聚苯胺-普鲁士蓝

52 纳米复合材料的制备及其在生物传感器和生物燃料电池中的应用

第三章基于PANI-PB/MWNTs纳米复合材料的葡萄糖生物传感器的

研究

葡萄糖酶生物传感器已广泛用于食品工业中进行质量检验以及在临床中检测糖尿病。在所有的酶生物传感器中，大约85%是研究葡萄糖生物传感器的[1-4]。极大部分葡萄糖生物传感器是通过检测酶反应产物H 2O 2来间接检测葡萄糖，对于葡萄糖的检测主要基于以下反应。

GOD(FAD) + D-glucose → GOD(FADH2)+gluconolactone （3-1） GOD (FADH 2) + O2 → GOD (FAD ) + H2O 2 （3-2）由反应可知过氧化氢氧化所产生的电流信号与葡萄糖含量成线性关系。在检测过氧化氢时，较高的检测电位使传感器易受生理溶液中电活性干扰物（如抗坏血酸，尿酸等）的影响。普鲁士蓝（PB ）作为生物电分析化学中常用的电子媒介体，可以在低电位下催化还原H 2O 2，而且具有价格便宜，容易制备等特点[5-7]。如前章所述，普鲁士蓝有致命的弱点就是在中性及碱性条件下不稳定，从而导致所制备的酶生物传感器的性能也不稳定[8]，因此提高普鲁士蓝在电极上的稳定性，是制备高稳定性酶生物传感器的前提。

PB 通常是通过电化学还原FeCl 3-Fe(CN)6溶液而制备的，在本章中，首次采用一步原位化学还原的方法制备了聚苯胺-普鲁士蓝（PANI-PB ）复合材料，然后将多壁碳纳米管分散在这种纳米颗粒的溶液中，最终得到 PANI-PB/MWNTs复合材料，该复合材料表现良好的稳定性和电催化活性，用该材料制备的生物传感器也表现出良好的稳定性。

第一节实验药品、仪器及方法

3.1.1 实验药品及仪器

第三章基于PANI-PB/MWNTs 纳米复合材料的葡萄糖生物传感器的研究 53 葡萄糖氧化酶(GOD,来源于Aspergillus niger; EC 1.1.3.4, type Ⅶ-S; 300,000 unit g-1) 购自Sanland 公司。多壁碳纳米管（MWNTs ，95%， 20-60 nm）购于深圳纳米港有限公司，前处理方法同第二章。苯胺购于沈阳市联邦化学试剂厂，使用前减压蒸馏。D-葡萄糖（D-glucose ）用去离子水配制，并在4 °C 的冰箱里放置24小时后使用。0.1 M 磷酸缓冲溶液(PBS)用Na 2HPO 4和NaH 2PO 4配制，支持电解质为0.1 M PBS + 0.1 M KCl （pH 6.5），实验过程中使用的其他试剂均为分析纯，用去离子水配制。电化学测试是在电化学工作站（IM6e ，Germany ）上进行的，采用三电极体系，玻碳电极(GC)为工作电极，NaCl 饱和的Ag/AgCl电极参比电极，铂丝电极为对电极。旋转圆盘电极（BAS, America）在检测葡萄糖和过氧化氢时的转速为3000 rpm，所有的实验均在室温下进行。

透射电镜照片(TEM)是由透射电镜（JEM-2000EX ，JEOL Co. Ltd, Japan)得到的。红外光谱的采集是在德国BRUKER 公司生产的Equinox 55型红外分光光度计上进行的。测试方法：采用KBr 压片法，取适量待测物的粉末与KBr 晶体在研钵中混合并研磨成极细的粉末，然后压片，扫描范围为4000 cm -1-400 cm-1。

3.1.2 PANI-PB复合材料的制备

聚苯胺/普鲁士蓝（PANI-PB ）复合材料的制备过程如下：配制0.1 M苯胺 + 0.1 M HCl 溶液50 mL，向该溶液中缓慢的加入0.002 M FeCl3 + 0.002 M K 3Fe(CN)6 + 0.1 M HCl溶液20 mL，边加边搅拌，彻底加完后，室温下再搅拌12 h，当加入后者溶液之后，溶液迅速变成蓝色。所得到的复合材料经离心、0.1 M HCl 洗涤、过滤，在50 °C 下真空干燥12 h。作为对比，也制备了聚苯胺，具体的制备方法如下：向 50 mL 0.1 M苯胺 + 0.1M HCl 的溶液加入一定浓度的FeCl 3溶液，后处理方法同上。参照文献[9]聚苯胺/普鲁士蓝

54 纳米复合材料的制备及其在生物传感器和生物燃料电池中的应用（PANI-PB ）复合材料可能的反应机理如下。

图3-1 PANI-PB 复合材料可能的反应机理

Fig. 3-1 Schematic diagram of the formation of PB in the PANI matrix: A FeCl 4-doped PANI; B, PANI/PB hybrid material

3.1.3 修饰电极的制备

玻碳电极依次在1.0、0.3 μm 的α-Al 2O 3上打磨至镜面光亮，然后依次在1：1（V/V）的HNO 3、无水乙醇、去离子水中各超声15 min，再在红外灯下烤干备用。取处理过的碳纳米管2 mg 分散在5 mL 的N,N-二甲基甲酰胺（DMF ）溶液中，超声1 h，得到0.4 mg mL-1 的悬浮液，取5 mg PANI-PB复合材料超声分散到上述悬浮液中，得到PANI-PB/MWNTs 纳米复合材料，取该纳米复合材料的悬浮液10 μL滴在玻碳电极的表面，在红外灯下烤干，然后用pH 5.0的HCl 溶液洗涤，再在0.1 M KCl + 0. 01 M HCl作循环伏安扫描，电势范围为-0.10-0.50 V ，扫描速度为50 mV/s，直到得到稳定的CV 曲线为止。

取10 mg GOD溶入pH 7 的2 mL 0.1 M PBS的溶液中得到5 mg mL-1 的GOD 溶液，取此溶液3 μL滴在PANI-PB/MWNTs/GC 修饰电极上。然后将该修饰电极放置在4 ℃的冰箱中60 min，再在电极上滴上2 μL Nafion 混合液。

第三章基于PANI-PB/MWNTs 纳米复合材料的葡萄糖生物传感器的研究 55 Nafion 混合液的具体制备方法如下：取2 ml 2.5% 的戊二醛和3 ml Nafion (5% v/v in ethanol)混合，然后用NaOH 调节该溶液的pH 到5.5。这样一个三明治式的酶生物传感器就制备好了，将制备好的电极置入4 °C 的冰箱备用。电极的结构示意图如图3-2所示。

图3-2 电极的结构示意图

Fig. 3-2 Sandwich configuration of the biosensor

第二节结果及讨论

3.2.1 PANI-PB纳米复合材料的制备

PB 通常采用电沉积的方法制备，本章采用原位化学还原的方法制备了PANI-PB 纳米复合材料。Itaya 等人发现酸性的FeCl 3-K 3[Fe(CN) 6]溶液具有很强的氧化性[10]，其开路电位相对于饱和甘汞电极（SCE ）可以达到0.98 V，这一电位不能在 FeCl 3或K 3[Fe(CN) 6]的溶液中单独获得。另一方面苯胺可以在很多氧化剂的作用下发生聚合反应，如NH 4) 2S 2O 8、H 2O 2, 、Ce(SO4) 2、K 2Cr 2O 7, 、KIO 3、FeCl 3等。尽管FeCl 3相对于标准氢电极（SHE ）只有0.77 V，

56 纳米复合材料的制备及其在生物传感器和生物燃料电池中的应用

也常被用作为苯胺聚合的氧化剂[11]。即苯胺完全可以在酸性的FeCl 3-K 3[Fe(CN) 6]中发生氧化聚合反应，同时FeCl 3-K 3[Fe(CN) 6]也被苯胺还原成PB 。因此在溶液中实现了PANI 和PB 的同时合成，这种合成方法是文献尚未报道的。而且可以利用聚苯胺对PB 的保护作用，提高PB 在电极上的稳定性，聚苯胺有良好的导电性，可以改善复合材料的导电性能。

3.2.2 复合材料的表征

图3-3为PANI-PB 纳米复合材料和PANI 的红外光谱图。从图3-3可以看出，PANI-PB 的红外光谱在2086 cm-1处有强烈的吸收，这是CN 在Fe 2+-CN- Fe 3+ 中伸缩振动的特征吸收峰[12]。同时，PANI-PB 的红外光谱在1511, 1295， 1112 cm-1处也出现吸收峰，这分别是聚苯胺翠绿亚胺盐中的环、C-N 以及C-H 的吸收[13]，这和文献上报道的结果是一致的。以上结果表明可以通过化学原位聚合的方法直接在溶液中合成出PANI-PB 复合材料。

T r a n s m i t t a n c e

-1Wavenumber (cm)

图3-3 PANI-PB复合材料和PANI 的红外光谱图

Fig. 3-3 IR spectra of PANI-PB and PANI alone

第三章基于PANI-PB/MWNTs 纳米复合材料的葡萄糖生物传感器的研究 57 图3-4为PANI-PB 复合材料的透射电镜图。从图3-4可以看出，普鲁士蓝分散在聚苯胺膜里，其中颜色较深的为PB 纳米粒子，直径大约为100 nm，大的粒子的直径大约200 nm。这些结果说明可以直接采用原位化学还原的方法制备PANI-PB 纳米粒子。

图3-4. 1PANI-PB复合材料的透射电镜照片

Fig. 3-4 TEM image of the PANI-PB hybrid composites

3.2.3 复合材料的电化学性质

为了研究PANI-PB/MWMTs 有机无机复合材料的电化学性质，将其修饰在玻碳电极上测试了其在0.1 M PBS +0.1 M KCl溶液中的CV 曲线。图3-5为PANI-PB/MWNTs修饰电极在不同pH 溶液中的CV 曲线，扫描速度为50 mV/s。可以看出，修饰电极在0.2 V 左右出现一对可逆的氧化还原峰，这是典型的PB 的氧化还原峰。而且随着pH 的升高，CV

曲线的峰电流并没有发

58 纳米复合材料的制备及其在生物传感器和生物燃料电池中的应用

生太大的变化。这说明复合材料对pH 有很高的稳定性，但是其峰电位之差却逐渐增大，这可能是由于pH 升高，聚苯胺的导电性下降引起的[14]。PANI-PB/WMNTs修饰电极在0.1 M PBS +0.1 M KCl (pH 6.5)连续扫描50个循环，CV 曲线的峰电流几乎没有变化，扫描200个循环，峰电流只降低8%。这说明PB 在PANI-PB/WMNTs复合材料中表现良好的稳定性。好的稳定性可能归因于电极的制备方法。一方面聚苯胺有很好的化学稳定性和良好的导电性，可以保护PB 纳米粒子，而且具有很强的信号转换能力[15]，可以有效地实现电子的转移，另一方面，碳纳米管有很高的比表面积，和PB 之间有协同效应，从而进一步保护了PB 粒子[16]。

10050

C u r r e n t / A 0

-50

-100

-150

Potential / V

图3-5支持电解质的pH 对PANI-PB/WMNTs复合材料修饰电极的CV 曲线的影响 (a) pH 5; (b) pH 6; (c) pH 7 (d) pH 8

Fig. 3-5 Effect of the pH value on the CV curves of PANI-PB/WMNTs modified electrodes, (a) pH 5; (b) pH 6; (c) pH 7 (d) pH 8

Time / s

图3-6 PANI-PB/MWNTs 修饰电极检测H 2O 2的时间电流曲线

Fig. 3-6 Typical current-time curves obtained at the PANI-PB/MWNTs modified electrode

纳米复合材料的制备及其在生物传感器和生物燃料电池中的应用

Concentration (μM)

图3-7 PANI-PB/MWNTs修饰电极对H 2O 2响应的工作曲线

Fig. 3-7 Calibration curve for H 2O 2 detection obtained from the PANI-PB/MWNTs modified electrode

在优化实验条件下，我们研究了PANI-PB/MWNTs 修饰电极对H 2O 2检测的响应时间、检测限、线性范围和灵敏度。图3-6为PANI-PB/MWNTs 修饰电极检测H 2O 2的时间电流曲线，图3-7为修饰电极对H 2O 2响应的工作曲线。所有的试验均在0.1 M PBS+0.1 M KCl (pH 6.5) 0.0 V进行，旋转圆盘电极的转速为3000 rpm 。H 2O 2检测的线性范围为1×10-8 -1×10-5 M ，相关系数为0.997。检测限为1×10-8 M ，当电流达到稳态电流的90%时，响应时间为15 s，电极的灵敏度为508.18 μA mM -1 cm -2。

同一只电极对1×10-7 M H2O 2连续测定5次，相对标准偏差为2.6%. 连续制备5支电极，其对1×10-7 M H 2O 2响应的相对标准偏差为5.0%。这说明PANI-PB/MWNTs不仅表现出良好的电催化活性，还表现出良好的稳定性。PANI-PB/MWNTs纳米复合材料修饰电极对H 2O 2有良好的响应，可以用来制

第三章基于PANI-PB/MWNTs 纳米复合材料的葡萄糖生物传感器的研究 61 备氧化性酶的生物传感器。

3.2.5 生物传感器性能的优化

3.2.5.1 GOD的修饰量对葡萄糖响应的影响

图3-8为葡萄糖氧化酶的浓度对酶电极的电流响应的影响，在0.1 M PBS+0.1 M KCl (pH 6.5) 0.0 V、转速为3000 rpm的条件下，所制备的酶生物传感器对葡萄糖的响应信号，该信号随着酶的修饰量的增加而增加，当GOD 的修饰量超过5 mg mL-1 时，响应信号不再增加，而且线性范围变得狭窄。这与文献的报道是一致的[17]。

C u r r e n t / μA-1C GOD / mg mL

图3-8 葡萄糖氧化酶的浓度对酶电极的电流响应的影响

Fig. 3-8 Effect of the GOD concentration on the response current of the biosensor

因为氧化型酶生物传感器的反应要有O 2的参入，因此O 2的浓度制约着

62 纳米复合材料的制备及其在生物传感器和生物燃料电池中的应用

传感器响应。当葡萄糖的浓度增加时，氧气受到扩散速度的控制，不能很快地扩散到电极表面，随着酶的载量的增加，进一步加剧了这种现象，而且太多的酶负载到电极上，使得酶很容易从电极上流失，从而使电极的稳定性变差。综合灵敏度和线性范围两者的考虑，本文选择酶的负载量的浓度为5 mg mL -1。

3.2.5.2 应用电位对酶生物传感器的影响

应用电位对酶生物传感器的也有很大的影响。应用电位过高，电极容易引起干扰，应用电位过低，O 2 也会在电极上发生还原。从图3-9中可以看出，当应用电位在-150到50 mV变化时，电流逐渐降低，但降低的不是太多。当电位高于50 mV时，电流下降的很多。考虑到灵敏度、干扰物种以及操作稳定性等因素，本章电极的应用电位选为0.0 V。

C u r r e n t / μAPotential / mV

图3-9 应用电位对葡萄糖响应信号的影响

Fig. 3-9 Effect of applied potential on the response current

第三章基于PANI-PB/MWNTs 纳米复合材料的葡萄糖生物传感器的研究 63

3.2.5.3 pH对酶生物传感器响应的影响

pH 对酶的活性及电极的稳定性都有很大的影响。从图3-10可以看出，随着pH 的升高，响应电流也逐渐增加。当pH 超过6.5时，响应电流开始下

。

8.0

7.6

C u r r e n t / A 7.26.8

6.4

6.0

图3-10 pH 对葡萄糖响应信号的影响

Fig. 3-10 Effect of pH on the current response of the biosensor

3.2.5.4 旋转圆盘电极的转速对酶生物传感器响应的影响

旋转圆盘电极的转速对葡萄糖的灵敏度也有重要的影响。微电极虽然可以将低扩散极化，但是其响应电极太小，从而导致检测的灵敏度很低。本文采用旋转圆盘电极来研究修饰电极对葡萄糖灵敏度的影响。从图3-11可以看出，当转速逐渐增加的时候，电极的响应也逐渐增加。但当转速到3000 rpm 时电极的响应不再增加，开始受动力学控制。因此本文在检测葡萄糖时，转速选为3000 rpm。

纳米复合材料的制备及其在生物传感器和生物燃料电池中的应用 8.0

7.8

C u r r e n t / μA7.67.4

7.2

7.0

Rotating rate / rpm

图3-11旋转圆盘电极转速对葡萄糖响应信号的影响

Fig. 3-11 Effect of rotating rate on the current response of the biosensor (The inset is ω-1/2 vs. iL -1. )

3.2.6 基于PANI-PB/MWNTs 纳米复合材料的生物传感器的研究

PANI-PB/MWNTs薄膜修饰电极对过氧化氢的良好响应，使得其很适合制备基于氧化酶的生物传感器。本章选用葡萄糖氧化酶为模型酶来研究生物传感的性能。酶的固定化是通过Nafion 和戊二醛来实现的，通过戊二醛中的自由醛基与酶中的氨基生成席夫碱的反应完成的。图3-12为在0.0 V 时，PANI-PB/MWNTs薄膜修饰的生物传感器在连续加入1 mM 的葡萄糖时的时间电流曲线，插图是工作曲线。修饰电极的响应电流达到稳态的95%时所需要的时间少于15 s ，这说明所制备的生物传感器的响应速度很快。酶电极的线形范围为1-11 mM，相关系数为0.999，电极还表现出很高的灵敏度（249.5

第三章基于PANI-PB/MWNTs 纳米复合材料的葡萄糖生物传感器的研究 65 μA mM-1cm -2 和很低的检测限（0.01 mM）。当葡萄糖的浓度增加到一定的程度后，出现了一个平台。这是明显的Michaelis –Menten 动力学特征。根据Michaelis –Menten 方程，可以计算米氏常数和最大电流密度[18]

1k m 11=⨯() + （3-3） i s i max C g i max

其中i s 为稳态电流，C g 为葡萄糖的浓度，k m 为米氏常数，i max 为最大电流密度。根据图3-12 的数据计算得到该酶电极的米氏常数为5.1×10−3 M ，这比文献报道的22 ± 2 mM [19，20]，及在溶液相中的33 mM要低得多[21]，

这说明

C u r r e n t / μATime / s

图3-12 葡萄糖检测的时间电流曲线，每次加入1 mM 葡萄糖

Fig. 3-12 Current-time curves obtained at the glucose biosensor for successice addition of 1 mM glucose. Inset: calibration curve of the biosensor as a function of glucose concentrations

这可能是由于两方面的原因，一方面，酶电极的固定方法为保持酶的活

66 纳米复合材料的制备及其在生物传感器和生物燃料电池中的应用

性提供了一个良好的微环境，另一方面MWNTs, PANI 和 PB 之间的协调效应优化了电极的性能。将MWNTs 分散到PANI-PB 溶液中，可得到新的PANI-PB/MWNTs体系利用了MWNTs 和PB 之间的协同作用，即由于MWNTs 优良的电子转移能力而使PB 的氧化还原能力得以显著增强。这个体系为基于氧化酶的电化学传感器的发展提供了新的平台，在这个体系中，PANI-PB/MWNTs在0.0 V 对过氧化氢有优良的响应。而Nafion 膜则为酶的固定化提供了一种具有生物相容性以及化学可饰性的方法。尤其是MWNTs 的介入使得该系统对H 2O 2的敏感度显著提高，PANI-PB/MWNTs体系能用于多种氧化酶的固定，制备不同的生物传感器。

3.2.7 生物传感器的稳定性及干扰试验

所制备的生物传感器还表现出良好的稳定性。用一支生物传感器对 1 mM 葡萄糖连续 5 次测定，得到的相对标准偏差为 2 %，这表明这种传感器有良好的重现性。同样对生物传感器的重复性也进行了检测，将用同一批 PANI-PB/MWNTs复合材料制备的5个生物传感器用于1 mM 葡萄糖的检测，其相对标准偏差RSD 为5.2%，同样证明了这种方法的可靠性。

生理样品中抗坏血酸、对乙酰氨基酚、L-半胱氨酸通常对葡萄糖的精确测定产生干扰。当向1 mM 的葡萄糖溶液中加入0.2 mM 的抗坏血酸、乙酰氨基酚和L-半胱氨酸时，电极几乎不产生明显的干扰，这说明所制备的修饰电极表现出良好的选择性。一方面电极是在较低的电位下（0.0V ）实现的葡萄糖的检测，另一方面，Nafion 膜可以有效地阻止这些阴离子的干扰。本章还对 PANI-PB/MWNTs修饰的生物传感器的贮存稳定性进行了研究，当电极不用时，放于 4 °C 磷酸盐缓冲液中，一个月后，其响应值减小到起始值的 90%，这说明该修饰电极有良好的贮存稳定性。

第三章基于PANI-PB/MWNTs 纳米复合材料的葡萄糖生物传感器的研究

C u r r e n t

Time

图3-13生物传感器的干扰实验测试，A) 1.0 mM葡萄糖, ；(B) 0.2 mM 抗坏血酸；(C) 0.2 mM L-半胱氨酸；(D) 0.2 mM对乙酰氨基酚

Fig. 3-13 Current–time recording at the biosensor for an addition of (A) 1.0 mM glucose, followed by addition of (B) 0.2 mM ascorbic acid, (C) 0.2 mM L- cysteine and (D) 0.2 mM acetaminophen respectively

本章小结

1. 本文采用一步原位聚合的方法首次同时合成了PANI-PB 纳米粒子，当掺入MWNTs 后，进一步优化了复合材料的结构。PANI-PB/MWNTs复合材料在PBS 溶液中表现出良好的稳定性，对H 2O 2有良好的电催化活性。

2. 用PANI-PB/MWNTs复合材料制备的酶生物传感器的实验条件进行了优化。所制备的酶生物传感器对葡萄糖表现出较宽的线性范围（1-11 mM）、较低的检测限（0.01 mM），生理液中的电活性物质对酶电极几乎不产生干扰，这个体系为基于氧化酶的电化学传感器的发展提供了新的平台。

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