液， 混匀后1 000 r/min离心5 min。去上清液，用0.6 moVL的甘露醇溶液混匀后以上述离心条件洗涤2次，最后用0.6 moVL的甘露醇溶液将鸡血红细胞稀释至每毫升2×105个。
(2)细胞融合仪操作步骤
1) 连接电源线插头至电源线插座。
2) 插入融合小室电极至电源线插座，将200 μL 鸡血红细胞融合液加入融合小室内，将融合小室板放于倒置显微镜下，调焦至细胞清晰。
3) 按下电源开关。
4) 用粗、中、细调节旋钮调节成串脉冲所需频率为350-450 kHz ，然后调节所需成串脉冲电压为30-40 V。
5) 调节融合脉冲脉宽为100 Hz ，调节融合脉冲个数为’1，选择闸门时间（一般为“中”）。
6) 调节融合脉冲电压至120-300 V。
7) 同时按下“成串脉冲”及“融合脉冲”开关，倒置显微镜下观察细胞移动并排列成串状的过程。
8) 按下“脉冲触发”开关，观察细胞被电脉冲击穿，并与相邻细胞发生融合的过程。
9) 取下融合小室，关闭电源。
(3)融合细胞观察用微量移液器吸取融合小室内的融合细胞液，滴片，加詹纳斯绿B 染液染色10 min后，镜下观察。
要点提示及注意事项
1、制备的鸡血红细胞悬液的浓度不宜过高，否则细胞容易聚集，融合效果受影响。浓度可根据具体情况调节。
2、电激诱导融合的过程中，脉冲的个数和脉冲触发不宜过多，否则细胞会破碎。 预期实验结果
可观察到两个或多个细胞发生质膜融合但核尚未融合，或者细胞间不仅发生了质膜融合，而且细胞核也发生了融合。
思考问题与作业
1、观察并拍摄（或绘制）融合细胞的形态。
2、思考细胞融合的理论和实际意义。
实验五 细胞的传代培养
【实验目的】
1．掌握无菌操作技术。
2．熟悉并完成传代各步骤的操作方法
3．解传代培养的原理及一般的方法。
【实验原理】
培养的细胞通过增殖达到一定数量后，为了避免因为生存空间不足或密度过大，造成细胞营养发生障碍进而影响其生长，需要对细胞加以及时的分离、稀释。将培养的细胞从原培养瓶中加以分离，经稀释后再接种子新的培养瓶中，这二过程即为传代(sub-culture)。
细胞类型不同，传代的方法也有差异。大多数贴壁细胞的传代，主要采用消化法，即：利用消化剂（常为0. 25%胰蛋白酶液）使贴壁细胞脱离培养器皿的表面，并使细胞彼此间发生分离，然后进行稀释、再培养。而悬浮细胞的传代过程相对较为简单，直接吹打或离心后，即可加以传代。
【实验器材和试剂】
【分组形式】
2～3人一组较为合适。
【操作步骤】
（一）贴壁细胞的传代培养 1．弃原代培养肝细胞培养瓶中的旧培养液；
2．加入适量的D-Hank 液，轻轻摇动、清洗残留在细胞表面的培养液，倒掉；
3．加入适量的消化液，使其覆盖整个细胞培养面，轻轻摇动培养瓶，并将培养瓶放于倒置显微镜下观察，当发现细胞胞质回缩、胞间间隙增大时，快速吸出消化液；
4．向培养瓶中加入D-Hank 液，轻轻转动培养瓶，倒掉，再加入含血清的培养液终止消化；
5．用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复轻轻吹打瓶壁，制备细胞悬液。吹打的过程应按一定的顺序进行，即从培养瓶底部的一边开始，到另一边结束，尽量使瓶底的各个部位的细胞均能被吹到。吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞；
6．在倒置显微镜下观察细胞，若发现原贴壁的细胞均已悬浮于培养液中，且细胞已分散成小的细胞团或单细胞，即可终止吹打；
7．将细胞悬液收集于l0ml 离心管中，1 000rpm离心3～5min ，去除上清；
8．细胞计数，按照1×105～1×106的密度接种细胞于新培养瓶中。
（二）悬浮细胞的传代
1．将原代培养的外周血淋巴细胞连同培养液一并转移到离心管中；
2，离心800～1 000rpm 5min，去除上清液；
3．加新的培养液到离心管中，吸管吹打、制悬。将悬液按1:2或1:3的比例分别接种于新的培养瓶中。
【观察与记录】
在倒置显微镜下，可见接种24h 后，大多数肝细胞已贴附于培养瓶底部，48h 以后，细胞开始增殖，细胞的数量增多，在接种的肝细胞或肝细胞团的周围可见有新生的细胞长出，96h 以后，培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合。
【注意事项】
1．传代培养的过程通常较长，细胞被污染的可能增加，因此必须严格进行无菌操作。
2．用胰蛋白酶液进行消化前，需用D-Hank 液清洗培养细胞表面残留的培养液，以免其所含的血清抑制胰蛋白酶活性的发挥。
3．消化液作用的时间常随细胞的种类、消化液配制的时间及消化液加入的量的多少而发生变化，消化过程中应密切注意培养细胞形态的变化，发现胞质回缩、细胞间的连接变松散时，应立刻终止消化。通常上皮样细胞因细胞间连接较为紧密，其消化的时间较成纤维样细胞长一些。此外，首次传代的细胞与已建系的细胞相比，也需要更多的消化时间。
4．首次传代的细胞因需适应新的环境，可适当增加其接种量，以促进其生存与增殖。
【试剂配制】
D-Hank 液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM 培养基的配制方法同前一实验。
实验六 培养细胞的形态观察和计数
【实验目的】
1．熟悉培养细胞形态分类的特点。
2．掌握培养过程中细胞形态、结构变化的规律以及细胞计数的方法。
【实验原理】
体外培养的细胞根据其生长方式的特点可分为贴附型与悬浮型两大类型。能附着于支持物表面生长的细胞属贴附型细胞，大多数活体细胞在体外培养的条件下，均呈现出贴附型生长的特点。有些细胞在培养时可悬浮于培养基中生长，而不需贴附于支持物上，此类细胞即为悬浮型细胞。
贴附型细胞在体外培养时形态常出现类似于“返祖”的现象，即失去原有在体内的
特征、趋向于单一化，并反映出其胚层起源的情况。
体外培养的贴附型细胞在形态上主要可分为上皮细胞型与成纤维细胞型两大类（见图4-1）。属上皮细胞型的细胞形态与上皮细胞类似，呈扁平、不规则的多角形，胞核圆形、位于细胞中央，细胞间连接紧密、相嵌排列，相互衔接成单层，外胚层及内胚层来源的细胞，如表皮、乳腺、肝等组织细胞在体外培养时均属此型细胞。成纤维细胞型形态与成纤维细胞类似，胞体呈梭形或不规则的三角形，有数个长短不等的突起，细胞彼此间呈旋涡状、放射状的排列，起源于中胚层的组织细胞，如纤维结缔组织、血管内皮、平滑肌、心肌等组织细胞均属此型。
悬浮型细胞的形态较为单一，无论其来源如何，在体外培养条件卞均为圆形，如淋巴细胞、白血病细胞等。因此，本实验主要以贴附型细胞作为材料，对细胞的形态进行观察。
在倒置显微镜下观察到的生长状态良好的活细胞，其胞质是匀质、‘透明的，胞质中颗粒较少，细胞的轮廓不明显。随着培养时间的延长，细胞中的颗粒物质逐渐增多，细胞的透明度减弱，细胞轮廓增强，核仁数量增多，因此通过观察培养细胞内颗粒多少、透明度的高低及轮廓的清晰程度，可以对培养细胞的生长状态加以判定。
细胞计数法是细胞生物学实验的一项基本技术，是了解培养细胞生长状态以及测定培养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。
细胞计数主要利用血球计数板来完成。血球计数板每一大方格长为Imm ，宽为1mm ，高为0.1mm ，体积为0．lrrirr13，可容纳的溶液是0. I u I ，那么每ml 溶液中所含细胞数即是视野中每一大方格中数出的细胞数的10 000倍(图4-2) 。
【实验器材和试剂】
【分组形式】
2～3人一组。
【操作步骤】
（一）培养细胞形态类型的观察 1．从CO 2培养箱中取出已培养3d 的传代肝细胞；
2．在倒置相差显微镜，对培养细胞的形态、细胞排列方式及彼此间连接的程度加以观察；
3．记录观察的结果；
4．将肝细胞放回培养箱，取出已培养3d 的传代成纤维细胞；
5．在倒置相差显微镜下，观察成纤维细胞的形态、细胞排列方式及彼此间连接的程度；
6．记录观察的结果，并与肝细胞的形态特征加以比较。
（二）细胞形态结构及生长状况的观察
1．将传代培养3d 的肝细胞或成纤维细胞从培养箱中取出；
2．在倒置相差显微镜10X 的物镜下，先转动目镜使视野中央的双十字的八条线清晰，再调节物镜使观察的细胞形态清楚，对细胞的透明度、细胞的轮廓进行观察；
3．将倒置相差显微镜转换至40×物镜，对细胞结构、内容物等作进一步的观察；
4．记录上述观察结果，并将细胞放回培养箱，同时取出传代培养7d 的肝细胞或成纤维细胞；
．5．在倒置相差显微镜下，分别用10×及40×的物镜对细胞的透明度、轮廓及内容物等进行观察；
6．记录观察的结果，并与传代培养3d 的细胞加以比较’。
（三）细胞的计数
1．准备计数板：用酒精清洁计数板和盖玻片，然后用吸水纸轻轻擦干；
2．制备细胞悬液：用胰蛋白酶消化单层培养细胞或收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于104/mI，若细胞数很少，应将悬液离心(1 000rpm，2min) ，
重悬浮于少量DMEM 培养基中；
3．加样：将盖玻片盖在计数板两槽中间。用尖嘴吸管轻轻吹打细胞悬液，吸取少量细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧边沿加细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。否则要将计数板和盖玻片擦干净重新加样；
4．计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。
【观察与记录】
1．培养细胞形态类型的观察
传代培养3d 的肝细胞具有典型的上皮型细胞的特点，即细胞呈不规则的多角形，细胞间连接紧密、彼此相嵌排列。
传代3d 的真皮成纤维细胞具有典型的成纤维型细胞的特点，胞体多呈梭形，部分细胞有数个长短不等的突起，细胞彼此间连接较为疏松，细胞呈放射状的排列。
2．培养细胞结构的观察
培养3d 的细胞，无论是上皮型或是成纤维型，细胞均具有较高的透明度，折光性强，胞质中颗粒较少，表明细胞处于良好的生长状态。但培养7d 的细胞在高倍镜下可见胞质中颗粒数明显增多，颗粒较为粗大，致使整个细胞的透明度降低，胞核中存在多个核仁，细胞的整体轮廓增强。
3．细胞计数
将记录的计数板四角大方格中的细胞数代人以下公式，可得出细胞密度。 细胞数／毫升原液=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数
【注意事项】
1．观察细胞形态时，应注意取放细胞时的无菌操作，以免污染。同时注意限制观察的时间，尤其是在对多瓶细胞进行观察时，应分批取放，以免细胞在培养箱外的时间过长影响细胞的状态。
2．细胞计数时，消化单层细胞应尽量使细胞分散良好，以制备单个细胞悬液，否则会影响细胞计数结果。
3．取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，特别应该注意这一点，否则前后计数结果会有很大误差。
4．镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占10%以上，说明消化不充分；或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当，需重制备细胞悬液、计数。
5．加样时，应尽量避免气泡的产生，否则不但会妨碍对计数细胞的观察，同时也会造成计数结果的误差。
【试剂配制】
D-Hank 液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM 培养基的配制方法同前一实验。
实验七
实验目的
1．了解溶血现象及其发生机制。 细胞膜的渗透性
2．了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
实验原理
细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障，是一种半透膜，可选择性地控制物质进出细胞。将红细胞放在低渗溶液中，水分子大量渗透到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，溶液由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血( hemolysis)。由于溶质渗透人细胞的速度不同，溶血时间也不同，因此，发生溶血现象所需的时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜渗透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。
实验用品
1．材料
兔血。
2．试剂
(1) 09%氯化钠溶液。
(2)2种低渗溶液0.017 mol/L氯化钠溶液和0.032 mol/L葡萄糖溶液。
(3) 7种等渗溶液0.17 mol/L氯化钠溶液、0.32 moI/L葡萄糖溶液、0.17 mol/L氯化铵溶液、0.17 moI/L乙酸铵溶液、0.12 mol/L草酸铵溶液、0.32 mol/L甘油、0.32 mol/L丙酮。
3．器材
50 mL烧杯、10 mL移液管、滴管、试管（12支）、试管架。
实验程序
1. 50%兔红细胞悬液的制备
以无菌方法抽取兔耳缘静脉血液1 mL，缓缓加入0.9%氯化钠溶液9 mL混匀，3 000
r/min离心5 min ，弃上清液。如此洗涤红细胞3次，最后使红细胞-0.9%氯化钠溶液的总体积为2 mL，制成50%兔红细胞悬液。 2．溶血现象的观察
取试管2支，分别加入0.017 mol/L氯化钠溶液和0.032 moVL葡萄糖溶液均为（低渗溶液）3 mL，再加入2滴制备好的50%兔红细胞悬液，注意观察溶液颜色的变化。当溶液由不透明的红细胞悬液变成透明的血红蛋白溶液（红细胞发生破裂，造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液），即发生溶血现象。 3．红细胞对不同物质的渗透性
(1)取试管1支，加入0.17 mol/L氯化钠溶液3 mL，再加入2滴制备好的50%兔红细胞悬液，轻轻摇动，混匀后静置于温室中，观察试管中发生溶血的时间及溶液颜色的变化。
(2)分别在下列几种等渗溶液中进行实验，步骤同(1)。
0.32 mol/L葡萄糖溶液 0.17 mol/L氯化铵溶液 0.17mol/L乙酸铵溶液 0.17 mol/L硝酸钠溶液 0.12 mol/L草酸铵溶液 0.12 mol/L硫酸钠洚一
0.32 mol/L甘油 0.32 mol/L乙醇 0.32丙酮 要点提示及注意事项
试管中红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。 预期实验结果
发生溶血后，由不透明的红细胞悬液变成透明的血红蛋白溶液。目测法判断标准：快速溶血：+++；慢速溶血：++或+；不溶血：-。
思考问题与作业
记录观察到的现象，并对实验结果进行分析和比较。
实验八 凋亡细胞的光镜下形态观察
一、凋亡细胞的普通光镜下形态观察
【实验目的】
1．熟悉普通光镜下凋亡细胞的形态变化。 2．熟悉苏木精一伊红(H．E) 染色方法。 3．了解染Giemsa 色方法。 【实验原理】
细胞发生凋亡时，其形态产生一系列变化，经相应的染色后在普通光镜下即可观察到的这些变化，如：核染色质固缩、边集，染色较深，或核破裂甚至出现凋亡小体等。 1 苏木精易溶于酒精、甘油及热水中，本身与组织亲和力小，不能成为染液，只有加入复盐和氧化剂方能成为染液，此时苏木精被氧化为苏木红，且与铝离子结合形成一种蓝色、带正电荷的碱性染料，可与细胞核中的脱氧核糖核酸根（带负电荷）结合完成染色。
伊红Y 是一种红色酸性染料，一般配成0.5%～1%的乙醇溶液。在苏木精染色后，经伊红复染，95%乙醇分色。
Giemsa 是一种复合染料，含天青Ⅱ和伊红，适于血涂片、体外培养细胞和染色体等的染色。
【实验器材和试剂】
【分组形式】 2～4人一组。 【操作步骤】
（一）细胞涂片的HE 染色
1．制备细胞涂片：培养细胞，诱导凋亡，然后消化细胞，制成单细胞悬液。将单细胞悬液移至离心管，离心(1 000g/min) 5min ，弃上清并用PBS 洗细胞1～2次后，制备细胞悬液，并调整细胞数至1×104～5×104／ril ，取100U l 细胞悬液，用细胞涂片离心机(1 000g/min，1～2min) 制成细胞涂片。4%甲醛（或多聚甲醛）固定l0min 后染色。 2．苏木精染液染色3min ，自来水洗Imin 。
3．在分化液中分化30s （提插数次）后用蒸馏水浸泡5～15min 。 4．伊红染液染色2min 。
5．脱水、透明：75%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇(I)、100%乙醇 (Ⅱ) 、二甲苯（工）和二甲苯(Ⅱ) 各Imin 以脱水透明。 6．中性树脂封片。 7．普通显微镜观察。 （二）Giemsa 染色
1．制备细胞涂片：步骤同上。
2．甲醇一冰醋酸(3：1) 固定l0min 。充分晾干，或用吹风机吹干。
3．滴加Giemsa 稀释染液(Sorensen磷酸缓冲液：Giemsa 原液=10：1) ，染色3～
10min 。
4．流水冲洗。，磷酸缓冲液分色（镜下控制颜色），晾干。 5．透明：二甲苯（I ）和二甲苯(Ⅱ) 分别Imin 。 6．中性树脂封片。 7．显微镜下观察。 【观察与记录】
1．HE 染色标本：细胞核蓝色，细胞质红色。
2．Gierrisa 染色的标本：细胞核红紫色，细胞质蓝色。
3．观察记录细胞的形态变化。凋亡细胞的核染色质固缩、边集，染色较深，或核破裂；细胞膜皱褶、卷曲，或出泡、芽生形成凋亡小体。 4．写出观察结果报告 【注意事项】
1．甲醛、二甲苯均有毒，而且甲醛有致癌作用，所以相关操作应戴手套等在化学通风橱进行。
2．注意，制备细胞涂片过程中，应将在消化前已脱壁的细胞收集在内。
3．如进行Giemsa 染色，应注意，在Giemsa 染色的第二步一定要充分晾干，否则将影响染色结果。 【试剂配制】
1．苏木精染液：苏木精1g 、蒸馏水l00ml 、碘酸钠0.2g 、钾矾50g ，加温溶解后加入水合氯醛50g ，枸橼酸1g ，搅拌溶解后可长期保存。
2．Giemsa 染液原液：Giemsa 0.5g加入甘油33ml ，研磨后加入33ml 甲醇，放入37～40℃温箱中12h ，棕色瓶保存。
3．Sorensen 磷酸缓冲液(pH值6.8) ：M/15磷酸氢二钠49. 6ml ，M/15磷酸二氢钾50. 4ml。