第六章 单倍体的产生
1引言
1.1单倍体的概念
所谓单倍体，指的是具有配子染色体数的个体或细胞。 一倍体：只含有一个染色体组的个体或细胞（n=x），一倍体不能进行减数分裂, 所以是不育的。
二倍体：含有二个染色体组的个体或细胞（2n=2x，n 代表配子染色体数，2n 代表合子染色体数，x 代表染色体组）。
三倍体：具有三个染色体组的细胞或个体。
四倍体：具有四个染色体组的细胞或个体。
多倍体：细胞或个体中的染色体组数多于二个。
整倍体：体细胞内含有完整的染色体组的类型称为整倍体。 非整倍体：如果在二倍体的基础上，增加或减少个别染色体，这种变异的细胞或个体叫非整倍体。
1.2单倍体在遗传研究和植物育种中的意义
（1）在单倍体细胞中染色体组减半，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来。单倍体植株中由隐性基因控制的性状, 虽经染色体加倍，但由于没有显性基因的掩盖而容易显现。因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。在诱导频率较高时，单倍体能在植株上较充分地显现重组的配子类型，可提供新的遗传资源和选择材料。
（2）在品种间杂交育种程序中，通过F 1代花药培养得到单倍体
植株后，经染色体加倍立即成为纯合体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代，和常规育种方法相比，显著缩短了育种年限。
1.3获得单倍体植株的途径
单倍体的重要意义虽然早已为人所知，然而，由于在自然界单倍体出现的频率极低，只有O.001％～0.01％，因此以前它们并未得到广泛的利用。目前，人们诱导单倍体植株主要采用整体操作技术和花药、花粉的离体培养技术。
1.3.1整体操作技术
①雌核发育。通过阻止授粉途径(利用预先离子辐射处理的花粉或使用不亲和花粉) ，引起未受精卵细胞发育成单倍体植株。
②胚珠雄核发育。由有雄核的卵细胞发育成单倍体植株。在这种发育途径中，卵细胞核在受精前发生消失或失活。
③通过远缘杂交消除一个亲本的基因组。这种情况出现在属间和种间杂交中，在受精之后的发育过程中双亲之一的基因组被选择性消除。于是，形成的胚只具有一亲本的基因组，由此发育形成的植株理所当然属于单倍体。
④半受精。杂交过程中，卵细胞核与萌发花粉粒产生的精核不发生融合，各自独立地进行分裂，产生嵌合的单倍体植株。
⑤化学处理。一些化学试剂如氯霉素和对氟苯丙氨酸，可能诱导体细胞或组织中的染色体丢失，产生单倍体。用甲苯蓝、顺丁烯二酰肼、一氧化二氮和秋水仙素也可能产生类似的结果。
⑥高低温处理。高低温处理，可以起到抑制配子融合，诱导单倍体的作用。
⑦辐射效应。据报道，X 射线或紫外线能诱导染色体断裂，导致亲本的染色体丢失，形成单倍体植株。
1.3.2花药、花粉的离体培养技术
整体处理方法获得单倍体植株的频率低。与此相反，使用离体培养的方法成功获得的单倍体植株数量惊人。自印度科学家20世纪60年代中期首次报道由毛曼陀罗花药培养获得了大量花粉起源的单倍体以后，立即引起了遗传育种工作者的巨大兴趣，随后在包括中国在内的很多国家广泛开展了花药培养的研究。有报道指出，通过花药培养(花药孤雄发育) 或花粉培养诱导获得的单倍体涉及34个科约247种植物，其中包括不少有重要经济价值的植物。茄科植物特别容易诱导产生单倍体，然而十字花科、禾本科、毛茛科等植物通过花药孤雄发育(此后称为雄核发育) 、单个花粉粒培养也能诱导获得单倍体。目前，这项技术已成为人们获得单倍体植株的主要途径。
2通过花药和花粉培养产生单倍体的理论解释
花药和花粉培养都指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化，最终发育成完整植株。只不过后者是将花粉从花药中游离出来，成为分散或游离态进行培养。从组织器官角度来说，花药培养属于器官培养的范畴，而花粉培养属于细胞培养的范畴。但两者的目的都一样，就是要诱导花粉细胞发育成单倍体植株。
花药(anther)是植物花的雄性器官，包括二倍性的药壁和药隔组织以及单倍性的雄性性细胞—花粉粒(pollen grain) 。一个花药的每个花粉囊中都充满了花粉粒，每个花粉粒在母体植株上的最终角色都是发育成一个雄配子体。但在花药的离体培养过程中，花粉粒的命运会脱离常轨，最终发育成一个单倍体的孢子体。为什么会这样呢？这涉及到花粉小孢子的发育途径。
2.1活体小孢子发育途径
一个花粉母细胞经过连续2次细胞分离（第一次减数分裂，第二次有丝分裂），形成4个子细胞，称为四分体，四分体分散成单核花粉粒。在正常情况下，单核经第一次有丝分裂，产生一个大而疏松的营养核和一个小而致密的生殖核，称二核花粉粒。第二次有丝分裂仅限于生殖核，形成两个精子，它们处在花粉或花粉管中(图6－1D) ，称为三核花粉粒。最后花粉粒进一步膨大，花粉进入成熟期。
2.2离体小孢子发育途径
在离体培养条件下，花粉是产生花粉植株的原始细胞，我们把花粉形成植株的途径称为“花粉孢子体发育途径”。目前，多数学者习惯把小孢子或花粉沿孢子体途径发育成花粉植株的过程称为“雄核发育”。离体培养时，小孢子在培养过程中呈现不同的发育模式。目前，一般根据小孢子第一次有丝分裂的情况将雄核发育分为A 途径(不均等分裂) 和B 途径(均等分裂) ，其中A 途径又根据第二次分裂及其以后的情况细分为A-V 途径、A-G 途径、A-VG 途径(又称E 途径) 及C 途径(图6-1) 。
图5—1小孢子正常发育途径与离体培养条件下胚胎发育途径比较
A ．第一次有丝分裂为非均等分裂，形成一个营养核、一个生殖核
A －V ．营养核重复分裂而生殖核败育
A －G ．生殖核重复分裂而营养核败育
A －VG ．生殖核和营养核共同分裂
C ．营养核、生殖核分别或同时进行核内复制，有丝分裂后核融合分别形成
二倍体、三倍体、四倍体胚
B ．第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个相似的营养型核，进而重复分裂形成
单倍体胚或先核融合然后重复分裂形成多倍体胚
D ．自然条件下小孢子的第二次分裂、淀粉粒及萌发形成的花粉管
2.2.1 A途径 小孢子的第一次有丝分裂按配子体方式进行，为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞(或营养核和生殖核) ，这种途径又可细分为以下几种途径：
(1)A-V途径 多细胞花粉(或多核花粉) 由营养细胞重复分裂衍生而成，生殖细胞以游离核的形式存在一个周期后退化，或分裂一至数次存在于多核花粉的一侧，有的甚至到球形胚形成仍存在。因此，生殖核并不参与花粉孢子体的形成，在花粉中往往可以观察到生殖细胞的存在。
(2)A-G途径 生殖细胞进行多次分裂形成胚状体，营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。由生殖细胞形成的细胞群其核致密，染色后着色较深，容易同营养细胞衍生而来的细胞群区分开来。
(3)A-VG途径(又称E 途径) 花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂，形成两类细胞群，各群的子细胞都类似其母细胞。
(4)C途径 在获得的花粉植株群体中，除单倍体外，常有相当比例的二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体等非单倍体植株，即出现小孢子培养过程中染色体自发加倍现象。1977年，Sunderland 提出C 途径，即生殖细胞和营养细胞通过核融合后共同形成多细胞花粉，产生非单倍体植株。此途径中生殖核与营养核共同参与了花粉植株的形成。
2.2.2 B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个大小相近的细胞(或游离核) 。以后，由这两个细胞(或游离核) 连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。
2.2花粉植株形态发生方式
如果不考虑小孢子核的早期分裂行为，花粉植株的形态发生有两种途径，即胚状体发育途径（直接发生途径）和愈伤组织发生途径（间
接发生途径）（图6－2）。
图6－2 花药培养与花粉植株的形态发生方式
3花药培养的一般程序
3.1取材
花药在接种以前，应预先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。一般而言，单核后期花药对培养反应较好。如：在烟草中，此时花蕾的花冠大约与萼片等长，小麦旗叶和旗叶下一叶之叶耳距约为5～15 cm，水稻颖片通常已达到最后大小，颜色淡绿，颖内的花药色亦淡绿(白则太嫩，黄则偏老) 。但值得注意的是，这种相关性绝不是一成不变的，而会因品种和气候的不同而异，因此，
在实验中还必须由每个花蕾取出一个花药，通过镜检确定花粉发育的准确时期。
3.2预处理
适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：烟草7～9℃，7～14 d；水稻7～10℃，10～15 d；黑麦1～3℃，7～14 d；大麦3～7℃，7～14 d。但低温预处理对小麦效果不稳定，有时还有负效果。
3.3消毒
花药适宜培养时，花蕾尚未开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态。因此，通常只要以70％酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。
3.4接种
在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。 如果所碰到的是花器很小的植物，如天门冬属、芸苔属和三叶草属植物等，可能需要借助解剖镜夹取花药，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。在有些情况下，甚至是接种整个花序以得到花粉单倍体。然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型，即其中雄核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行，而在这种培养基上孢子体组织增殖
的机会很少。不过，当必须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候，应当尽可能把孢子体组织去掉。
由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。
3.5培养方式和培养条件
培养方式：花药的培养方式主要有3种：一是在琼脂固化培养基表面培养，二是在加入30％Ficoll(水溶性聚蔗糖) 的液体培养基表面飘浮培养，三是利用固体一液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。
培养条件：主要包括温度和光照。
（1）温度 花药对培养温度的要求因物种而不同，对于大多数小麦品种来说，在培养的最初6 d给以30～32℃的较高温度，然后再转入28～30℃下培养，花药出愈率会有明显提高。水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27℃。愈伤组织分化阶段对温度的要求不像诱导阶段那样严格，例如小麦在17℃和30℃下花粉愈伤组织分化频率没有显著差异，水稻花粉植株的分化也多在和诱导期间相同的温度下进行。
（2）光照 对光照的要求在物种间差异更为明显。如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果较好，强光会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。
愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但对光照强度和照光
时间的要求则因物种而异。例如水稻花粉愈伤组织在转入分化培养基之初仍不宜照光培养，须待3～5 d 后再给以每天14 h ，1 000～2 000 lx 的光照，以免引起愈伤组织的老化坏死。对小麦花粉植株则不宜给以长日照。
3.6花粉植株的诱导
烟草花药接种在无激素培养基上1周以后，即有部分花粉粒开始膨大，2周以后细胞开始不断分裂，相继形成球形胚、心形胚和鱼雷形胚等，3周后在花药开裂处即可见到许多淡黄色的胚状体，见光后变绿，并逐渐长成小苗。
禾本科植物的花药在培养中通常不能形成胚状体，在这类植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行。第一步，将花药接种在含有2,4－D(1～2 mg ／L) 的诱导培养基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。第二步，当花粉愈伤组织形成后10～15 d ，其直径已长到1.5～
2.O mm时，及时把它们转到分化培养基上诱导植株分化。分化培养基中不含2,4-D ，含有NAA 和KT 各0.5 mg ／L 。在分化培养基上，愈伤组织表面陆续分化出芽和根。
在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此几乎都是单倍体。在稻麦等植物中，由于花粉植株是经由愈伤组织产生的，染色体数常有变化，其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体以及各种非整倍体等。 4花粉培养
在花药培养中，由于一个花药内的花粉粒在遗传上是异质的，因此，由一个花药所产生的植株，将构成一个异质的群体。如果单倍体
植株是经由花粉愈伤组织的途径产生的，由于从若干花粉起源的愈伤组织常常混在一起，因此由一个花药形成的愈伤组织将会是一个嵌合体。而且，如果在花粉愈伤组织化的同时，花药壁细胞也进行增殖，那么最终所得到的愈伤组织就不可能具有纯粹的配子体起源。解决这个问题的方法是培养离体小孢子或花粉粒，并诱导它们进行雄核发育。
与花药培养相比较，花粉培养在某些方面具有一定的优越性。如花粉培养不存在花药中的有害物质，不影响小孢子启动第一次分裂；排除了药壁、药隔、花丝的干扰，从小孢子中获得的材料是纯合的；小孢子能均匀地接触化学和物理诱变因素，是研究吸收、转化和诱变的理想材料；小孢子培养可观察到雄核发育的全过程，是很好的遗传和发育研究的材料体系；小孢子培养可以从每个花药中获得更多的单倍体。
花粉培养需将花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养。所以与花药培养相比，花粉培养前必须进行花粉的分离与纯化。
4.1花粉分离与纯化方法
将小孢子从花药里游离出来的主要方法有自然散落法、挤压法和机械游离法。
(1) 自然散落法 将合适的花蕾消毒后，无菌条件下取出花药，接种在预处理液或培养基上。一段时间后，有些花粉囊自动裂开，里面的小孢子从裂口处散落到培养基中，收集这些脱落下来的小孢子，
用新鲜培养基制成一定密度后进行培养。所以，此法又称漂浮培养散落小孢子收集法。此法操作简单，不需专门仪器，并且可以连续收集，曾被不少研究者在水稻、大麦、小麦、玉米上成功采用，但效率低，易受花药组织影响。
(2)挤压法 挤压法分为两种：①直接挤压法。消毒处理过的花药置于无菌培养皿或烧杯中，加入少量提取液，用注射器内管或一端压扁的玻璃棒轻压花药，将花粉挤到提取液中，经级联过筛，除去比小孢子大的组织碎片，然后低速离心，使小孢子沉淀，清洗几次后，制成小孢子悬浮液用于培养。此法简便易行，不需专门装置，也可对单花蕾或花药进行少量分离，所以直到近年仍在芜菁、结球甘蓝、大麦、小麦、玉米、水稻等作物上采用。不过，此法不适宜大规模游离小孢子的操作，并且重复性受不同操作人员用力大小、时间长短等因素影响。②研磨过滤收集法。与挤压法相似，不同之处是把消毒过的花蕾置于无菌的研钵中研磨，挤出小孢子。甘蓝、大白菜、小白菜、红菜苔的小孢子培养主要采用此法。
(3)机械游离法 此法也分为两种：①磁搅拌法。是将花药接种于盛有培养液或渗透压稳定剂的三角瓶中，放入一根磁棒(为提高分离速度，可另加入几颗玻璃珠) ，置磁力搅拌器上，低速旋转至花药透明。该法分离花粉比较彻底，但对花粉有不同程度的机械损伤，且所需时间长，所以至今用得不太普遍。②小型搅拌(超速旋切) 法。小型搅拌器的雏形就是厨用搅拌混合器。不过，刀具、容器室、容器盖均用不锈钢或耐高温的塑料制成，以便对容器进行灭菌操作。现在在
控时、控速方面得到了进一步改进，并发展出可以更换的多种转轴型号，其基本原理是通过旋转刀具的高速转动带动花蕾、穗子切段或花药高速运动而破碎，从而使小孢子游离出来。机械上装有调速器和时间控制器(有的还有实际转速显示器) ，操作方便，重复性好，可一次处理大量材料。如油菜的花序，玉米、大麦、小麦的雄穗切段等均可直接放入容器中进行处理。此外，提取小孢子所需时间短，获得率高，成活率也较高。目前不但在油菜上被广泛采用，而且还逐渐被用于玉米、大麦、小麦等禾谷类作物。
(4)小孢子分离和纯化 无论哪一种方法提取的小孢子匀浆，都需经过去除杂质的过筛、离心收集等步骤。特别当采用花序或穗切段时，杂质甚至比小孢子量还要多。不同物种甚至同一物种不同品种所用的筛子孔径由于小孢子的大小不同而有所不同。采用级联过筛时，第一级可以选用孔径较大的，以便使大杂质去除，最后一级应选用略大于小孢子直径的筛子。过筛后经过离心收集小孢子群体，一般在80～300g 条件下进行。不过由于各种作物小孢子的密度不同，需要经过摸索调整后才能获得理想的小孢子得率和成活率。
一些研究中使用聚果糖(percoll)或聚蔗糖(ficoll)甚至蔗糖配成不连续梯度对得到的小孢子群体进行纯化，以获得同步性较高的群体。如Joersbo 等(1990)对大麦小孢子群体用Percoll 梯度纯化，结果为：成活率高达70％的小孢子处于0／20％梯度界面；20％／30％界面的小孢子存活率只有4％；30％以上的只有碎片和已死的小孢子。
4.2花粉培养方式
(1)平板培养(plate cultivation method) 花粉置琼脂固化培养基上进行培养，诱导产生胚状体，进而分化成植株。
(2)液体培养 花粉悬浮在液体培养基中进行培养。由于液体培养容易造成培养物的通气不良，影响细胞分裂和分化，可将培养物置于摇床上震荡，使其处于良好的通气状态。
(3)双层培养 花粉置固体一液体双层培养基上培养。双层培养基的制作方法为：在培养皿中铺加一层琼脂培养基，待其冷却并保持表面平整，然后在其表面加入少量液体培养基。
(4)看护培养(nurse cultivation method) 配制好花粉粒悬浮液和琼脂固体培养基后，将完整的花药或花药的愈伤组织放在琼脂培养基上，将圆片滤纸放在花药或愈伤组织上，然后将花粉置于滤纸的上方。应用此法培养番茄花粉形成了细胞无性繁殖系。
(5)微室培养(microchamber culture method) 将花粉培养在很少的培养基中。具体做法是：把悬浮花粉的液体培养基用滴管取一滴滴在盖玻片上，然后翻过来放在凹穴载玻片上密封。这种培养方法的优点是便于培养过程中进行活体观察，可以把一个细胞生长、分裂、分化及形成细胞团的全过程记录下来。缺点是培养基太少，水分容易蒸发，培养基中的养分含量和pH 都会发生变化，影响花粉细胞的进一步发育。应用这个方法曾诱导油菜花粉形成多细胞团，但未能继续发育。
(6)条件培养基培养(conditioned medium method) 在预先培养过花药的液体培养基中或在加入失活的花药提取物的合成培养基中，
接入花粉进行培养。前者的做法是：将发育时期合适的花药接种在合适的培养基上一段时间后，去掉花药并离心清除散落在培养基中的花粉，用所得上清液(即条件培养基) 再培养合适的花粉。后者的做法是：首先将花药接种在合适的培养基上一段时间(如1周) ，然后将这些花药取出浸泡在沸水中杀死细胞，用研钵研碎，倒人离心管离心，上清液即为花药提取物。提取液过滤灭菌后，加入培养基中，再接种花粉进行培养。由于条件培养基和失活的花药提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于花粉培养成功。
5壮苗和移栽
花粉植株非常娇嫩，很难移植。需采取逐步过渡的方式，使其适应从异养到自养。以小麦为例，王培等采用的方法是：将已长出2～3片叶的花粉植株转入含有多效唑3 mg ／L ，NAA 和KT 各0．5 mg ／L ，LH （水解乳蛋白）500 mg ／L 和蔗糖8％的MS 培养基上，于22～25 ℃下进行壮苗培养，然后在3～8℃低温弱光条件下越夏，深秋时炼苗移栽。移栽的关键是保持高空气湿度(80％～90％，1～2周) 和低土壤湿度。
6禾谷类植物花药培养中白化苗的形成
在禾谷类植物花粉单倍体生产中存在的一个严重问题是出现大量白化苗。在大麦、小麦和水稻的花粉植株中，白化苗通常要占总苗数的1／3以上，严重的情况下，白化苗频率可高达60％～90％，这就大大限制了花药培养技术在育种实践中的应用。和绿苗相比，花粉白化苗除了缺乏绿色外，并无其他明显的形态学变异。但是，花粉白
化苗因没有发育完好的叶绿体，缺乏叶绿素，只能在异养条件下生长一段时间，很难开花结实，这给其遗传研究带来了难以克服的困难。
6.1白化花粉植株的亚微结构特征
根据对小麦花药培养中白化苗的研究，小麦花粉绿苗和花粉白化苗虽在形态、营养生长和染色体倍性上无明显差异，但白苗的生殖生长和雌蕊发育均不正常，在离体培养条件下，它不能完成有性世代和产生种子。在花粉白化苗的细胞中，常发现有微核存在，叶肉细胞的细胞质中，存在着原质体，质体早期发育正常，但发育到一定阶段即停止发育，在质体中缺乏核糖核蛋白体。某些胚性花粉粒和白苗的茎段分生细胞中出现染色体断片和微核。
6.2白化苗产生的影响因素及机理
几乎所有的研究者都发现内部因素和外部因素均可在一定程度上影响花粉植株的白苗率。内部因素有供体植株的基因型、花药和花粉本身的状态；外部因素有低温预处理、培养基成分、生长激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。在内部因素中，基因型和花粉发育时期的影响最为明显；在外界因素中，用28℃以上高温和高浓度2,4-D 进行诱导培养，延迟愈伤组织转分化培养，可明显地促进花粉白苗发生。而花药4～10℃低温预处理适当时间，可减少白化苗发生，提高绿苗率。在小麦的花药培养中，要想获得高频率的花粉愈伤组织，就需要高浓度的蔗糖，但使用高浓度的蔗糖会提高花药培养中的白苗率。
质体DNA 的缺失可能是出现白化苗的直接原因。从小麦的花粉白
苗和绿苗中提取出较完整的DNA 相比较，结果表明：白苗质体DNA 有相当大的一段易缺失区域，白苗质体DNA 的相对分子质量、含量都比绿苗少得多，如相对分子质量仅及正常质体DNA 相对分子质量的1／4，质体DNA 在总DNA 中的比例仅为绿苗的1／6。这些结果都说明小麦花粉白苗的质体DNA 是不健全的。缺失基本上都发生在植株再生的过程中，因为诱导再分化之前的愈伤组织内的质体基因组还保持完整。
核基因是控制花药培养力(包括绿苗率) 的关键因素。小麦花粉白苗发生是由核基因控制的，或是由核DNA 变异引起的。核基因可能是通过控制花粉质体变态，质体DNA 结构改变、缺失过程发生的迟早、快慢、程度和频率而影响花粉白苗发生的。这一推测可解释基因型的差异和通过一些措施可以降低白苗发生、提高花粉绿苗率的原因。
一些研究者认为，离体培养中高频发生的体细胞无性系变异是花粉白苗大量出现的原因之一。
6.3白化苗的控制
李景崎等(2002)研究发现，小麦花药培养技术中，通过采取一些措施可减少或阻止白苗发生，提高花粉绿苗率：①采穗时主要取主茎和大分蘖穗，取花粉发育时期处于单核中晚期的幼穗。镊取花药接种时，幼穗穗轴中部花药全取，下部多取，上部少取。②幼穗4℃低温离体预处理24h 。③脱分化培养一般在暗室进行，温度30～32℃时，出愈率较高，但白苗多。在29℃条件下培养，效果较为理想。④脱分化培养基一般情况下用2.0mg ／L 的2,4-D 与0.5mg ／L 的KT 或6-BA
配合使用。⑤诱导愈伤组织分化阶段，把培养基的碳源由11％蔗糖改为9％蔗糖+2％麦芽糖。⑥前期产生的愈伤组织分化能力较强，后期产生的愈伤组织分化能力降低，白苗率相对较高，所以出愈后应提早进行转分化培养。
为了找出减少白化现象的有效办法，还有待进一步的研究。所幸的是，除葡萄外，在禾本科以外植物的花药培养中未曾发现过白化苗，在禾本科植物体细胞再生植株中，虽偶有白化苗出现，但频率很低。 7影响雄核发育的因子
7.1基因型
植物基因型是影响花药离体培养诱导单倍体成功的最重要的因素之一。迄今为止，花药培养的成功主要局限于3个科的植物—茄科、禾本科和十字花科。由此可见，花药对离体培养的反应在很大程度上受基因型的影响。即使是同一科、属的植物，在不同物种间也存在巨大的差异，如据Irikura(1975)报道，在属于茄属的46个物种和9个种间杂种中，只有19个物种和4个杂种能产生花粉植株。另据陈锦骅等(1982)报道，水稻不同种、亚种和品种间花药对离体培养反应的高低顺序是：糯型、粳×籼杂种、粳型、籼型杂交稻、籼型。在粳稻中花粉愈伤组织诱导率平均可达10％，而在籼粳中只有1 ％～2％。烟草属各个种的花药对离体培养反应最灵敏，花粉植株的获得率最高，但是其中的郎氏烟草(Nicotiana longsdorffii ) 花药培养却很难成功。
7.2植株生理状态和生长条件
供体植株的年龄及其所处的生长条件(如光周期、光强、温度和矿质营养) 也能影响花药对离体培养的反应。一般来说，幼年植株的花药反应能力较好。在开花末季采集的花药不但形成孢子体的频率很低，而且发生反应的时间也较迟。在水稻和小麦等禾谷类植物中，大田植株比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率高。 在烟草中，短光周期(8h)和高光强(16 000lx) 较有利；大麦低温(18℃) 和高光强(20 000 lx)较好；油菜高光强和一定的温度变化较有利；生长在24℃下的曼陀罗属植株其雄核发育频率(45％) 比生长在17℃(8％) 下的高；对烟草植株进行氮饥饿处理可提高花药培养效果。由供体植株生长条件的差异造成的花药对培养反应的不同，可能是内生激素水平变动的结果。
7.3花粉发育时期
花粉发育时期的选择对雄核发育也是至关重要的。一般而言单核后期花药对培养反应较好，但不同物种最适的发育时期不同（表6－
1）。
表6－1 不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育期
检查花粉发育时期常用的方法是醋酸洋红染色，但对于DNA 含量较低的材料，最好用孚尔根试剂染色。
7.4预处理
接种前或后对花药采用适当的方法进行预处理，能使绿苗产量大量增加。在花药培养中采用的预处理方法很多，有高低温、化学物质、离心、射线等方法。
（1）高低温处理 高低温处理包括低温预处理、低温后处理以及热击处理。所谓低温预处理是指在接种之前将材料用0℃以上低温处理一段时间后再行接种；低温后处理是指花药接种后，先置低温条件下培养一段时间，再移至正常温度下继续培养；热击处理则是指花药接种后，先在较高温度下(一般为30～35℃) 培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。近年的研究表明，多数物种的花药培养中，上述几项变温措施均可在不同程度上提高花粉愈伤组织或花粉胚状体的诱导率，或者提高花粉植株的再生频率。
（2）化学物质处理 化学物质处理的方法有以下几种：
①高糖 接种前用高糖预处理花药一定时间，再转移到适宜的糖浓度下培养，可大幅度提高愈伤组织和胚状体的诱导率。如陆朝福等(1990)用35％的蔗糖于接种前分别浸泡10min 、30min 、1h 、3h 、5h 、24h ，发现浸lOmin 、30min 、1h 、3h 时愈伤组织诱导率均不同程度地高于对照，其中浸30min 时愈伤组织诱导率最高，比对照高出近1倍。
玉米在25％的蔗糖溶液中处理6～8min ，也能显著提高愈伤组织诱导率。
②甘露醇 用甘露醇进行预处理在麦类作物上很普遍。李文泽等(1995)研究了甘露醇预处理对大麦雄核发育的影响。结果发现：甘露醇预处理比低温预处理和对照能明显地提高花粉存活率，提高小孢子的质量，抑制淀粉积累，有利于小孢子分裂发育，使发育进度比低温预处理和对照提早2～3h 。甘露醇不能作为一种碳源，它的作用被认为是造成小孢子短时间内的营养饥饿，从而引起小孢子去分化。但也有人认为是给小孢子提供一个适当的渗透压环境。
③秋水仙素 是用秋水仙素(colchicine)处理可改变小孢子的有丝分裂、诱导它们像体细胞一样生长。其作用被认为扰乱了对不对称分裂起决定作用的微管细胞骨架，使单核花粉的细胞核移向中央，导致均等分裂。在添加O.05％的秋水仙素+2％的二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO) 的基本培养基中浸泡烟草的花药并暗培养4～12h ，发现单核花粉的数量从4.5％上升到19％，并且发现这些单核比正常的小孢子核大。
④乙烯利 乙烯利是一种杀雄剂。用100mg ／L 乙烯利喷施烟草植株花芽，营养核偶尔发生分裂，lOd 后从这种芽上取花进行培养，其雄核发育提高了25％。在花粉母细胞正在减数分裂时，用乙烯利喷“中国春”小麦，因发生额外有丝分裂，使多核花粉增多。
此外也有报道用EMS （？）、酒精、顺丁烯二酰肼等化学物质进行预处理的。
（3）其他 通过研究还发现经过射线(γ射线对小孢子也有刺激作用) 、离心(离心重力作用可打破微管，影响小孢子的发育) 、紫外光、磁场等处理可以促进雄核发育。
7.5培养基
(1)基本培养基 基本培养基对花药培养的成败影响很大。在由20世纪60年代开始连续20余年的花药培养研究热潮中，研究者一方面证实了原有的一些培养基如MS ，Miller 和Nitsch 培养基等对花药培养的普遍适用性，同时又因为作物种类不同，对培养基的要求各不相同，根据花药培养的特殊要求，研制出适合不同植物的新型培养基。如适用于稻、麦和玉米的N 6培养基(朱至清等，1974) 、适于烟草
的H 培养基(Bourgin等，1967) ；适于小麦的C 17培养基(王培等，1986) 、
W 14培养基(欧阳俊闻，1989) 、马铃薯－Ⅱ培养基(庄家骏等，1978)
等（p113, 表7,2）。
（2）碳源 由于不同植物花粉细胞渗透压的差异，使得不同种类植物花药培养要求不同的糖浓度。一般认为，单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度高，如双子叶的烟草、甜椒需3％，单子叶的小麦、水稻为6％，玉米6％～15％，大麦10％。
在花药培养中，蔗糖一直是最常用的碳源，关于糖的种类对花药培养效应的影响近年有新的研究，也有些作者使用其他糖类，如麦芽糖、果糖和葡萄糖等做碳源，取得了良好的培养效果。
（3）氨基酸和其他有机物质 氨基酸对花药培养十分重要，越来越受到人们的重视。Olsen(1987)将培养基中20mmol ／L 硝酸铵减
至2mmol ／L ，同时补加5.1 mmol／L 谷氨酰胺，使大麦花药培养绿苗产量提高到46.4％；Chu 等(1988)报道在培养基中补加丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和丙氨酸各40mg ／L 、谷氨酰胺400mg ／L 能提高小麦花粉胚状体的数量和质量；Zhu 等(1990)在大麦花药培养中也发现，8mg ／L 丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸和天冬酰胺混合物补加到改良MS 培养基中，能增加绿苗分化率。
（4）植物激素 培养基中的激素成分对于诱导花粉细胞的增殖和发育起着重要作用。由于植物种类的不同，花药在离体培养中对激素的要求有2种不同的情况：①在烟草、毛曼陀罗、假白花曼陀罗以及瘤果曼陀罗等植物中，雄核发育的途径是直接形成花粉胚。在这些植物中，一般不需要激素，在基本培养基上就可以产生完整的单倍体植株，在有些情况下，甚至连维生素也无必要。②在大多数已知能进行雄核发育的非茄科物种中，花粉粒首先形成愈伤组织，然后，或是在同一培养基中，或是在略加改变的培养基中，由愈伤组织分化出孢子体。在这些植物中，为了诱导花药进行雄核发育，必须单独地或以不同配比在培养基中加人生长调节物质、复杂的营养混合物(如酵母浸出液，水解酪蛋白) 和椰子汁等。在大多数禾本科植物如水稻、小麦、大麦和黑麦的花药培养中，外源生长素，特别是2,4－D(1～3 mg ／L) ，是启动小孢子细胞分裂形成愈伤组织的必要条件。但燕麦和玉米例外，它们的花药在没有外源激素刺激的情况下，即能启动细胞分裂。在水稻和小麦花药培养基中除2,4－D 之外还常常添加KT 0.5 mg ／L ，其作用或在于增强愈伤组织的胚胎发生能力，或在于抑制花丝
愈伤组织的形成。
有时，通过审慎地改变培养基中的生长调节物质，有可能改变雄核发育的方式。例如在小麦中，如果培养基里含有2,4－D 和水解乳蛋白，花粉就形成愈伤组织；如果在基本培养基中补加椰子汁，花粉粒就直接发育成胚。在籼稻的花药培养中，若培养基里补加了生长素，花粉起初是沿成胚途径发育；当把带有幼胚的花药转移到不含生长素的培养基上以后，就会形成分化完善的花粉胚。但是若把花药留在含生长素的培养基中时间较长，就会形成易散碎的愈伤组织。在黑麦中也是这样，为了促进花粉胚的充分发育，防止它们愈伤化或在成熟前死亡，当花药已在含有激素的培养基上进行了6～8周的暗培养之后，必须把幼胚转移到不含生长素的培养基上在光下培养。
（5）活性炭 活性炭的作用是通过吸附培养基中的某些物质如激素、维生素、铁盐等来影响外植体的生长发育。对雄核发育不依赖于外源激素的植物如烟草，在培养基中加入活性碳对雄核发育具有促进作用。但对于必须依赖外源激素才能进行雄核发育的植物来说，在花粉愈伤组织诱导培养基中添加活性炭可能是有害而无益的。
7.6药壁因子
大量的证据表明，在花粉胚发育过程中花药壁起着重要的作用。Pelletier 和Ilami(1972)通过一系列的移植实验证明，即使把一个品种烟草的花粉移植到另一个品种的花药中，前者也能够顺利地发育成胚。通过这项工作建立了一个“药壁因子”的概念。随后又出现了花药对同一物种及不同物种离体花粉雄核发育的看护作用的报道。甚
至花药浸提液也能刺激花粉胚的形成。在大麦花药漂浮培养中，若使用曾经培养过大麦花药或子房7 d 之久的条件培养基，能显著促进花粉胚的形成。
组织学研究也明确证实了药壁因子在花粉胚发育中的作用。在烟草中，只有原来贴靠着花药壁的花粉粒，才能顺利发育成花粉胚。在天仙子中，也只有处在药室外围紧靠绒毡层的花粉能够成胚。这个事实进一步表明，由绒毡层起源的某些重要物质的梯度变化，对于诱导花粉粒发育成胚起着关键的作用。
7.7培养条件
培养条件如温度、光照、板植密度等对雄核发育也有一定的影响。 温度：温度对离体培养的花粉的发育有一定的影响。如烟草在27℃下产生的单倍体植株比22℃ 产生的多。不同物种花粉发育的最适温度是不同的。一个物种花粉发育的最适温度比不分化的愈伤组织生长的最适温度要高。
光照：黑暗条件下，小植株能从花药培养中发育出来，有光条件下，花药能培养出更多更壮的苗。
植板密度：花粉培养中，小孢子的植板密度和分化培养时愈伤组织/细胞团植板密度对植株再生有很大影响。Davies 等(1998)对大麦小孢子植板密度的研究发现：小孢子植板密度低于5×104个/ml时，细胞团的分化不是太好，密度为5×104个/ml和1×105个/ml时，细胞团的分化效果均很好。 Davies 等(1998)的实验表明，在固体诱导培养基上，愈伤组织的植块密度为12.5块/cm2和25块/cm2时，其绿
苗再生情况显著高于5块/cm2和 50块/cm2。
8通过远缘杂交产生单倍体
除花药和花粉培养外，在远缘杂交之后有选择地进行染色体消除也是获得单倍体的一个途径。Kasha 和Kao(1970)发现，在四倍体栽培大麦和四倍体球茎大麦的种间杂交中，几乎所有后代植株都是双单倍体。与此相似，把这两个物种的双单倍体杂交，后代中出现了单倍体。在形态上和细胞学上，这些后代都与栽培大麦相似。将受精小花以低浓度GA 3(25～150 μg ／L) 处理数天，明显有利于提高结实率和
获得单倍体植株。详细的细胞学研究表明，在这些杂交中双受精正常发生，但在杂种胚的早期发育过程中，球茎大麦染色体被选择性地淘汰了，因而所形成的胚只含有栽培大麦的染色体。在这些杂交中，胚通常在授粉后10 d夭折。为了得到完整的植株，必须把未成熟胚剥离，在人工培养基上培养。这种通过远缘杂交后再辅以未成熟胚培养的方法，还由小麦品种中国春获得了频率很高的单倍体。 9单倍体植株的鉴定和染色体加倍
9.1花粉和花药植株的倍性鉴定
确定新形成植株的倍性是非常重要的，因为胚形成的途径不同，植株在倍性上可能存在很大差异，如黄佩霞等(1978)对2 496棵水稻花粉植株进行了染色体计数，发现单倍体占35.4％，二倍体占53.4％，多倍体占5.2％，混倍体占6.0％。
9.1.1染色体直接计数法
通过植株的根尖或茎尖等细胞分裂旺盛处的细胞染色体直接计
数是最有效的方法。
9.1.2间接鉴定
(1)扫描细胞光度仪鉴定 采用扫描细胞光度仪(flow cytometry ，FCM ，也叫流式细胞仪) 进行鉴定。用流式细胞测定法可迅速测定叶片单个细胞核内DNA 含量，根据DNA 含量曲线图推断细胞的倍性。特别是在离体培养过程中，试管中的芽或小植株很小很嫩时，此方法仅用lcm 2的样品就很容易确定其倍性。
(2)细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。杨艳琼等(2002)对经不同浓度秋水仙碱溶液加倍处理的烟草花粉植株用叶片气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定染色体倍性，结果表明：气孔保卫细胞叶绿体数平均值差异极显著，单倍体95％以上的叶绿体数在14个以下，双倍体95％以上的叶绿体数则在14个以上。经开花结实验证其准确率达91％，叶展开到第5片时就可鉴定。
(3)植株形态学鉴定法 不同倍性的植株在形态上有比较明显的差别，主要表现在子叶，真叶、花等的形状、大小和颜色，开花结实性，花粉着色能力及大小，果实形状及种子的形态等。在植株生长的不同时期抓住这些肉眼易辨的典型特征，就能够有效地将变异植株筛选出来。如生长期四倍体西瓜植株比二倍体叶片肥厚，裂片宽大，叶色深绿，茎节缩短。开花期花瓣颜色深黄，花朵变大，花瓣增宽、肥厚、皱褶，花蕊和子房增大，种子增大加厚、横径和种脐部加宽。三倍体西瓜的子叶多数畸形或色浅，叶片薄而不对称。三倍体和单倍体
的花粉均不着色。单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。
(4)高／低温胁迫法 郭启高等(2000)在西瓜子叶离体组织培养中，利用二倍体和四倍体的再生苗在高温和低温胁迫时的受害死亡情况进行倍性鉴定，结果确定：50℃／10h 为高温胁迫的临界点，0℃／5h 为低温胁迫的临界点，通过此方法鉴定的倍性符合度为90％和80％。这种方法省掉独立单株倍性鉴定过程，只需对试管再生苗进行一次短时处理，即可筛选出四倍体。
(5)杂交鉴定法 分为自交鉴定和测交鉴定。前者适用于自花授粉植物，自交后代群体分离的二倍体为杂合二倍体，否则为纯合二倍体。有时也利用四倍体自交结实率较低的特性鉴定四倍体植株。测交鉴定适用于雌雄异株的植物，如石刁柏、啤酒花(Humulus lupulus) 、猕猴桃等。方法是使雄株和雌株杂交，从F 1分离比例来判断亲代雄株
的基因型，从而判断雄亲是来自小孢子还是体细胞。
(6)分子标记鉴定 ①生化标记鉴定。主要是运用同工酶进行鉴定。该标记是一种共显性标记，若等位基因纯合时，无论其拷贝有多少，表现在酶谱带上仅有一条酶带，等位基因杂合时，则呈现不同的酶带。根据这一原理，选择某一同工酶为杂合表现型的植株作为花药供体，分析再生植株的酶谱即可确定其来源。用同工酶基因标记(isozyme gene marker)对花粉植株遗传标记的研究在野生稻、辣椒属、杨树、石刁柏上已有不少报道。②分子标记研究。RFLP （restriction fragment length polymorphism，片段限制长度多
态性）和RAPD （randomly amplified polymorphic DNA，随机扩增多态DNA ）是常用的DNA 分子标记技术，近年来作为遗传育种的重要手段得到广泛应用。特别是在遗传理论研究(基因定位、基因图谱) 、鉴定染色体的同源性、物种系统发育及分类学上的亲缘关系中发挥了很大作用。
9.2花粉和花药植株的染色体加倍
单倍体植株能正常地生长到开花期，但由于缺少同源染色体，减数分裂不能正常进行，因而不能形成有活力的配子。为了得到可育的纯合二倍体，必须把单倍体植株的染色体组加倍。虽然在花粉植株中染色体可自发加倍，但其频率太低。通过人工措施则可显著提高加倍频率。
9.2.1茎段培养
单倍体愈伤组织培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂(没有核分裂的染色体复制) 及花粉核的融合，形成二倍体细胞，可有意识地利用这一特点来获得纯合的二倍体植株。在此试验中，将单倍体植株的茎段置于含有一定比例的生长素和细胞分裂素的培养基上诱导愈伤组织形成。在愈伤组织生长的过程中有大量的纯合二倍体细胞产生，并进而分化出纯合的二倍体植株。
9.2.2化学试剂诱变
单倍体植物染色体加倍用得最多的是化学诱变法，常用的诱变剂有秋水仙素和Oryzalin(黄草消) 、trifluralin(氟乐灵, 一种除莠剂) 、APM(amiprophos methyl)等除草剂，其中秋水仙素应用最广泛。
(1)秋水仙素诱导 ①浸泡法。将再生小植株从试管中取出，无菌条件下用秋水仙素直接浸泡，然后再转移至新鲜的培养基中培养。如用0.2％～0.4％的秋水仙素水溶液浸泡烟草小植株24～48h ，加倍率可达35％。②生长锥处理。用秋水仙素水溶液直接浸生长点；或将其滴到棉球上然后将棉球置于顶芽或腋芽，诱导分生组织染色体加倍；或将适宜浓度的秋水仙素调和在载体羊毛脂中，然后将羊毛脂涂抹在单倍体植物的顶端分生组织上诱导染色体加倍。如用O.5％秋水仙素浸泡黄瓜单倍体幼苗生长点2h ，得到纯合的双单倍体植株；用秋水仙碱水溶液处理茄子40-42h(每隔4h 滴加一次溶液) ，加倍率为87.5％；用0.2％～0.4％秋水仙素调和羊毛脂，处理烟草24-48h ，加倍率为25％。③培养基处理。将单倍体植株的任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的培养基中继续培养。
(2)除草剂诱导 Hansen和Andsen(1996)以秋水仙碱作对照，用抗微管形成的Oryzalin 、trifluralin 、APM 三种除草剂分别添加适量的二甲基亚砜，对大白菜小孢子进行处理以获得纯合双单倍体。结果发现这三种除草剂与秋水仙碱具有相似的功能，但使用浓度要比秋水仙碱低100倍左右。其中APM 对离体加倍表现最为突出，主要是它的毒性极小，且可产生95％～100％双单倍体的加倍率。至于二甲基亚砜的作用，一般认为单独的二甲基亚砜对单倍体的染色体加倍没有作用，它只是秋水仙碱的一种助渗剂，对单倍体染色体的加倍起主导作用的仍然是秋水仙碱。
张兴平(1996)用抗微管形成的除草剂在西瓜染色体加倍上进行了试验，认为秋水仙碱并非最佳的染色体加倍诱导物，低浓度(15～30 μmol ／L) 的重氮除草剂(Oryzalin)可有效地诱导染色体加倍，这类除草剂与纺锤丝蛋白的结合专一，对染色体损伤小，引起其他变异的几率可能比秋水仙碱小，并且在这些再生植株中不存在嵌合体和植株生长延迟现象。
10在高等植物中单倍性的意义
由于多数突变是隐性，当同源染色体上有显性等位基因存在时，它们不能表现，因此在高等植物中突变常常不易发现。为了使隐性性状表现出来，需要对携有突变的植株反复自交。然而，某些物种，如茶和黑麦等，是自交不亲合的，不可能自交。此外，即使在有可能自交的情况下，4个个体中也只能有1个表现这个隐性性状。如果发生了不止一个隐性突变，要想得到一个能表现所有突变性状的个体，机会还要少得多。与此相反，在单倍体中诱发突变很容易表现出来，这是因为单倍体只有一套基因，隐性突变的作用不会受到显性等位基因的干扰。携有有利突变的单倍体一经发现，就可以在一个世代之内，通过染色体加倍，而成为表现所有有利突变的可育二倍体。
当对多细胞生物体进行诱变处理之后，突变常常呈嵌合体状态存在。为了避免这种现象，理想的办法是处理单个细胞，然后再由这些细胞产生完整植株。为了达到这个目的，可以在离体诱导雄核发育之前用诱变剂处理花药。或者是由花粉单倍体植株制备叶肉原生质体或建立细胞悬浮培养，用诱变剂处理这些单细胞系统，然后对细胞系进
行选择，并由入选的细胞系获得完整的植株。取决于所用选择剂的不同，这些植株可能具有耐热、抗植物病原菌毒素、耐盐或抗除草剂等特性。
除了便于发现隐性突变以外，利用单倍性还可以既快又容易地建立等基因纯系。在具有高度杂合性的异花授粉作物中，用传统的方法固定特定性状需要7～8年的时间，若采用F 1代植株花药培养的办法，
只要一个世代就可达到这个目的。
单倍体对通过染色体配对行为的研究进行染色体组分析，以及对制造单体、缺体和其他非整倍体也很有用。
单倍体在作物改良中已经取得了一定的应用。Nakamura 等(1974)通过MC-1610×Coker-139杂种的花药培养得到了3个优良的烟草品系，它们对细菌性枯萎病和黑胫病有较强的抗性，同时又保持了MC-1610的农艺和化学特性。Wark(1977)应用花药培养的方法育成了烟草的双单倍体，它们不仅产量高，烤烟品质好，而且抗病性强，育种过程所用的时间比常规育种法短得多。Corduan(1974)用紫外线和X-射线照射天仙子花粉单倍体，获得了形态异常的植株，然而其中有些突变体具有较高的生物碱含量。利用烟草由雄核发育单倍体建立的单细胞培养物，Carlson(1973)选出了抗甲硫氨酸类似物甲硫氨酸磺肟(MSO)的突变系。由于MSO 在结构上和作用上与烟草野火病病原菌毒素相似，因此所选出的烟草植株不但抗MSO ，同时对烟草野火病的感病程度也较轻。在雌雄异株作物石刁柏中，栽培群体是通过雌株(XX)和雄株(XY)之间的传粉产生的。由于雄株幼茎纤维含量较低，生产上
要求栽培均匀一致的雄性群体。Thevenin(1974)通过雄株的花药培养获得了纯合的超雄株(YY)。这些超雄株(YY)与雌株(XX)授粉以后，全部后代都是雄株。
中国科学工作者利用花药培养已在烟草、小麦和水稻中育成和推广了若干新品种。在其他一些栽培植物如玉米和三叶橡胶的花药培养方面，中国学者的工作也处于领先的地位。
11花药和花粉培养的局限
虽然在很多物种中，利用花药培养大量生产单倍体已获得成功，但目前这种方法还不能在栽培植物的所有重要基因型中普遍应用。迄今为止，花药培养的成功主要局限于3个科的植物—茄科、禾本科和十字花科。非常明显，花药对离体培养的反应在很大程度上受基因型的影响。
在花药培养中，一般在一个花药的小孢子总数中，大约有5％能够进行雄核发育，但其中能长成完整孢子体的小孢子只占一个更小的比例。这对于获得植物育种家所感兴趣的各种可能的遗传分离类型来说，不能不是一个严重的限制因素。造成反应频率低的一个可能原因，是花粉粒之间对药室内的空间存在着激烈的竞争。如果在大多数物种中，培养离体小孢子或小孢子原生质体的技术都能获得成功，这个问题则可得到部分解决。
此外，通过未受精胚珠或子房培养诱导孤雌生殖，是生产单倍体的另一途径。但这个途径几乎被完全忽略了，在这个领域中还需要做进一步的工作。
复习思考题：
1、简述单倍体在遗传研究和植物育种中的意义和单倍体获得的途径。
2、简述离体小孢子发育途径。
3、简述花药培养的一般程序。
4、简述花粉分离与纯化的方法及花粉培养的方式。
5、影响雄核发育的因素有哪些？
6、试述单倍体植株的鉴定方法及其染色体加倍的方法。
第六章 单倍体的产生
1引言
1.1单倍体的概念
所谓单倍体，指的是具有配子染色体数的个体或细胞。 一倍体：只含有一个染色体组的个体或细胞（n=x），一倍体不能进行减数分裂, 所以是不育的。
二倍体：含有二个染色体组的个体或细胞（2n=2x，n 代表配子染色体数，2n 代表合子染色体数，x 代表染色体组）。
三倍体：具有三个染色体组的细胞或个体。
四倍体：具有四个染色体组的细胞或个体。
多倍体：细胞或个体中的染色体组数多于二个。
整倍体：体细胞内含有完整的染色体组的类型称为整倍体。 非整倍体：如果在二倍体的基础上，增加或减少个别染色体，这种变异的细胞或个体叫非整倍体。
1.2单倍体在遗传研究和植物育种中的意义
（1）在单倍体细胞中染色体组减半，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来。单倍体植株中由隐性基因控制的性状, 虽经染色体加倍，但由于没有显性基因的掩盖而容易显现。因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。在诱导频率较高时，单倍体能在植株上较充分地显现重组的配子类型，可提供新的遗传资源和选择材料。
（2）在品种间杂交育种程序中，通过F 1代花药培养得到单倍体
植株后，经染色体加倍立即成为纯合体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代，和常规育种方法相比，显著缩短了育种年限。
1.3获得单倍体植株的途径
单倍体的重要意义虽然早已为人所知，然而，由于在自然界单倍体出现的频率极低，只有O.001％～0.01％，因此以前它们并未得到广泛的利用。目前，人们诱导单倍体植株主要采用整体操作技术和花药、花粉的离体培养技术。
1.3.1整体操作技术
①雌核发育。通过阻止授粉途径(利用预先离子辐射处理的花粉或使用不亲和花粉) ，引起未受精卵细胞发育成单倍体植株。
②胚珠雄核发育。由有雄核的卵细胞发育成单倍体植株。在这种发育途径中，卵细胞核在受精前发生消失或失活。
③通过远缘杂交消除一个亲本的基因组。这种情况出现在属间和种间杂交中，在受精之后的发育过程中双亲之一的基因组被选择性消除。于是，形成的胚只具有一亲本的基因组，由此发育形成的植株理所当然属于单倍体。
④半受精。杂交过程中，卵细胞核与萌发花粉粒产生的精核不发生融合，各自独立地进行分裂，产生嵌合的单倍体植株。
⑤化学处理。一些化学试剂如氯霉素和对氟苯丙氨酸，可能诱导体细胞或组织中的染色体丢失，产生单倍体。用甲苯蓝、顺丁烯二酰肼、一氧化二氮和秋水仙素也可能产生类似的结果。
⑥高低温处理。高低温处理，可以起到抑制配子融合，诱导单倍体的作用。
⑦辐射效应。据报道，X 射线或紫外线能诱导染色体断裂，导致亲本的染色体丢失，形成单倍体植株。
1.3.2花药、花粉的离体培养技术
整体处理方法获得单倍体植株的频率低。与此相反，使用离体培养的方法成功获得的单倍体植株数量惊人。自印度科学家20世纪60年代中期首次报道由毛曼陀罗花药培养获得了大量花粉起源的单倍体以后，立即引起了遗传育种工作者的巨大兴趣，随后在包括中国在内的很多国家广泛开展了花药培养的研究。有报道指出，通过花药培养(花药孤雄发育) 或花粉培养诱导获得的单倍体涉及34个科约247种植物，其中包括不少有重要经济价值的植物。茄科植物特别容易诱导产生单倍体，然而十字花科、禾本科、毛茛科等植物通过花药孤雄发育(此后称为雄核发育) 、单个花粉粒培养也能诱导获得单倍体。目前，这项技术已成为人们获得单倍体植株的主要途径。
2通过花药和花粉培养产生单倍体的理论解释
花药和花粉培养都指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化，最终发育成完整植株。只不过后者是将花粉从花药中游离出来，成为分散或游离态进行培养。从组织器官角度来说，花药培养属于器官培养的范畴，而花粉培养属于细胞培养的范畴。但两者的目的都一样，就是要诱导花粉细胞发育成单倍体植株。
花药(anther)是植物花的雄性器官，包括二倍性的药壁和药隔组织以及单倍性的雄性性细胞—花粉粒(pollen grain) 。一个花药的每个花粉囊中都充满了花粉粒，每个花粉粒在母体植株上的最终角色都是发育成一个雄配子体。但在花药的离体培养过程中，花粉粒的命运会脱离常轨，最终发育成一个单倍体的孢子体。为什么会这样呢？这涉及到花粉小孢子的发育途径。
2.1活体小孢子发育途径
一个花粉母细胞经过连续2次细胞分离（第一次减数分裂，第二次有丝分裂），形成4个子细胞，称为四分体，四分体分散成单核花粉粒。在正常情况下，单核经第一次有丝分裂，产生一个大而疏松的营养核和一个小而致密的生殖核，称二核花粉粒。第二次有丝分裂仅限于生殖核，形成两个精子，它们处在花粉或花粉管中(图6－1D) ，称为三核花粉粒。最后花粉粒进一步膨大，花粉进入成熟期。
2.2离体小孢子发育途径
在离体培养条件下，花粉是产生花粉植株的原始细胞，我们把花粉形成植株的途径称为“花粉孢子体发育途径”。目前，多数学者习惯把小孢子或花粉沿孢子体途径发育成花粉植株的过程称为“雄核发育”。离体培养时，小孢子在培养过程中呈现不同的发育模式。目前，一般根据小孢子第一次有丝分裂的情况将雄核发育分为A 途径(不均等分裂) 和B 途径(均等分裂) ，其中A 途径又根据第二次分裂及其以后的情况细分为A-V 途径、A-G 途径、A-VG 途径(又称E 途径) 及C 途径(图6-1) 。
图5—1小孢子正常发育途径与离体培养条件下胚胎发育途径比较
A ．第一次有丝分裂为非均等分裂，形成一个营养核、一个生殖核
A －V ．营养核重复分裂而生殖核败育
A －G ．生殖核重复分裂而营养核败育
A －VG ．生殖核和营养核共同分裂
C ．营养核、生殖核分别或同时进行核内复制，有丝分裂后核融合分别形成
二倍体、三倍体、四倍体胚
B ．第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个相似的营养型核，进而重复分裂形成
单倍体胚或先核融合然后重复分裂形成多倍体胚
D ．自然条件下小孢子的第二次分裂、淀粉粒及萌发形成的花粉管
2.2.1 A途径 小孢子的第一次有丝分裂按配子体方式进行，为不均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞(或营养核和生殖核) ，这种途径又可细分为以下几种途径：
(1)A-V途径 多细胞花粉(或多核花粉) 由营养细胞重复分裂衍生而成，生殖细胞以游离核的形式存在一个周期后退化，或分裂一至数次存在于多核花粉的一侧，有的甚至到球形胚形成仍存在。因此，生殖核并不参与花粉孢子体的形成，在花粉中往往可以观察到生殖细胞的存在。
(2)A-G途径 生殖细胞进行多次分裂形成胚状体，营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结构。由生殖细胞形成的细胞群其核致密，染色后着色较深，容易同营养细胞衍生而来的细胞群区分开来。
(3)A-VG途径(又称E 途径) 花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂，形成两类细胞群，各群的子细胞都类似其母细胞。
(4)C途径 在获得的花粉植株群体中，除单倍体外，常有相当比例的二倍体、三倍体、四倍体、非整倍体等非单倍体植株，即出现小孢子培养过程中染色体自发加倍现象。1977年，Sunderland 提出C 途径，即生殖细胞和营养细胞通过核融合后共同形成多细胞花粉，产生非单倍体植株。此途径中生殖核与营养核共同参与了花粉植株的形成。
2.2.2 B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成两个大小相近的细胞(或游离核) 。以后，由这两个细胞(或游离核) 连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。
2.2花粉植株形态发生方式
如果不考虑小孢子核的早期分裂行为，花粉植株的形态发生有两种途径，即胚状体发育途径（直接发生途径）和愈伤组织发生途径（间
接发生途径）（图6－2）。
图6－2 花药培养与花粉植株的形态发生方式
3花药培养的一般程序
3.1取材
花药在接种以前，应预先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。一般而言，单核后期花药对培养反应较好。如：在烟草中，此时花蕾的花冠大约与萼片等长，小麦旗叶和旗叶下一叶之叶耳距约为5～15 cm，水稻颖片通常已达到最后大小，颜色淡绿，颖内的花药色亦淡绿(白则太嫩，黄则偏老) 。但值得注意的是，这种相关性绝不是一成不变的，而会因品种和气候的不同而异，因此，
在实验中还必须由每个花蕾取出一个花药，通过镜检确定花粉发育的准确时期。
3.2预处理
适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：烟草7～9℃，7～14 d；水稻7～10℃，10～15 d；黑麦1～3℃，7～14 d；大麦3～7℃，7～14 d。但低温预处理对小麦效果不稳定，有时还有负效果。
3.3消毒
花药适宜培养时，花蕾尚未开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态。因此，通常只要以70％酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求。
3.4接种
在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。 如果所碰到的是花器很小的植物，如天门冬属、芸苔属和三叶草属植物等，可能需要借助解剖镜夹取花药，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。在有些情况下，甚至是接种整个花序以得到花粉单倍体。然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型，即其中雄核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行，而在这种培养基上孢子体组织增殖
的机会很少。不过，当必须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候，应当尽可能把孢子体组织去掉。
由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。
3.5培养方式和培养条件
培养方式：花药的培养方式主要有3种：一是在琼脂固化培养基表面培养，二是在加入30％Ficoll(水溶性聚蔗糖) 的液体培养基表面飘浮培养，三是利用固体一液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。
培养条件：主要包括温度和光照。
（1）温度 花药对培养温度的要求因物种而不同，对于大多数小麦品种来说，在培养的最初6 d给以30～32℃的较高温度，然后再转入28～30℃下培养，花药出愈率会有明显提高。水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27℃。愈伤组织分化阶段对温度的要求不像诱导阶段那样严格，例如小麦在17℃和30℃下花粉愈伤组织分化频率没有显著差异，水稻花粉植株的分化也多在和诱导期间相同的温度下进行。
（2）光照 对光照的要求在物种间差异更为明显。如连续光照可显著增加烟草花粉胚的产量，却强烈抑制曼陀罗的花粉胚胎发生。禾谷类植物在花粉愈伤组织诱导期间则以暗培养或散射光培养效果较好，强光会抑制小麦花粉愈伤组织的形成。
愈伤组织的分化原则上都应在光照下进行，但对光照强度和照光
时间的要求则因物种而异。例如水稻花粉愈伤组织在转入分化培养基之初仍不宜照光培养，须待3～5 d 后再给以每天14 h ，1 000～2 000 lx 的光照，以免引起愈伤组织的老化坏死。对小麦花粉植株则不宜给以长日照。
3.6花粉植株的诱导
烟草花药接种在无激素培养基上1周以后，即有部分花粉粒开始膨大，2周以后细胞开始不断分裂，相继形成球形胚、心形胚和鱼雷形胚等，3周后在花药开裂处即可见到许多淡黄色的胚状体，见光后变绿，并逐渐长成小苗。
禾本科植物的花药在培养中通常不能形成胚状体，在这类植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行。第一步，将花药接种在含有2,4－D(1～2 mg ／L) 的诱导培养基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。第二步，当花粉愈伤组织形成后10～15 d ，其直径已长到1.5～
2.O mm时，及时把它们转到分化培养基上诱导植株分化。分化培养基中不含2,4-D ，含有NAA 和KT 各0.5 mg ／L 。在分化培养基上，愈伤组织表面陆续分化出芽和根。
在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此几乎都是单倍体。在稻麦等植物中，由于花粉植株是经由愈伤组织产生的，染色体数常有变化，其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体以及各种非整倍体等。 4花粉培养
在花药培养中，由于一个花药内的花粉粒在遗传上是异质的，因此，由一个花药所产生的植株，将构成一个异质的群体。如果单倍体
植株是经由花粉愈伤组织的途径产生的，由于从若干花粉起源的愈伤组织常常混在一起，因此由一个花药形成的愈伤组织将会是一个嵌合体。而且，如果在花粉愈伤组织化的同时，花药壁细胞也进行增殖，那么最终所得到的愈伤组织就不可能具有纯粹的配子体起源。解决这个问题的方法是培养离体小孢子或花粉粒，并诱导它们进行雄核发育。
与花药培养相比较，花粉培养在某些方面具有一定的优越性。如花粉培养不存在花药中的有害物质，不影响小孢子启动第一次分裂；排除了药壁、药隔、花丝的干扰，从小孢子中获得的材料是纯合的；小孢子能均匀地接触化学和物理诱变因素，是研究吸收、转化和诱变的理想材料；小孢子培养可观察到雄核发育的全过程，是很好的遗传和发育研究的材料体系；小孢子培养可以从每个花药中获得更多的单倍体。
花粉培养需将花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养。所以与花药培养相比，花粉培养前必须进行花粉的分离与纯化。
4.1花粉分离与纯化方法
将小孢子从花药里游离出来的主要方法有自然散落法、挤压法和机械游离法。
(1) 自然散落法 将合适的花蕾消毒后，无菌条件下取出花药，接种在预处理液或培养基上。一段时间后，有些花粉囊自动裂开，里面的小孢子从裂口处散落到培养基中，收集这些脱落下来的小孢子，
用新鲜培养基制成一定密度后进行培养。所以，此法又称漂浮培养散落小孢子收集法。此法操作简单，不需专门仪器，并且可以连续收集，曾被不少研究者在水稻、大麦、小麦、玉米上成功采用，但效率低，易受花药组织影响。
(2)挤压法 挤压法分为两种：①直接挤压法。消毒处理过的花药置于无菌培养皿或烧杯中，加入少量提取液，用注射器内管或一端压扁的玻璃棒轻压花药，将花粉挤到提取液中，经级联过筛，除去比小孢子大的组织碎片，然后低速离心，使小孢子沉淀，清洗几次后，制成小孢子悬浮液用于培养。此法简便易行，不需专门装置，也可对单花蕾或花药进行少量分离，所以直到近年仍在芜菁、结球甘蓝、大麦、小麦、玉米、水稻等作物上采用。不过，此法不适宜大规模游离小孢子的操作，并且重复性受不同操作人员用力大小、时间长短等因素影响。②研磨过滤收集法。与挤压法相似，不同之处是把消毒过的花蕾置于无菌的研钵中研磨，挤出小孢子。甘蓝、大白菜、小白菜、红菜苔的小孢子培养主要采用此法。
(3)机械游离法 此法也分为两种：①磁搅拌法。是将花药接种于盛有培养液或渗透压稳定剂的三角瓶中，放入一根磁棒(为提高分离速度，可另加入几颗玻璃珠) ，置磁力搅拌器上，低速旋转至花药透明。该法分离花粉比较彻底，但对花粉有不同程度的机械损伤，且所需时间长，所以至今用得不太普遍。②小型搅拌(超速旋切) 法。小型搅拌器的雏形就是厨用搅拌混合器。不过，刀具、容器室、容器盖均用不锈钢或耐高温的塑料制成，以便对容器进行灭菌操作。现在在
控时、控速方面得到了进一步改进，并发展出可以更换的多种转轴型号，其基本原理是通过旋转刀具的高速转动带动花蕾、穗子切段或花药高速运动而破碎，从而使小孢子游离出来。机械上装有调速器和时间控制器(有的还有实际转速显示器) ，操作方便，重复性好，可一次处理大量材料。如油菜的花序，玉米、大麦、小麦的雄穗切段等均可直接放入容器中进行处理。此外，提取小孢子所需时间短，获得率高，成活率也较高。目前不但在油菜上被广泛采用，而且还逐渐被用于玉米、大麦、小麦等禾谷类作物。
(4)小孢子分离和纯化 无论哪一种方法提取的小孢子匀浆，都需经过去除杂质的过筛、离心收集等步骤。特别当采用花序或穗切段时，杂质甚至比小孢子量还要多。不同物种甚至同一物种不同品种所用的筛子孔径由于小孢子的大小不同而有所不同。采用级联过筛时，第一级可以选用孔径较大的，以便使大杂质去除，最后一级应选用略大于小孢子直径的筛子。过筛后经过离心收集小孢子群体，一般在80～300g 条件下进行。不过由于各种作物小孢子的密度不同，需要经过摸索调整后才能获得理想的小孢子得率和成活率。
一些研究中使用聚果糖(percoll)或聚蔗糖(ficoll)甚至蔗糖配成不连续梯度对得到的小孢子群体进行纯化，以获得同步性较高的群体。如Joersbo 等(1990)对大麦小孢子群体用Percoll 梯度纯化，结果为：成活率高达70％的小孢子处于0／20％梯度界面；20％／30％界面的小孢子存活率只有4％；30％以上的只有碎片和已死的小孢子。
4.2花粉培养方式
(1)平板培养(plate cultivation method) 花粉置琼脂固化培养基上进行培养，诱导产生胚状体，进而分化成植株。
(2)液体培养 花粉悬浮在液体培养基中进行培养。由于液体培养容易造成培养物的通气不良，影响细胞分裂和分化，可将培养物置于摇床上震荡，使其处于良好的通气状态。
(3)双层培养 花粉置固体一液体双层培养基上培养。双层培养基的制作方法为：在培养皿中铺加一层琼脂培养基，待其冷却并保持表面平整，然后在其表面加入少量液体培养基。
(4)看护培养(nurse cultivation method) 配制好花粉粒悬浮液和琼脂固体培养基后，将完整的花药或花药的愈伤组织放在琼脂培养基上，将圆片滤纸放在花药或愈伤组织上，然后将花粉置于滤纸的上方。应用此法培养番茄花粉形成了细胞无性繁殖系。
(5)微室培养(microchamber culture method) 将花粉培养在很少的培养基中。具体做法是：把悬浮花粉的液体培养基用滴管取一滴滴在盖玻片上，然后翻过来放在凹穴载玻片上密封。这种培养方法的优点是便于培养过程中进行活体观察，可以把一个细胞生长、分裂、分化及形成细胞团的全过程记录下来。缺点是培养基太少，水分容易蒸发，培养基中的养分含量和pH 都会发生变化，影响花粉细胞的进一步发育。应用这个方法曾诱导油菜花粉形成多细胞团，但未能继续发育。
(6)条件培养基培养(conditioned medium method) 在预先培养过花药的液体培养基中或在加入失活的花药提取物的合成培养基中，
接入花粉进行培养。前者的做法是：将发育时期合适的花药接种在合适的培养基上一段时间后，去掉花药并离心清除散落在培养基中的花粉，用所得上清液(即条件培养基) 再培养合适的花粉。后者的做法是：首先将花药接种在合适的培养基上一段时间(如1周) ，然后将这些花药取出浸泡在沸水中杀死细胞，用研钵研碎，倒人离心管离心，上清液即为花药提取物。提取液过滤灭菌后，加入培养基中，再接种花粉进行培养。由于条件培养基和失活的花药提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于花粉培养成功。
5壮苗和移栽
花粉植株非常娇嫩，很难移植。需采取逐步过渡的方式，使其适应从异养到自养。以小麦为例，王培等采用的方法是：将已长出2～3片叶的花粉植株转入含有多效唑3 mg ／L ，NAA 和KT 各0．5 mg ／L ，LH （水解乳蛋白）500 mg ／L 和蔗糖8％的MS 培养基上，于22～25 ℃下进行壮苗培养，然后在3～8℃低温弱光条件下越夏，深秋时炼苗移栽。移栽的关键是保持高空气湿度(80％～90％，1～2周) 和低土壤湿度。
6禾谷类植物花药培养中白化苗的形成
在禾谷类植物花粉单倍体生产中存在的一个严重问题是出现大量白化苗。在大麦、小麦和水稻的花粉植株中，白化苗通常要占总苗数的1／3以上，严重的情况下，白化苗频率可高达60％～90％，这就大大限制了花药培养技术在育种实践中的应用。和绿苗相比，花粉白化苗除了缺乏绿色外，并无其他明显的形态学变异。但是，花粉白
化苗因没有发育完好的叶绿体，缺乏叶绿素，只能在异养条件下生长一段时间，很难开花结实，这给其遗传研究带来了难以克服的困难。
6.1白化花粉植株的亚微结构特征
根据对小麦花药培养中白化苗的研究，小麦花粉绿苗和花粉白化苗虽在形态、营养生长和染色体倍性上无明显差异，但白苗的生殖生长和雌蕊发育均不正常，在离体培养条件下，它不能完成有性世代和产生种子。在花粉白化苗的细胞中，常发现有微核存在，叶肉细胞的细胞质中，存在着原质体，质体早期发育正常，但发育到一定阶段即停止发育，在质体中缺乏核糖核蛋白体。某些胚性花粉粒和白苗的茎段分生细胞中出现染色体断片和微核。
6.2白化苗产生的影响因素及机理
几乎所有的研究者都发现内部因素和外部因素均可在一定程度上影响花粉植株的白苗率。内部因素有供体植株的基因型、花药和花粉本身的状态；外部因素有低温预处理、培养基成分、生长激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。在内部因素中，基因型和花粉发育时期的影响最为明显；在外界因素中，用28℃以上高温和高浓度2,4-D 进行诱导培养，延迟愈伤组织转分化培养，可明显地促进花粉白苗发生。而花药4～10℃低温预处理适当时间，可减少白化苗发生，提高绿苗率。在小麦的花药培养中，要想获得高频率的花粉愈伤组织，就需要高浓度的蔗糖，但使用高浓度的蔗糖会提高花药培养中的白苗率。
质体DNA 的缺失可能是出现白化苗的直接原因。从小麦的花粉白
苗和绿苗中提取出较完整的DNA 相比较，结果表明：白苗质体DNA 有相当大的一段易缺失区域，白苗质体DNA 的相对分子质量、含量都比绿苗少得多，如相对分子质量仅及正常质体DNA 相对分子质量的1／4，质体DNA 在总DNA 中的比例仅为绿苗的1／6。这些结果都说明小麦花粉白苗的质体DNA 是不健全的。缺失基本上都发生在植株再生的过程中，因为诱导再分化之前的愈伤组织内的质体基因组还保持完整。
核基因是控制花药培养力(包括绿苗率) 的关键因素。小麦花粉白苗发生是由核基因控制的，或是由核DNA 变异引起的。核基因可能是通过控制花粉质体变态，质体DNA 结构改变、缺失过程发生的迟早、快慢、程度和频率而影响花粉白苗发生的。这一推测可解释基因型的差异和通过一些措施可以降低白苗发生、提高花粉绿苗率的原因。
一些研究者认为，离体培养中高频发生的体细胞无性系变异是花粉白苗大量出现的原因之一。
6.3白化苗的控制
李景崎等(2002)研究发现，小麦花药培养技术中，通过采取一些措施可减少或阻止白苗发生，提高花粉绿苗率：①采穗时主要取主茎和大分蘖穗，取花粉发育时期处于单核中晚期的幼穗。镊取花药接种时，幼穗穗轴中部花药全取，下部多取，上部少取。②幼穗4℃低温离体预处理24h 。③脱分化培养一般在暗室进行，温度30～32℃时，出愈率较高，但白苗多。在29℃条件下培养，效果较为理想。④脱分化培养基一般情况下用2.0mg ／L 的2,4-D 与0.5mg ／L 的KT 或6-BA
配合使用。⑤诱导愈伤组织分化阶段，把培养基的碳源由11％蔗糖改为9％蔗糖+2％麦芽糖。⑥前期产生的愈伤组织分化能力较强，后期产生的愈伤组织分化能力降低，白苗率相对较高，所以出愈后应提早进行转分化培养。
为了找出减少白化现象的有效办法，还有待进一步的研究。所幸的是，除葡萄外，在禾本科以外植物的花药培养中未曾发现过白化苗，在禾本科植物体细胞再生植株中，虽偶有白化苗出现，但频率很低。 7影响雄核发育的因子
7.1基因型
植物基因型是影响花药离体培养诱导单倍体成功的最重要的因素之一。迄今为止，花药培养的成功主要局限于3个科的植物—茄科、禾本科和十字花科。由此可见，花药对离体培养的反应在很大程度上受基因型的影响。即使是同一科、属的植物，在不同物种间也存在巨大的差异，如据Irikura(1975)报道，在属于茄属的46个物种和9个种间杂种中，只有19个物种和4个杂种能产生花粉植株。另据陈锦骅等(1982)报道，水稻不同种、亚种和品种间花药对离体培养反应的高低顺序是：糯型、粳×籼杂种、粳型、籼型杂交稻、籼型。在粳稻中花粉愈伤组织诱导率平均可达10％，而在籼粳中只有1 ％～2％。烟草属各个种的花药对离体培养反应最灵敏，花粉植株的获得率最高，但是其中的郎氏烟草(Nicotiana longsdorffii ) 花药培养却很难成功。
7.2植株生理状态和生长条件
供体植株的年龄及其所处的生长条件(如光周期、光强、温度和矿质营养) 也能影响花药对离体培养的反应。一般来说，幼年植株的花药反应能力较好。在开花末季采集的花药不但形成孢子体的频率很低，而且发生反应的时间也较迟。在水稻和小麦等禾谷类植物中，大田植株比温室植株、主茎穗比分蘖穗花粉愈伤组织的诱导率高。 在烟草中，短光周期(8h)和高光强(16 000lx) 较有利；大麦低温(18℃) 和高光强(20 000 lx)较好；油菜高光强和一定的温度变化较有利；生长在24℃下的曼陀罗属植株其雄核发育频率(45％) 比生长在17℃(8％) 下的高；对烟草植株进行氮饥饿处理可提高花药培养效果。由供体植株生长条件的差异造成的花药对培养反应的不同，可能是内生激素水平变动的结果。
7.3花粉发育时期
花粉发育时期的选择对雄核发育也是至关重要的。一般而言单核后期花药对培养反应较好，但不同物种最适的发育时期不同（表6－
1）。
表6－1 不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育期
检查花粉发育时期常用的方法是醋酸洋红染色，但对于DNA 含量较低的材料，最好用孚尔根试剂染色。
7.4预处理
接种前或后对花药采用适当的方法进行预处理，能使绿苗产量大量增加。在花药培养中采用的预处理方法很多，有高低温、化学物质、离心、射线等方法。
（1）高低温处理 高低温处理包括低温预处理、低温后处理以及热击处理。所谓低温预处理是指在接种之前将材料用0℃以上低温处理一段时间后再行接种；低温后处理是指花药接种后，先置低温条件下培养一段时间，再移至正常温度下继续培养；热击处理则是指花药接种后，先在较高温度下(一般为30～35℃) 培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。近年的研究表明，多数物种的花药培养中，上述几项变温措施均可在不同程度上提高花粉愈伤组织或花粉胚状体的诱导率，或者提高花粉植株的再生频率。
（2）化学物质处理 化学物质处理的方法有以下几种：
①高糖 接种前用高糖预处理花药一定时间，再转移到适宜的糖浓度下培养，可大幅度提高愈伤组织和胚状体的诱导率。如陆朝福等(1990)用35％的蔗糖于接种前分别浸泡10min 、30min 、1h 、3h 、5h 、24h ，发现浸lOmin 、30min 、1h 、3h 时愈伤组织诱导率均不同程度地高于对照，其中浸30min 时愈伤组织诱导率最高，比对照高出近1倍。
玉米在25％的蔗糖溶液中处理6～8min ，也能显著提高愈伤组织诱导率。
②甘露醇 用甘露醇进行预处理在麦类作物上很普遍。李文泽等(1995)研究了甘露醇预处理对大麦雄核发育的影响。结果发现：甘露醇预处理比低温预处理和对照能明显地提高花粉存活率，提高小孢子的质量，抑制淀粉积累，有利于小孢子分裂发育，使发育进度比低温预处理和对照提早2～3h 。甘露醇不能作为一种碳源，它的作用被认为是造成小孢子短时间内的营养饥饿，从而引起小孢子去分化。但也有人认为是给小孢子提供一个适当的渗透压环境。
③秋水仙素 是用秋水仙素(colchicine)处理可改变小孢子的有丝分裂、诱导它们像体细胞一样生长。其作用被认为扰乱了对不对称分裂起决定作用的微管细胞骨架，使单核花粉的细胞核移向中央，导致均等分裂。在添加O.05％的秋水仙素+2％的二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO) 的基本培养基中浸泡烟草的花药并暗培养4～12h ，发现单核花粉的数量从4.5％上升到19％，并且发现这些单核比正常的小孢子核大。
④乙烯利 乙烯利是一种杀雄剂。用100mg ／L 乙烯利喷施烟草植株花芽，营养核偶尔发生分裂，lOd 后从这种芽上取花进行培养，其雄核发育提高了25％。在花粉母细胞正在减数分裂时，用乙烯利喷“中国春”小麦，因发生额外有丝分裂，使多核花粉增多。
此外也有报道用EMS （？）、酒精、顺丁烯二酰肼等化学物质进行预处理的。
（3）其他 通过研究还发现经过射线(γ射线对小孢子也有刺激作用) 、离心(离心重力作用可打破微管，影响小孢子的发育) 、紫外光、磁场等处理可以促进雄核发育。
7.5培养基
(1)基本培养基 基本培养基对花药培养的成败影响很大。在由20世纪60年代开始连续20余年的花药培养研究热潮中，研究者一方面证实了原有的一些培养基如MS ，Miller 和Nitsch 培养基等对花药培养的普遍适用性，同时又因为作物种类不同，对培养基的要求各不相同，根据花药培养的特殊要求，研制出适合不同植物的新型培养基。如适用于稻、麦和玉米的N 6培养基(朱至清等，1974) 、适于烟草
的H 培养基(Bourgin等，1967) ；适于小麦的C 17培养基(王培等，1986) 、
W 14培养基(欧阳俊闻，1989) 、马铃薯－Ⅱ培养基(庄家骏等，1978)
等（p113, 表7,2）。
（2）碳源 由于不同植物花粉细胞渗透压的差异，使得不同种类植物花药培养要求不同的糖浓度。一般认为，单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度高，如双子叶的烟草、甜椒需3％，单子叶的小麦、水稻为6％，玉米6％～15％，大麦10％。
在花药培养中，蔗糖一直是最常用的碳源，关于糖的种类对花药培养效应的影响近年有新的研究，也有些作者使用其他糖类，如麦芽糖、果糖和葡萄糖等做碳源，取得了良好的培养效果。
（3）氨基酸和其他有机物质 氨基酸对花药培养十分重要，越来越受到人们的重视。Olsen(1987)将培养基中20mmol ／L 硝酸铵减
至2mmol ／L ，同时补加5.1 mmol／L 谷氨酰胺，使大麦花药培养绿苗产量提高到46.4％；Chu 等(1988)报道在培养基中补加丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和丙氨酸各40mg ／L 、谷氨酰胺400mg ／L 能提高小麦花粉胚状体的数量和质量；Zhu 等(1990)在大麦花药培养中也发现，8mg ／L 丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸和天冬酰胺混合物补加到改良MS 培养基中，能增加绿苗分化率。
（4）植物激素 培养基中的激素成分对于诱导花粉细胞的增殖和发育起着重要作用。由于植物种类的不同，花药在离体培养中对激素的要求有2种不同的情况：①在烟草、毛曼陀罗、假白花曼陀罗以及瘤果曼陀罗等植物中，雄核发育的途径是直接形成花粉胚。在这些植物中，一般不需要激素，在基本培养基上就可以产生完整的单倍体植株，在有些情况下，甚至连维生素也无必要。②在大多数已知能进行雄核发育的非茄科物种中，花粉粒首先形成愈伤组织，然后，或是在同一培养基中，或是在略加改变的培养基中，由愈伤组织分化出孢子体。在这些植物中，为了诱导花药进行雄核发育，必须单独地或以不同配比在培养基中加人生长调节物质、复杂的营养混合物(如酵母浸出液，水解酪蛋白) 和椰子汁等。在大多数禾本科植物如水稻、小麦、大麦和黑麦的花药培养中，外源生长素，特别是2,4－D(1～3 mg ／L) ，是启动小孢子细胞分裂形成愈伤组织的必要条件。但燕麦和玉米例外，它们的花药在没有外源激素刺激的情况下，即能启动细胞分裂。在水稻和小麦花药培养基中除2,4－D 之外还常常添加KT 0.5 mg ／L ，其作用或在于增强愈伤组织的胚胎发生能力，或在于抑制花丝
愈伤组织的形成。
有时，通过审慎地改变培养基中的生长调节物质，有可能改变雄核发育的方式。例如在小麦中，如果培养基里含有2,4－D 和水解乳蛋白，花粉就形成愈伤组织；如果在基本培养基中补加椰子汁，花粉粒就直接发育成胚。在籼稻的花药培养中，若培养基里补加了生长素，花粉起初是沿成胚途径发育；当把带有幼胚的花药转移到不含生长素的培养基上以后，就会形成分化完善的花粉胚。但是若把花药留在含生长素的培养基中时间较长，就会形成易散碎的愈伤组织。在黑麦中也是这样，为了促进花粉胚的充分发育，防止它们愈伤化或在成熟前死亡，当花药已在含有激素的培养基上进行了6～8周的暗培养之后，必须把幼胚转移到不含生长素的培养基上在光下培养。
（5）活性炭 活性炭的作用是通过吸附培养基中的某些物质如激素、维生素、铁盐等来影响外植体的生长发育。对雄核发育不依赖于外源激素的植物如烟草，在培养基中加入活性碳对雄核发育具有促进作用。但对于必须依赖外源激素才能进行雄核发育的植物来说，在花粉愈伤组织诱导培养基中添加活性炭可能是有害而无益的。
7.6药壁因子
大量的证据表明，在花粉胚发育过程中花药壁起着重要的作用。Pelletier 和Ilami(1972)通过一系列的移植实验证明，即使把一个品种烟草的花粉移植到另一个品种的花药中，前者也能够顺利地发育成胚。通过这项工作建立了一个“药壁因子”的概念。随后又出现了花药对同一物种及不同物种离体花粉雄核发育的看护作用的报道。甚
至花药浸提液也能刺激花粉胚的形成。在大麦花药漂浮培养中，若使用曾经培养过大麦花药或子房7 d 之久的条件培养基，能显著促进花粉胚的形成。
组织学研究也明确证实了药壁因子在花粉胚发育中的作用。在烟草中，只有原来贴靠着花药壁的花粉粒，才能顺利发育成花粉胚。在天仙子中，也只有处在药室外围紧靠绒毡层的花粉能够成胚。这个事实进一步表明，由绒毡层起源的某些重要物质的梯度变化，对于诱导花粉粒发育成胚起着关键的作用。
7.7培养条件
培养条件如温度、光照、板植密度等对雄核发育也有一定的影响。 温度：温度对离体培养的花粉的发育有一定的影响。如烟草在27℃下产生的单倍体植株比22℃ 产生的多。不同物种花粉发育的最适温度是不同的。一个物种花粉发育的最适温度比不分化的愈伤组织生长的最适温度要高。
光照：黑暗条件下，小植株能从花药培养中发育出来，有光条件下，花药能培养出更多更壮的苗。
植板密度：花粉培养中，小孢子的植板密度和分化培养时愈伤组织/细胞团植板密度对植株再生有很大影响。Davies 等(1998)对大麦小孢子植板密度的研究发现：小孢子植板密度低于5×104个/ml时，细胞团的分化不是太好，密度为5×104个/ml和1×105个/ml时，细胞团的分化效果均很好。 Davies 等(1998)的实验表明，在固体诱导培养基上，愈伤组织的植块密度为12.5块/cm2和25块/cm2时，其绿
苗再生情况显著高于5块/cm2和 50块/cm2。
8通过远缘杂交产生单倍体
除花药和花粉培养外，在远缘杂交之后有选择地进行染色体消除也是获得单倍体的一个途径。Kasha 和Kao(1970)发现，在四倍体栽培大麦和四倍体球茎大麦的种间杂交中，几乎所有后代植株都是双单倍体。与此相似，把这两个物种的双单倍体杂交，后代中出现了单倍体。在形态上和细胞学上，这些后代都与栽培大麦相似。将受精小花以低浓度GA 3(25～150 μg ／L) 处理数天，明显有利于提高结实率和
获得单倍体植株。详细的细胞学研究表明，在这些杂交中双受精正常发生，但在杂种胚的早期发育过程中，球茎大麦染色体被选择性地淘汰了，因而所形成的胚只含有栽培大麦的染色体。在这些杂交中，胚通常在授粉后10 d夭折。为了得到完整的植株，必须把未成熟胚剥离，在人工培养基上培养。这种通过远缘杂交后再辅以未成熟胚培养的方法，还由小麦品种中国春获得了频率很高的单倍体。 9单倍体植株的鉴定和染色体加倍
9.1花粉和花药植株的倍性鉴定
确定新形成植株的倍性是非常重要的，因为胚形成的途径不同，植株在倍性上可能存在很大差异，如黄佩霞等(1978)对2 496棵水稻花粉植株进行了染色体计数，发现单倍体占35.4％，二倍体占53.4％，多倍体占5.2％，混倍体占6.0％。
9.1.1染色体直接计数法
通过植株的根尖或茎尖等细胞分裂旺盛处的细胞染色体直接计
数是最有效的方法。
9.1.2间接鉴定
(1)扫描细胞光度仪鉴定 采用扫描细胞光度仪(flow cytometry ，FCM ，也叫流式细胞仪) 进行鉴定。用流式细胞测定法可迅速测定叶片单个细胞核内DNA 含量，根据DNA 含量曲线图推断细胞的倍性。特别是在离体培养过程中，试管中的芽或小植株很小很嫩时，此方法仅用lcm 2的样品就很容易确定其倍性。
(2)细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。杨艳琼等(2002)对经不同浓度秋水仙碱溶液加倍处理的烟草花粉植株用叶片气孔保卫细胞叶绿体计数法鉴定染色体倍性，结果表明：气孔保卫细胞叶绿体数平均值差异极显著，单倍体95％以上的叶绿体数在14个以下，双倍体95％以上的叶绿体数则在14个以上。经开花结实验证其准确率达91％，叶展开到第5片时就可鉴定。
(3)植株形态学鉴定法 不同倍性的植株在形态上有比较明显的差别，主要表现在子叶，真叶、花等的形状、大小和颜色，开花结实性，花粉着色能力及大小，果实形状及种子的形态等。在植株生长的不同时期抓住这些肉眼易辨的典型特征，就能够有效地将变异植株筛选出来。如生长期四倍体西瓜植株比二倍体叶片肥厚，裂片宽大，叶色深绿，茎节缩短。开花期花瓣颜色深黄，花朵变大，花瓣增宽、肥厚、皱褶，花蕊和子房增大，种子增大加厚、横径和种脐部加宽。三倍体西瓜的子叶多数畸形或色浅，叶片薄而不对称。三倍体和单倍体
的花粉均不着色。单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。
(4)高／低温胁迫法 郭启高等(2000)在西瓜子叶离体组织培养中，利用二倍体和四倍体的再生苗在高温和低温胁迫时的受害死亡情况进行倍性鉴定，结果确定：50℃／10h 为高温胁迫的临界点，0℃／5h 为低温胁迫的临界点，通过此方法鉴定的倍性符合度为90％和80％。这种方法省掉独立单株倍性鉴定过程，只需对试管再生苗进行一次短时处理，即可筛选出四倍体。
(5)杂交鉴定法 分为自交鉴定和测交鉴定。前者适用于自花授粉植物，自交后代群体分离的二倍体为杂合二倍体，否则为纯合二倍体。有时也利用四倍体自交结实率较低的特性鉴定四倍体植株。测交鉴定适用于雌雄异株的植物，如石刁柏、啤酒花(Humulus lupulus) 、猕猴桃等。方法是使雄株和雌株杂交，从F 1分离比例来判断亲代雄株
的基因型，从而判断雄亲是来自小孢子还是体细胞。
(6)分子标记鉴定 ①生化标记鉴定。主要是运用同工酶进行鉴定。该标记是一种共显性标记，若等位基因纯合时，无论其拷贝有多少，表现在酶谱带上仅有一条酶带，等位基因杂合时，则呈现不同的酶带。根据这一原理，选择某一同工酶为杂合表现型的植株作为花药供体，分析再生植株的酶谱即可确定其来源。用同工酶基因标记(isozyme gene marker)对花粉植株遗传标记的研究在野生稻、辣椒属、杨树、石刁柏上已有不少报道。②分子标记研究。RFLP （restriction fragment length polymorphism，片段限制长度多
态性）和RAPD （randomly amplified polymorphic DNA，随机扩增多态DNA ）是常用的DNA 分子标记技术，近年来作为遗传育种的重要手段得到广泛应用。特别是在遗传理论研究(基因定位、基因图谱) 、鉴定染色体的同源性、物种系统发育及分类学上的亲缘关系中发挥了很大作用。
9.2花粉和花药植株的染色体加倍
单倍体植株能正常地生长到开花期，但由于缺少同源染色体，减数分裂不能正常进行，因而不能形成有活力的配子。为了得到可育的纯合二倍体，必须把单倍体植株的染色体组加倍。虽然在花粉植株中染色体可自发加倍，但其频率太低。通过人工措施则可显著提高加倍频率。
9.2.1茎段培养
单倍体愈伤组织培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂(没有核分裂的染色体复制) 及花粉核的融合，形成二倍体细胞，可有意识地利用这一特点来获得纯合的二倍体植株。在此试验中，将单倍体植株的茎段置于含有一定比例的生长素和细胞分裂素的培养基上诱导愈伤组织形成。在愈伤组织生长的过程中有大量的纯合二倍体细胞产生，并进而分化出纯合的二倍体植株。
9.2.2化学试剂诱变
单倍体植物染色体加倍用得最多的是化学诱变法，常用的诱变剂有秋水仙素和Oryzalin(黄草消) 、trifluralin(氟乐灵, 一种除莠剂) 、APM(amiprophos methyl)等除草剂，其中秋水仙素应用最广泛。
(1)秋水仙素诱导 ①浸泡法。将再生小植株从试管中取出，无菌条件下用秋水仙素直接浸泡，然后再转移至新鲜的培养基中培养。如用0.2％～0.4％的秋水仙素水溶液浸泡烟草小植株24～48h ，加倍率可达35％。②生长锥处理。用秋水仙素水溶液直接浸生长点；或将其滴到棉球上然后将棉球置于顶芽或腋芽，诱导分生组织染色体加倍；或将适宜浓度的秋水仙素调和在载体羊毛脂中，然后将羊毛脂涂抹在单倍体植物的顶端分生组织上诱导染色体加倍。如用O.5％秋水仙素浸泡黄瓜单倍体幼苗生长点2h ，得到纯合的双单倍体植株；用秋水仙碱水溶液处理茄子40-42h(每隔4h 滴加一次溶液) ，加倍率为87.5％；用0.2％～0.4％秋水仙素调和羊毛脂，处理烟草24-48h ，加倍率为25％。③培养基处理。将单倍体植株的任何一部分作为外植体，种植在附加一定浓度秋水仙素的培养基中培养一段时间后，转入无秋水仙素的培养基中继续培养。
(2)除草剂诱导 Hansen和Andsen(1996)以秋水仙碱作对照，用抗微管形成的Oryzalin 、trifluralin 、APM 三种除草剂分别添加适量的二甲基亚砜，对大白菜小孢子进行处理以获得纯合双单倍体。结果发现这三种除草剂与秋水仙碱具有相似的功能，但使用浓度要比秋水仙碱低100倍左右。其中APM 对离体加倍表现最为突出，主要是它的毒性极小，且可产生95％～100％双单倍体的加倍率。至于二甲基亚砜的作用，一般认为单独的二甲基亚砜对单倍体的染色体加倍没有作用，它只是秋水仙碱的一种助渗剂，对单倍体染色体的加倍起主导作用的仍然是秋水仙碱。
张兴平(1996)用抗微管形成的除草剂在西瓜染色体加倍上进行了试验，认为秋水仙碱并非最佳的染色体加倍诱导物，低浓度(15～30 μmol ／L) 的重氮除草剂(Oryzalin)可有效地诱导染色体加倍，这类除草剂与纺锤丝蛋白的结合专一，对染色体损伤小，引起其他变异的几率可能比秋水仙碱小，并且在这些再生植株中不存在嵌合体和植株生长延迟现象。
10在高等植物中单倍性的意义
由于多数突变是隐性，当同源染色体上有显性等位基因存在时，它们不能表现，因此在高等植物中突变常常不易发现。为了使隐性性状表现出来，需要对携有突变的植株反复自交。然而，某些物种，如茶和黑麦等，是自交不亲合的，不可能自交。此外，即使在有可能自交的情况下，4个个体中也只能有1个表现这个隐性性状。如果发生了不止一个隐性突变，要想得到一个能表现所有突变性状的个体，机会还要少得多。与此相反，在单倍体中诱发突变很容易表现出来，这是因为单倍体只有一套基因，隐性突变的作用不会受到显性等位基因的干扰。携有有利突变的单倍体一经发现，就可以在一个世代之内，通过染色体加倍，而成为表现所有有利突变的可育二倍体。
当对多细胞生物体进行诱变处理之后，突变常常呈嵌合体状态存在。为了避免这种现象，理想的办法是处理单个细胞，然后再由这些细胞产生完整植株。为了达到这个目的，可以在离体诱导雄核发育之前用诱变剂处理花药。或者是由花粉单倍体植株制备叶肉原生质体或建立细胞悬浮培养，用诱变剂处理这些单细胞系统，然后对细胞系进
行选择，并由入选的细胞系获得完整的植株。取决于所用选择剂的不同，这些植株可能具有耐热、抗植物病原菌毒素、耐盐或抗除草剂等特性。
除了便于发现隐性突变以外，利用单倍性还可以既快又容易地建立等基因纯系。在具有高度杂合性的异花授粉作物中，用传统的方法固定特定性状需要7～8年的时间，若采用F 1代植株花药培养的办法，
只要一个世代就可达到这个目的。
单倍体对通过染色体配对行为的研究进行染色体组分析，以及对制造单体、缺体和其他非整倍体也很有用。
单倍体在作物改良中已经取得了一定的应用。Nakamura 等(1974)通过MC-1610×Coker-139杂种的花药培养得到了3个优良的烟草品系，它们对细菌性枯萎病和黑胫病有较强的抗性，同时又保持了MC-1610的农艺和化学特性。Wark(1977)应用花药培养的方法育成了烟草的双单倍体，它们不仅产量高，烤烟品质好，而且抗病性强，育种过程所用的时间比常规育种法短得多。Corduan(1974)用紫外线和X-射线照射天仙子花粉单倍体，获得了形态异常的植株，然而其中有些突变体具有较高的生物碱含量。利用烟草由雄核发育单倍体建立的单细胞培养物，Carlson(1973)选出了抗甲硫氨酸类似物甲硫氨酸磺肟(MSO)的突变系。由于MSO 在结构上和作用上与烟草野火病病原菌毒素相似，因此所选出的烟草植株不但抗MSO ，同时对烟草野火病的感病程度也较轻。在雌雄异株作物石刁柏中，栽培群体是通过雌株(XX)和雄株(XY)之间的传粉产生的。由于雄株幼茎纤维含量较低，生产上
要求栽培均匀一致的雄性群体。Thevenin(1974)通过雄株的花药培养获得了纯合的超雄株(YY)。这些超雄株(YY)与雌株(XX)授粉以后，全部后代都是雄株。
中国科学工作者利用花药培养已在烟草、小麦和水稻中育成和推广了若干新品种。在其他一些栽培植物如玉米和三叶橡胶的花药培养方面，中国学者的工作也处于领先的地位。
11花药和花粉培养的局限
虽然在很多物种中，利用花药培养大量生产单倍体已获得成功，但目前这种方法还不能在栽培植物的所有重要基因型中普遍应用。迄今为止，花药培养的成功主要局限于3个科的植物—茄科、禾本科和十字花科。非常明显，花药对离体培养的反应在很大程度上受基因型的影响。
在花药培养中，一般在一个花药的小孢子总数中，大约有5％能够进行雄核发育，但其中能长成完整孢子体的小孢子只占一个更小的比例。这对于获得植物育种家所感兴趣的各种可能的遗传分离类型来说，不能不是一个严重的限制因素。造成反应频率低的一个可能原因，是花粉粒之间对药室内的空间存在着激烈的竞争。如果在大多数物种中，培养离体小孢子或小孢子原生质体的技术都能获得成功，这个问题则可得到部分解决。
此外，通过未受精胚珠或子房培养诱导孤雌生殖，是生产单倍体的另一途径。但这个途径几乎被完全忽略了，在这个领域中还需要做进一步的工作。
复习思考题：
1、简述单倍体在遗传研究和植物育种中的意义和单倍体获得的途径。
2、简述离体小孢子发育途径。
3、简述花药培养的一般程序。
4、简述花粉分离与纯化的方法及花粉培养的方式。
5、影响雄核发育的因素有哪些？
6、试述单倍体植株的鉴定方法及其染色体加倍的方法。