流式细胞术实验报告
姓名：刘洪悦 院系：肿瘤医院 学号：[1**********]
实验目的：
学习流式细胞学的基本原理方法，掌握基本操作流程。
实验原理：
流式细胞学技术的基本原理为：悬浮在液体中的分散细胞单个地依次通过测量区时产生电信号(分别代表荧光，散射光，关吸收或细胞光阻抗），从而可快速的对大量细胞进行多参数的测定（如细胞大小，细胞粒度，细胞表面积，核质比例，DNA含量与细胞周期，RNA含量，蛋白质含量，细胞活性，胞内细胞因子，酶活性等）和分析，并可从整个群体中分选出特定的细胞亚群。 实验仪器与材料：
流式细胞仪、细胞悬液
实验方法：
1、实体组织(Solid tissues)单分散细胞的制备：
a. 酶消化法：
蛋白酶：释放组织中的细胞.
胰酶：水解脂键和肽键（碱性氨基酸羰基形成的肽键）。
胶原酶：降解胶原蛋白为分子量低、可溶性肽的蛋 白水解酶。
b. 机械法：
剪碎法：将组织剪碎至匀浆状，过滤 (100目)、 离心
(1000/700rpm,5min)；再过滤。
网搓法：在100、300目的尼龙网上轻搓组织块，离心(700rpm)。 研磨法：组织剪碎至小块置研磨器中，加2mlSN用研棒研至匀浆，SN冲洗过滤(300目)、离心(700rpm,2min)。
2、①新鲜或冰冻实体组织标本
标本含去污剂PBS漂洗组织剪碎，吸出上清液待用消化（含200/ml胶原酶） 37℃孵育30min，并在磁力搅拌器上搅拌组织在不锈钢网上轻轻研磨用200目筛网过滤两次，细胞液与上吸出的待用上清液合并。
②石蜡包埋标本：
切片至少50m厚脱蜡水化 80%甲酸（内含3%H2O2）在-18度处理30 min 消化(pepsin或protease)终止后过滤(200目)离心(1500rpm，700rpm)重悬。
3、①直接染色法：
106个细胞加入荧光标记的抗体15~30min后洗涤两次（冷PBS、350g、5分钟）加入适量缓冲液或固定液待测。 ②间接染色法：
106个细胞加入特异的第一抗体，4℃或冰浴放置30~60min洗涤两次加入荧光标记的二抗 以下同上
实验结果：
流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。
实验讨论：
流式细胞学主要应用：
细胞DNA含量检测、肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究、淋巴细胞分类、白血病的免疫分型、细胞内蛋白的分析、细胞内钙离子测定
流式细胞术实验报告
姓名：刘洪悦 院系：肿瘤医院 学号：[1**********]
实验目的：
学习流式细胞学的基本原理方法，掌握基本操作流程。
实验原理：
流式细胞学技术的基本原理为：悬浮在液体中的分散细胞单个地依次通过测量区时产生电信号(分别代表荧光，散射光，关吸收或细胞光阻抗），从而可快速的对大量细胞进行多参数的测定（如细胞大小，细胞粒度，细胞表面积，核质比例，DNA含量与细胞周期，RNA含量，蛋白质含量，细胞活性，胞内细胞因子，酶活性等）和分析，并可从整个群体中分选出特定的细胞亚群。 实验仪器与材料：
流式细胞仪、细胞悬液
实验方法：
1、实体组织(Solid tissues)单分散细胞的制备：
a. 酶消化法：
蛋白酶：释放组织中的细胞.
胰酶：水解脂键和肽键（碱性氨基酸羰基形成的肽键）。
胶原酶：降解胶原蛋白为分子量低、可溶性肽的蛋 白水解酶。
b. 机械法：
剪碎法：将组织剪碎至匀浆状，过滤 (100目)、 离心
(1000/700rpm,5min)；再过滤。
网搓法：在100、300目的尼龙网上轻搓组织块，离心(700rpm)。 研磨法：组织剪碎至小块置研磨器中，加2mlSN用研棒研至匀浆，SN冲洗过滤(300目)、离心(700rpm,2min)。
2、①新鲜或冰冻实体组织标本
标本含去污剂PBS漂洗组织剪碎，吸出上清液待用消化（含200/ml胶原酶） 37℃孵育30min，并在磁力搅拌器上搅拌组织在不锈钢网上轻轻研磨用200目筛网过滤两次，细胞液与上吸出的待用上清液合并。
②石蜡包埋标本：
切片至少50m厚脱蜡水化 80%甲酸（内含3%H2O2）在-18度处理30 min 消化(pepsin或protease)终止后过滤(200目)离心(1500rpm，700rpm)重悬。
3、①直接染色法：
106个细胞加入荧光标记的抗体15~30min后洗涤两次（冷PBS、350g、5分钟）加入适量缓冲液或固定液待测。 ②间接染色法：
106个细胞加入特异的第一抗体，4℃或冰浴放置30~60min洗涤两次加入荧光标记的二抗 以下同上
实验结果：
流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。
实验讨论：
流式细胞学主要应用：
细胞DNA含量检测、肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究、淋巴细胞分类、白血病的免疫分型、细胞内蛋白的分析、细胞内钙离子测定