Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 1, 2012 Vol.16, No.1
中国组织工程研究 第16卷 第1期 2012–01–01出版
脐带间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展★
哈承志，王大伟
Development of umbilical cord mesenchymal stem cells applied in bone tissue engineering
Ha Cheng-zhi, Wang Da-wei
Department of Joint Surgery, Liaocheng People’s Hospital, Liaocheng 252000, Shandong Province, China
Ha Cheng-zhi★, Studying for master’s degree, Taishan Medical University, Taian 271016, Shandong Province, China
hcz19851013@ 163.com
Correspondence to: Wang Da-wei,
Master’s supervisor, Chief physician, Department of Joint Surgery, Liaocheng People’s Hospital, Liaocheng 252000, Shandong Province, China
Received: 2011-06-08 Accepted: 2011-07-20
聊城关节外科，市人民医院
聊城市山东省
252000 哈承志★，东省聊城市人，男，山族，汉读硕士，泰山医学院在骨组织工程研究。主要从事hcz19851013@ 163.com
通讯伟，硕士生导师，作者：王大主任医师，人民科，医院关节聊城市外252000 山东省聊城市
中图分类号:R318 文献标识码:B
文章编号:1673-8225 (2012)01-00158-05
收稿日期：2011-06-08 修回日期：2011-07-20 ([1**********]/G·L)
158
Abstract
BACKGROUND: In bone tissue engineering, the studies about umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) as the new seed cells are gradually increased.
OBJECTIVE: To review the isolation, culture, biology characteristics and the carrier used in bone tissue engineering of UC-MSCs. METHODS: A computer-based online search of literatures published between January 1999 to March 2011 related to the isolation, culture, biology characteristics and the carrier of UC-MSCs was performed in PubMed database and CNKI database using the key words of “umbilical cord stem cell, bone tissue engineering” in English and in Chinese. Finally, 46 articles were included according to inclusion criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: UC-MSCs possess multiple properties of embryon and adult stem cells. UC-MSCs have been proved to meet the criteria of MSCs published by the international society for cellular therapy. However, the isolation, culture, and differentiation of UC-MSCs are still unclear. There are many studies on single scaffolds as carrier, the research about composite carrier and injectable carrier may be the hotspot in the future.
Ha CZ, Wang DW. Development of umbilical cord mesenchymal stem cells applied in bone tissue engineering.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(1): 158-162. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]
摘要
背景：在骨组织工程领域，对新型种子细胞脐带间充质干细胞的研究逐渐增多。
目的：针对脐带间充质干细胞的分离培养、生物学特征及其在骨组织中所用载体进行综述。 方法：由第一作者应用计算机检索1999-01/2011-03 PubMed数据库及中国期刊全文数据库中有关脐带间充质干细胞分离培养、生物学特征、载体方面的文章。英文检索词为“umbilical cord stem cell，tissue engineering”，中文检索词为“脐带间充质干细胞，骨组织工程”。排除重复性研究及无关研究，共保留46篇文章进行综述。
结果与结论：脐带间充质干细胞具备胚胎和成体干细胞的多重特点，并且符合国际细胞疗法协会制定的间充质干细胞标准，但是脐带间充质干细胞的分离培养、诱导分化方法等尚不完善，应进一步深入分析。在脐带干细胞的载体方面，单一的材料支架目前研究已很多，对于复合材料载体与可注射性载体的研究可能是今后的热点。 关键词：脐带间充质干细胞；异体移植；载体；骨组织工程；综述文献 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.01.034
哈承志，王大伟. 脐带间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展[J].中国组织工程研究，2012，16(1):158-162. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]
或松质骨的成骨细胞，但由于其取材困难，创0 引言
伤大，来源及扩增能力有限，并且异体移植所
产生的免疫排斥反应无法根本解决，所以在骨组织工程学是应用工程学和生命科学的基组织工程中的应用受到了严重的限制，已逐渐本原理和技术，在体外构建具有生物功能的人被间充质干细取代。应用最广泛的间充质干细工替代物，用于修复组织缺损，替代失去功能胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来自于骨和衰竭的组织、器官的部分或全部功能[1]
。其中髓，但是随着研究的深入其不足之处逐渐被学发展最为迅速的是骨组织工程——利用细胞生者们发现，骨髓内含量较低，占有核细胞数的物学和工程学原理，研究开发修复和改善损伤0.001%~0.01%，骨髓MSCs的数量和分化能力骨组织形态和功能的生物替代物的一门科学。随着年龄的增长相对减少和减弱，如果合并感染骨组织工程的主要研究方向是种子细胞和调控或肿瘤等恶性疾病时，其分化能力更明显下 细胞的生长因子以及运载细胞的载体。骨组织降[3]
，并且获取骨髓是一项侵袭性操作，有一定工程中理想的的种子细胞应具备以下特点：①的感染率和痛苦。2003年Romanov等[4]
从人的取材方便，对机体损伤小。②体外培养易定向脐带中分离出MSCs，命名为人脐带间充质干细分化为成骨细胞并具有较强的稳定传代增殖能胞(human umbilical cord mesenchymal stem 力。③植入体内能适应局部环境并保持较强的cells, HUC-MSCs)并提出该细胞增殖活性及成成骨活性[2]
。最早应用的种子细胞是来源于骨膜
骨分化能力要高于骨髓MSCs，且来源广泛、培
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哈承志，等. 脐带间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展
养简单、不易污染、提取无创伤及避免伦理学争议[5]
。现将有关UC-MSCs在骨组织工程中的应用综述如下。
1 资料和方法
资料来源：由第一作者检索1999-01/2010-03
PubMed数据库及中国知网中国期刊全文数据库，英文检索词为“umbilical cord stem cell，tissue engineering”，中文检索词为“脐带间充质干细胞，骨组织工程”。检索文献总量462篇，英文197篇，中文265篇。
纳入标准：①文章所述内容与UC-MSCs的分离培
养、免疫特征、诱导分化等生物学特征及载体选择密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。
排除标准：重复性研究与无关研究。
数据的提取：计算机初检得到462篇文献，阅读标
题和摘要，排除因研究目的与本文无关及内容重复的研究，共保留其中的46篇归纳总结。
质量评估：符合纳入标准的文献中，文献[1-26]探讨
了UC-MSCs的分离培养诱导分化等生物学特征，[27-32]探讨了UC-MSCs的免疫特征，[33-46]探讨了UC-MSCs的载体进展。
2 结果 2.1 UC-MSCs的来源与分离
2.1.1 UC-MSCs的提取部位 脐带长约60 cm，直径为1.0~2.5 cm，表面被羊膜覆盖，内含两条动脉和一条静脉，血管的周围环绕着半透明的基质，称为华通胶(Wharton’s jelly)。以往资料显示，从脐带静脉内皮及内皮下层、脐血管周围、Wharton's jell等均可分离出MSCs
[6-10]
。但是究竟从脐带的什么部位提取细胞最合适，
仍没有结论。当前的研究倾向于从脐带华通胶中分离MSCs，认为该处的MSCs纯度较高，Romanov等[4]
通过实验发现从脐带华通胶中分离出MSCs的比率是100%而从脐带的其他部位分离出的MSCs比率是30%。但是Baksh等[5]
并没有在华通胶来源的间充质细胞中发现MSCs的通用表达标记CD146，而脐静脉血管周围存在。Ishige等
[11]通过比较来自脐静脉、脐动脉、
华通胶的MSCs的特点，发现3种来源的间充质细胞在形态和免疫表型上没有明显区别，华通胶中分离的间充质细胞成骨分化能力较差，因为虽然此处来源的细胞有骨桥蛋白表达，但是在成骨培养基中培养28 d未见碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的表达，而来自脐血管的间充质细胞ALP表达能力较强，尤其是脐带动脉来源的间充质细胞。所以他们推论脐带血管才是获
ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
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取MSCs的最佳部位。但是仅凭ALP的表达水平高低评估成骨能力稍有牵强，因为脐动脉壁细胞本身就表达ALP，Ushiki等
[12]
曾经在老鼠的模型中证明了这点。所
以有可能分离的间充质细胞混有大量动脉壁内皮细胞。UC-MSCs的最佳提取部位仍需进一步研究。 2.1.2 UC-MSCs的分离方法 UC-MSCs的分离方法主要有酶消化法与组织块法，最近有研究发现一种新的组织块培养法即“纵切法”，将长约10 cm左右的脐带纵向劈开，去除血管，不将脐带切割成小块，直接将华通胶放置在培养基中培养[13]
。并与小块的组织块法，酶
消化法相比较，发现该方法操作简单快速、污染率低。
国内袁源等[14]
利用组织块培养法与胶原酶法分离
MSCs，并进行比较结果发现此两种分离方法差别不大。
侯克东等
[10]
比较了胶原酶法与组织块法分离MSCs的
方法，认为采用小组织块纱巾培养法的培养时间较长,而采用胶原酶消化法可快速获得大量贴壁生长的MSCs，操作简便易行，可更好地保持细胞活力，显著缩短原代培养时间。但徐燕等[15]
通过实验比较各种分离
UC-MSCs的方法后认为组织块培养法更适合分离
UC-MSCs，与侯克东等
[10]
报道结果相反。尽管胶原酶
法分离MSCs的方法被广泛使用，但文献描述的处理方式各不相同，结果也往往相差很大。有研究者应用胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶联合酶解分离基质细胞，但是结果不甚理想。胶原酶法的主要缺点是由于酶的过度使用使组织过度消化导致细胞活力降低，细胞表面的受体降解，改变细胞的功能
[16]
。其优点主要是可以快速获
得大量的贴壁生长的MSCs，缩短原代培养时间。组织块培养方法缺点主要是原代培养时间较长，但其操作简单，经济方便。总之各种方法应进一步研究完善。 2.1.3 UC-MSCs的培养基选择 选用何种培养基培养UC-MSCs也存在争议。洪敬欣等
[17]
选择低糖DMEM、
MesenPRO RSTM
Medium和STEMPRO MSC SFM3种培养体系进行UC-MSCs生长增殖的对比实验。结果表明MesenPRO RSTM
Medium是最适合于UC-MSCs在体外扩增的培养基。Nekanti等
[18]
将UC-MSCs培养
在DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-KO、DMEM-F12四种不同的培养基中，发现DMEM-KO 与DMEM-F12较另两种培养基更适合MSCs的黏附、扩增、分化。在培养基中加入促进细胞扩增的细胞因子bFGF，可以明显的提高间充质细胞的扩增能力，且对MSCs的表面标记没有影响。叶夏云等
[19]
发现人胰岛素和胰岛素类似物
均可以促进干细胞的增殖，其中甘精胰岛素促细胞增殖的能力较明显。应用人体血清也可以成功的培养出MSCs，国内葛殿华等
[20]
应用人脐带血血清为主的培养
基培养UC-MSCs取得的良好的效果，Hatlapatka等
[21]
也证明了人体血清可以有效的培养扩增MSCs。当前UC-MSCs的培养体系主要应用含动物血清(如胎牛血
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清)的培养基，在此种环境下生长的细胞其内部机构会发生何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致的过敏反应，无血清培养基体外培养扩增UC-MSCs成为研究方向
[22]
。
2.1.4 UC-MSCs的成骨分化 UC-MSCs的成骨分化潜力首先是2004年被Wang发现的，也逐渐被国内外许多研究者证明[4-5，8，23]
。但是具体的分化基质尚不明
确。Baksh等
[24]
比较了脐带血管周围细胞与骨髓MSCs
的扩增分化能力，结果表明脐带血管周围细胞在成骨分化方面强于骨髓MSCs。并且证实了脐带血管周围细胞表达CD146这一公认的间充质细胞表面标志。同骨髓间充质细胞类似，也是通过Wnt信号途径诱导成骨分化。Hsieh等
[25]
比较脐带华通胶与骨髓来源的MSCs的分化能力，认为UC-MSCs比骨髓MSCs更易向胰腺和内皮细胞分化。他们在基因表达水平上比较了这两种细胞，结果表明UC-MSCs易表达血管生长因子相关的基因包括表皮生长因子，而骨髓来源的间充质细胞易表达成骨基因如RUNX2，DLX5。骨髓MSCs基因表达形式比脐带干细胞更类似于成骨细胞基因，暗示骨髓MSCs有较好的成骨潜力。UC-MSCs在血管再生方面有较好的优势。Majore等
[26]
也证实UC-MSCs虽可以像成骨细胞
分化，但是分化效力低下，即使经过最强的成骨诱导物质1，25-二羟基维生素D3的诱导。所以诱导UC-MSCs向成骨细胞方向的分化，是值得深入研究的问题。 2.1.5 UC-MSCs的免疫特点 UC-MSCs之所以可以用于异基因移植，是因为其具有免疫抑制作用。Weiss等
[27]
研究了脐带间充质细胞的体外免疫特点，并揭示了
UC-MSCs的一些免疫抑制机制：首先，UC-MSCs抑制一些免疫细胞的扩增，如人外周血单个核细胞、纯化的T细胞等；其次，脐带间充质细胞可以合成免疫抑制分子HLA-G6；第三，脐带间充质细胞不表达免疫反应协同刺激分子CD40，CD80，CD86；第四，脐带间充质细胞表达间充质细胞免疫调节分子白细胞介素6。Yoo等
[28]
证实了脐带间充质细胞同骨髓间充质细胞一样，具有免疫调节作用和抗炎作用。具体机制是T细胞活化时分泌γ-干扰素和肿瘤坏死因子α同时诱导间充质细胞分泌吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)抑制T细胞扩增。这些体外的脐带间充质细胞免疫特点研究结果支持早期的这一发现：异体脐带间充质细胞可以在动物模型中耐受。Cho等
[29]
研究异基因UC-MSCs移植证实，只有反复注射MHC不匹配的非活化脐带间充质细胞才产生免疫反应导致局部产生炎症。有学者也通过脐带间充质细胞异基因转移治疗动物模型诱导的帕金森病和视网膜病，没有发现产生免疫排斥反应
[30-31]
。野向阳等
[32]
应用UC-MSCs治疗人股骨头坏死并观察人体的免疫反应，结果未引起宿主免疫应答，二次移植时也未出现免疫记忆及免疫排斥。UC-MSCs少次应用是安全的，具体的
160
哈承志，等. 脐带间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展
免疫抑制机制仍需进一步探索。
2.2 UC-MSCs的载体 要想把种子细胞高效的植入骨缺损处，必须有合适的载体。而骨组织工程中理想的载体材料应具有以下几方面的特点：①良好的生物相容性即组织相容性和细胞相容性。②良好的生物降解性，基质材料在完成支架作用后应能降解，降解速度应与组织细胞生长速度相适应，降解时间应能根据组织生长特性做人为的调控。③具有三维立体多孔结构，孔隙率最好达到90%以上，具有较高的面积体积比。④具有可塑性和一定的机械强度。⑤良好的材料-细胞界面，材料可以提供良好的细胞界面，利于细胞黏附、增殖，更重要的是能激活细胞细胞特异基因表达，维持细胞正常表型表达。⑥能够便于临床医师或实验者观察处理
[33]
。从目
前各种载体材料的特性来看，单独的一种材料均无法满足上述要求。生物来源的异体脱钙骨基质，其孔隙和骨诱导特性虽然较好，但机械强度低，并存在潜在的免疫原性。胶原材料及纤维蛋白凝块具有良好的生物相容性，适合细胞生长的孔径，移植前可预先塑形，移植过程保持适当的机械强度等，但也存在吸收较快的缺点，多用于促进骨折愈合，治疗骨不连与小的骨缺损。人工合成的高聚物，如聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物、聚L-乳酸、聚乳酸等，不具有骨诱导作用，机械强度偏低，体内移植降解后局部可出现排斥反应
[34]
，缺少细胞共刺激信号
并且具有疏水性，阻碍了细胞的植入[35]
。生物陶瓷类材
料虽然生物相容性较好，但疲劳强度低、脆性大、抗折及抗冲击性远不能满足高负荷人工骨的机械强度要求。
多种支架材料复合使用可以互补长短，有利于更好地发挥各自优点，促进骨组织工程产品的修复重建效果，这将是以后的发展方向。目前已有大量关于复合支架材料使用的实验研究
[36-37]
。为了克服人工合成高聚物
的缺点，很多研究组通过对其进行表面修饰来改进其疏水性，如采用纤维蛋白凝胶、胶原、左旋多聚赖氨酸包埋等方法增加其对细胞的黏附性，最近Ramay等
[38]
通
过在PLGA中加入一种亲水性物质聚乙二醇来增加其性能，并证实其作为载体具有较高的成骨性。Maquet等
[39]
通过比较来源于华通胶的UC-MSCs在体外PCL、
PCL/HA、PCL/COLLAGEN、 PCL/HA/COLLAGEN 载体中成骨分化能力，证实含有胶原酶的载体较其他载体容易使UC-MSCs黏附、扩增、成骨分化，其中PCL/ HA/COLLAGEN的效果最好。Penolazz等
[40]
报道了应
用海藻酸盐微珠包裹华通胶干细胞作为载体，发现脐带干细胞在微胶囊内不会影响其功能，相反还会促进其分泌作用，诱导其成骨分化。在此基础上，Zhao等
[41-42]
研发了一种可注射性磷酸钙-海藻酸盐凝胶-脐带干细胞水泥。通过将脐带干细胞用水凝胶、海藻酸盐或者壳聚糖包裹然后融入磷酸钙中制成一种可注射型性的细胞载体植入骨缺损处。发现包裹的UC-MSCs不会丧失
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哈承志，等. 脐带间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展
存活及分化能力，而且可以诱导成骨分化，在磷酸钙中加入纤维、壳聚糖、海藻酸盐等其力学指标未见降低，相反却能增加其韧性，这种可注射性载体具有缩短手术时间，减少肌肉回缩所致的损伤，降低围手术期的疼痛与瘢痕大小等优点。应用生物材料将UC-MSCs包裹，然后混入复合材料中达到双重缓释的效果逐渐成为研究方向。此外，大多数骨组织工程支架材料的黏附性较差，细胞较难吸附于材料表面，接种时难以在支架空隙内锚定并增殖。所以对支架材料的表面特性加以改造，可能会增加细胞的黏附和趋化宿主细胞的迁移以及细胞的成骨能力
[43-45]
，这些也将可能是以后的研究方向。
采用不同的工艺制备材料和根据对支架材料需求的不同将其制备成不同形状，也是近年来组织工程骨支架材料发展的一个方向。快速成形技术是近年来兴起的新型仿生制造技术，其最大的优势是可以预先设计出支架材料的大小、形状、孔径和孔隙率，然后通过计算机辅助设计软件将其转换成数字信号，再通过三维立体打印技术按照预先设定的要求直接形成支架的三维结构，不受形状复杂程度限制，有着其他传统工艺不可比拟的优势[46]
，越来越多的研究者通过这种技术设计支架材
料，以满足个体化治疗的需求。
3 讨论 综上所述，UC-MSCs同其他来源的MSCs相比拥有其独特的特点，在组织工程中有广阔的应用前景。随着国内脐血库的建立，UC-MSCs的储蓄将趋向完善。但是UC-MSCs的提取、培养、扩增、诱导分化等方法尚不完善，需要进一步研究。在脐带干细胞的载体方面，单一的材料支架目前研究已很多，但是具体应用于临床仍有较多的细节需要考虑，对于复合材料载体与可注射性载体的研究可能是今后的热点。而且通过对载体表面的修饰如添加一些生长因子、生化药物，以此来改善载体的特性也有较大研究空间。临床上骨缺损常并发骨感染，而组织工程骨本身不具有抗感染能力，移植到感染环境或是潜在的感染环境中可能因为感染而导致移植失败。将抗生素缓释技术同组织工程骨结合，可为目前临床上解决骨缺损并发感染提供新策略，进一步拓宽组织工程骨的应用范围。
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中国组织工程研究 第16卷 第1期 2012–01–01出版
脐带间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展★
哈承志，王大伟
Development of umbilical cord mesenchymal stem cells applied in bone tissue engineering
Ha Cheng-zhi, Wang Da-wei
Department of Joint Surgery, Liaocheng People’s Hospital, Liaocheng 252000, Shandong Province, China
Ha Cheng-zhi★, Studying for master’s degree, Taishan Medical University, Taian 271016, Shandong Province, China
hcz19851013@ 163.com
Correspondence to: Wang Da-wei,
Master’s supervisor, Chief physician, Department of Joint Surgery, Liaocheng People’s Hospital, Liaocheng 252000, Shandong Province, China
Received: 2011-06-08 Accepted: 2011-07-20
聊城关节外科，市人民医院
聊城市山东省
252000 哈承志★，东省聊城市人，男，山族，汉读硕士，泰山医学院在骨组织工程研究。主要从事hcz19851013@ 163.com
通讯伟，硕士生导师，作者：王大主任医师，人民科，医院关节聊城市外252000 山东省聊城市
中图分类号:R318 文献标识码:B
文章编号:1673-8225 (2012)01-00158-05
收稿日期：2011-06-08 修回日期：2011-07-20 ([1**********]/G·L)
158
Abstract
BACKGROUND: In bone tissue engineering, the studies about umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) as the new seed cells are gradually increased.
OBJECTIVE: To review the isolation, culture, biology characteristics and the carrier used in bone tissue engineering of UC-MSCs. METHODS: A computer-based online search of literatures published between January 1999 to March 2011 related to the isolation, culture, biology characteristics and the carrier of UC-MSCs was performed in PubMed database and CNKI database using the key words of “umbilical cord stem cell, bone tissue engineering” in English and in Chinese. Finally, 46 articles were included according to inclusion criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: UC-MSCs possess multiple properties of embryon and adult stem cells. UC-MSCs have been proved to meet the criteria of MSCs published by the international society for cellular therapy. However, the isolation, culture, and differentiation of UC-MSCs are still unclear. There are many studies on single scaffolds as carrier, the research about composite carrier and injectable carrier may be the hotspot in the future.
Ha CZ, Wang DW. Development of umbilical cord mesenchymal stem cells applied in bone tissue engineering.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(1): 158-162. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com]
摘要
背景：在骨组织工程领域，对新型种子细胞脐带间充质干细胞的研究逐渐增多。
目的：针对脐带间充质干细胞的分离培养、生物学特征及其在骨组织中所用载体进行综述。 方法：由第一作者应用计算机检索1999-01/2011-03 PubMed数据库及中国期刊全文数据库中有关脐带间充质干细胞分离培养、生物学特征、载体方面的文章。英文检索词为“umbilical cord stem cell，tissue engineering”，中文检索词为“脐带间充质干细胞，骨组织工程”。排除重复性研究及无关研究，共保留46篇文章进行综述。
结果与结论：脐带间充质干细胞具备胚胎和成体干细胞的多重特点，并且符合国际细胞疗法协会制定的间充质干细胞标准，但是脐带间充质干细胞的分离培养、诱导分化方法等尚不完善，应进一步深入分析。在脐带干细胞的载体方面，单一的材料支架目前研究已很多，对于复合材料载体与可注射性载体的研究可能是今后的热点。 关键词：脐带间充质干细胞；异体移植；载体；骨组织工程；综述文献 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.01.034
哈承志，王大伟. 脐带间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展[J].中国组织工程研究，2012，16(1):158-162. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com]
或松质骨的成骨细胞，但由于其取材困难，创0 引言
伤大，来源及扩增能力有限，并且异体移植所
产生的免疫排斥反应无法根本解决，所以在骨组织工程学是应用工程学和生命科学的基组织工程中的应用受到了严重的限制，已逐渐本原理和技术，在体外构建具有生物功能的人被间充质干细取代。应用最广泛的间充质干细工替代物，用于修复组织缺损，替代失去功能胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来自于骨和衰竭的组织、器官的部分或全部功能[1]
。其中髓，但是随着研究的深入其不足之处逐渐被学发展最为迅速的是骨组织工程——利用细胞生者们发现，骨髓内含量较低，占有核细胞数的物学和工程学原理，研究开发修复和改善损伤0.001%~0.01%，骨髓MSCs的数量和分化能力骨组织形态和功能的生物替代物的一门科学。随着年龄的增长相对减少和减弱，如果合并感染骨组织工程的主要研究方向是种子细胞和调控或肿瘤等恶性疾病时，其分化能力更明显下 细胞的生长因子以及运载细胞的载体。骨组织降[3]
，并且获取骨髓是一项侵袭性操作，有一定工程中理想的的种子细胞应具备以下特点：①的感染率和痛苦。2003年Romanov等[4]
从人的取材方便，对机体损伤小。②体外培养易定向脐带中分离出MSCs，命名为人脐带间充质干细分化为成骨细胞并具有较强的稳定传代增殖能胞(human umbilical cord mesenchymal stem 力。③植入体内能适应局部环境并保持较强的cells, HUC-MSCs)并提出该细胞增殖活性及成成骨活性[2]
。最早应用的种子细胞是来源于骨膜
骨分化能力要高于骨髓MSCs，且来源广泛、培
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哈承志，等. 脐带间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展
养简单、不易污染、提取无创伤及避免伦理学争议[5]
。现将有关UC-MSCs在骨组织工程中的应用综述如下。
1 资料和方法
资料来源：由第一作者检索1999-01/2010-03
PubMed数据库及中国知网中国期刊全文数据库，英文检索词为“umbilical cord stem cell，tissue engineering”，中文检索词为“脐带间充质干细胞，骨组织工程”。检索文献总量462篇，英文197篇，中文265篇。
纳入标准：①文章所述内容与UC-MSCs的分离培
养、免疫特征、诱导分化等生物学特征及载体选择密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。
排除标准：重复性研究与无关研究。
数据的提取：计算机初检得到462篇文献，阅读标
题和摘要，排除因研究目的与本文无关及内容重复的研究，共保留其中的46篇归纳总结。
质量评估：符合纳入标准的文献中，文献[1-26]探讨
了UC-MSCs的分离培养诱导分化等生物学特征，[27-32]探讨了UC-MSCs的免疫特征，[33-46]探讨了UC-MSCs的载体进展。
2 结果 2.1 UC-MSCs的来源与分离
2.1.1 UC-MSCs的提取部位 脐带长约60 cm，直径为1.0~2.5 cm，表面被羊膜覆盖，内含两条动脉和一条静脉，血管的周围环绕着半透明的基质，称为华通胶(Wharton’s jelly)。以往资料显示，从脐带静脉内皮及内皮下层、脐血管周围、Wharton's jell等均可分离出MSCs
[6-10]
。但是究竟从脐带的什么部位提取细胞最合适，
仍没有结论。当前的研究倾向于从脐带华通胶中分离MSCs，认为该处的MSCs纯度较高，Romanov等[4]
通过实验发现从脐带华通胶中分离出MSCs的比率是100%而从脐带的其他部位分离出的MSCs比率是30%。但是Baksh等[5]
并没有在华通胶来源的间充质细胞中发现MSCs的通用表达标记CD146，而脐静脉血管周围存在。Ishige等
[11]通过比较来自脐静脉、脐动脉、
华通胶的MSCs的特点，发现3种来源的间充质细胞在形态和免疫表型上没有明显区别，华通胶中分离的间充质细胞成骨分化能力较差，因为虽然此处来源的细胞有骨桥蛋白表达，但是在成骨培养基中培养28 d未见碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的表达，而来自脐血管的间充质细胞ALP表达能力较强，尤其是脐带动脉来源的间充质细胞。所以他们推论脐带血管才是获
ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
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取MSCs的最佳部位。但是仅凭ALP的表达水平高低评估成骨能力稍有牵强，因为脐动脉壁细胞本身就表达ALP，Ushiki等
[12]
曾经在老鼠的模型中证明了这点。所
以有可能分离的间充质细胞混有大量动脉壁内皮细胞。UC-MSCs的最佳提取部位仍需进一步研究。 2.1.2 UC-MSCs的分离方法 UC-MSCs的分离方法主要有酶消化法与组织块法，最近有研究发现一种新的组织块培养法即“纵切法”，将长约10 cm左右的脐带纵向劈开，去除血管，不将脐带切割成小块，直接将华通胶放置在培养基中培养[13]
。并与小块的组织块法，酶
消化法相比较，发现该方法操作简单快速、污染率低。
国内袁源等[14]
利用组织块培养法与胶原酶法分离
MSCs，并进行比较结果发现此两种分离方法差别不大。
侯克东等
[10]
比较了胶原酶法与组织块法分离MSCs的
方法，认为采用小组织块纱巾培养法的培养时间较长,而采用胶原酶消化法可快速获得大量贴壁生长的MSCs，操作简便易行，可更好地保持细胞活力，显著缩短原代培养时间。但徐燕等[15]
通过实验比较各种分离
UC-MSCs的方法后认为组织块培养法更适合分离
UC-MSCs，与侯克东等
[10]
报道结果相反。尽管胶原酶
法分离MSCs的方法被广泛使用，但文献描述的处理方式各不相同，结果也往往相差很大。有研究者应用胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶联合酶解分离基质细胞，但是结果不甚理想。胶原酶法的主要缺点是由于酶的过度使用使组织过度消化导致细胞活力降低，细胞表面的受体降解，改变细胞的功能
[16]
。其优点主要是可以快速获
得大量的贴壁生长的MSCs，缩短原代培养时间。组织块培养方法缺点主要是原代培养时间较长，但其操作简单，经济方便。总之各种方法应进一步研究完善。 2.1.3 UC-MSCs的培养基选择 选用何种培养基培养UC-MSCs也存在争议。洪敬欣等
[17]
选择低糖DMEM、
MesenPRO RSTM
Medium和STEMPRO MSC SFM3种培养体系进行UC-MSCs生长增殖的对比实验。结果表明MesenPRO RSTM
Medium是最适合于UC-MSCs在体外扩增的培养基。Nekanti等
[18]
将UC-MSCs培养
在DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-KO、DMEM-F12四种不同的培养基中，发现DMEM-KO 与DMEM-F12较另两种培养基更适合MSCs的黏附、扩增、分化。在培养基中加入促进细胞扩增的细胞因子bFGF，可以明显的提高间充质细胞的扩增能力，且对MSCs的表面标记没有影响。叶夏云等
[19]
发现人胰岛素和胰岛素类似物
均可以促进干细胞的增殖，其中甘精胰岛素促细胞增殖的能力较明显。应用人体血清也可以成功的培养出MSCs，国内葛殿华等
[20]
应用人脐带血血清为主的培养
基培养UC-MSCs取得的良好的效果，Hatlapatka等
[21]
也证明了人体血清可以有效的培养扩增MSCs。当前UC-MSCs的培养体系主要应用含动物血清(如胎牛血
159
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清)的培养基，在此种环境下生长的细胞其内部机构会发生何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致的过敏反应，无血清培养基体外培养扩增UC-MSCs成为研究方向
[22]
。
2.1.4 UC-MSCs的成骨分化 UC-MSCs的成骨分化潜力首先是2004年被Wang发现的，也逐渐被国内外许多研究者证明[4-5，8，23]
。但是具体的分化基质尚不明
确。Baksh等
[24]
比较了脐带血管周围细胞与骨髓MSCs
的扩增分化能力，结果表明脐带血管周围细胞在成骨分化方面强于骨髓MSCs。并且证实了脐带血管周围细胞表达CD146这一公认的间充质细胞表面标志。同骨髓间充质细胞类似，也是通过Wnt信号途径诱导成骨分化。Hsieh等
[25]
比较脐带华通胶与骨髓来源的MSCs的分化能力，认为UC-MSCs比骨髓MSCs更易向胰腺和内皮细胞分化。他们在基因表达水平上比较了这两种细胞，结果表明UC-MSCs易表达血管生长因子相关的基因包括表皮生长因子，而骨髓来源的间充质细胞易表达成骨基因如RUNX2，DLX5。骨髓MSCs基因表达形式比脐带干细胞更类似于成骨细胞基因，暗示骨髓MSCs有较好的成骨潜力。UC-MSCs在血管再生方面有较好的优势。Majore等
[26]
也证实UC-MSCs虽可以像成骨细胞
分化，但是分化效力低下，即使经过最强的成骨诱导物质1，25-二羟基维生素D3的诱导。所以诱导UC-MSCs向成骨细胞方向的分化，是值得深入研究的问题。 2.1.5 UC-MSCs的免疫特点 UC-MSCs之所以可以用于异基因移植，是因为其具有免疫抑制作用。Weiss等
[27]
研究了脐带间充质细胞的体外免疫特点，并揭示了
UC-MSCs的一些免疫抑制机制：首先，UC-MSCs抑制一些免疫细胞的扩增，如人外周血单个核细胞、纯化的T细胞等；其次，脐带间充质细胞可以合成免疫抑制分子HLA-G6；第三，脐带间充质细胞不表达免疫反应协同刺激分子CD40，CD80，CD86；第四，脐带间充质细胞表达间充质细胞免疫调节分子白细胞介素6。Yoo等
[28]
证实了脐带间充质细胞同骨髓间充质细胞一样，具有免疫调节作用和抗炎作用。具体机制是T细胞活化时分泌γ-干扰素和肿瘤坏死因子α同时诱导间充质细胞分泌吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)抑制T细胞扩增。这些体外的脐带间充质细胞免疫特点研究结果支持早期的这一发现：异体脐带间充质细胞可以在动物模型中耐受。Cho等
[29]
研究异基因UC-MSCs移植证实，只有反复注射MHC不匹配的非活化脐带间充质细胞才产生免疫反应导致局部产生炎症。有学者也通过脐带间充质细胞异基因转移治疗动物模型诱导的帕金森病和视网膜病，没有发现产生免疫排斥反应
[30-31]
。野向阳等
[32]
应用UC-MSCs治疗人股骨头坏死并观察人体的免疫反应，结果未引起宿主免疫应答，二次移植时也未出现免疫记忆及免疫排斥。UC-MSCs少次应用是安全的，具体的
160
哈承志，等. 脐带间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展
免疫抑制机制仍需进一步探索。
2.2 UC-MSCs的载体 要想把种子细胞高效的植入骨缺损处，必须有合适的载体。而骨组织工程中理想的载体材料应具有以下几方面的特点：①良好的生物相容性即组织相容性和细胞相容性。②良好的生物降解性，基质材料在完成支架作用后应能降解，降解速度应与组织细胞生长速度相适应，降解时间应能根据组织生长特性做人为的调控。③具有三维立体多孔结构，孔隙率最好达到90%以上，具有较高的面积体积比。④具有可塑性和一定的机械强度。⑤良好的材料-细胞界面，材料可以提供良好的细胞界面，利于细胞黏附、增殖，更重要的是能激活细胞细胞特异基因表达，维持细胞正常表型表达。⑥能够便于临床医师或实验者观察处理
[33]
。从目
前各种载体材料的特性来看，单独的一种材料均无法满足上述要求。生物来源的异体脱钙骨基质，其孔隙和骨诱导特性虽然较好，但机械强度低，并存在潜在的免疫原性。胶原材料及纤维蛋白凝块具有良好的生物相容性，适合细胞生长的孔径，移植前可预先塑形，移植过程保持适当的机械强度等，但也存在吸收较快的缺点，多用于促进骨折愈合，治疗骨不连与小的骨缺损。人工合成的高聚物，如聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物、聚L-乳酸、聚乳酸等，不具有骨诱导作用，机械强度偏低，体内移植降解后局部可出现排斥反应
[34]
，缺少细胞共刺激信号
并且具有疏水性，阻碍了细胞的植入[35]
。生物陶瓷类材
料虽然生物相容性较好，但疲劳强度低、脆性大、抗折及抗冲击性远不能满足高负荷人工骨的机械强度要求。
多种支架材料复合使用可以互补长短，有利于更好地发挥各自优点，促进骨组织工程产品的修复重建效果，这将是以后的发展方向。目前已有大量关于复合支架材料使用的实验研究
[36-37]
。为了克服人工合成高聚物
的缺点，很多研究组通过对其进行表面修饰来改进其疏水性，如采用纤维蛋白凝胶、胶原、左旋多聚赖氨酸包埋等方法增加其对细胞的黏附性，最近Ramay等
[38]
通
过在PLGA中加入一种亲水性物质聚乙二醇来增加其性能，并证实其作为载体具有较高的成骨性。Maquet等
[39]
通过比较来源于华通胶的UC-MSCs在体外PCL、
PCL/HA、PCL/COLLAGEN、 PCL/HA/COLLAGEN 载体中成骨分化能力，证实含有胶原酶的载体较其他载体容易使UC-MSCs黏附、扩增、成骨分化，其中PCL/ HA/COLLAGEN的效果最好。Penolazz等
[40]
报道了应
用海藻酸盐微珠包裹华通胶干细胞作为载体，发现脐带干细胞在微胶囊内不会影响其功能，相反还会促进其分泌作用，诱导其成骨分化。在此基础上，Zhao等
[41-42]
研发了一种可注射性磷酸钙-海藻酸盐凝胶-脐带干细胞水泥。通过将脐带干细胞用水凝胶、海藻酸盐或者壳聚糖包裹然后融入磷酸钙中制成一种可注射型性的细胞载体植入骨缺损处。发现包裹的UC-MSCs不会丧失
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哈承志，等. 脐带间充质干细胞在骨组织工程中的应用进展
存活及分化能力，而且可以诱导成骨分化，在磷酸钙中加入纤维、壳聚糖、海藻酸盐等其力学指标未见降低，相反却能增加其韧性，这种可注射性载体具有缩短手术时间，减少肌肉回缩所致的损伤，降低围手术期的疼痛与瘢痕大小等优点。应用生物材料将UC-MSCs包裹，然后混入复合材料中达到双重缓释的效果逐渐成为研究方向。此外，大多数骨组织工程支架材料的黏附性较差，细胞较难吸附于材料表面，接种时难以在支架空隙内锚定并增殖。所以对支架材料的表面特性加以改造，可能会增加细胞的黏附和趋化宿主细胞的迁移以及细胞的成骨能力
[43-45]
，这些也将可能是以后的研究方向。
采用不同的工艺制备材料和根据对支架材料需求的不同将其制备成不同形状，也是近年来组织工程骨支架材料发展的一个方向。快速成形技术是近年来兴起的新型仿生制造技术，其最大的优势是可以预先设计出支架材料的大小、形状、孔径和孔隙率，然后通过计算机辅助设计软件将其转换成数字信号，再通过三维立体打印技术按照预先设定的要求直接形成支架的三维结构，不受形状复杂程度限制，有着其他传统工艺不可比拟的优势[46]
，越来越多的研究者通过这种技术设计支架材
料，以满足个体化治疗的需求。
3 讨论 综上所述，UC-MSCs同其他来源的MSCs相比拥有其独特的特点，在组织工程中有广阔的应用前景。随着国内脐血库的建立，UC-MSCs的储蓄将趋向完善。但是UC-MSCs的提取、培养、扩增、诱导分化等方法尚不完善，需要进一步研究。在脐带干细胞的载体方面，单一的材料支架目前研究已很多，但是具体应用于临床仍有较多的细节需要考虑，对于复合材料载体与可注射性载体的研究可能是今后的热点。而且通过对载体表面的修饰如添加一些生长因子、生化药物，以此来改善载体的特性也有较大研究空间。临床上骨缺损常并发骨感染，而组织工程骨本身不具有抗感染能力，移植到感染环境或是潜在的感染环境中可能因为感染而导致移植失败。将抗生素缓释技术同组织工程骨结合，可为目前临床上解决骨缺损并发感染提供新策略，进一步拓宽组织工程骨的应用范围。
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