豆类植物蛋白酶抑制剂研究进展

314 大豆科学 3期

豆类植物蛋白酶抑制剂研究进展

张莉汪东风张宾孙丽平

(中国海洋大学食品科学与工程学院, 青岛266003)

摘要对国内外豆类丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的结构、理化性质和生理功能进行了阐述, 探讨了在抗虫植物基因工程和临床上的应用。

关键词豆类植物; 丝氨酸蛋白酶抑制剂; 半胱氨酸蛋白酶抑制剂

中图分类号 S 56511 文献标识码 A 文章编号 1000-9841(2006) 03-0314-06 蛋白酶抑制剂(pr otease inhibitor , PI) 广泛存在于动植物和微生物体内, 与机体内相应的蛋白水解酶形成动态平衡, 调节许多重要的生命活动。PI 是一类分子量较小的多肽或蛋白质, 它们能与蛋白酶活性部位或变构部位结合抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶, 在调节蛋白酶活性和蛋白质代谢等方面起着重要的作用。根据其作用的酶活性部位的不同, PI 分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(巯基蛋白酶抑制剂) 、金属羧肽酶蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。目前已发现的植物来源的PI 主要属于前3种类型。在植物的贮藏器官, 特别在种子和球茎中, 其含量常常高达总蛋白的1%~10%。植物叶片受到机械损伤或经化学处理, 也会积累大量PI 。迄今为止, 已发现含有PI 的植物有90多种且在豆科、茄科、葫芦科、禾本科及十字花科等草本植物中存在较多, 而在木本植物中较少, 仅在苹果等蔷薇科植物和欧洲白杨等杨柳科植物中发现[1]。

豆类植物属于被子植物双子叶植物纲(Dicoty -ledoneae) 豆目(Fabales) 蝶形花科(Fabaceae ) , 约12000种, 分布于全世界。豆类在我国居民膳食中占有十分重要的地位, 因此针对豆类植物蛋白酶抑制剂的研究在营养学和医学等领域都有着深远的意义。目前, 有关植物PI 的报道很多, 但是关于各种豆类植物PI 的研究综述还未见报道。本文主要就豆类植物丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的种类、分布、及其在生产和生活中的应用进行论述。

1 豆类植物中的丝氨酸蛋白酶抑制剂

1. 1 大豆

大豆[Gly cine m ax (L. ) Merr. ], 原产我国, 主产东北, 是重要的油料作物。大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean tr ypsin inhibitor , SBT I) 属于丝氨酸蛋白酶抑制剂, 是一种多肽, 组成氨基酸残基在72~197个左右。SBT I 约有7~10种[2], 据氨基酸组成、分子量、等电点、与不同蛋白酶的结合力以及免疫学的反应性等特点, 可将其分为两大类:¹Kunitz 胰蛋白酶抑制剂(Kunitz trypsin inhibitor, KT I) , 分子量20~25kDa, 呈易变的非螺旋形, 对热不稳定, 含有二对二硫键, 特异抑制胰蛋白酶。一个抑制剂分子可以结合一分子的胰蛋白酶, 属单头抑制剂。大豆中含量约为1. 4%; ºBow man -Birk 胰蛋白酶抑制剂(Brow m an -Birk trypsin inhibitor, BBT I) , 分子量6~10kDa, 含有较多二硫键, 具有热稳定性, BBT I 对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及弹性蛋白酶三种蛋白酶发生特异抑制。一个抑制剂分子可以结合二个分子的胰蛋白酶, 是一个双头抑制剂, 大豆中仅

[3]

含0. 6%。

Kunitz 于1945年首先从大豆种子中分离KT I (SBTI-A2, 并得到纯化结晶, 其分子量大约为20. 1kDa [4]。该种抑制剂结构为直径3~5nm 球体, 由12个反平行B 带十字交叉构成, 其疏水性侧链起到主要稳定作用, 具有特殊热稳定性和化学稳定性。Roychaudhuri 等测定KTI 热变性和复性, 发现热变性后一旦冷却很容易恢复到天然状态, 这为进一步研究无序B -折叠蛋白的展开提供有用的理论依

收稿日期:2006-03-22

基金项目:山东省自然科学基金重点项目(Z2004D05)

作者简介:张莉(1979-) , 女, 博士, 研究方向生物化学。E-m ail:qdz han g li@ou c. edu 1cn :E-w ouc. 1

3期张莉等:豆类植物蛋白酶抑制剂研究进展315

据[5]。SBT I-A2具有电泳变异类型, 电泳后出现Rf 值分别为0. 79、0. 75、0. 83的三个互为显性的等位基因Ti 、T i 、Ti 。由这3个显性等位基因编码的相应蛋白为T i a , T i b , T i c , 聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移率相对大小为T i c >Ti a >T i b , 抑制剂的活力为Ti T T i >Ti , 其中Ti 在自然界中普遍存在, 而Ti b 和T i c 较少见到。忻骅于1991年从国内15000余份大豆资源中发现了T i d , 与Ti a 仅有一个氨基酸的差别

[6]

蛇、猴等的胰蛋白酶均可被BBT I 抑制, 抑制率达90%~100%

[14]

。从未加热的大豆蛋白纯品或生大

豆粉中提取的BBT I 对人类胰蛋白酶的抑制程度比加热后要稍强一些[15]。Sessa 和Wolf 发现大豆种皮可作为BBTI 的一种新的廉价原料, 从而可用来作为具有较大开发前景的抗癌药物1. 2 菜豆

[16]

。

菜豆(Phaseolus v ulgaris L. ) 是全世界普遍栽培的豆类作物之一。Pusztai 在1966年就报道了从菜豆(P. vulgaris , var . haricot) 中得到一种胰蛋白酶抑制剂, 随后人们又从另一种菜豆(var . r ed bean) 中得到一种完全不同的胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂。Wu 等人从红色菜豆(Phaseolus v ulgaris var . Linden) 中分离纯化了四种胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂[19]。氨基酸分析表明均含有丰富的Cys, Ser, Asp 和Pr o, 但Gly, Ala 及芳香氨基酸含量却很低。四种抑制剂的分子量相同, 并且基本以二聚体的形式存在, 等电点介于4. 46~5. 09。抑制剂R(A) , R(B2) 和R(C) 可以结合一分子胰蛋白酶和一分子胰凝乳蛋白酶, R(B1) 只结合一分子胰蛋白酶。Gibbs 从白色菜豆(Phaseolus v ulgaris ) 中得到四种抑制A -淀粉酶活性的成分[20]。进一步研究抑制活性最高的成分, 发现是N -末端糖基化的糖蛋白, 去糖基化后的分子量大约是55kDa, 且不改变与酶的结合常数, 说明糖基不参与结合。C-末端残基是Ser -Ala-Tyr 。血浆蛋白酶, 噬热菌蛋白酶或链霉蛋白酶可以水解该抑制剂, 胃蛋白酶对其没有作用。抑制剂的活性离不开Cl -, Ca 2+可以使结合的最初速率加快。Mg 2+和SO 42-对其抑制活性没有影响, 在pH 6. 9时达到最大抑制效果。Osman 等比较了宽叶菜豆(Phaseolus acutif olius ) 蛋白酶抑制剂(T BPI) 与大豆胰蛋白酶抑制剂(KTI) 、大豆胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂(BBT I) 以及利马豆胰蛋白酶抑制剂(LBTI) 在不同条件下的热稳定性。TBPI, BBT I 和LBTI 在中性和酸性条件下加热到100e 或在中性条件下高压处理仍具有热稳定性, 在中性条件下, 宽叶菜豆粗提物和KTI 对加热和高压敏感。在碱性条件下, 所有纯化的PI 对热敏感, 加热到100e 时迅速失去对胰蛋白酶的抑制活性。实验表明, T BPI 与Bow man-Birk 家族相似, 具有热稳定性, 在碱性条件下加热迅速失活。

Campos 等通过H PLC 阴离子交换柱从宽叶菜() [21]

[17, 18]

。李严等从我国2种多年生野生大豆多毛

豆(G. tomentella) 和胭豆(G. tabacina ) 种子蛋白中发现SBTi 蛋白酶的同工抑制剂现象[7]。这些SBT i-A2蛋白的一级结构也已被先后阐明。它们均含181个氨基酸残基, 都在相同位置含有两个二硫键(Cys39-Cys86, Cys138-Cys145) , 活性位点为Ar g63-Ile64, 在组成上稍有差异, 一个抑制剂分子能钝化一分子胰蛋白酶[8]。

Birk 在继Bow m an1944年发现BBTI 后于1961年纯化了BBTI [9]。Odani 和Ikenaka 于1973年测定出BBTI 的全部氨基酸序列, BBT I 是由71个氨基酸组成的单肽链, 含有7个二硫键, 分子量大约是8kDa 。它具有两个反应中心, 一个在Ly s16-Ser 17, 可以和胰蛋白酶结合; 另一个在Leu43-Ser44, 可与胰凝乳蛋白酶结合, 所以BBTI 可形成与胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶1B 1结合或与两种酶同时结合的复合物[10]。研究表明, BBTI 不含A -螺旋构型, 具有61%B -折叠, 38%无序构型和1%B -转角

[11]

。

BBTI 家族的抑制区是由二硫键连接9个残基的环形结构区, 这是许多丝氨酸蛋白酶所具有的特征性规则结构域。但BBTI 环形结构的独特之处在于其抑制环边缘存在一个顺式肽键。BBTI 的抑制环最常见的基因序列是在P3-P4c 处带有顺-反式立体结构的脯氨酸-脯氨酸元件。通过分析合成片段的抑制活性和结构发现, 只有脯氨酸存在于P3c 时, BBT I 才显示出有效的胰蛋白酶抑制作用, 此处的顺式肽键是生物活性所必需的, 而P4c 处的脯氨酸则可抑制P3c 处反式构象的形成[12]。

War e 等通过使用BBTI 滴定人类皮肤组织中肥大细胞里糜蛋白酶抑制剂活性位点, 发现BBTI 是人类糜蛋白酶的高效抑制剂, 化学计量法显示在10nM 糜蛋白酶条件下即可检测到其对糜蛋白酶的抑制作用, 糜蛋白酶/BBT I 复合物经过SDS -PAGE 分析后并未发生解离, 说明二者之间形成了[13]等

316 大豆科学 3期

(TBPI-A 和T BPI-B) , 抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。T BPI-B 含有80个氨基酸残基, 分子量大约是9kDa, 氨基酸序列和Bow man-Birk 家族类似。电泳和质谱表明该抑制剂存在二聚体和三聚体, 另外一个不寻常的特征是可以结合金属。N -端四个连续的组氨酸可能与金属结合有关。质谱和原子吸收光谱也表明在天然状态下抑制剂与钙结合。

[22]

制剂[30]。继M isaka 等人之后, H ines 等从大豆种子中分离得到分子量为12kDa 的cystatins, 其N-端氨基酸序列与水稻oryzacystatin 及鸡蛋cy statin 有同源性, 可以抑制木瓜蛋白酶, 无花果蛋白酶, 但对菠萝蛋白酶, 牛胰蛋白酶, 牛A -胰凝乳蛋白酶和猪胃蛋白酶的活性没有影响[28, 31]。这种抑制剂可以在不同程度上抑制几种以半胱氨酸蛋白酶为消化酶的昆虫幼虫中肠粗提物的分解蛋白的能力。大豆cystatins 的等电点是pH 5. 3, 糖蛋白染色为阴性, 在100e 加热30min 后失活。

2. 2 菜豆

Brzin 等通过亲合层析和凝胶过滤层析从菜豆(Phaseo lus vulgaris L. ) 的种子中分离得到一种cystatinsFSCPI 5. 5[32]。SDS -PAGE 电泳显示在14kDa 附近有一条主带, 等电聚焦测得其等电点是5. 5。反相H PLC 测得其N-末端序列, 可知FSC -PI 5. 5为植物胱蛋白, 其N -末端序列与胡萝卜cystatin 的氨基酸顺序有48%类似, 与豆科植物的有18%~23%相似。FSCPI 5. 5对来源于P. vu-l garis 叶子的两种半胱氨酸蛋白酶FLCP-1和FL -CP-3有强烈的抑制作用, 并且也是木瓜蛋白酶和人组织蛋白酶B, H 和L 的潜在抑制剂, 其Ki 值分别是0. 08、3. 6、2. 8和0. 02nM 。采用相似的方法首次从菜豆叶子中分离得到另一种cy statinsFLC -PI 。其N-端氨基酸序列与FSCPI 5. 5的相似但不完全相同, 免疫抗原性与FSCPI 5. 5有关, 并且分子量相同。FLCPI 可以有效地抑制菜豆叶子中的两种半胱氨酸蛋白酶说明在正常和病理条件下该抑制剂在叶子蛋白质水解过程中发挥主要作用。

2 豆类植物中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂

半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cy statins) 是一类小肽, 可以保护细胞免受不合适的内源或外部的蛋白质水解, 参与细胞内外正常及病理情况下的蛋白质降解的调控。通常认为种子里的胱蛋白可能参与调节发芽过程中的贮藏蛋白质的水解, 并且作为一种防御机制, 协同丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制昆虫体内的蛋白酶[23]。

cystatins 家族可以与半胱氨酸蛋白酶紧密且可逆地结合, 根据氨基酸序列的同源性, 分子量大小及其在机体内的分布状况, 分为stefins 、cy statins 和kinino gens 三个家族。Barrett 等认为stefins 家族为不含二硫键和糖的单链蛋白, 分子量约为11kDa, 包括stefinA 和stefinB 。stefins 家族具有热稳定性, 在中性和碱性pH 下稳定。cy statins 家族是含有两个链内二硫键的分泌性蛋白, 大约含有115个氨基酸残基, 分子量约为12-13kDa, 主要包括cy statin C, D, E, F, S 等, 成员众多, 分布广泛。除了鼠cy statin C 外, 该家族的其他成员都没有糖基化。kininog ens 家族也是含有链内二硫键的单链蛋白, 分子量较大, 约68-120kDa, 主要包括H -kininog en, L -kininogen 和T -kininog en 。kinino gens 在中性和碱性pH 下是稳定的, 在90e 短时间内具有热稳定性[26]。最近将来源于植物的cystatins 胱蛋白" phy tocy statin" 列为第四家族的观点已被人们广泛接受, 分离并鉴定了许多新成员。植物胱蛋白分布在许多植物组织中, 主要存在于蛋白质贮藏器官。除了共同的结构特征Gln-Val-Val-Ala-Gly [27], 植物胱蛋白通常还有长的C -末端和N-末端以及二硫键, 这表明这个家族也是可以再分的2. 1 大豆

[28]

[25]

[24]

3 豆类植物蛋白酶抑制剂的应用

3. 1 在抗虫植物基因工程中的应用

M ickel 和Standish 最早于1947年观察到一些昆虫的幼虫在豆类产物中不能发育。随后Lipke 等发现大豆中的丝氨酸蛋白酶抑制剂对杂拟谷盗(T ribolium confusum) 表现出毒性。此后, 许多蛋白酶抑制剂的抗虫研究被陆续报道。谢可方等报道棉铃虫的幼虫喂食含有大豆胰蛋白酶抑制剂的人工饲料后, 表现出生长延缓、体重减轻、羽化率降低、

[35]

死亡率增加。丝氨酸蛋白酶抑制剂主要具有抑制鳞翅目昆虫消化蛋白酶的能力, 而巯基蛋白酶抑制剂则主要是通过抑制鞘翅目和半翅目昆虫消化道[36][34][33]

。

Learmo nth 早在1958年就发现大豆粉有抑制木瓜蛋白酶的活性, Brzin 在1990年从大豆种子[29]

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类植物蛋白酶抑制剂在生物农药及利用转基因方法使作物提高抗虫性方面有着广阔的应用前景。目前, 在转基因中使用较为成熟的是豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cow pea trypsin inhibitor, CPT I) 。CPTI 基因的作用靶位是昆虫的酶的活性位点, 具有杀虫范围广, 效果稳定等特点, 应用价值巨大。1987年, 首次获得表达CPT I 基因的烟草植株, 其体内的CPT I 占总可溶性蛋白质的0. 9%, 抗虫效果明显, 烟草芽蛾的死亡率为50%~62. 5%。随后, 相继获得转CPTI 基因的水稻、油菜、白薯、苹果、杨树和棉花等植物, 对玉米螟和水稻三化螟都有一定的抗性[37, 38]。

高越峰等构建了大豆Kunitz 型胰蛋白酶抑制剂基因的一系列植物表达载体, 用于烟草(N icotiana tabacum L. ) 、水稻(Ory z a sativa L. ) 、棉花(Gossy p ium hir sutum L. ) 等作物的转化[39]。利用棉铃虫(H elio this arm ig era H ubner) 对转基因烟草进行了抗虫测试, 结果表明, 转基因烟草和对照烟草相比, 具有明显的抗虫能力。Confalonieri 等将大豆Kunitz 蛋白酶抑制剂基因转化到欧洲黑杨(Po pulus r ig ra) , 但对试虫的毒杀效果不好。此外, 在油菜、白杨和马铃薯等作物中也分别进行了大豆丝氨酸蛋白酶抑制剂的转基因研究[41]。虽然蛋白酶抑制剂基因是抗虫基因工程中经常使用的目的基因之一, 但是仍存在表达水平较低, 昆虫的适应性及植物本身代谢产物的影响等问题。3. 2 在临床治疗上的应用

蛋白酶抑制剂在临床治疗上有许多重要应用, 如在治疗胰腺炎和多功能衰竭、抗休克、减少心脏外科手术中失血、防治脑水肿和脑缺血、预防早产、预防单侧肺缺血再灌注引起的损伤等方面都有相关的研究报道。其中, 最令人瞩目的是在H IV 和肿瘤治疗中的应用。

目前艾滋病的化学治疗主要是从H IV 病毒的复制周期入手, 通过阻断病毒复制周期的三个关键酶(逆转录酶, 整合酶和蛋白酶) 来达到抑制H IV 复制的目的。将不同的酶抑制剂联合使用, 采用多药协同作用和从H IV 复制周期的多个环节同时阻断, 在临床上取得了很好的效果[42]。继1995年第1个H IV 蛋白酶抑制剂沙奎那韦研制成功后, 如今已有5种H IV 蛋白酶抑制剂陆续研制出来。豆类植物蛋白酶抑制剂来源广泛, 方便易得, 相信随着研究的深入, 会在抗病毒方面发挥独特的作用。

[40]

量大约为7. 5kD 的胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂, 该抑制剂对My cosphaer ella arachidicola, Fusar -ium o xyspo rum 和Botrytis cinerea 具有抗真菌活性[43]。和其他抗真菌蛋白一样, 抑制剂也抑制H IV -1逆转录酶的活性。可以增强鼠脾细胞的有丝分裂能力。这是首次关于豆类蛋白酶抑制剂抗真菌活性的报道。该抑制剂对Fusar ium oxy sporum 的抑制活性比豆类其他的抗真菌蛋白的活性都要好, 对M ycosphaerella arachidicola 的抑制活性和ginkb-i lobin 相当, 但对Botrytis cinerea 的抑制能力比豆类其他的抗真菌蛋白弱。

研究发现, 大豆BBT I 型蛋白酶抑制剂具有明显的抗癌作用, 它不同于其它一些抗癌药物, 能以不可逆方式影响致癌过程且在低含量时也能发挥其抗癌作用。在已经发生癌症的模型中大豆BBT I 型蛋白酶抑制剂体内外均可长期表现出抑癌作用[44]。大豆BBTI 型蛋白酶抑制剂可抑制或阻止诱导结肠癌的发生, 其抑制肿瘤的效果主要来自于抑制胰凝乳蛋白酶的活性[45]。蛋白酶抑制剂虽然对癌细胞没有直接的杀伤效果, 但它在离体条件下可阻止正常细胞向恶性转化、甚至在癌症晚期亦如此。Augustine 等通过给C3H /Jax 小鼠长期饲喂富含蛋白酶抑制剂(24%) 的野生大豆研究鼠乳腺癌病毒(M M TV) 诱导的乳腺癌发生过程。野生大豆在剂量为2%、4%和8%时的肿瘤抑制率分别为68%、75%和81%[47]。蛋白酶抑制剂被加热破坏的野生大豆组在2%时对肿瘤发生无抑制作用, 说明是大豆中的PI 对肿瘤的发生有抑制作用。纯化的野生大豆PI 还可以明显降低7, 12-二甲基苯蒽诱导的Sw iss albino 小鼠皮肤癌的发生和转移[48]。Ashutosh 等研究了野生大豆对乙烷基亚硝基脲(ENU) 诱导Sprague-Daw ley 小鼠神经系统肿瘤的作用[49]。ENU 组小鼠平均在表现神经系统病症282天后全部发生神经系统肿瘤, 明显比野生大豆组小鼠的时间短。野生大豆组的肿瘤抑制率为41%, 并且小鼠个体的肿瘤个数要少的多。加热破坏蛋白酶抑制剂的野生大豆组的肿瘤发生率为100%, 表明肿瘤抑制与蛋白酶抑制剂有关。野生大豆BDF1胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制剂可以呈剂量依赖性有效阻断B16F10黑色素瘤细胞向肺部的转移, 推测与抑制血纤维蛋白溶酶有关[50]。Garc a-Gasca 等采用硫酸铵沉淀和凝胶过滤从宽叶菜豆(Phaseolus acutifolius) 中分离出一种分7. (T [46]

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较了对正常3T3成纤维细胞, H eLa 细胞和3T3/v -m os 转化细胞生长的影响

[51]

。TPIF 呈剂量依赖

性抑制3T3/v-mos 转化细胞的生长, 在最高剂量

时表现出对3T 3成纤维细胞的细胞毒性, 对H eLa 的生长没有影响。次致死剂量的TPIF 还可以增强3T3/v-m os 转化细胞的黏附能力, 促使其表型向正常细胞转化。其原因可能是细胞黏附蛋白或细胞外基质蛋白表达的变化, 也可能是参与细胞外基质蛋白水解的蛋白酶活性发生了变化。

随着植物蛋白酶抑制剂的分离和鉴定方法的逐渐改进, 不同来源、不同类型、不同特性的豆类蛋白酶抑制剂将会得到新的发现和应用, 豆类蛋白酶抑制剂将会在人们的生产生活中发挥巨大的作用。参考文献

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ADVANCES IN THE STUDY OF PROTEASE INHIBITORS FROM LEGUMIN OUS PLANTS

Zhang Li Wang Dong feng Zhang Bin Sun Liping

(Colleg e of Food S cience and Engineer ing , Ocean Univer sity of China , Qingdao 266003)

Abstract Pr otease inhibitors ar e im por tant in the pro teoly sis pro cess of plant. It can mediate the deg rada -tion o f storag e pro teins for the assim ilation of nitro gen into biosy nthetic pathway s. A nd it plays an im po r -tant ro le in the plant defense response to insect o r pathogen pr edation. Protease inhibitor (PI) is generally categ orized into four types. T he intent of the present review is to focus on the structur al, physicochem ical character istics and phy siolo gical functio ns of leguminous ser ine protease inhibitor and cysteine pro tease in -hibito r. T he clinical application and applicatio n in resisting pest g enetic eng ineering w ere also discussed. Key words Leg um inous plants; Serine pro teinase inhibitor; Cysteine pr oteinase inhibito r