研究性学习论文
瓶口种类与细菌滋生程度的关系
摘要：
在日常生活中使用水瓶是及其普遍的情况，不同的瓶子细菌滋生的难易程度不同，在不同的环境及不同的时间长度对细菌的滋生也有影响。我们小组对同学较常使用的瓶子进行了实验研究，主要研究方法为实验，对五种瓶子的六个部位进行了细菌滋生难易程度的测定与分析。
关键词：瓶口 细菌滋生 难易程度
论文正文
一. 问题提出
（一）问题提出的背景
每个人在学习、生活中都需要使用水瓶。而大家使用的水瓶种类也非常繁多，即买即用的矿泉水瓶、可长期存放热水的真空保温水瓶、较轻便的运动水瓶、乐扣瓶等。不同种类的瓶子瓶口也大多相异。那么，瓶口的不同是否会造成相同时间和环境下滋生细菌的难易程度不同？虽说大部分的细菌未必会对人体有害或带来疾病，但为了最大程度地避免受到细菌的“侵扰”，饮水上，我们应该关注它的细菌滋生情况。
（二）研究问题
1. 一定的培养时间与环境下，使用时间变量与细菌滋生难易程度的关系。
2. 瓶口对细菌滋生难易程度的影响因素有哪些？
3. 一定的环境下不同的瓶口种类，细菌滋生速度的变化。
**研究问题中主要概念的定义**
水瓶瓶口：本研究中水瓶为同学日常生活中普遍使用的水瓶，瓶口指喝水时嘴与瓶子接触的部分。
细菌滋生难易程度：研究中细菌滋生的难易程度主要通过细菌的滋生数量及繁衍速度进行衡量，采取等量溶液进行接种，在相同的时间内进行培养，观察比较不同瓶口采集标本的细菌滋生数量（菌落数）。
（三）研究假设
1. 假设瓶口类型的确会对细菌滋生难易程度产生影响。
2. 假设瓶口对细菌滋生难易程度的影响因素有：
（1）瓶口材质：塑料质比金属质的瓶口更易滋生细菌。
（2）瓶口的密闭程度：胶垫及螺纹部分能在一定程度上减小细菌滋生的程度。
（3）瓶口所处的温度：大部分水瓶瓶口所处温度都为室温。但对于保温瓶而言，瓶内所装
的水的温度对瓶口温度有一定影响，可能影响水瓶瓶口滋生细菌的数量。
（4）瓶内所装的液体的种类：不同的液体中含有不同的营养成分，相对而言纯净水所含的
营养成分最少。
3. 假设同种瓶口细菌滋生在一个月内呈“S ”型分布，第一、二星期细菌滋生速度较快，三、四星期细菌滋生速度减缓。
二. 文献述评
（一）已有研究
从健康网的文章中，我们可看出，在打开瓶盖嘴对瓶口直接灌饮料时，会使口腔内的细菌、手上潜在的细菌和瓶口的细菌混杂后进入到瓶中，并随着时间的流逝而不断繁殖[1]，造成许多恶劣的健康影响，如：皮肤粗糙起粉刺、口腔炎、口角炎，更严重还会引起食物中毒、身体不适等。造成这些后果的菌种主要为大肠杆菌、念珠菌、金黄色葡萄球菌。
羊城晚报提出，实际上，饮料瓶的螺纹部分仅仅起到加固作用，并不密闭。国际食品包装协会秘书长董金狮告诉记者，“真正起到密闭作用的是瓶盖上有一块突出的胶垫，在拧紧
瓶盖的同时加压紧贴瓶口，起到密封作用。”[2]由此可看出, 我们在课题开始提出的假设螺纹可一定程度抑制细菌滋生是错误的。所以尽量不要直接用嘴接触瓶盖特别是瓶口，最好是倒在自己干净的杯子里面再喝，以避免出现二次污染。
沈阳晚报记者对在市场上随机购买了8瓶饮料，用墨水进行简单试验以测试其密封性，结果令人大吃一惊，竟有5个瓶盖都渗入了蓝色水珠，被不同程度地污染。[3]矿泉水瓶的密闭性并不如我们想象中好。
曾有一条微博称：“对瓶吹等于使一年没洗的脏碗。”（“对瓶吹”即嘴对瓶口直接灌饮料）对此北京晚报记者通过广州绿洲生化科技股份有限公司技术人员的指导，做了一组试验来对此说法进行检验。得到的结论较为乐观，饮料瓶瓶盖处的缝隙可能会渗入一些细菌，但未刷洗的饭碗所滋生的细菌数量明显要比瓶口缝隙处的多。所以，“拧开饮料瓶盖，瓶口对人口就喝，相当于用一副一年不洗的碗筷吃饭”的说法未免言过其实。北京军区总医院消化内科李世荣教授提出，大部分细菌进入胃中会被胃酸杀死，所以因饮料瓶口病菌治病的几率并不大。但马路边一些小摊上将饮料浸入水中这种方法不可取，这会大大增加细菌渗入瓶口的机会。[4]
中国中医药报对两种500毫升饮料瓶进行检测，饮料瓶中分别装有无防腐剂的麦茶饮料和含糖运动饮料。将其置于室温27℃、湿度85%的房间，让5岁女孩每隔两小时共计饮用5次，每两个小时检查一次普通细菌数，直至饮料放置24小时。结果显示，两种饮料直接饮用的瓶口处均有细菌繁殖，在无防腐剂的条件下，麦茶饮料比含糖运动饮料细菌繁殖更为严重，8小时后1毫升达每3万3千CFU ，显示细菌急剧增加。[5]可见细菌的繁殖比人们想象得还要快。喝瓶装饮料，最理想的方法是将其倒在杯子里，若条件不允许，一定要对嘴喝，建议开瓶后，在4到5小时内喝完。
所找到的已有研究中大多未涉及瓶口的种类对于细菌数量的影响，主要为一次性使用的饮料瓶和矿泉水瓶的瓶口卫生状况以及瓶内液体种类对细菌滋生的影响的研究，或为瓶内液体滋生细菌情况的研究，说明我们的课题在以前并没有人做过研究。不过可以看出现在饮料瓶口及易拉罐的卫生问题已经引起人们的注意，可以作为螺旋形瓶口数据的参考资料。几篇文献中都提到了关于瓶口密封不好导致了细菌的滋生，这个也是我们需要考虑的一点，虽然我们研究的不是瓶里的细菌，但是会有一定的影响。
（二）理论基础
1．安全标准：
目前我国出台的有关饮食的安全标准及法律法规有《食品安全国家标准》、《食品添加剂使用卫生标准》、《预包装食品标签通则》、《餐饮服务食品安全操作规范》、《生活饮用水卫生标准》、《食品工具、设备用洗涤卫生标准》、《食品安全法》、《产品质量法》等，但对瓶口的相关卫生标准还未出台。
在《生活饮用水卫生标准》[6]中有如下表格
其中CFP 为指单位体积中的活菌个数。MPN 为稀释培养计数。
由此可见在饮用水标准中菌落限值较少。
但并未找到可作为瓶口细菌滋生量限值的安全标准。
2．致病菌种
（1）大肠杆菌
由维基百科介绍，大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。除某些菌型能引起腹泻外，一般不致病，能合成维生素B 和K ，对人体有益。
然而一般无害的大肠杆菌在以下三种情况下也会导致疾病：
1) 当细菌离开肠道进入泌尿道可以导致感染。
2) 当细菌由于如溃疡等导致的穿孔进入腹腔，通常会导致致命性的腹膜炎感染。
3) 大肠杆菌的某些株具有毒性（其中一些类似导致痢疾的毒素），可以导致食物中毒。[7]
（2）念珠菌
念珠菌是一种真菌，属酵母菌目，具酵母型或假菌丝型双相，酵母型为圆形或椭圆形，可产生芽生分生孢子。
可导致疾病：念珠菌菌血症，感染时会发生发烧、心跳过快、呼吸急促、低血压等类似细菌性败血症症状，死亡率达40-60%。[8]
(3)葡萄球菌
金黄色葡萄球菌为一种革兰氏染色阳性球型细菌是常见的引起食物中毒的致病菌。常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。细菌引起不同程度的化脓性炎症扩散疾病，如疖和痈、中耳炎、鼻窦炎骨髓炎、脓毒病等。[9]
3. 关于VBNC[10]
自然界中90%以上的微生物不能在人工培养基下生长，称之为不可培养微生物（VBNC ）。因此对于微生物的检测，我们仅针对致病菌种（大肠杆菌，葡萄球菌，念珠菌）进行观察。大肠杆菌属于可人工培养的革兰氏阴性菌，葡萄球菌属于可人工培养的革兰氏阳性菌。三者均可在LB 培养基上生长。故在培养细菌时我们选用LB 培养基。
三．研究方法
我们小组对这个课题采用了实验法。对瓶口的细菌进行采集及培养，培养24小时后进行观察。主要研究问题为问题一，并对问题二进行分析讨论，由于时间关系，我们在本课题中不对问题三进行研究。
步骤一：细菌样品的制作
在检测周前一周周一下午，对所有样品（瓶口）进行清洗，并用75%的酒精进行擦拭消毒。从周二开始使用。为控制变量，我们规定使用者在教室外的饮用水机装水，以控制水的来源（本研究将瓶内所装液体确定为水，防止所装液体种类对实验结果的影响）。并规定使用者每日用该水瓶饮水20口，每次饮水在同一位置（使用者自行在水瓶上标记），防止饮水次数对实验结果的影响。由于所有使用者都为本班学生，故饮水场所为本班教室，水瓶的放置地点也为本班教室，防止室温对实验结果造成误差。为减少口腔内细菌数量的明显差异，我们规定使用者在使用水瓶喝水前半个小时内不吃其它食品（如吃早餐、零食、喝饮料）。以这些措施尽可能减少实验误差。
步骤二：制作LB 培养基
LB 固体培养基（1L ）的配方[11]如下：
胰蛋白胨10g 、酵母提取物5g 、NaCl 10g、琼脂粉10-15g 、水 1000ml
实验器材
蛋白胨、酵母膏、NaCl 、琼脂粉、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、棉球、酒精灯、玻璃棒、锥形瓶、滤纸、培养皿、量筒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、记号笔、棉绳、报纸、封口膜、超净台等
操作步骤
1. 称量 按照培养基配方比例一次准确地称取胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl 、琼脂粉放入
锥形瓶中。取用药品时动作迅速，取用药品后及时将瓶盖盖好，防止蛋白胨吸潮及盖错瓶盖。在称取另一种药品前，洗净、擦干牛角匙再进行下一步操作，放置药品混杂。在将滤纸上药物倒入锥形瓶时，尽量减少药品在滤纸上的残留，减小配方的误差。
2. 溶化 在锥形瓶中加入适量水，用玻璃棒搅拌至所有药品溶化。
3. 调pH 在未调pH 前，先用pH 是指测量培养基的原始pH 值，若pH 偏酸，则向培养基中
加入适量1mol/L NaOH至培养基pH 至7左右，反之加入适量HCl 。调pH 应避免调过头而需要回调，否则将影响培养基的离子浓度。
4. 加塞包扎 在锥形瓶上用封口膜封口，并用棉线以活结形式扎好，使用时容易解开。用
标记笔注明培养基名称、组别、日期。
5. 灭菌 将上述培养基放入高压蒸汽灭菌锅中进行20分钟高压蒸汽灭菌。将培养皿洗净，
用报纸包好，与无菌水、棉球、培养基一同灭菌。
6. 倒平板 将灭菌的培养基冷至50℃左右，在超净台内进行倒平板。至平板冷却凝固后倒
置防止水汽凝结低落回平板上。
步骤三：将制作好的细菌样品接种在培养基上培养记录
每次进行平板涂布的时间为水瓶消毒使用后一星期的星期一下午。为减少操作、实验器材带来的实验误差，以及降低试验成本。实验每次使用两个培养基（平板），将每个平板分为四等分，编号为1、2、3、4、5、6，每个培养基有四分之一为空白对照组。接种前需将超净台提前打开二十分钟，以便工作台内空气是纯净的。接种时接种员的手以及工作台需用酒精棉球擦拭，避免外来杂菌的污染。将水瓶进行编号，用灼烧灭菌后的镊子夹取灭菌后的棉球蘸取无菌水，对瓶口与使用者嘴部接触位置进行擦拭后涂到培养基上相应编号处，对空白对照组用无菌水涂布，以确保涂布过程中的无菌操作到位。将涂布完成的培养基倒置，放在37℃恒温培养箱培养24小时后观察结果。
四．数据分析
一．瓶口分析
一号：
瓶口材质：塑料（p.p5）
瓶盖材质：塑料（p.p5）
有无螺纹：无
有无胶圈：无
所装液体：直饮水
密封情况：良好（试验使用水瓶倒置未出现漏
水情况，但小组内其它成员曾使用过会出
现漏水情况的同款水瓶。）
备注：水瓶与瓶盖接触部分粗糙。利用摩擦盖
紧瓶盖。
二号：
瓶口材质：塑料（p.p5）
瓶盖材质：塑料（p.p5）
有无螺纹：无
有无胶圈：有
所装液体：直饮水
密封情况：良好
备注：水瓶与瓶盖接触部分光滑。主要利用活
扣扣紧瓶盖时对瓶盖上胶圈的压力使胶圈紧贴瓶口达到密封效果。
三号：
瓶口材质：塑料（p.p ）
瓶盖材质：塑料（p.p ）
有无螺纹：有
有无胶圈：有
所装液体：直饮水
密封情况：良好
备注：利用螺纹固定瓶盖。在拧紧瓶盖的同时
加压使胶圈紧贴瓶口，起到密封作用。
四号：
瓶口材质：塑料（聚酯PET ）
瓶盖材质：塑料（聚酯PET ）
有无螺纹：有
有无胶圈：无
所装液体：直饮水
密封情况：良好
备注：瓶口与瓶盖接触部位光滑。据资料瓶盖
内部有胶垫，但在日常使用中并未发现。
五号（保温瓶使用部位1）：
瓶口材质：塑料（p.p ）
瓶盖材质：金属
有无螺纹：有
有无胶圈：无
所装液体：直饮水
密封情况：良好
备注：这种情况下使用的部位为瓶盖，按照
本课题关键词定义，将实际意义上的
“瓶盖”定义为课题中的“瓶口”，在
实验是检验其内壁，减少外部细菌及灰尘的影响。“瓶盖”指在扭紧瓶盖时与之接触的部分。
六号（保温瓶使用位置2）：
瓶口材质：金属
瓶盖材质：塑料（p.p ）
有无螺纹：有
有无胶圈：无
所装液体：直饮水
密封情况：良好
备注：保温瓶的胶圈在旋塞底部确保在旋紧旋
塞以及未按开出水口时保证其封闭性，
但与瓶口接触部分无旋塞。
**密封情况定义：本课题中密封情况指将水瓶倒置或侧置，瓶中水从瓶口处流出的情况。 在实验期间，实验者身体状况良好，没有人出现生病情况。
二．检测结果分析
由于培养后菌落生长过密，无法用具体的菌落数进行统计比较。我们在对检测结果进行分析时采用目测菌落密度的方法，对培养基中菌落密度由大到小进行排列并编号，1为最少，
在测定时，第二次操作由于无菌操作不当，培养基出现污染，空白对照组长出菌落。在第一次检测中，除一号瓶外其余瓶子瓶口所取菌种培养后为淡黄色，一号瓶菌种与其他瓶口菌种不同，颜色为深黄色。第三次检测中，除一号瓶外其余瓶口所取菌种培养后为淡黄色，一号瓶瓶口菌种与其他瓶口菌种不同，颜色为白色。
由实验结果表明，二号瓶（乐扣瓶）瓶口较难滋生细菌。而四号瓶（矿泉水瓶）瓶口最易滋生细菌。一号瓶瓶口与三号瓶瓶口滋生细菌难易程度接近，相对而言三号瓶较易滋生细菌。五号瓶口与六号瓶口滋生细菌难易程度接近。
将瓶口种类进行进一步分类，对数据进一步分析可得。
对有无螺纹
1. 对有胶圈一组：二号瓶口与三号瓶口。
该组检测结果与实验预期不同，有螺纹的三号瓶口比无螺纹的二号瓶口更易滋生细菌。
2. 对无胶圈一组：一号瓶口与四号瓶口。
由检测结果可看出，有螺纹的四号瓶口比无螺纹的一号瓶口更易滋生细菌。
由以上两组，我们可得到结论，在相同条件下，有螺纹的瓶口比无螺纹的瓶口更易滋生细菌。对该现象，我们推断，由于螺纹之间存在空隙，而螺纹增大了嘴与瓶口以及瓶盖与瓶口的接触面积，增大了细菌滋生的面积，导致细菌更易在这种瓶口滋生。
对保温瓶
3. 对保温瓶一组：五号瓶口与六号瓶口
由于学校所提供饮用水一般为温水，加上冬天使用该种水瓶主要盛装温水考虑。我们认为两个饮用位置存在一定的温差，对细菌滋生有一定影响。内瓶口（六号瓶口）比外瓶口（五号瓶口）温度较高，更适合细菌生长。从实验结果来看，六号瓶口比五号瓶口更易滋生细菌，证明了我们实验前的猜测。
对有无胶圈
4. 对无螺纹一组：一号瓶口与二号瓶口
有检测结果可看出，有胶圈的二号瓶口比之无胶圈的一号瓶口较难滋生细菌。改组还有一变量为接触面是否光滑。我们估计接触面粗糙可能使细菌滋生的面积增大，但具体影响有待进一步检测论证。
5. 对有螺纹一组：三号瓶口与四号瓶口
从检测结果可看出，无胶圈的四号瓶口比有胶圈的三号瓶口更易滋生细菌。
由以上两组，我们可初步得到结论：胶圈能在一定程度上阻碍细菌滋生，与我们的预期相符合。对于该现象，我们推断，胶圈在盖紧瓶盖时受到挤压，与瓶口贴合较紧密，减小了细菌的生存空间与所需氧气，一定程度上能够阻碍细菌滋生。
密封情况，瓶口材质及所装液体未做进一步探究。在实验中体现了控制变量的原则。
五．结论
经过实验，我们得到结论：乐扣瓶瓶口为所选入实验的几种水瓶的瓶口中最不易滋生细菌的一种，而矿泉水瓶则为最易滋生细菌的一种水瓶。橡胶圈能一定程度抑制细菌滋生，而瓶盖上的螺纹只能起到固定作用，不仅不能抑制细菌滋生，反而在一定程度上促进细菌滋生。在使用保温瓶时，使用将水倒入瓶盖（使用位置一）引用更不易滋生细菌。在瓶口虽有细菌
滋生，但并不容易使使用水瓶的人生病。
六．讨论
1. 在研究中遇到的主要困难：
（1）对瓶口使用情况的变量控制。
瓶口使用情况的变量主要有：使用者的使用次数、每次用水瓶喝水嘴部所触碰的瓶口位置、实验用水瓶在实验期间所处的环境（温度、湿度等）、水源、使用者使用水瓶前是否食用其它食品可能影响口腔内细菌数量而导致瓶口细菌更易滋生。
在研究前，我们小组对此问题进行多次讨论，以尽量减少因不同的使用者使用状况不同而影响实验结果，以及实验所用水瓶放置的环境不同对实验结果的影响。最终要求使用者在教室内使用水瓶，在实验期间将水瓶放置于教室内，以控制细菌样品制作期间的环境，防止室温及湿度等外部条件对实验结果造成误差。使用者在教室外的饮用水机装水，以控制水的来源。并规定使用者每日用该水瓶饮水20口，每次饮水在同一位置（使用者自行在水瓶上标记），防止饮水次数对实验结果的影响。为减少口腔内细菌数量的明显差异，我们规定使用者在使用水瓶喝水前半个小时内不吃其它食品（如吃早餐、零食、喝饮料）。
（2）在使用培养基培养细菌过程中的无菌操作。
我们的研究借用C201（IGEM 生物竞赛使用研究室）作为培养基制作及细菌培养的场所。在我们的实验过程中，由于无菌水污染以及C201内空气中细菌较多，导致第二次实验中培养基出现污染，导致数据无效。
2. 实验过程中的不足：
（1）在瓶口消毒后，我们应配置培养基对刚消毒还未进行细菌培养的瓶口进行涂布培养，以确保消毒后细菌数量达到最低值，且不同的瓶口在消毒后细菌数量没有较大差异，以增加实验结果的科学性与可信度。
（2）由于培养基大小的限制，培养基上细菌生长过密。我们无法对细菌滋生数量进行确切的统计，仅能通过直接观察估计细菌滋生的情况。
3. 进一步的研究方向：
（1）在本研究中，仅在保温瓶出现金属质瓶口，而其它的瓶口材质均为塑料，在后面的研究中，可寻找更多金属制瓶口与塑料瓶口的细菌滋生难易程度进行对比，以研究瓶口材质对细菌滋生难易程度的影响。
（2）对于密封性的研究，本研究中只涉及水瓶倒置瓶口是否会漏水。沈阳晚报[3]为我们提供了很好的关于水瓶瓶口密封性的研究方法。可对实验瓶口的密封性对瓶口细菌滋生的难易程度进行进一步探讨。
（3）中国医药报告诉我们，细菌滋生速度比人们想象的要快。为方便时间控制，以及实验室安排，在本研究中，我们设定的水瓶使用时间为1星期，在条件允许的情况下，可缩短使用水瓶的时间，或在一个星期内进行多次测定，能够更清楚地了解细菌滋生的速度及不同时间段内细菌滋生情况。
参考文献：
[1]瓶装水细菌多暗藏健康隐患[J/OL]. 39
http://food.39.net/a/130813/4235830.html. 健康网, 2013[2014-6-6].
[2]丁熙玮. 喝矿泉水[N]. 羊城晚报, 2012-4-14(B16).
[3]陈扶宜. 饮料与细菌有染 瓶盖“看管不严”[N]. 沈阳晚报, 2012-4-12(A15).
[4]李环宇. 对瓶吹等于使一年没洗的脏碗？[N]. 北京晚报, 2012-6-19(8).
[5]. 瓶装饮料开瓶后需五小时内喝完 否则致食物中毒[N]. 中国中医药报, 8-19(07).
[6] GB 5749-2006, 生活饮用水卫生标准[S].
[7]维基百科编者. 大肠杆菌[G/OL]. 维基百科, 2014(20140514)[2014-06-06]. .
[8]维基百科编者. 念珠菌症[G/OL]. 维基百科, 2013(20130313)[2014-06-06]. .
[9]维基百科编者. 金黄色葡萄球菌[G/OL]. 维基百科, 2013(20130308)[2014-06-06]. .
[10]维基百科编者. VBNC[G/OL]. 维基百科, 2014-06-06
[11]LB培养基配方及使用范围. [G/OL]. 丁香园微生物学和寄生虫学, 2007-08-31
附录
前期消毒
培养基上细菌滋生情况
研究性学习论文
瓶口种类与细菌滋生程度的关系
摘要：
在日常生活中使用水瓶是及其普遍的情况，不同的瓶子细菌滋生的难易程度不同，在不同的环境及不同的时间长度对细菌的滋生也有影响。我们小组对同学较常使用的瓶子进行了实验研究，主要研究方法为实验，对五种瓶子的六个部位进行了细菌滋生难易程度的测定与分析。
关键词：瓶口 细菌滋生 难易程度
论文正文
一. 问题提出
（一）问题提出的背景
每个人在学习、生活中都需要使用水瓶。而大家使用的水瓶种类也非常繁多，即买即用的矿泉水瓶、可长期存放热水的真空保温水瓶、较轻便的运动水瓶、乐扣瓶等。不同种类的瓶子瓶口也大多相异。那么，瓶口的不同是否会造成相同时间和环境下滋生细菌的难易程度不同？虽说大部分的细菌未必会对人体有害或带来疾病，但为了最大程度地避免受到细菌的“侵扰”，饮水上，我们应该关注它的细菌滋生情况。
（二）研究问题
1. 一定的培养时间与环境下，使用时间变量与细菌滋生难易程度的关系。
2. 瓶口对细菌滋生难易程度的影响因素有哪些？
3. 一定的环境下不同的瓶口种类，细菌滋生速度的变化。
**研究问题中主要概念的定义**
水瓶瓶口：本研究中水瓶为同学日常生活中普遍使用的水瓶，瓶口指喝水时嘴与瓶子接触的部分。
细菌滋生难易程度：研究中细菌滋生的难易程度主要通过细菌的滋生数量及繁衍速度进行衡量，采取等量溶液进行接种，在相同的时间内进行培养，观察比较不同瓶口采集标本的细菌滋生数量（菌落数）。
（三）研究假设
1. 假设瓶口类型的确会对细菌滋生难易程度产生影响。
2. 假设瓶口对细菌滋生难易程度的影响因素有：
（1）瓶口材质：塑料质比金属质的瓶口更易滋生细菌。
（2）瓶口的密闭程度：胶垫及螺纹部分能在一定程度上减小细菌滋生的程度。
（3）瓶口所处的温度：大部分水瓶瓶口所处温度都为室温。但对于保温瓶而言，瓶内所装
的水的温度对瓶口温度有一定影响，可能影响水瓶瓶口滋生细菌的数量。
（4）瓶内所装的液体的种类：不同的液体中含有不同的营养成分，相对而言纯净水所含的
营养成分最少。
3. 假设同种瓶口细菌滋生在一个月内呈“S ”型分布，第一、二星期细菌滋生速度较快，三、四星期细菌滋生速度减缓。
二. 文献述评
（一）已有研究
从健康网的文章中，我们可看出，在打开瓶盖嘴对瓶口直接灌饮料时，会使口腔内的细菌、手上潜在的细菌和瓶口的细菌混杂后进入到瓶中，并随着时间的流逝而不断繁殖[1]，造成许多恶劣的健康影响，如：皮肤粗糙起粉刺、口腔炎、口角炎，更严重还会引起食物中毒、身体不适等。造成这些后果的菌种主要为大肠杆菌、念珠菌、金黄色葡萄球菌。
羊城晚报提出，实际上，饮料瓶的螺纹部分仅仅起到加固作用，并不密闭。国际食品包装协会秘书长董金狮告诉记者，“真正起到密闭作用的是瓶盖上有一块突出的胶垫，在拧紧
瓶盖的同时加压紧贴瓶口，起到密封作用。”[2]由此可看出, 我们在课题开始提出的假设螺纹可一定程度抑制细菌滋生是错误的。所以尽量不要直接用嘴接触瓶盖特别是瓶口，最好是倒在自己干净的杯子里面再喝，以避免出现二次污染。
沈阳晚报记者对在市场上随机购买了8瓶饮料，用墨水进行简单试验以测试其密封性，结果令人大吃一惊，竟有5个瓶盖都渗入了蓝色水珠，被不同程度地污染。[3]矿泉水瓶的密闭性并不如我们想象中好。
曾有一条微博称：“对瓶吹等于使一年没洗的脏碗。”（“对瓶吹”即嘴对瓶口直接灌饮料）对此北京晚报记者通过广州绿洲生化科技股份有限公司技术人员的指导，做了一组试验来对此说法进行检验。得到的结论较为乐观，饮料瓶瓶盖处的缝隙可能会渗入一些细菌，但未刷洗的饭碗所滋生的细菌数量明显要比瓶口缝隙处的多。所以，“拧开饮料瓶盖，瓶口对人口就喝，相当于用一副一年不洗的碗筷吃饭”的说法未免言过其实。北京军区总医院消化内科李世荣教授提出，大部分细菌进入胃中会被胃酸杀死，所以因饮料瓶口病菌治病的几率并不大。但马路边一些小摊上将饮料浸入水中这种方法不可取，这会大大增加细菌渗入瓶口的机会。[4]
中国中医药报对两种500毫升饮料瓶进行检测，饮料瓶中分别装有无防腐剂的麦茶饮料和含糖运动饮料。将其置于室温27℃、湿度85%的房间，让5岁女孩每隔两小时共计饮用5次，每两个小时检查一次普通细菌数，直至饮料放置24小时。结果显示，两种饮料直接饮用的瓶口处均有细菌繁殖，在无防腐剂的条件下，麦茶饮料比含糖运动饮料细菌繁殖更为严重，8小时后1毫升达每3万3千CFU ，显示细菌急剧增加。[5]可见细菌的繁殖比人们想象得还要快。喝瓶装饮料，最理想的方法是将其倒在杯子里，若条件不允许，一定要对嘴喝，建议开瓶后，在4到5小时内喝完。
所找到的已有研究中大多未涉及瓶口的种类对于细菌数量的影响，主要为一次性使用的饮料瓶和矿泉水瓶的瓶口卫生状况以及瓶内液体种类对细菌滋生的影响的研究，或为瓶内液体滋生细菌情况的研究，说明我们的课题在以前并没有人做过研究。不过可以看出现在饮料瓶口及易拉罐的卫生问题已经引起人们的注意，可以作为螺旋形瓶口数据的参考资料。几篇文献中都提到了关于瓶口密封不好导致了细菌的滋生，这个也是我们需要考虑的一点，虽然我们研究的不是瓶里的细菌，但是会有一定的影响。
（二）理论基础
1．安全标准：
目前我国出台的有关饮食的安全标准及法律法规有《食品安全国家标准》、《食品添加剂使用卫生标准》、《预包装食品标签通则》、《餐饮服务食品安全操作规范》、《生活饮用水卫生标准》、《食品工具、设备用洗涤卫生标准》、《食品安全法》、《产品质量法》等，但对瓶口的相关卫生标准还未出台。
在《生活饮用水卫生标准》[6]中有如下表格
其中CFP 为指单位体积中的活菌个数。MPN 为稀释培养计数。
由此可见在饮用水标准中菌落限值较少。
但并未找到可作为瓶口细菌滋生量限值的安全标准。
2．致病菌种
（1）大肠杆菌
由维基百科介绍，大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。除某些菌型能引起腹泻外，一般不致病，能合成维生素B 和K ，对人体有益。
然而一般无害的大肠杆菌在以下三种情况下也会导致疾病：
1) 当细菌离开肠道进入泌尿道可以导致感染。
2) 当细菌由于如溃疡等导致的穿孔进入腹腔，通常会导致致命性的腹膜炎感染。
3) 大肠杆菌的某些株具有毒性（其中一些类似导致痢疾的毒素），可以导致食物中毒。[7]
（2）念珠菌
念珠菌是一种真菌，属酵母菌目，具酵母型或假菌丝型双相，酵母型为圆形或椭圆形，可产生芽生分生孢子。
可导致疾病：念珠菌菌血症，感染时会发生发烧、心跳过快、呼吸急促、低血压等类似细菌性败血症症状，死亡率达40-60%。[8]
(3)葡萄球菌
金黄色葡萄球菌为一种革兰氏染色阳性球型细菌是常见的引起食物中毒的致病菌。常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。细菌引起不同程度的化脓性炎症扩散疾病，如疖和痈、中耳炎、鼻窦炎骨髓炎、脓毒病等。[9]
3. 关于VBNC[10]
自然界中90%以上的微生物不能在人工培养基下生长，称之为不可培养微生物（VBNC ）。因此对于微生物的检测，我们仅针对致病菌种（大肠杆菌，葡萄球菌，念珠菌）进行观察。大肠杆菌属于可人工培养的革兰氏阴性菌，葡萄球菌属于可人工培养的革兰氏阳性菌。三者均可在LB 培养基上生长。故在培养细菌时我们选用LB 培养基。
三．研究方法
我们小组对这个课题采用了实验法。对瓶口的细菌进行采集及培养，培养24小时后进行观察。主要研究问题为问题一，并对问题二进行分析讨论，由于时间关系，我们在本课题中不对问题三进行研究。
步骤一：细菌样品的制作
在检测周前一周周一下午，对所有样品（瓶口）进行清洗，并用75%的酒精进行擦拭消毒。从周二开始使用。为控制变量，我们规定使用者在教室外的饮用水机装水，以控制水的来源（本研究将瓶内所装液体确定为水，防止所装液体种类对实验结果的影响）。并规定使用者每日用该水瓶饮水20口，每次饮水在同一位置（使用者自行在水瓶上标记），防止饮水次数对实验结果的影响。由于所有使用者都为本班学生，故饮水场所为本班教室，水瓶的放置地点也为本班教室，防止室温对实验结果造成误差。为减少口腔内细菌数量的明显差异，我们规定使用者在使用水瓶喝水前半个小时内不吃其它食品（如吃早餐、零食、喝饮料）。以这些措施尽可能减少实验误差。
步骤二：制作LB 培养基
LB 固体培养基（1L ）的配方[11]如下：
胰蛋白胨10g 、酵母提取物5g 、NaCl 10g、琼脂粉10-15g 、水 1000ml
实验器材
蛋白胨、酵母膏、NaCl 、琼脂粉、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、棉球、酒精灯、玻璃棒、锥形瓶、滤纸、培养皿、量筒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、记号笔、棉绳、报纸、封口膜、超净台等
操作步骤
1. 称量 按照培养基配方比例一次准确地称取胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl 、琼脂粉放入
锥形瓶中。取用药品时动作迅速，取用药品后及时将瓶盖盖好，防止蛋白胨吸潮及盖错瓶盖。在称取另一种药品前，洗净、擦干牛角匙再进行下一步操作，放置药品混杂。在将滤纸上药物倒入锥形瓶时，尽量减少药品在滤纸上的残留，减小配方的误差。
2. 溶化 在锥形瓶中加入适量水，用玻璃棒搅拌至所有药品溶化。
3. 调pH 在未调pH 前，先用pH 是指测量培养基的原始pH 值，若pH 偏酸，则向培养基中
加入适量1mol/L NaOH至培养基pH 至7左右，反之加入适量HCl 。调pH 应避免调过头而需要回调，否则将影响培养基的离子浓度。
4. 加塞包扎 在锥形瓶上用封口膜封口，并用棉线以活结形式扎好，使用时容易解开。用
标记笔注明培养基名称、组别、日期。
5. 灭菌 将上述培养基放入高压蒸汽灭菌锅中进行20分钟高压蒸汽灭菌。将培养皿洗净，
用报纸包好，与无菌水、棉球、培养基一同灭菌。
6. 倒平板 将灭菌的培养基冷至50℃左右，在超净台内进行倒平板。至平板冷却凝固后倒
置防止水汽凝结低落回平板上。
步骤三：将制作好的细菌样品接种在培养基上培养记录
每次进行平板涂布的时间为水瓶消毒使用后一星期的星期一下午。为减少操作、实验器材带来的实验误差，以及降低试验成本。实验每次使用两个培养基（平板），将每个平板分为四等分，编号为1、2、3、4、5、6，每个培养基有四分之一为空白对照组。接种前需将超净台提前打开二十分钟，以便工作台内空气是纯净的。接种时接种员的手以及工作台需用酒精棉球擦拭，避免外来杂菌的污染。将水瓶进行编号，用灼烧灭菌后的镊子夹取灭菌后的棉球蘸取无菌水，对瓶口与使用者嘴部接触位置进行擦拭后涂到培养基上相应编号处，对空白对照组用无菌水涂布，以确保涂布过程中的无菌操作到位。将涂布完成的培养基倒置，放在37℃恒温培养箱培养24小时后观察结果。
四．数据分析
一．瓶口分析
一号：
瓶口材质：塑料（p.p5）
瓶盖材质：塑料（p.p5）
有无螺纹：无
有无胶圈：无
所装液体：直饮水
密封情况：良好（试验使用水瓶倒置未出现漏
水情况，但小组内其它成员曾使用过会出
现漏水情况的同款水瓶。）
备注：水瓶与瓶盖接触部分粗糙。利用摩擦盖
紧瓶盖。
二号：
瓶口材质：塑料（p.p5）
瓶盖材质：塑料（p.p5）
有无螺纹：无
有无胶圈：有
所装液体：直饮水
密封情况：良好
备注：水瓶与瓶盖接触部分光滑。主要利用活
扣扣紧瓶盖时对瓶盖上胶圈的压力使胶圈紧贴瓶口达到密封效果。
三号：
瓶口材质：塑料（p.p ）
瓶盖材质：塑料（p.p ）
有无螺纹：有
有无胶圈：有
所装液体：直饮水
密封情况：良好
备注：利用螺纹固定瓶盖。在拧紧瓶盖的同时
加压使胶圈紧贴瓶口，起到密封作用。
四号：
瓶口材质：塑料（聚酯PET ）
瓶盖材质：塑料（聚酯PET ）
有无螺纹：有
有无胶圈：无
所装液体：直饮水
密封情况：良好
备注：瓶口与瓶盖接触部位光滑。据资料瓶盖
内部有胶垫，但在日常使用中并未发现。
五号（保温瓶使用部位1）：
瓶口材质：塑料（p.p ）
瓶盖材质：金属
有无螺纹：有
有无胶圈：无
所装液体：直饮水
密封情况：良好
备注：这种情况下使用的部位为瓶盖，按照
本课题关键词定义，将实际意义上的
“瓶盖”定义为课题中的“瓶口”，在
实验是检验其内壁，减少外部细菌及灰尘的影响。“瓶盖”指在扭紧瓶盖时与之接触的部分。
六号（保温瓶使用位置2）：
瓶口材质：金属
瓶盖材质：塑料（p.p ）
有无螺纹：有
有无胶圈：无
所装液体：直饮水
密封情况：良好
备注：保温瓶的胶圈在旋塞底部确保在旋紧旋
塞以及未按开出水口时保证其封闭性，
但与瓶口接触部分无旋塞。
**密封情况定义：本课题中密封情况指将水瓶倒置或侧置，瓶中水从瓶口处流出的情况。 在实验期间，实验者身体状况良好，没有人出现生病情况。
二．检测结果分析
由于培养后菌落生长过密，无法用具体的菌落数进行统计比较。我们在对检测结果进行分析时采用目测菌落密度的方法，对培养基中菌落密度由大到小进行排列并编号，1为最少，
在测定时，第二次操作由于无菌操作不当，培养基出现污染，空白对照组长出菌落。在第一次检测中，除一号瓶外其余瓶子瓶口所取菌种培养后为淡黄色，一号瓶菌种与其他瓶口菌种不同，颜色为深黄色。第三次检测中，除一号瓶外其余瓶口所取菌种培养后为淡黄色，一号瓶瓶口菌种与其他瓶口菌种不同，颜色为白色。
由实验结果表明，二号瓶（乐扣瓶）瓶口较难滋生细菌。而四号瓶（矿泉水瓶）瓶口最易滋生细菌。一号瓶瓶口与三号瓶瓶口滋生细菌难易程度接近，相对而言三号瓶较易滋生细菌。五号瓶口与六号瓶口滋生细菌难易程度接近。
将瓶口种类进行进一步分类，对数据进一步分析可得。
对有无螺纹
1. 对有胶圈一组：二号瓶口与三号瓶口。
该组检测结果与实验预期不同，有螺纹的三号瓶口比无螺纹的二号瓶口更易滋生细菌。
2. 对无胶圈一组：一号瓶口与四号瓶口。
由检测结果可看出，有螺纹的四号瓶口比无螺纹的一号瓶口更易滋生细菌。
由以上两组，我们可得到结论，在相同条件下，有螺纹的瓶口比无螺纹的瓶口更易滋生细菌。对该现象，我们推断，由于螺纹之间存在空隙，而螺纹增大了嘴与瓶口以及瓶盖与瓶口的接触面积，增大了细菌滋生的面积，导致细菌更易在这种瓶口滋生。
对保温瓶
3. 对保温瓶一组：五号瓶口与六号瓶口
由于学校所提供饮用水一般为温水，加上冬天使用该种水瓶主要盛装温水考虑。我们认为两个饮用位置存在一定的温差，对细菌滋生有一定影响。内瓶口（六号瓶口）比外瓶口（五号瓶口）温度较高，更适合细菌生长。从实验结果来看，六号瓶口比五号瓶口更易滋生细菌，证明了我们实验前的猜测。
对有无胶圈
4. 对无螺纹一组：一号瓶口与二号瓶口
有检测结果可看出，有胶圈的二号瓶口比之无胶圈的一号瓶口较难滋生细菌。改组还有一变量为接触面是否光滑。我们估计接触面粗糙可能使细菌滋生的面积增大，但具体影响有待进一步检测论证。
5. 对有螺纹一组：三号瓶口与四号瓶口
从检测结果可看出，无胶圈的四号瓶口比有胶圈的三号瓶口更易滋生细菌。
由以上两组，我们可初步得到结论：胶圈能在一定程度上阻碍细菌滋生，与我们的预期相符合。对于该现象，我们推断，胶圈在盖紧瓶盖时受到挤压，与瓶口贴合较紧密，减小了细菌的生存空间与所需氧气，一定程度上能够阻碍细菌滋生。
密封情况，瓶口材质及所装液体未做进一步探究。在实验中体现了控制变量的原则。
五．结论
经过实验，我们得到结论：乐扣瓶瓶口为所选入实验的几种水瓶的瓶口中最不易滋生细菌的一种，而矿泉水瓶则为最易滋生细菌的一种水瓶。橡胶圈能一定程度抑制细菌滋生，而瓶盖上的螺纹只能起到固定作用，不仅不能抑制细菌滋生，反而在一定程度上促进细菌滋生。在使用保温瓶时，使用将水倒入瓶盖（使用位置一）引用更不易滋生细菌。在瓶口虽有细菌
滋生，但并不容易使使用水瓶的人生病。
六．讨论
1. 在研究中遇到的主要困难：
（1）对瓶口使用情况的变量控制。
瓶口使用情况的变量主要有：使用者的使用次数、每次用水瓶喝水嘴部所触碰的瓶口位置、实验用水瓶在实验期间所处的环境（温度、湿度等）、水源、使用者使用水瓶前是否食用其它食品可能影响口腔内细菌数量而导致瓶口细菌更易滋生。
在研究前，我们小组对此问题进行多次讨论，以尽量减少因不同的使用者使用状况不同而影响实验结果，以及实验所用水瓶放置的环境不同对实验结果的影响。最终要求使用者在教室内使用水瓶，在实验期间将水瓶放置于教室内，以控制细菌样品制作期间的环境，防止室温及湿度等外部条件对实验结果造成误差。使用者在教室外的饮用水机装水，以控制水的来源。并规定使用者每日用该水瓶饮水20口，每次饮水在同一位置（使用者自行在水瓶上标记），防止饮水次数对实验结果的影响。为减少口腔内细菌数量的明显差异，我们规定使用者在使用水瓶喝水前半个小时内不吃其它食品（如吃早餐、零食、喝饮料）。
（2）在使用培养基培养细菌过程中的无菌操作。
我们的研究借用C201（IGEM 生物竞赛使用研究室）作为培养基制作及细菌培养的场所。在我们的实验过程中，由于无菌水污染以及C201内空气中细菌较多，导致第二次实验中培养基出现污染，导致数据无效。
2. 实验过程中的不足：
（1）在瓶口消毒后，我们应配置培养基对刚消毒还未进行细菌培养的瓶口进行涂布培养，以确保消毒后细菌数量达到最低值，且不同的瓶口在消毒后细菌数量没有较大差异，以增加实验结果的科学性与可信度。
（2）由于培养基大小的限制，培养基上细菌生长过密。我们无法对细菌滋生数量进行确切的统计，仅能通过直接观察估计细菌滋生的情况。
3. 进一步的研究方向：
（1）在本研究中，仅在保温瓶出现金属质瓶口，而其它的瓶口材质均为塑料，在后面的研究中，可寻找更多金属制瓶口与塑料瓶口的细菌滋生难易程度进行对比，以研究瓶口材质对细菌滋生难易程度的影响。
（2）对于密封性的研究，本研究中只涉及水瓶倒置瓶口是否会漏水。沈阳晚报[3]为我们提供了很好的关于水瓶瓶口密封性的研究方法。可对实验瓶口的密封性对瓶口细菌滋生的难易程度进行进一步探讨。
（3）中国医药报告诉我们，细菌滋生速度比人们想象的要快。为方便时间控制，以及实验室安排，在本研究中，我们设定的水瓶使用时间为1星期，在条件允许的情况下，可缩短使用水瓶的时间，或在一个星期内进行多次测定，能够更清楚地了解细菌滋生的速度及不同时间段内细菌滋生情况。
参考文献：
[1]瓶装水细菌多暗藏健康隐患[J/OL]. 39
http://food.39.net/a/130813/4235830.html. 健康网, 2013[2014-6-6].
[2]丁熙玮. 喝矿泉水[N]. 羊城晚报, 2012-4-14(B16).
[3]陈扶宜. 饮料与细菌有染 瓶盖“看管不严”[N]. 沈阳晚报, 2012-4-12(A15).
[4]李环宇. 对瓶吹等于使一年没洗的脏碗？[N]. 北京晚报, 2012-6-19(8).
[5]. 瓶装饮料开瓶后需五小时内喝完 否则致食物中毒[N]. 中国中医药报, 8-19(07).
[6] GB 5749-2006, 生活饮用水卫生标准[S].
[7]维基百科编者. 大肠杆菌[G/OL]. 维基百科, 2014(20140514)[2014-06-06]. .
[8]维基百科编者. 念珠菌症[G/OL]. 维基百科, 2013(20130313)[2014-06-06]. .
[9]维基百科编者. 金黄色葡萄球菌[G/OL]. 维基百科, 2013(20130308)[2014-06-06]. .
[10]维基百科编者. VBNC[G/OL]. 维基百科, 2014-06-06
[11]LB培养基配方及使用范围. [G/OL]. 丁香园微生物学和寄生虫学, 2007-08-31
附录
前期消毒
培养基上细菌滋生情况