细菌原生质体融合实验
一、 实验菌株
rs1、枯草杆菌（B.Subtilis）Ki-2-132 StrRif
枯草杆菌（B.Subtilis）ASL-1098 StrsRifr
二、 实验材料
1、器皿：三角瓶、离心管、试管、平皿、吸管、牙签、滤纸、玻璃棒等。
2、仪器：摇床、恒温箱、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计、显微镜等。
三、 试剂与培养基
1、HM液(1000mL)
配方：
NH4Cl 1g；Tris 12g；KCl 0.035g；NaCl 0.05g；NaSO4·10H2O 0.3g；MgCl·5H2O
4.26g；蔗糖 171g。
调节pH=7.5，另加以血清制剂。
2、HMD
每1mLHM液含DNase 10µg
3、CM
配方：
牛肉膏 0.5%；酵母膏0.5%；NaCl 0.5%；蛋白酶 1%；葡萄糖0.5%。 调节pH=7.2。
4、DM3
配方：
琥珀酸钠 90.05g；水解乳蛋白 5g；葡萄糖 5g；酵母膏 5g；MgCl2·H2O 4.66g；K2HPO4 3.5g;KH2PO4 1.5g
5、其他
0.85% NaCl；0.5M蔗糖液；40%PEG。
四、操作步骤
（一）原生质体制备
1、分别从活化的菌种斜面取2环，接于30mL/100mL的CM液中，摇床培养至OD570至0.86-0.9；
2、以0.2%的接种量转接于200mL/500mL的CM液中，37℃振荡培养5小时；
3、当OD570达到0.4时
①稀释、活菌计数
②5x10mL 3500rpm离心收集菌体，用HM数量悬浮并洗涤1-2次，弃上清。用10mLHM液将5管菌体悬浮液倒入盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，震荡10分钟，使菌体分散均匀。先吸取0.1mL做系列稀释，做酶解前计数。
4、无菌称量2.5mg，2.0mg溶菌酶加入三角瓶中，温和震荡35分钟，再置于42℃水浴锅中保温酶解20分钟；
5、用接种环取样以0.5M蔗糖液稀释涂片、美兰染色、镜检若干视野，计算原生质体的制备率。同时取0.5mL原生质体稀释置于4.5mL无菌 中，裂解20分钟后，系列稀释做裂解计数，计算原生质体制备率。
（二）原生质体再生
1、取酶解后的原生质体液5mL置于无菌离心管中，以3500rpm离心15min，收集原生质体，去掉酶液。
2、用少量DM3液悬浮，离心洗涤一次，最后用5mL DM3液再悬浮，做成原生质体悬液。
3、将上述原生质体悬液用DM3做系列稀释，取0.5mL样加入0.5mL枯草杆菌细胞壁的碎片制剂，加4mL DM3半固体，混匀后倾注于DM3底层平皿上再生。
4、37℃培养48-72小时后，计数再生平皿上长出的菌落，计算再生率。
再生率=[再生平皿上算得的总菌落数-活菌计数x（1-制备率）]/活菌总数x制备率
(三)原生质体融合与再生
1、取2环菌株的上述原生质体悬浮液各1mL，混合离心收集原生质体，悬浮于0.2mLHMD中；
2、加入1.8mL40%PEG（6000），置于4℃冷水1-2min；
3、立即加入3倍体积的HMD（6mL），轻轻摇匀，再按3500-4000rpm离心15min，弃上清。
4、以2mL DM3液悬浮，并做系列稀释。
5、同(二)分别用双层培养法，倾注于DM3平皿或同时含有两种抗菌药物的DM3底层平皿上。37℃正置培养48-72小时后分别计数再生的菌落。
（四）融合子的检出
将上述每新株原生质体，景荣和诱导剂处理后，在含两种抗菌药物（链霉素与利福平）的DM3在大平皿上长出的菌落绝大多数是融合子。
细菌原生质体融合实验
一、 实验菌株
rs1、枯草杆菌（B.Subtilis）Ki-2-132 StrRif
枯草杆菌（B.Subtilis）ASL-1098 StrsRifr
二、 实验材料
1、器皿：三角瓶、离心管、试管、平皿、吸管、牙签、滤纸、玻璃棒等。
2、仪器：摇床、恒温箱、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计、显微镜等。
三、 试剂与培养基
1、HM液(1000mL)
配方：
NH4Cl 1g；Tris 12g；KCl 0.035g；NaCl 0.05g；NaSO4·10H2O 0.3g；MgCl·5H2O
4.26g；蔗糖 171g。
调节pH=7.5，另加以血清制剂。
2、HMD
每1mLHM液含DNase 10µg
3、CM
配方：
牛肉膏 0.5%；酵母膏0.5%；NaCl 0.5%；蛋白酶 1%；葡萄糖0.5%。 调节pH=7.2。
4、DM3
配方：
琥珀酸钠 90.05g；水解乳蛋白 5g；葡萄糖 5g；酵母膏 5g；MgCl2·H2O 4.66g；K2HPO4 3.5g;KH2PO4 1.5g
5、其他
0.85% NaCl；0.5M蔗糖液；40%PEG。
四、操作步骤
（一）原生质体制备
1、分别从活化的菌种斜面取2环，接于30mL/100mL的CM液中，摇床培养至OD570至0.86-0.9；
2、以0.2%的接种量转接于200mL/500mL的CM液中，37℃振荡培养5小时；
3、当OD570达到0.4时
①稀释、活菌计数
②5x10mL 3500rpm离心收集菌体，用HM数量悬浮并洗涤1-2次，弃上清。用10mLHM液将5管菌体悬浮液倒入盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，震荡10分钟，使菌体分散均匀。先吸取0.1mL做系列稀释，做酶解前计数。
4、无菌称量2.5mg，2.0mg溶菌酶加入三角瓶中，温和震荡35分钟，再置于42℃水浴锅中保温酶解20分钟；
5、用接种环取样以0.5M蔗糖液稀释涂片、美兰染色、镜检若干视野，计算原生质体的制备率。同时取0.5mL原生质体稀释置于4.5mL无菌 中，裂解20分钟后，系列稀释做裂解计数，计算原生质体制备率。
（二）原生质体再生
1、取酶解后的原生质体液5mL置于无菌离心管中，以3500rpm离心15min，收集原生质体，去掉酶液。
2、用少量DM3液悬浮，离心洗涤一次，最后用5mL DM3液再悬浮，做成原生质体悬液。
3、将上述原生质体悬液用DM3做系列稀释，取0.5mL样加入0.5mL枯草杆菌细胞壁的碎片制剂，加4mL DM3半固体，混匀后倾注于DM3底层平皿上再生。
4、37℃培养48-72小时后，计数再生平皿上长出的菌落，计算再生率。
再生率=[再生平皿上算得的总菌落数-活菌计数x（1-制备率）]/活菌总数x制备率
(三)原生质体融合与再生
1、取2环菌株的上述原生质体悬浮液各1mL，混合离心收集原生质体，悬浮于0.2mLHMD中；
2、加入1.8mL40%PEG（6000），置于4℃冷水1-2min；
3、立即加入3倍体积的HMD（6mL），轻轻摇匀，再按3500-4000rpm离心15min，弃上清。
4、以2mL DM3液悬浮，并做系列稀释。
5、同(二)分别用双层培养法，倾注于DM3平皿或同时含有两种抗菌药物的DM3底层平皿上。37℃正置培养48-72小时后分别计数再生的菌落。
（四）融合子的检出
将上述每新株原生质体，景荣和诱导剂处理后，在含两种抗菌药物（链霉素与利福平）的DM3在大平皿上长出的菌落绝大多数是融合子。