生物学实验技术
玻璃仪器的洗涤方法很多，有机械法、化学法、物理化学法、超声波
法、蒸气法等，以及这些方法之间的交替使用或结合使用。
化学试剂的品级规格
一、国产化学药品：
1、一级品：保证试剂或优级纯，标签色为绿色。试剂杂质含量最低，纯度最高，适用于精
确分析及研究工作，常用来配制标准液。
2、二级品—分析纯，标签为红色。试剂纯度很高，仅次于“一级品”，适用于精确分析及
研究用，有时也可用来配制标准液。
3、三级品—纯，标签为蓝色，适用于一般分析和定性试验
4、四级品—化学用，标签为蓝色，纯度低，比工业用高，只适用于一般定性检验。
国产试剂的规格及质量等级
分析纯(A R ) ---相当二级品
化学纯(C P ) ---相当于三级品
实验试剂(L R ) --相当于四级品
二、英美各国的试剂规格
等级 规格符号 相当于国产规格
A R , G R , A C S , P A 一级品
C P , P U S S , L A B 二级品
L R , E P , 三级品
P u r e 四级品
三、特殊规格的试剂
B R -----生物试剂，B S ------生物染色素，I N D ----指示剂，按用途基本相同分类，不分规格
等级。
F C P ----层析，M A R ----微量分析试剂，F M P ----显微镜用，R S 、 C G S ------特殊试剂，G C ----
气体层析，T L C -----薄层层析等。
此外有的化学试剂还有各种同分异构体如D --或L --，(-) 及(+) 代表实际测得的旋光方向。
试剂的配制方法
一、直接配制法
可分为以下两类
标准溶液
配制标准溶液的物质必须具备下列条件
易于制纯和烘干，试剂应符合于G R 或A R 品级。
易于保存，制备后的溶液浓度可长久不变。
使用中能符合反应方程式所表示的结果进行，不得有副反应产生。
2、 配制标准溶液: 上述纯品进行恒重以后，直接称取一定重量溶解在定量试剂中。
直接法配制标准溶液时，注意事项：
(1) 称重时根据需要，用1/1000或1/10000的天平称重。注
(2) 用一等容量瓶，玻璃仪器洁净干燥。
(3) 溶剂应十分纯净。注
(4) 凡是用有机物作标准溶液者，配好以后要加防腐剂或用防腐剂作标准溶液
(5) 配制好的标准溶液，若需转移到其它容器中存放，则此容器必须是干燥过或经此标准溶
液多次漱洗过的。
(6) 多种标准溶液常配成浓的贮存液保存，以减少误差。
(二) 一般溶液
凡不是标准溶液，但又不要求严格控制浓度条件的试剂，可直接配制：
一般以试剂瓶签上所注明的化学式作为计算组成量的依据，按照所要求的浓度进行配制。所
用的天平可根据要求用粗天平或分析天平。可用二等品容量瓶。
二、间接配制法
有些不易恒重的固体试剂和含量不准的液体试剂，在配成浓度准确的标准溶液时，常采用间
接配制法：即先配成大约 浓度的溶液(粗配) ，再以标准溶液标定出准确浓度(精配) 。
试剂应用一级品或二级品，选择合适的标定方法(中和法、沉淀法、络合物生成法、氧化还
原法等) 、标定物、指示剂。
常用试剂浓度表示法
一、常用试剂浓度表示法
1、比例浓度: 以溶质的重量或体积与溶液的体积比来表示的浓度。如:K I (1:5) 指1g K I 加水
溶成5m l 的溶液；H C I (1:1) 指1体积的浓H C I 与1体积的水配成的溶液。
2、百分比浓度:
质量/体积百分比浓度(g /m l , W /V ) , 指100m l 溶液中所含溶质的g 数。如0. 9％N a C I 是指
100m l 溶液中含有0. 9g N a C I 。
质量百分比浓度(W /W ) 指100g 溶液中所含溶质的g 数。如98％的H 2S O 4是指在100g H 2S O 4
中含有纯H 2S O 498g 。也叫质量百分比浓度
体积百分比(m l /m l , V /V ) 是指100m l 溶液中含 溶质的m l 数。
3、摩尔浓度: 是指1000m l 溶液中所含溶质的摩尔数。用符号m o l 表示。如1M N a O H 是将
40g N a O H 溶于水定容至1000m l 。
摩尔浓度（m o l ）=溶质摩尔数/溶液体积（升）
用固体试剂配制：
所需溶质的质量=摩尔浓度×体积× 摩尔质量
用液体试剂配制：
所需质量=M V 1m /p 或所需体积=M V 1m /p d
V 1—配制溶液体积 m —溶质的摩尔质量
P —液体试剂的质量百分比浓度 d —液体试剂的比重
4、当量浓度：用1000m l 溶液中所含 溶质的克当量数来表示的浓度称之为当量浓度，以N
表示。
当量浓度=溶质的克当量数/溶液体积（升）
某酸的当量=某酸的分子量/某酸分子中可被金属置换的氢原子数
某碱的当量=某碱的分子量/某碱分子中所含的O H 根数.
某盐的当量=某盐的分子量/某盐分子中金属原子数和金属价数之积
用固体试剂配:所需试剂质量=N V E
N —当量浓度 V —溶液体积 E —溶质的克当量=分子量/n
用液体试剂配V =N V 1E /p d
5. p p m 和p p b
-6P p m 是指一百万份质量(或体积) 的溶液中含有一份质量(或体积) 的溶质，即10。
如配制20p p m 的赤霉素1000m l ，一般称取20m g ，先用酒精溶解，再加水稀释至1000m l
-9P p b 是指十亿分率, 即10。
1p p m =1000p p b
二、溶液浓度的换算
摩尔浓度=1000×比重×质量百分比浓度/溶质的摩尔质量
当量浓度=1000 ×比重×质量百分比浓度/溶质的克当量
当量浓度=摩尔浓度×溶质分子中参与反应的正价(或负价) 总数
质量百分浓度=当量浓度×溶质的克当量/1000 ×比重
质量百分浓度=质量/体积浓度（毫克/升）/104 ×比重
质量/体积浓度（m g /L ）=104质量百分浓度
第三章 生物制片技术
【教学目标和基本要求】
掌握常用固定剂、染色剂等药品的效能及使用方法，掌握石蜡切片法各步骤的操作方
法和注意事项；了解生物制片技术的主要种类，学会常见的切片法和非切片法制片技
术。
【教学内容及学时分配】（6课时）
第一节 制片技术的概念及分类
第二节 石蜡切片法制片技术
第三节 植物材料的非切片制片方法
第四节 动物材料非切片制片方法
【重点与难点】
常用的固定剂、脱水剂、染色剂及其优缺点，石蜡切片法的技术流程
【教学内容的深化与拓宽】
石蜡切片法是研究动植物体结构的常用方法，在介绍该方法同时给学生介绍一些
科研实例，可使学生增强实验设计和操作能力，为以后的研究工作打下基础。
【教学方式及教学过程中应注意的问题】
本章内容课堂讲授与实验教学相结合。以多媒体教学为主要教学手段，
【主要参考书目及网络资源】
《生物实验与实用技术》，赵树舜 杜在祥 主编，济南: 山东大学出版社，2005。
《现代细胞生物学技术》，徐承水 党本元 主编，青岛:青岛海洋大学出版社，1995。
【思考题】 1. 分别用石蜡切片法和徒手切片法设计实验过程研究某种阳性树种叶的
结构。
2. 理想的固定剂应具有哪些条件？
【课时单元授课教案】
【教学内容】
第一节 制片技术的概念及分类
一、概念: 生物制片技术是动物学、植物学、组织胚胎学、病理解剖学等生物科学及
医学科学研究观察组织细胞的生理、病理形态变化的一种重要方法。
二 、分类：生物制片法可分 为切片法和非切片法两种类型。
切片法就是将新鲜的材料经过特殊的处理，用刀切成薄片的过程。
主要有徒手、石蜡、冰冻、火棉胶切片法等。其基本过程大 致如下：
固定→冲洗 →脱水 →透明 →包埋 →切 片 →染色 →分化 →封片。
非切片法是用物理或化学的 方法，将生物体 组织分离成单全细胞或薄片，或将整个生物体
进行封藏。
常用的非切 片法有整体装片法、压片法、滴片法、解离法、伸展法等。
第二节 石蜡切片法制片技术
一、取材：新鲜、材料、大小、部位因观察的对象不同而有所差异。
二、固定：将所要观察的新鲜材料立即投入固定剂内，借助化学药品的作用，使细胞组织的
形态结构保存起来，不使其改变形态和内部物质的一种方法。
固定的作用主要是防止组织溶解和腐败凝固沉淀细胞内的物质同时又使组织硬化，增加组织
硬度，使组织不易变形，有利于以后的处理。
（一）一种理想固定剂必需具备以下几个条件
1、迅速渗入组织，杀死原生质，固定其微细结构。
2、使细胞不至于因固定引起人为的改变。
3、凝固原生质后，增加细胞对各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理而使固定了的原生
质变形。
4、不会改变原生质的体积。
5、增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。
6、具有媒染作用和增加染色能力。
7、使组织变硬，适于切片，但又不至于使 材料太坚硬而松脆。
8、固定以后，又能有保存的作用。
（二）固定过程中的一些要求
1、充足：固定液一般为材料块的20--30倍，有些水分过 多的材料，中间还要更换1--2
次新液。
2、时间：视材料的种类、性质、大小以及固定剂的种类，性质、渗透力的强弱而定。
3、 P H 值：P H 值较大的固定液，可增强染色能力。许多酸性固定液可溶解核质 和线粒体，
但能保存染色体、核仁和 纺缍丝；而一些碱性固定液 能溶解某些材料的染色质和纺缍丝，
但核仁、线 粒体可被保存。固定剂应以所观察的内容和染色剂而定。
（三）固定液的类型
单一固定液：
1、乙醇：组织保存剂，制片时的 固定剂。50%以上的乙醇都有固定作用。
酒精固定的特点是杀死快, 渗透力强，可使材料变硬。用纯酒精固定时间不宜太长，否则会
使材料发脆，但70%的酒精可较久的保存材料。
酒精可凝固蛋白质，但不能沉淀核蛋白，不适合固定染色质。
酒精能溶解类脂物，不能固定高尔基体和线粒体。
酒精是还原剂，能被氧化为醋酸，一般不与铬酸、锇酸和 重铬酸钾等氧化剂配合为固定液。
酒精与福尔马林、醋酸混合使用则效果更佳。
2、福尔马林：
市售的福尔马林约含37%---40%甲醛，单独使用时，浓度在2%---10%左右，为很好的硬化剂，
但渗透力不强。
不能使白蛋白和核蛋白凝固，但能保存类脂物，可用作高尔基体及线粒体的固定。
用福尔马林固定的材料，有利于核的染色，特别是用动物组织的固定效果更佳。
福尔马林是还原剂，易被氧化成甲酸，故不宜与氧化 剂铬酸混合使用，但若与酒精混合使
用，效果更佳。
3、醋酸
醋酸 又称乙酸，常在16、7℃以下凝成冰状固体 故名冰醋酸 。
用 0. 3%---5%的醋酸作固定液，渗透力极强，对 一般组织短时间内就可产生固定作用。
醋酸可沉淀核蛋白，所以对染色质或染色体的固定 和染色都很好，但它不能固定类脂物。
醋酸可使细胞膨胀和防止收缩；同时由于它不能凝固细胞质中的蛋白质 ，组织不会硬化 ，
因此可与引起组织变和收缩的液体相混合，起到相互平衡的作用。
4、苦味酸(三硝基苯酚）
苦味酸是极毒的黄色结晶，极易爆炸，常配成饱和水溶液贮存，它在水中的溶解度为
0. 9%---1. 2%，亦可溶于酒精、氯仿等。
可沉淀一切蛋白质，对类脂物无作用，也不能固定碳水化合物。渗透速度较慢。固定后细胞
收缩明显，收缩率达50%以上，但不使组织硬化.
苦味酸的固定时间不宜过 长，否则会影响苏木精等碱性染料的染色。
苦味酸固定组织的黄色，在以70%酒精脱水时加入少许碳酸锂饱和水溶液即可除去。
5、升汞（氯化汞）
是一种毒性很强的化合物，渗透力仅比醋酸弱。几乎可沉淀所有蛋白质，升汞能充分固定细
胞质和细胞核，并可增加对酸 性 染料的亲和力，升汞能使组织收缩，但硬化作用不强，多
与冰醋酸、铬酸盐及甲醛混合使 用。
升汞固定的材料中常存有沉 淀或结晶，因此固定后用 0. 5%的碘酒（70%酒精）洗涤，以提
出升汞；然后再用70%酒精洗涤，将碘 去掉；最后还要用0. 2%--0. 5%硫代硫酸钠溶液洗涤，
彻底去掉碘黄色。
混合固定液
1、卡诺固定液(C a r n o y s )
无水乙醇3份+冰醋酸 1份
无水乙醇6份+氯仿3份+冰醋酸 1份
此液可固定细胞质和 细胞核, 对于花粉母细胞、胚胎以 及染色体的固定均可收到良好的效
果。
此液由于有较多醋酸，所以固定速度很快，不同的组织固定的时间也不相同，如根尖固定
15分钟；花药固定1小时；动物组织因1. 5-3小时，固定无需水洗，要用纯酒精浸洗数次。
2、F A A 固定液(万能固定液)
配方：50%或70%酒精90m l +福尔马林5m l +冰醋酸5m l .
此液可用于一般植物 组织的固定，一般薄嫩的组织用50%酒精，厚硬的组织用70%酒精，醋
酸穿透力强，可缩短固定时间，有利于固定质量。一般固定5--20小时，超过时间也无妨，
固定的材料不用水洗，可直接从70%酒精开始脱水。也可用于保存材料。
3、秦克氏液（Z e n k e r ’ s )
细胞学中最常用的一种固定液，对动物细胞质、细胞核的固定效果最佳，并有利于染色。
固定时间约为18--24小时，固定后水洗12小时，以除去 组织中的重铬酸钾。当酒精分级
脱水至70%酒精时，可加少许碘，以提出留于组织中的汞。
配方：重铬酸钾2. 5g +升汞5g +硫酸钠1g +冰醋酸5m l +蒸馏水100m l
先将升汞放在蒸馏水中加热溶解，然后加重铬酸钾和硫酸钠，溶后放置，同时用少量的冰醋
酸调节p h 至2. 3。
三、洗涤与脱水
（一）洗涤：组织在固定后一定要把里面的固定液洗去，否则影响以后的染色和观察。所用
的冲洗液应依固定液的性质而定。
1. 水洗: 用流水洗涤，也可用清水浸洗，但时间要适当延长，而且应经常换水。
2. 酒精洗涤:材料自固定液取出后，可直接投入贮有适宜酒精的小瓶中，材料与酒精的比例
应以1:10为准。
洗涤的次数与时间长短，依材料的大小和性质、固定液的种类及固定时间等条件而定。固定
时间较长的、大的组织块，则洗涤时间也较长。一般在开始换洗的一二次中，每次间隔可短
些，约20---30分钟，以几次可延长到1---3小时，最可在 70%酒精中过 夜。
（二）脱水：脱水的目的在于 使组织中的 水分完全除去，并使组织变硬。注
最常用的脱水剂是乙醇，此外还有丙酮、正丁醇、叔丁醇、和苯等。
乙醇与丙酮为非石蜡溶剂，所以包埋前一定要经过透明。正丁醇和叔丁醇等石蜡熔剂，不需
要透明剂透明。苯可以代替纯酒精作脱水剂，又是一种透明剂，而且价格便宜，但缺点是使
植物组织变硬（柔软组织更不适宜）。
乙醇脱水法：为了不使材料急剧收缩和不发生其它改变，用不同浓度的酒精，从低浓度到高
浓度顺次进行，一般材料从30%酒精开始，经50% 、 70%、 80%、90%、95%至纯酒精（梯
度酒精）。对于一些脆弱薄嫩的组织，如植物嫩芽、嫩叶及部分藻类，则可从15%或20%的浓
度开始，然后每级相差10度直至纯酒精。
每级处理时间，根据材料的大小和含水情况有所区别，多则5--6小时，少则0. 5---1小时，
而最后 一级纯酒精的时间还可延长。在最初一二级酒精中的时间要比高浓度中的时间少些。
四、 透明与包埋
1. 透明：组织块或切片在非石蜡溶剂中脱水后，一定要经过透明剂透明，才能浸蜡包埋。
透明的主要目的在于使组织中的酒精或丙酮被透明剂所取代，使石蜡能顺利地进入组织中，
或增强组织的折光系数，并能和封藏剂混合进行封藏。
透明剂的种类很多，常用的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油等。这些都具有使 材料透
明的作用，同时又都是石蜡的溶剂。
(1) 二甲苯：是最常用的透明剂，透明过久，组织块容易收缩变脆，同时若脱水不净，会引
起不良后果，为了避免材料收缩，材料从纯酒精到透明剂必须逐渐转换。
二甲苯1:纯酒精2→二甲苯1:纯酒精1→ 二甲苯2:纯酒精1→纯二甲苯。
在二甲苯中的时间不宜太久，染色后的制片，一般经过5---10分钟; 切片前的材料约经1--3
小时 。
(2) 甲苯：此剂的作用与二甲苯相似，其优点是不象二甲苯那样使组织脆化；其缺点是透明
速度较慢，挥发比二甲苯快。
(3) 氯仿:火棉胶法 中常用作透明剂，此剂使组织收缩不太 强烈不使组织脆化，但挥发太
强，另外能破坏染色，所以染色后的切片不宜用它透明包埋。
(4) 苯 ：在切片技术上的用途与二 甲苯相似，但沸点较低，易挥发 ，有毒，使用时必须
小心。
2. 透蜡：是把透明好了的 材料，浸在石蜡溶液中，石蜡透入组织，替换出透明剂，为包埋
提供条件。软石蜡用于透蜡，硬石蜡用于包埋。
溶化软石蜡，把透明剂和材料倒入石蜡: 透明剂（1:1) 2--4 小时。
3、浸蜡：将带有透明剂的蜡倒出，移入纯软石蜡溶液中2--6 小时，移入硬石蜡中6--12 小
时。
透入的时间常因材料的不同而异，且以上操作均在温箱中进行。
4、包埋：把透入好的材料放在盛有蜡液的容器中，凝成含材料的蜡块，以便切片。
五、切片
常用的切片机：旋转切片机、滑行切片机、冷冻切片机 。
修切蜡块，使材料在蜡块的正中心。
蜡块固着在硬质小木块上。
用旋转切片机切片（切片厚度一般为4-10微米 ）。
六、粘片
材料切成薄片后，须将切片粘在玻璃片上，加热展开，这叫粘片。
粘片时，需把胶液(或称粘贴剂) 置载玻片上，滴加1滴蒸馏水，再取切片，浮置水面上，然
后置42℃烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸
吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃约1小时即
干。
常用的粘片胶液
明胶液：100毫升纯水中，加明胶1克，苯酚1克，甘油15m l ，36℃水浴 加热熔化，纱布
过滤备用。
七、脱蜡及复水
二甲苯→1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒
精→30％酒精→水→染色
以上各级约需5～10分钟。
八、染色
(一) . 染色液的配制：
1. 代拉菲尔德氏苏木精：
苏木精是从南美的豆科植物苏木干枝中用乙醚提取的一色素，是一种淡黄色或浅褐色
粉末状结晶，易溶于乙醇，微溶于水和甘油。
代拉菲尔德氏苏木精配制
甲液：苏木精1g 纯酒精25m l
乙液：硫酸铝铵饱和水溶液100m l
丙液：甘油25m l 甲醇25m l
将甲液一滴滴加入乙液中，随时搅动，曝晒于阳光和空气中约7---10天后，加入丙液，将
混合液静置1--2月，至颜色变深为止 ，紧塞瓶口，放于阴凉处，使用时可将染液1 份用
3---5份蒸馏水稀释，则染色后分化更明显
2. 海登汉氏铁苏木精
甲液（媒染剂）：硫酸铁铵（铁明矾）2--4g 蒸馏水100m l
乙液(染液）：10%苏木精酒精溶液5m l 蒸馏水100m l
甲液应在用 时配制。铁 明矾应为紫色 结晶，变黄后不能使用，
乙液在用 前六周配制，将0. 5g 苏木精溶于5m l 95%酒精中，置于轻塞的 瓶中使其充分氧化，
用时再加100m l 蒸馏水。此液可保存3--6个月，甲、乙液不能混合。
3. 硼砂洋红
洋红又叫胭脂红或卡红，是从一处热带昆虫胭脂虫雌虫体中提取的天然染料。
单纯的 洋红不能染色，常要和铁、铝或某些金属盐类的媒染剂一 起应用。
4%硼砂水溶液100m l 洋红2--3g 70%的酒精100m l
将洋红加入 4%硼砂水溶液中，煮沸30分钟，静置3天 后用等量70%酒精冲淡，再静置24
小时后过滤。
4. 蕃红(藏花红）
蕃红是从藏红花柱头中提取的 一 种天然染色剂，其溶解度（26℃) 在中为54. 5%，在乙醇
中约为3. 41%，可配成1%的蕃红水溶液用来染植物的木质部 。
95%酒精蕃红溶液：蕃红1g +95%酒精10m l +苯胺油4m l + 蒸馏水90 m l 。
1%蕃红水溶液：蕃红1g +蒸馏水100ml
5. 固绿：
又称 牢绿，为绿色粉 末，能溶于水及乙醇，细胞质及纤维素的染色剂。
水溶固绿：固 绿1g +蒸馏水100m l
醇溶固绿; 固绿1g +95%乙醇 100m l
固绿1g +无水乙醇100m l +苯胺油4m l
此液现配现用效果更好，多与蕃红配合进行复染。
6. 曙红:(伊红）
是染细胞质、胶原纤维、肌纤维和嗜酸性颗粒常用的染色剂，常用的有：伊红Y 和伊红B 。
0. 1--1%伊红水溶液:伊红0. 1--1g 、蒸馏水100m l
0. 1--1%伊红乙醇溶液伊红0. 1--1g 、95%乙醇100m l
7、复制伊红
先将0. 5g 伊 红溶于5m l 蒸馏水中溶解后一滴滴加入醋酸，边加边搅动，可见有沉淀生成，
至成浆糊状时再加蒸馏水100m l ，继续加冰醋酸至沉淀不再增加时过滤，将滤物于50--60℃
温箱干燥。烘干物溶于100m l 95%乙醇中即成。
用复制伊红 染色效果较好，尤其对 动物组织块的染色，效果较好。
染色方法
1、H E 染色法：
适用材料一般为动物组织，染色细胞核、细胞质。
⑴脱蜡：纯二甲苯--二甲苯:酒精（1:1）-纯酒精
⑵复水：倒酒精梯度
⑶苏木精染色，2-4小时。
⑷水洗：约15---30分钟。
⑸分色：
⑹水洗：约15---30分钟。
⑺脱水：酒精梯度，1-3分钟。
⑻伊红染色：3分钟。
⑼脱水：95%酒精--纯酒精1---纯酒精2各3-5分钟。
⑽透明：纯酒精:二甲苯(1:1) --纯二甲苯，5-7分钟。
⑾封片：
结果为：细胞核染为紫色，细胞质染成淡红色。
2、蕃红固绿对染法
适用于一般植物组织、分生组织。将细胞质、染色质、纤维素细胞壁和木质化细胞壁区分开。 ⑴脱蜡：纯二甲苯--二甲苯:酒精（1:1）-纯酒精
⑵复水：倒梯度酒精
⑶1%蕃红水溶液，染色24小时。
⑷水洗：
⑸脱水：梯度酒精至95%酒精，各一分钟。
⑹固绿酒液：半分钟。
⑺纯酒1---30秒，纯酒2---3-5分钟。
⑻透明：各5-7分钟。
⑼封片：
结果：细胞核或染色质、核仁、木质 化细胞壁为鲜红色，纺缍丝、细胞质和纤维素细胞壁为绿色。
3、番红-固绿对染流程及铁矾-苏木精染色流程
九、分化
1、分化
就是用分化剂处理因染料过多或染色时间过长而染色太深的材料，使浓染的部分褪到适当的程度。
用于分化染料的物质一般有三类：酸、氧化物和媒染剂。
（1）酸类→组织中的金属根（即媒染剂）与组织分离→与之相结合→可溶性的氯化盐或醋酸盐。
（2）一般将盐酸或冰醋酸配成稀溶液，可以分化苏木精染色的组织。
（3）氧化剂（漂白作用） → 组织上所有的染料无选择地氧化为无色物质（其作用速度） 如苦味酸，可分化苏木精的铁沉淀色素。
十、封片
封片就是将切片经染色、脱水、透明后最后用封藏剂把它封藏起来，使切片能永久保存起来，便于镜检。
第三节 植物材料的非切片制片方法
一、压片法：
是将一些柔软的材料放在载片上，用镊子或解剖针将材料拨散后，盖上玻片然后再用解剖针柄末端或铅笔平头轻压盖片，并微微振动，使材料压散成为显微观察的薄片，最后制成玻片。（适用的材料有植物的根尖、花药、愈伤组织、幼叶等。
比如植物根尖有丝分裂观察
1、取材：25℃左右，培养根尖至1-2厘米，一般为上午9--11点左右取材0. 5厘米。
2、固定保存：卡诺固定液，固定3-24小时，95%酒精冲洗一次，水冲洗二次，70%酒精保存于冰箱中。三个月左右更新一次酒精。
3、解离：1N 浓盐酸或+1N 浓盐酸+95%酒精（1:1) 解离10-14分钟，至根尖分生区为乳白色，其他部位透明，水洗三次。
4、染色:改良苯酚品红染色、1-2％醋酸洋红 10分钟左右，或0. 25%的龙胆紫溶液，染色３分钟。
5、压片：将材料放在载片上，用镊子或解剖针将材料拨散后，盖上玻片然后再用解剖针柄末端或铅笔平头轻压盖片，并微微敲击，使材料压散成为显微观察的薄片
6、观察：
7、冰冻：3-5小时
8、揭盖片：
⑴分离盖片：将压好的玻片盖片向下，斜放于盛有45%醋酸，95%酒精(1:1) 的培养皿中，5-10分钟，待盖片与载片脱离，取出载片和盖片，吸去醋酸酒精。
⑵脱水透明:95%酒精+叔丁醇(1:1) 二分钟，酒精+叔丁醇(1:3) 25分钟，叔丁醇3分钟。
9、气干：3-5天
10、透明：二甲苯
11、封片：加拿大树胶
四、涂片法：
是将液体或半滚动或 比较疏松的材料涂布到载片上制成片子的方法。
如植物花粉母细胞减数分裂制片：
1. 取 材:应在花粉母 细胞减数 分裂最盛期取 花药固定。
2. 卡诺固定液30分钟。
10 /
3. 洗涤：95%酒精换洗一次，再经90%、80%、70%、50%酒精浸洗各30分钟。
⒋离析:将材料置于1N H C I 内，放在60℃水浴中处理15分钟左右(或95%酒精:1N H C I =1:1处理2--10分钟) ，较小的花药，可不经离析，离析后用50%酒精洗3-4小时，中间换一次。 ⒌染色：苏木精染色，蒸馏水冲洗2---4小时，0. 1%盐酸酒精分色1 小时。
⒍涂片：
⒎粘固：用0. 5%火棉胶将材料粘住。
⒏脱水透明：
⒐封片：
第四节 动物材料其他制片方法
一、整体装片法：
是不经切片而将整个微小生物体、卵、器官、各发育时期胚胎封藏起来，制成玻片的方法。经取材、固定、洗涤、染色、脱水、透明、封固几个步骤，脱水时间应较长，否则不容易脱尽水分。
水螅整体装片
⑴采集:在洁净池塘水草上采集，用玻璃缸培养。
⑵固定：用40--50℃ 的热B o u i n 氏固定液固定。
⑶洗涤：70%酒精洗去黄色。
⑷染色：用 硼砂洋红染24--48小时。
⑸分色：用1%盐酸酒精分色到合适。
⑹脱水：70%→80%→95%→95% →100%→100%每级1--2小时。
⑺透明：二甲苯透明。
⑻封藏。
第四章 生物学摄影
1839年8月19 日法国画家达盖尔公布 “达盖尔银版摄影术”
一、照相机的种类：
(一) 按所用胶片的宽度分类
120相机，胶卷宽度为61m m 并有衬纸，可分为6c m X 6c m . 6c m X 7c m . 6c m X 4. 5c m . 6c m X 9c m 四种规格。
135相机，胶卷宽度35m m ，有双边片孔，又可以拍摄36张画幅的普通135相机和拍摄拭2张画幅的半幅135相机
(三) 照相机按取景方式分类：
1. 同轴取景照相机，又称单镜头反光照相机。
2. 旁轴取景照相机，包括俯视磨砂玻璃取景照相机、平视光学取景照相机 和平视框式取景照相机。
(四) 照相机按自动化程度分类：
手控曝光照相机。
半自动控制曝光照相机(其取景器内能显示出应选择的快门速度及光圈系数值) 。
自动快门照相机(光圈优先式) 。
自动光圈照相机(快门优先式) 。
11 /
二. 照相机的基本原理：
1. 针孔成像原理：
物体表面无数个光点所形成的反射光通过一个小孔投射到一个白色屏幕上就形成了该物体的影像，此像左右相反、上下倒置。
2. 透镜成像原理：
①照 相机的发明：透镜成像最早由米兰物理学家卡尔达诺发现于十六世纪，他把双透镜镶在小孔上，并获得了明亮的影像。十七世纪法国数学教授温特将木头做一个牛眼睛一样的球，在球中间凿出通光孔，用两个不同透镜镶在通光孔的两 端，并把这个装置安装在暗室的通光口上，不断变换其角度，在暗室后面的屏幕上就映出了透视感强、立体效果极佳的、不同位置的风景画面。温特的发明可以说是现代照机镜头的前身。
②透镜的种类和性能：
凸透镜：又称汇聚透镜，只有凸透镜才能结成影像，无论照相机镜头由多少凹凸程度不同的镜头组成，其最终仍是起着凸透镜的作用。
凹透镜：又称发散透镜，单纯使用凹透镜是不能结成影像，它在其中起着校正像差、使影像更加完美的作用。
透镜的焦距：一束平行光线( 封锁限远处的光束) 透过透镜后，汇聚在主轴上的点称为焦点，焦点至光心的距离为焦距。
像距：是物体的反射光通过前后透镜后，在胶卷平面上结成影像的距离。被摄物体离透镜越近，像距就越大; 反之就越小。
物距：是成像物体距透镜中心的距离。
1/物距 + 1/像距=1/焦距=常数
三. 照相机的主要部件：
由镜头、快门、取景器、测距器、卷片装置和机身等主要部件所构成。
1. 镜头：
⑴镜头的种类：
标准镜头：是指焦距长度等于底片对角线长度的镜头。
长焦镜头：如在135相机镜头系列中焦距为85m m 至300m m 的镜头称为普通远摄 镜头；300m m 至2000m m 的称为超远摄镜头。
广角镜头：焦距小于底片对角线长度的镜头。如135相机焦距小于35m m 的镜头为广角。 变焦镜头 ：焦距可连续、迅速地改变，兼起若干个定焦距镜头的作用，使用灵活方便易于选择画面构图方式但构造复杂，造价昂贵，成像质量上有时不如定焦距镜头。
⑵镜头的基本参数与性能指标：
焦距：是镜头的重要光学性质之一，镜头焦距一般为定值（变焦镜头除外）并用F 表示，标在镜头上，如F =25m m F =35m m F =90m m F =135m m 。
有效口径：又叫感光力，是镜头的最大通光能力。有效口径与镜头口径及焦距有关，一般来说，镜头口径愈大，通光能力愈强，焦距愈长则感 光力愈弱。
有效口径=最大口径/焦距。
在镜头上常有1:2 1:4等字样，表示该镜头的有效口径，越大越有利于在光线较暗的情况下拍摄，镜头价值越昂贵。
相对口径：是由光圈控制而可以改变的口径。相对口径=光孔口径/焦距。相对口径的倒数
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值称为f 系数或光圈指数，在国际上已经标准化，如f 系数：2 2. 8 4 5. 6 8 11 16 22，每相邻两级之间光通量相差1倍。
2. 快门：是控制胶片有效曝光时间的装置，以秒为单位。其功能是与光圈配合控制镜头的光通量及用于运动物体瞬间动作的抓拍。
机械快门：因其基本结构和所在位置的不同，又分为镜间快门（镜中快门）和焦点平面快门（帘幕快门）
电子快门：一般有自动测系统，测出光量后经过电子途径自动调节快门速度或光圈大小，只需摁动快门按扭。
自拍机：是一种特殊的快门装置，具有延缓快门开启的作用，延时约10秒。
速度盘：常见标有B 、1、2、4、8、15、30、60、125、250、500、1000、数据为快门速度的倒数，即为快门开启时间的倒数，单位为1/秒每前一级的光通量为后一级的2倍。B 门为1秒以上快门。
⒊取景器：是照相机上用来观察取舍景物的一种专门装置，常见的有框式取景器、光学平视取景器、反光式取景器等。
⒋测距器：是根据像距与物距，随时调整镜头的像距，使不同距离的景物获得清晰影像的装置。
连动测距器，测距器与镜头的伸缩连动。
自测式（目测式）
全自动测距，电子控制测距系统，是利用超声和声纳作用，通过小型电脑来测距调焦。 ⒌卷片装置：
⒍机身
⒎常用附件：
闪光灯
遮光罩
三脚架
快门线
一、感光片
感光片是由透明支持物构成的片基、感光的乳剂层、起粘合作用的结合层、起保护作用的保护层及阻止光晕的防光晕层等部分构成。
乳剂层：是感光片的主效层，由卤化银和明胶组成。
三、感光片的性能
1、感光度：是胶卷感光快慢的标志。1979 年，国际标准化组织统一了世界胶片感光度标准，用I S O 表示。
中国标准制 德国定制 美国标准制
G B D I N A S A
15 ° 15 ° 25
21° 21° 100
31° 31 ° 1000
6、感光片的主要照相性能存在着内在的联系：
感光度高的胶片：反差小、宽容度大、颗粒粗、解像力差、层次少、灰雾度大、保存期短。 感光度低的胶片：反差大、宽容度小、颗粒细、解像力高、层次多、灰雾度小、保存期长。 D X 编码 ：根据印在暗盒上的12格方格的不同排列组成方格码。照相机通过触点与暗盒连
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接，自动识别胶片感光度、胶片张数和曝光范围等数据
有效期：指胶片的感光性能在一定时间内保持基本不变的期限。胶片的有效期通常为两年，专业胶片更短一些。
生物摄影
一、正确曝光：
曝光又称感光，是景物通过摄影镜头形成光影 ，使胶卷乳剂层中的卤化银发生光化学反应，以潜影形式反景物影像记录下来的过程。
二、光线运用：
顺光：光线直接射到 被拍物体上，物面全是阳光部分，没有阴影，也就是照相机拍照 的方向和光的照射方向是一致的。物体明亮清晰，反差太小，缺乏层次，不利于表现物体的立体感和质感。
侧光，也称侧面光，光线方向同镜头方向夹角成45度时，为小侧光；成90度时为大侧光。光线由侧面照 射到被拍物体上，在物体上呈现一部分是阳光，一部分是阴影，而照相机的光轴和光线照射方向成一定的角度使被照物体具有立方体感。感光时应顾及到阴影部分，就是使 阳光部分稍过，以补救阴影部分 的不足，一般是顺光感光的二倍为宜。可使景物明暗有别，层次丰富，立体感与质感强烈。
逆光：光来于镜头对面 。光线是由后射到被 拍物体上，镜上的光轴下对着光源，物体上在部分或全部是阴影，感光时，应根据阴影部分的亮度 ，使这部分的影纹显出，曝光时间相应的加长，其加长的倍数应看物体 上亮度如何及有无其他光线而定，一般应与顺光的感光相差四倍。
顶光：上明下暗，反差强烈，层次缺乏，如夏季12点左右的光线。
散光:漫射光，用来拍摄较小的动植物或特写，能取得比较 柔和的影调。
三、景深效果：景深是指在照相时，不仅对准的一点景物清楚，在被拍景物前后一定范
围也是清晰的，这个能成清晰像的景物深度称为景深。
景深与光圈成反比，光圈越大，景深越浅，反之越深。
景深与距离成正比，拍摄距离越远，景深越长，反之距离越短，景深就越浅。（在光圈 距离相同的情况下，焦距越长，景深就越小，焦早期越短，景深就越大）
实际应用时，可从三种改变景深的方法中任选其一，也可综合运用。因为各有其缺陷。如光圈的缩小会受到感光量的限制，太小，则导致曝光不足；改变摄影距离，又常会受到拍摄场地的限制、更换镜头，除了经济问题外，还会错失瞬间的拍摄 良机。总之，应根据实际情况灵活运用。
五、生物学摄影的一般步骤：
⑴装胶卷：
⑵拉出并旋转胶片感光度调定圈，使 指示窗内出现的数字和装 在照相机内胶卷的感光度符合。
⑶确定光圈系数和快门速度：光圈和快门都是控制曝光的机构，二者相互联系。（数据的确定）拍照 静态景深范围长的景物，应由光圈系数来决定快门速度；如拍照 动态景深范围短的景物，应由快门速度来定光圈系数。
⑷卷片上弦：转动卷片扳手，直到扳不动为止。
⑸取景配光 根据拍照的对象和要求，进行取景配光。
14 /
光照的方向一般分为顺光、侧光和逆光。
⑹调焦 又叫对光。对光时，如果在取景器内观察到的影像有模糊现象，可来回转动调焦圈，直到 取景器内观察到 影像高度清晰为止。
⑺拍照 在上述操作完成后，按下快门按钮使 底片正确感光即完成整个拍照过程。拍照时避免照相机发生震动。
(8) 卸卷
二、感光片的冲洗
指从相机中取出的胶卷（感光片）经过显影、停影、定影、水洗、干燥成为底片的过程。 感光片冲洗过程需要显影液、停影液、定影液三种药液，每次转换时需水洗。
（一）、 显影
1、感光片显影液的化学组成及其性能：
⑴显影剂:能使感光片上的感光的卤化银银盐颗粒还原为黑色银粒，又叫还原剂。
米吐尔(对甲氨基酚硫酸盐, 又称衣仑) :显影效果平淡柔和
对苯二酚(几奴尼) :显影效果反差强硬。
⑵促进剂 :碱性的化学药品则有增加显影的能力
碳酸钠、碳酸钾、苛性钠、苛性钾和硼砂等，其中以碳酸钠为主。
⑶保护剂：能防止显影剂氧化、延长显影液寿命的物质，叫保护剂，
通常使用氧化能力较强的亚硫酸钠为保护剂。
⑷抑制剂：防止胶膜上未感光的溴化银颗粒被还原，抑制感光片阴暗部分的显影能力，增强反差的物质，叫抑制剂。常用的抑制剂是溴化钾。
⑴定影剂: 硫代硫酸钠，将感光材料中未感光的卤化银溶解。
⑵亚硫酸钠：保护剂。
⑶醋酸：一方面起停显作用，另一方面防止亚硫酸钠与钾明矾结合成白色沉淀。
⑷硼酸：可防止定影液被污染变色。
⑸硫酸铝钾：具有坚膜作用，可防止感光材料在液体内浸泡时间过长而出现药膜松软。
第五章 显微摄影
显微摄影的概念
一
二、显微摄影装置的成象原理：
利用专用 的显微摄影仪与显微镜配合进行摄影时，玻片标本通过显微镜的 物镜所成的放大实像落在显微摄影仪的摄影目镜的焦点之外(2倍焦距之内) ，可通过摄影目镜在另一侧成一再次放大的实象,
落在感光片上，使其感光。
第二节 一、显微镜的构造：机械系统、光学系统
⒈机械部分: 镜座、镜臂、物镜转换器和调焦装置。
15 /
⒉光学部分:目镜、物镜、聚光镜。
目镜：由两组凹透镜组成，有5× 10×、16×。不增加显微镜的分辨力。目镜的放大倍数不宜过大，否则影响观察效果。
物镜 ：是显微镜性能的关键部件，也是显微镜好坏的标志。物镜的种类按倍分为10倍以下的低倍镜; 40倍左右的高倍镜，90----100倍的油镜。
聚光镜：相当于一个凸透镜；可变光阑 有叶轮状和光圈状，控制照 明光线的强弱。
照明装置： 光源、反光镜和滤光器。
二、光学显微镜的主要性能
1、分辨力：是指一架显微镜或人眼在25 厘米明视距离处能分辨被检物体细微结构最小间隔的能力。光学显微镜最大分辨力不超过0. 2微米。
2、放大率 :：也叫放大倍数，在标准光学筒长时，显微镜的放大倍数等于目镜的放大倍数和物镜放大倍数的乘积。
3、清晰度：指显微镜造成明显物象的能力。
4、焦点深度：即景深。当显微镜通过调焦看清楚某一点时，不仅是这一物点而且是它的上下两 侧也能看清楚，能看清的这两 侧之间的厚度叫焦点深度。放大倍数越高，焦点深度越小。
5、显微镜的视场：叫视野。指所能看到 被检标本的范围。
6、工作距离：当显微镜看清标本时，物镜下缘到标本之间的距离叫工作距离 。
7、明视距离:从眼球的晶状体到放大的虚象之间的距离叫明视距离。其长度为250m m . .
8、机械筒长:从镜筒的抽管上缘到 物镜螺旋基部之间的长度就是机械筒长，其长度为160m m 。
9、光学筒长:由物镜的上焦平面到目镜的下焦平面之间的距离为光学筒长。其长度随机械筒长及物镜而异。
第三节
主要是由显微镜和显摄影仪两部分组成。
一、用于显微摄影的显微镜必备的条件：
第一是具有理想的内藏式照明光源。
第二是调焦方式为载物台升降式。
第三是镜臂为固定式。
二、 显微摄影仪：
一般包括接口、接筒、摄影目镜、取景器、摄影电暗箱等。
1、接口与接筒：
摄影目镜-----接筒-----接口-----显微镜
2、摄影目镜与目镜座：
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目镜座套在摄影目镜外 ，一方面 保护目镜，另一方面连接接筒与取景器。
3、取景器：
为一供取景和 调焦用的 分支光路。
4、摄影暗箱：常有135型和120型两种。
显微摄影系统 相机-接筒-望远目镜
O l y m p u s B X -50+P M 20显微摄影系统 体视显微镜
第四节
一、感光片的选择
1、黑白胶片：根据摄影暗箱规格选择胶片的尺寸规格，一般用135胶卷。
根据被摄物体的特性选择胶片感光度，切片等静止物体拍摄中可采用低感光度胶片，如G B 14-18º，可得到较强反差和较细的颗粒。
如所用标本为活体，则应选用感光速度较快的胶片，如G B 27°，但移动太快的标本应采取措施固定或使其速度变慢。
在没有特殊要求时，G B 21 °的常规胶片可以适应一般需要。
2、彩色片：柯达胶卷适于显示黄红色调，而富士彩卷适于显示蓝绿色调。
根据所摄材料的性质选择适当的感光片。高感光度胶片感光快，颗粒粗，色彩重, 适于拍摄活动对象或光线较暗时的动物；低感光度胶片感光慢，颗粒细，色彩柔和，适于拍摄静止对象。
二、滤色片的选择
滤色片的作用：增大反差，提高分辨率。
利用适当的滤色片可以提高被摄对象与背景之间或被摄对象的某些结构之间的反差，起 到突出被摄对象中某些结构的作用。
要使某种颜色成分的结构相对变暗，可选择近于此颜色的补色的滤色片；而要使这一颜色成分的结构相对变亮，可选择接近于这一颜色的滤色片。
实验:显微拍摄番红--固绿染色的植物某器官切片。
选用绿色滤色片时染上绿色的部分变得相对明亮，而染上红色的结构变得相对深暗，反差加大。采用橙色滤色片，则红色的部分相对变亮，而绿色的部分相对变暗，反差亦加大。 使用滤色片时要尽量选择能透过短波光线的滤色片(如紫、蓝、绿色的滤光片。选择好的滤色片可安装在显微镜聚光器下的滤色片托上，或直接放在镜座上部。
柯勒照明:聚焦和调中灯丝在物镜的后焦平面和聚光镜的前焦平面上在标本的像平面上产生一个最大的散焦的灯丝的像，均匀的照亮整个视野。
1) 对光：将目镜屈光度调节环放置零位
2) 用10X 物镜将标本调焦清晰, 并将灯丝调节居中。
3) 缩小视场光阑。
4) 聚光器调中:两手柄协同
5) 调整孔径光阑—满视野
6) 观察。
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换用其他物镜时应重新调整柯勒照明。
四、 曝光时间的确定
即使是带有半自动测光装置或自动曝光装置的摄影仪，其测光机构或”曝光控制系统也往往只是在采用明视野照明时起作用，而在暗视野照明和使用荧光技术等条件下，也只有通过试验来确定曝光时间；对性能不太熟悉的显微摄影装置，曝光试验可以按如下设计进行 曝光试验:
10×物镜:
¼秒、1秒 、4 秒、15秒
40×物镜:
1秒、 4秒、15秒、30秒
100×物镜:
2秒、 8秒 、30秒 、120秒
记录照明条件、摄影目镜倍率及所用物镜倍率和曝光时间，根据这一曝光试验结果，选择适当的曝光时间。
五、 手动拍摄
1、装胶卷、设置感光度数据
2、设定光源亮度
3、转换物镜，将拍摄区域移到视野正中
4、调整柯勒照明
5、根据曝光试验的数据设定曝光参数
6、调节聚焦螺旋和细调焦螺旋，使摄影望远镜中“双十字”清晰
7、按下快门针进行曝光
8、拍摄完毕，卸卷
第六章 植物组织培养技术
第一节、植物组织培养技术发展简史
1902年，德国植物学家哈伯兰特(H a b e r l a n d t ) 提出“细胞全能性”，及在试管中人工培育植物的可能性。
1937年，美国科学家怀特(W h i t e ) 配制出了植物组织培养用的培养基，并且认识到维生素和植物激素在植物组织培养中的重要作用。
1948年，我国植物生理学家崔徵和美国科学家S k o o g ，用烟草茎段和髓，发现腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。
1952年，M o r e l 和M a r t i n 首次证实通过茎尖离体培养可获无病毒植株
1953-1954年，M u i r 单倍体培养获得成功
1957年，S k o o g 和M i l l e r 提出植物激素控制器官形成的概念
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1958年，美国植物学家斯图尔德(F . C . S t e w a r d ) 用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结实。
1958-1959年，R e i n e r t 和S t e w a r d 胡萝卜愈伤组培中形成体细胞胚。
20世纪60年代以后，植物组织培养技术开始在生产上应用
1964年，G u h a 和M a h e s h w a r i 由毛曼佗罗离体花药培养胚
1971年，T a k e b e 首次由烟草原生质体获得再生植株
1972年，C a r l s o n 获得烟草的第一个体细胞杂种
第二节、组织培养的原理
一、植物组织培养常涉及的词汇
植物细胞具有全能性(c e l l u l a r t o t i p o t e n c y ) ，即任一生活细胞都包含有发展成完整植株的全部遗传信息，在适当的条件下可以培养成完整的植株
物质基础是每个细胞都有繁殖后代的全套基因。但通常情况下，只有胚性细胞具有全能性，而已分化的细胞的全能性受到限制。
在组织培养提供的条件下，已经分化的细胞可重新恢复分裂能力，即脱分化(d e d i f f e r e n t i a t i o n ) 。
C a l l u s ）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
r e d i f f e r e n t i a t i o n ）：一个成熟的植物细胞经历了脱分化后，能再分化而形成完整植株的过
程。
e m b r y o i d ）：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极
性的胚状结构。
是指利用细胞的全能性将离体培养所产生的体细胞或具有发育成完整植株能力的分生组织（胚状体，茎和茎段）包裹在一层含有营养物质并具有保护功能的外膜内形成在适宜条件下能够发育成完整植株的小颗粒。包括人工种皮，胚状体（分生组织），人工胚乳。
p r o t o p l a s t f u s i o n ) ：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。
s o m a t i c h y b r i d i z a t i o n ) ：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法称为体细胞杂交。
对称融合：父母均未处理，对后代贡献一样。
不对称融合：父母本在后代中贡献不同，须经射线处理或化学处理
胞质杂种：利用原生质体融合技术，使两种不同来源的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一
起，就形成胞质杂种。
利用植物茎尖分生组织中心部不含或含极少病毒的特点培养出无病毒植株的
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技术
二、组织培养的意义
1、基础理论研究方面:试验体系的准确性和可重复性，广泛用于细胞、组织的代谢生理及其它生化等方面的研究。
2、应用研究:无性繁殖系快速繁殖的生产、试管苗的商品化，遗传育种，种质保存，克服远缘杂交，种质资源创新，获得转基因植株等。
器官发生途径：
1、茎尖或茎段培养产生腋芽
2、直接不定芽发生
3、间接不定芽发生
胚胎发生方式：
1 、 直接胚胎发生
2 、 间接胚胎发生
球型胚（g l o b a l e m b r y o ）→ 心型胚（h e a r t -s t a g e e m b r y o ）→ 鱼雷型胚（t o r p e d o -s t a g e e m b r y o ）→ 子叶型胚（c y t o l e d o n -s t a g e e m b r y o ）
第三节、组织培养对场所和设备的要求
依所培养的对象，即外植体材料不同可分为：
1. 器官培养：选用植物器官（如茎、芽、叶等）为材料。
2. 胚胎培养：选用成熟的胚为材料进行培养，多用于育苗，提高成苗率。选用未成熟胚进行培养，则用于远缘杂交，克服胚的败育现象，使其获行新植株。
3. 子房和胚珠的培养：常用于遗传育种上，用其进行试管受精，便于远缘杂交。
4. 原生质体的培养和融合：培养裸露的植物细胞，使两个植物的原生质体融合，而形成新的个体，即进行植物体细胞的杂交。
获得无菌外植体，建立起无菌培养体系
（一） 外植体的准备
1. 外植体选择的原则：
（1）、必须含有活细胞。
（2）、幼嫩组织所含活跃分裂的细胞比例高。
（3）、母株必须健康并且无任何腐烂或生病的迹象。
（4）、母株必须活跃生长并且不会立即进入休眠。
2. 外植体的部位选择：
（1） 茎尖
（2）茎段
（3）叶
（4）花球和花蕾
（5）种子、根、块根、块茎、花瓣等
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（二）消毒：70%乙醇消毒约，1升汞消毒约
（三）培养基的制备
1、培养基的组成
化学合成培养基大致由6种成分组成：①糖类，②多种无机盐类，③微量元素，④氨基酸、酰胺、嘌呤：⑤维生素；⑥生长素。
有些培养基还可添加天然的汁液，如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麦芽浸出液等 培养基中如加入0．5～1％的琼脂即为静止培养的固体培养基，否则为悬浮培养的液体培养基。
培养基配方的种类M S （M u r a s h i g e a n d S k o o g ）培养基配方为最常用的一种基本培养基，它利于一般植物组织和细胞的快速生长。
（1）水
（2）无机成分：
无机大量元素 氮： 铵态氮、硝态氮混合
磷： 磷酸盐
钾： 钾盐
钙、硫、镁
无机微量元素
主要有：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯
（3）有机成分：
糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。
（4）植物生长调节物质：
生长素类：N A A 、I A A 、I B A 、2, 4-D
细胞分裂素类：B A P , K T ，T D z ，Z T
其他类： G A 3, A B A ， P P 333
（5）琼脂
（6）调整p H 值到5. 8
3、各营养成分的作用
（1）无机营养物
主要由大量元素和微量元素两部分组成
大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮。
磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。
钾是培养基中主要的阳离子。钙、钠、镁的需要则较少，钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。
微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即F e S O 4与N a 2—E D T A （螯合剂）的混合。
（2）培养基中的有机成分
碳源:培养基中的碳水化合物通常是蔗糖(碳源和能源，维持培养基的渗透压)
维生素:B 族，主要有维生素B 1、维生素B 6、生物素、泛酸钙和肌醇等。
有机附加物:包括人工合成或天然的有机附加物。有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸、琼脂等。
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(1) 植物生长素类:如吲哚乙酸（I A A ）、萘乙酸（N A A ）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D ）。
(2) 细胞分裂素:如玉米素（Z t ）、6-苄基嘌呤（6-B A 或B A P ）和激动素（K t ）。
(3) 赤霉素:组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（G A 3）。
铁盐：7. 45g N a 2-E D T A (乙二铵四乙酸二钠) 和5. 57g F e S O 4. 7H 2O 溶于1L 水中，配1L 培养基时取此液5m l
大量元素：将药品称取后分别溶解再依顺序混合定溶，配成10倍浓度的母液，每配制1L 培养基时取母液100m l
微量元素：微量元素用量少，为称取方便精确，常配成100倍或1000倍的母液，每配制1L 培养基时取母液10m l 或1m l
有机化合物：可配成100倍或1000倍的母液每配制1L 培养基时取母液10m l 或1m l 激素的配制
植物激素：配制成0. 1--0. 5m g /m l 的溶液。
萘乙酸（N N A ）可溶于热水中或先溶于少量95％酒精中再加水至一定浓度
吲哚丁酸（I B A ）可先用少量0. 4％的N a O H 溶液溶解，再加水到一定浓度
吲哚乙酸（I A A ）可先溶于少量95％酒精中，再加水到一定浓度
细胞分裂素：6---苄基嘌呤（6--B A ）、激动素（K T ）需用3. 65％的H C I 或0. 4％N a O H 溶液先溶解后再加水到一定浓度
5、培养基的制备程序
依次吸取各种溶液混合 → 将蔗糖放入溶化的琼脂中溶解 → 注入混合液→ 搅拌均匀 → 用0. 4％的N a O H 或3. 65％的H C l 调节p H (5. 7) → 分装于三角瓶等培养容器内，用锡箔纸
2等将容器口封紧包好 → 放入高压锅中灭菌(1. 1K g /c m 压力, 灭菌15—20m i n ) → 取出冷
却凝固备用。
冷却后放到培养室预培养3天，观察有没有杂菌污染
打开灭菌锅盖，向锅内加水。
加水后，将待灭菌的物品放入锅内，不要放的太多，以免影响灭菌效果。物品不要近靠锅壁，以免冷凝水顺壁流入物品中。
加盖旋紧螺旋。
打开放汽阀，加热，自开始产生蒸汽后5分钟，再关紧放汽阀，此时锅内的冷空气已由排气孔排尽，让温度随蒸汽压力的增高而上升。
5 待压力逐渐上升到所需压力时（一般为15磅/时， 1. 034×10P a ）, 灭菌20分钟。
灭菌后，待压力降至0时，开盖，取出灭菌物品。（在压力未完全下降前，切勿打开锅盖）。
（四）接种
①表面消毒。
②切割
③接种
④消毒
⑤密封
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（五）培养
开始进行一定时间的暗培养，之后先用合适的光照和温度进行培养。
培养过程中随时观察与记录，统计实验结果。
室温应控制在23～26℃，每天12～16小时光照，光照度为1000～3000勒克斯。
（六）继代培养
愈伤组织的培养:
继代培养: 在严格的无菌条件下(接种箱内) 将愈伤组织切割后转接到新的培养基上。 继代培养可多次连续进行。根据需要可随时中断继代培养，转接到分化培养基上催苗。 常用的继代培养和生芽培养基配方：M S 培养基+6B A (0. 5--1. 0 m g /L ) +N A A (0. 1--0. 15 m g /L ) 。
（七）分化培养
试管苗的培养分为生芽培养和生根培养。
生芽大约需要4～6周的时间(用上述生芽培养基) ，而生根培养1周以后就可以见到幼根了。注意，试管苗应该进行见光培养。
生根培养的培养基配方是：M S 培养基+N A A (0. 1--0. 5 m g /L ) 。 N A A 起促进生根的作用 试管苗
（八）炼苗与移栽
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生物学实验技术
玻璃仪器的洗涤方法很多，有机械法、化学法、物理化学法、超声波
法、蒸气法等，以及这些方法之间的交替使用或结合使用。
化学试剂的品级规格
一、国产化学药品：
1、一级品：保证试剂或优级纯，标签色为绿色。试剂杂质含量最低，纯度最高，适用于精
确分析及研究工作，常用来配制标准液。
2、二级品—分析纯，标签为红色。试剂纯度很高，仅次于“一级品”，适用于精确分析及
研究用，有时也可用来配制标准液。
3、三级品—纯，标签为蓝色，适用于一般分析和定性试验
4、四级品—化学用，标签为蓝色，纯度低，比工业用高，只适用于一般定性检验。
国产试剂的规格及质量等级
分析纯(A R ) ---相当二级品
化学纯(C P ) ---相当于三级品
实验试剂(L R ) --相当于四级品
二、英美各国的试剂规格
等级 规格符号 相当于国产规格
A R , G R , A C S , P A 一级品
C P , P U S S , L A B 二级品
L R , E P , 三级品
P u r e 四级品
三、特殊规格的试剂
B R -----生物试剂，B S ------生物染色素，I N D ----指示剂，按用途基本相同分类，不分规格
等级。
F C P ----层析，M A R ----微量分析试剂，F M P ----显微镜用，R S 、 C G S ------特殊试剂，G C ----
气体层析，T L C -----薄层层析等。
此外有的化学试剂还有各种同分异构体如D --或L --，(-) 及(+) 代表实际测得的旋光方向。
试剂的配制方法
一、直接配制法
可分为以下两类
标准溶液
配制标准溶液的物质必须具备下列条件
易于制纯和烘干，试剂应符合于G R 或A R 品级。
易于保存，制备后的溶液浓度可长久不变。
使用中能符合反应方程式所表示的结果进行，不得有副反应产生。
2、 配制标准溶液: 上述纯品进行恒重以后，直接称取一定重量溶解在定量试剂中。
直接法配制标准溶液时，注意事项：
(1) 称重时根据需要，用1/1000或1/10000的天平称重。注
(2) 用一等容量瓶，玻璃仪器洁净干燥。
(3) 溶剂应十分纯净。注
(4) 凡是用有机物作标准溶液者，配好以后要加防腐剂或用防腐剂作标准溶液
(5) 配制好的标准溶液，若需转移到其它容器中存放，则此容器必须是干燥过或经此标准溶
液多次漱洗过的。
(6) 多种标准溶液常配成浓的贮存液保存，以减少误差。
(二) 一般溶液
凡不是标准溶液，但又不要求严格控制浓度条件的试剂，可直接配制：
一般以试剂瓶签上所注明的化学式作为计算组成量的依据，按照所要求的浓度进行配制。所
用的天平可根据要求用粗天平或分析天平。可用二等品容量瓶。
二、间接配制法
有些不易恒重的固体试剂和含量不准的液体试剂，在配成浓度准确的标准溶液时，常采用间
接配制法：即先配成大约 浓度的溶液(粗配) ，再以标准溶液标定出准确浓度(精配) 。
试剂应用一级品或二级品，选择合适的标定方法(中和法、沉淀法、络合物生成法、氧化还
原法等) 、标定物、指示剂。
常用试剂浓度表示法
一、常用试剂浓度表示法
1、比例浓度: 以溶质的重量或体积与溶液的体积比来表示的浓度。如:K I (1:5) 指1g K I 加水
溶成5m l 的溶液；H C I (1:1) 指1体积的浓H C I 与1体积的水配成的溶液。
2、百分比浓度:
质量/体积百分比浓度(g /m l , W /V ) , 指100m l 溶液中所含溶质的g 数。如0. 9％N a C I 是指
100m l 溶液中含有0. 9g N a C I 。
质量百分比浓度(W /W ) 指100g 溶液中所含溶质的g 数。如98％的H 2S O 4是指在100g H 2S O 4
中含有纯H 2S O 498g 。也叫质量百分比浓度
体积百分比(m l /m l , V /V ) 是指100m l 溶液中含 溶质的m l 数。
3、摩尔浓度: 是指1000m l 溶液中所含溶质的摩尔数。用符号m o l 表示。如1M N a O H 是将
40g N a O H 溶于水定容至1000m l 。
摩尔浓度（m o l ）=溶质摩尔数/溶液体积（升）
用固体试剂配制：
所需溶质的质量=摩尔浓度×体积× 摩尔质量
用液体试剂配制：
所需质量=M V 1m /p 或所需体积=M V 1m /p d
V 1—配制溶液体积 m —溶质的摩尔质量
P —液体试剂的质量百分比浓度 d —液体试剂的比重
4、当量浓度：用1000m l 溶液中所含 溶质的克当量数来表示的浓度称之为当量浓度，以N
表示。
当量浓度=溶质的克当量数/溶液体积（升）
某酸的当量=某酸的分子量/某酸分子中可被金属置换的氢原子数
某碱的当量=某碱的分子量/某碱分子中所含的O H 根数.
某盐的当量=某盐的分子量/某盐分子中金属原子数和金属价数之积
用固体试剂配:所需试剂质量=N V E
N —当量浓度 V —溶液体积 E —溶质的克当量=分子量/n
用液体试剂配V =N V 1E /p d
5. p p m 和p p b
-6P p m 是指一百万份质量(或体积) 的溶液中含有一份质量(或体积) 的溶质，即10。
如配制20p p m 的赤霉素1000m l ，一般称取20m g ，先用酒精溶解，再加水稀释至1000m l
-9P p b 是指十亿分率, 即10。
1p p m =1000p p b
二、溶液浓度的换算
摩尔浓度=1000×比重×质量百分比浓度/溶质的摩尔质量
当量浓度=1000 ×比重×质量百分比浓度/溶质的克当量
当量浓度=摩尔浓度×溶质分子中参与反应的正价(或负价) 总数
质量百分浓度=当量浓度×溶质的克当量/1000 ×比重
质量百分浓度=质量/体积浓度（毫克/升）/104 ×比重
质量/体积浓度（m g /L ）=104质量百分浓度
第三章 生物制片技术
【教学目标和基本要求】
掌握常用固定剂、染色剂等药品的效能及使用方法，掌握石蜡切片法各步骤的操作方
法和注意事项；了解生物制片技术的主要种类，学会常见的切片法和非切片法制片技
术。
【教学内容及学时分配】（6课时）
第一节 制片技术的概念及分类
第二节 石蜡切片法制片技术
第三节 植物材料的非切片制片方法
第四节 动物材料非切片制片方法
【重点与难点】
常用的固定剂、脱水剂、染色剂及其优缺点，石蜡切片法的技术流程
【教学内容的深化与拓宽】
石蜡切片法是研究动植物体结构的常用方法，在介绍该方法同时给学生介绍一些
科研实例，可使学生增强实验设计和操作能力，为以后的研究工作打下基础。
【教学方式及教学过程中应注意的问题】
本章内容课堂讲授与实验教学相结合。以多媒体教学为主要教学手段，
【主要参考书目及网络资源】
《生物实验与实用技术》，赵树舜 杜在祥 主编，济南: 山东大学出版社，2005。
《现代细胞生物学技术》，徐承水 党本元 主编，青岛:青岛海洋大学出版社，1995。
【思考题】 1. 分别用石蜡切片法和徒手切片法设计实验过程研究某种阳性树种叶的
结构。
2. 理想的固定剂应具有哪些条件？
【课时单元授课教案】
【教学内容】
第一节 制片技术的概念及分类
一、概念: 生物制片技术是动物学、植物学、组织胚胎学、病理解剖学等生物科学及
医学科学研究观察组织细胞的生理、病理形态变化的一种重要方法。
二 、分类：生物制片法可分 为切片法和非切片法两种类型。
切片法就是将新鲜的材料经过特殊的处理，用刀切成薄片的过程。
主要有徒手、石蜡、冰冻、火棉胶切片法等。其基本过程大 致如下：
固定→冲洗 →脱水 →透明 →包埋 →切 片 →染色 →分化 →封片。
非切片法是用物理或化学的 方法，将生物体 组织分离成单全细胞或薄片，或将整个生物体
进行封藏。
常用的非切 片法有整体装片法、压片法、滴片法、解离法、伸展法等。
第二节 石蜡切片法制片技术
一、取材：新鲜、材料、大小、部位因观察的对象不同而有所差异。
二、固定：将所要观察的新鲜材料立即投入固定剂内，借助化学药品的作用，使细胞组织的
形态结构保存起来，不使其改变形态和内部物质的一种方法。
固定的作用主要是防止组织溶解和腐败凝固沉淀细胞内的物质同时又使组织硬化，增加组织
硬度，使组织不易变形，有利于以后的处理。
（一）一种理想固定剂必需具备以下几个条件
1、迅速渗入组织，杀死原生质，固定其微细结构。
2、使细胞不至于因固定引起人为的改变。
3、凝固原生质后，增加细胞对各种穿透的抵抗力，不至于因以后的处理而使固定了的原生
质变形。
4、不会改变原生质的体积。
5、增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。
6、具有媒染作用和增加染色能力。
7、使组织变硬，适于切片，但又不至于使 材料太坚硬而松脆。
8、固定以后，又能有保存的作用。
（二）固定过程中的一些要求
1、充足：固定液一般为材料块的20--30倍，有些水分过 多的材料，中间还要更换1--2
次新液。
2、时间：视材料的种类、性质、大小以及固定剂的种类，性质、渗透力的强弱而定。
3、 P H 值：P H 值较大的固定液，可增强染色能力。许多酸性固定液可溶解核质 和线粒体，
但能保存染色体、核仁和 纺缍丝；而一些碱性固定液 能溶解某些材料的染色质和纺缍丝，
但核仁、线 粒体可被保存。固定剂应以所观察的内容和染色剂而定。
（三）固定液的类型
单一固定液：
1、乙醇：组织保存剂，制片时的 固定剂。50%以上的乙醇都有固定作用。
酒精固定的特点是杀死快, 渗透力强，可使材料变硬。用纯酒精固定时间不宜太长，否则会
使材料发脆，但70%的酒精可较久的保存材料。
酒精可凝固蛋白质，但不能沉淀核蛋白，不适合固定染色质。
酒精能溶解类脂物，不能固定高尔基体和线粒体。
酒精是还原剂，能被氧化为醋酸，一般不与铬酸、锇酸和 重铬酸钾等氧化剂配合为固定液。
酒精与福尔马林、醋酸混合使用则效果更佳。
2、福尔马林：
市售的福尔马林约含37%---40%甲醛，单独使用时，浓度在2%---10%左右，为很好的硬化剂，
但渗透力不强。
不能使白蛋白和核蛋白凝固，但能保存类脂物，可用作高尔基体及线粒体的固定。
用福尔马林固定的材料，有利于核的染色，特别是用动物组织的固定效果更佳。
福尔马林是还原剂，易被氧化成甲酸，故不宜与氧化 剂铬酸混合使用，但若与酒精混合使
用，效果更佳。
3、醋酸
醋酸 又称乙酸，常在16、7℃以下凝成冰状固体 故名冰醋酸 。
用 0. 3%---5%的醋酸作固定液，渗透力极强，对 一般组织短时间内就可产生固定作用。
醋酸可沉淀核蛋白，所以对染色质或染色体的固定 和染色都很好，但它不能固定类脂物。
醋酸可使细胞膨胀和防止收缩；同时由于它不能凝固细胞质中的蛋白质 ，组织不会硬化 ，
因此可与引起组织变和收缩的液体相混合，起到相互平衡的作用。
4、苦味酸(三硝基苯酚）
苦味酸是极毒的黄色结晶，极易爆炸，常配成饱和水溶液贮存，它在水中的溶解度为
0. 9%---1. 2%，亦可溶于酒精、氯仿等。
可沉淀一切蛋白质，对类脂物无作用，也不能固定碳水化合物。渗透速度较慢。固定后细胞
收缩明显，收缩率达50%以上，但不使组织硬化.
苦味酸的固定时间不宜过 长，否则会影响苏木精等碱性染料的染色。
苦味酸固定组织的黄色，在以70%酒精脱水时加入少许碳酸锂饱和水溶液即可除去。
5、升汞（氯化汞）
是一种毒性很强的化合物，渗透力仅比醋酸弱。几乎可沉淀所有蛋白质，升汞能充分固定细
胞质和细胞核，并可增加对酸 性 染料的亲和力，升汞能使组织收缩，但硬化作用不强，多
与冰醋酸、铬酸盐及甲醛混合使 用。
升汞固定的材料中常存有沉 淀或结晶，因此固定后用 0. 5%的碘酒（70%酒精）洗涤，以提
出升汞；然后再用70%酒精洗涤，将碘 去掉；最后还要用0. 2%--0. 5%硫代硫酸钠溶液洗涤，
彻底去掉碘黄色。
混合固定液
1、卡诺固定液(C a r n o y s )
无水乙醇3份+冰醋酸 1份
无水乙醇6份+氯仿3份+冰醋酸 1份
此液可固定细胞质和 细胞核, 对于花粉母细胞、胚胎以 及染色体的固定均可收到良好的效
果。
此液由于有较多醋酸，所以固定速度很快，不同的组织固定的时间也不相同，如根尖固定
15分钟；花药固定1小时；动物组织因1. 5-3小时，固定无需水洗，要用纯酒精浸洗数次。
2、F A A 固定液(万能固定液)
配方：50%或70%酒精90m l +福尔马林5m l +冰醋酸5m l .
此液可用于一般植物 组织的固定，一般薄嫩的组织用50%酒精，厚硬的组织用70%酒精，醋
酸穿透力强，可缩短固定时间，有利于固定质量。一般固定5--20小时，超过时间也无妨，
固定的材料不用水洗，可直接从70%酒精开始脱水。也可用于保存材料。
3、秦克氏液（Z e n k e r ’ s )
细胞学中最常用的一种固定液，对动物细胞质、细胞核的固定效果最佳，并有利于染色。
固定时间约为18--24小时，固定后水洗12小时，以除去 组织中的重铬酸钾。当酒精分级
脱水至70%酒精时，可加少许碘，以提出留于组织中的汞。
配方：重铬酸钾2. 5g +升汞5g +硫酸钠1g +冰醋酸5m l +蒸馏水100m l
先将升汞放在蒸馏水中加热溶解，然后加重铬酸钾和硫酸钠，溶后放置，同时用少量的冰醋
酸调节p h 至2. 3。
三、洗涤与脱水
（一）洗涤：组织在固定后一定要把里面的固定液洗去，否则影响以后的染色和观察。所用
的冲洗液应依固定液的性质而定。
1. 水洗: 用流水洗涤，也可用清水浸洗，但时间要适当延长，而且应经常换水。
2. 酒精洗涤:材料自固定液取出后，可直接投入贮有适宜酒精的小瓶中，材料与酒精的比例
应以1:10为准。
洗涤的次数与时间长短，依材料的大小和性质、固定液的种类及固定时间等条件而定。固定
时间较长的、大的组织块，则洗涤时间也较长。一般在开始换洗的一二次中，每次间隔可短
些，约20---30分钟，以几次可延长到1---3小时，最可在 70%酒精中过 夜。
（二）脱水：脱水的目的在于 使组织中的 水分完全除去，并使组织变硬。注
最常用的脱水剂是乙醇，此外还有丙酮、正丁醇、叔丁醇、和苯等。
乙醇与丙酮为非石蜡溶剂，所以包埋前一定要经过透明。正丁醇和叔丁醇等石蜡熔剂，不需
要透明剂透明。苯可以代替纯酒精作脱水剂，又是一种透明剂，而且价格便宜，但缺点是使
植物组织变硬（柔软组织更不适宜）。
乙醇脱水法：为了不使材料急剧收缩和不发生其它改变，用不同浓度的酒精，从低浓度到高
浓度顺次进行，一般材料从30%酒精开始，经50% 、 70%、 80%、90%、95%至纯酒精（梯
度酒精）。对于一些脆弱薄嫩的组织，如植物嫩芽、嫩叶及部分藻类，则可从15%或20%的浓
度开始，然后每级相差10度直至纯酒精。
每级处理时间，根据材料的大小和含水情况有所区别，多则5--6小时，少则0. 5---1小时，
而最后 一级纯酒精的时间还可延长。在最初一二级酒精中的时间要比高浓度中的时间少些。
四、 透明与包埋
1. 透明：组织块或切片在非石蜡溶剂中脱水后，一定要经过透明剂透明，才能浸蜡包埋。
透明的主要目的在于使组织中的酒精或丙酮被透明剂所取代，使石蜡能顺利地进入组织中，
或增强组织的折光系数，并能和封藏剂混合进行封藏。
透明剂的种类很多，常用的有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油等。这些都具有使 材料透
明的作用，同时又都是石蜡的溶剂。
(1) 二甲苯：是最常用的透明剂，透明过久，组织块容易收缩变脆，同时若脱水不净，会引
起不良后果，为了避免材料收缩，材料从纯酒精到透明剂必须逐渐转换。
二甲苯1:纯酒精2→二甲苯1:纯酒精1→ 二甲苯2:纯酒精1→纯二甲苯。
在二甲苯中的时间不宜太久，染色后的制片，一般经过5---10分钟; 切片前的材料约经1--3
小时 。
(2) 甲苯：此剂的作用与二甲苯相似，其优点是不象二甲苯那样使组织脆化；其缺点是透明
速度较慢，挥发比二甲苯快。
(3) 氯仿:火棉胶法 中常用作透明剂，此剂使组织收缩不太 强烈不使组织脆化，但挥发太
强，另外能破坏染色，所以染色后的切片不宜用它透明包埋。
(4) 苯 ：在切片技术上的用途与二 甲苯相似，但沸点较低，易挥发 ，有毒，使用时必须
小心。
2. 透蜡：是把透明好了的 材料，浸在石蜡溶液中，石蜡透入组织，替换出透明剂，为包埋
提供条件。软石蜡用于透蜡，硬石蜡用于包埋。
溶化软石蜡，把透明剂和材料倒入石蜡: 透明剂（1:1) 2--4 小时。
3、浸蜡：将带有透明剂的蜡倒出，移入纯软石蜡溶液中2--6 小时，移入硬石蜡中6--12 小
时。
透入的时间常因材料的不同而异，且以上操作均在温箱中进行。
4、包埋：把透入好的材料放在盛有蜡液的容器中，凝成含材料的蜡块，以便切片。
五、切片
常用的切片机：旋转切片机、滑行切片机、冷冻切片机 。
修切蜡块，使材料在蜡块的正中心。
蜡块固着在硬质小木块上。
用旋转切片机切片（切片厚度一般为4-10微米 ）。
六、粘片
材料切成薄片后，须将切片粘在玻璃片上，加热展开，这叫粘片。
粘片时，需把胶液(或称粘贴剂) 置载玻片上，滴加1滴蒸馏水，再取切片，浮置水面上，然
后置42℃烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸
吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃约1小时即
干。
常用的粘片胶液
明胶液：100毫升纯水中，加明胶1克，苯酚1克，甘油15m l ，36℃水浴 加热熔化，纱布
过滤备用。
七、脱蜡及复水
二甲苯→1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒
精→30％酒精→水→染色
以上各级约需5～10分钟。
八、染色
(一) . 染色液的配制：
1. 代拉菲尔德氏苏木精：
苏木精是从南美的豆科植物苏木干枝中用乙醚提取的一色素，是一种淡黄色或浅褐色
粉末状结晶，易溶于乙醇，微溶于水和甘油。
代拉菲尔德氏苏木精配制
甲液：苏木精1g 纯酒精25m l
乙液：硫酸铝铵饱和水溶液100m l
丙液：甘油25m l 甲醇25m l
将甲液一滴滴加入乙液中，随时搅动，曝晒于阳光和空气中约7---10天后，加入丙液，将
混合液静置1--2月，至颜色变深为止 ，紧塞瓶口，放于阴凉处，使用时可将染液1 份用
3---5份蒸馏水稀释，则染色后分化更明显
2. 海登汉氏铁苏木精
甲液（媒染剂）：硫酸铁铵（铁明矾）2--4g 蒸馏水100m l
乙液(染液）：10%苏木精酒精溶液5m l 蒸馏水100m l
甲液应在用 时配制。铁 明矾应为紫色 结晶，变黄后不能使用，
乙液在用 前六周配制，将0. 5g 苏木精溶于5m l 95%酒精中，置于轻塞的 瓶中使其充分氧化，
用时再加100m l 蒸馏水。此液可保存3--6个月，甲、乙液不能混合。
3. 硼砂洋红
洋红又叫胭脂红或卡红，是从一处热带昆虫胭脂虫雌虫体中提取的天然染料。
单纯的 洋红不能染色，常要和铁、铝或某些金属盐类的媒染剂一 起应用。
4%硼砂水溶液100m l 洋红2--3g 70%的酒精100m l
将洋红加入 4%硼砂水溶液中，煮沸30分钟，静置3天 后用等量70%酒精冲淡，再静置24
小时后过滤。
4. 蕃红(藏花红）
蕃红是从藏红花柱头中提取的 一 种天然染色剂，其溶解度（26℃) 在中为54. 5%，在乙醇
中约为3. 41%，可配成1%的蕃红水溶液用来染植物的木质部 。
95%酒精蕃红溶液：蕃红1g +95%酒精10m l +苯胺油4m l + 蒸馏水90 m l 。
1%蕃红水溶液：蕃红1g +蒸馏水100ml
5. 固绿：
又称 牢绿，为绿色粉 末，能溶于水及乙醇，细胞质及纤维素的染色剂。
水溶固绿：固 绿1g +蒸馏水100m l
醇溶固绿; 固绿1g +95%乙醇 100m l
固绿1g +无水乙醇100m l +苯胺油4m l
此液现配现用效果更好，多与蕃红配合进行复染。
6. 曙红:(伊红）
是染细胞质、胶原纤维、肌纤维和嗜酸性颗粒常用的染色剂，常用的有：伊红Y 和伊红B 。
0. 1--1%伊红水溶液:伊红0. 1--1g 、蒸馏水100m l
0. 1--1%伊红乙醇溶液伊红0. 1--1g 、95%乙醇100m l
7、复制伊红
先将0. 5g 伊 红溶于5m l 蒸馏水中溶解后一滴滴加入醋酸，边加边搅动，可见有沉淀生成，
至成浆糊状时再加蒸馏水100m l ，继续加冰醋酸至沉淀不再增加时过滤，将滤物于50--60℃
温箱干燥。烘干物溶于100m l 95%乙醇中即成。
用复制伊红 染色效果较好，尤其对 动物组织块的染色，效果较好。
染色方法
1、H E 染色法：
适用材料一般为动物组织，染色细胞核、细胞质。
⑴脱蜡：纯二甲苯--二甲苯:酒精（1:1）-纯酒精
⑵复水：倒酒精梯度
⑶苏木精染色，2-4小时。
⑷水洗：约15---30分钟。
⑸分色：
⑹水洗：约15---30分钟。
⑺脱水：酒精梯度，1-3分钟。
⑻伊红染色：3分钟。
⑼脱水：95%酒精--纯酒精1---纯酒精2各3-5分钟。
⑽透明：纯酒精:二甲苯(1:1) --纯二甲苯，5-7分钟。
⑾封片：
结果为：细胞核染为紫色，细胞质染成淡红色。
2、蕃红固绿对染法
适用于一般植物组织、分生组织。将细胞质、染色质、纤维素细胞壁和木质化细胞壁区分开。 ⑴脱蜡：纯二甲苯--二甲苯:酒精（1:1）-纯酒精
⑵复水：倒梯度酒精
⑶1%蕃红水溶液，染色24小时。
⑷水洗：
⑸脱水：梯度酒精至95%酒精，各一分钟。
⑹固绿酒液：半分钟。
⑺纯酒1---30秒，纯酒2---3-5分钟。
⑻透明：各5-7分钟。
⑼封片：
结果：细胞核或染色质、核仁、木质 化细胞壁为鲜红色，纺缍丝、细胞质和纤维素细胞壁为绿色。
3、番红-固绿对染流程及铁矾-苏木精染色流程
九、分化
1、分化
就是用分化剂处理因染料过多或染色时间过长而染色太深的材料，使浓染的部分褪到适当的程度。
用于分化染料的物质一般有三类：酸、氧化物和媒染剂。
（1）酸类→组织中的金属根（即媒染剂）与组织分离→与之相结合→可溶性的氯化盐或醋酸盐。
（2）一般将盐酸或冰醋酸配成稀溶液，可以分化苏木精染色的组织。
（3）氧化剂（漂白作用） → 组织上所有的染料无选择地氧化为无色物质（其作用速度） 如苦味酸，可分化苏木精的铁沉淀色素。
十、封片
封片就是将切片经染色、脱水、透明后最后用封藏剂把它封藏起来，使切片能永久保存起来，便于镜检。
第三节 植物材料的非切片制片方法
一、压片法：
是将一些柔软的材料放在载片上，用镊子或解剖针将材料拨散后，盖上玻片然后再用解剖针柄末端或铅笔平头轻压盖片，并微微振动，使材料压散成为显微观察的薄片，最后制成玻片。（适用的材料有植物的根尖、花药、愈伤组织、幼叶等。
比如植物根尖有丝分裂观察
1、取材：25℃左右，培养根尖至1-2厘米，一般为上午9--11点左右取材0. 5厘米。
2、固定保存：卡诺固定液，固定3-24小时，95%酒精冲洗一次，水冲洗二次，70%酒精保存于冰箱中。三个月左右更新一次酒精。
3、解离：1N 浓盐酸或+1N 浓盐酸+95%酒精（1:1) 解离10-14分钟，至根尖分生区为乳白色，其他部位透明，水洗三次。
4、染色:改良苯酚品红染色、1-2％醋酸洋红 10分钟左右，或0. 25%的龙胆紫溶液，染色３分钟。
5、压片：将材料放在载片上，用镊子或解剖针将材料拨散后，盖上玻片然后再用解剖针柄末端或铅笔平头轻压盖片，并微微敲击，使材料压散成为显微观察的薄片
6、观察：
7、冰冻：3-5小时
8、揭盖片：
⑴分离盖片：将压好的玻片盖片向下，斜放于盛有45%醋酸，95%酒精(1:1) 的培养皿中，5-10分钟，待盖片与载片脱离，取出载片和盖片，吸去醋酸酒精。
⑵脱水透明:95%酒精+叔丁醇(1:1) 二分钟，酒精+叔丁醇(1:3) 25分钟，叔丁醇3分钟。
9、气干：3-5天
10、透明：二甲苯
11、封片：加拿大树胶
四、涂片法：
是将液体或半滚动或 比较疏松的材料涂布到载片上制成片子的方法。
如植物花粉母细胞减数分裂制片：
1. 取 材:应在花粉母 细胞减数 分裂最盛期取 花药固定。
2. 卡诺固定液30分钟。
10 /
3. 洗涤：95%酒精换洗一次，再经90%、80%、70%、50%酒精浸洗各30分钟。
⒋离析:将材料置于1N H C I 内，放在60℃水浴中处理15分钟左右(或95%酒精:1N H C I =1:1处理2--10分钟) ，较小的花药，可不经离析，离析后用50%酒精洗3-4小时，中间换一次。 ⒌染色：苏木精染色，蒸馏水冲洗2---4小时，0. 1%盐酸酒精分色1 小时。
⒍涂片：
⒎粘固：用0. 5%火棉胶将材料粘住。
⒏脱水透明：
⒐封片：
第四节 动物材料其他制片方法
一、整体装片法：
是不经切片而将整个微小生物体、卵、器官、各发育时期胚胎封藏起来，制成玻片的方法。经取材、固定、洗涤、染色、脱水、透明、封固几个步骤，脱水时间应较长，否则不容易脱尽水分。
水螅整体装片
⑴采集:在洁净池塘水草上采集，用玻璃缸培养。
⑵固定：用40--50℃ 的热B o u i n 氏固定液固定。
⑶洗涤：70%酒精洗去黄色。
⑷染色：用 硼砂洋红染24--48小时。
⑸分色：用1%盐酸酒精分色到合适。
⑹脱水：70%→80%→95%→95% →100%→100%每级1--2小时。
⑺透明：二甲苯透明。
⑻封藏。
第四章 生物学摄影
1839年8月19 日法国画家达盖尔公布 “达盖尔银版摄影术”
一、照相机的种类：
(一) 按所用胶片的宽度分类
120相机，胶卷宽度为61m m 并有衬纸，可分为6c m X 6c m . 6c m X 7c m . 6c m X 4. 5c m . 6c m X 9c m 四种规格。
135相机，胶卷宽度35m m ，有双边片孔，又可以拍摄36张画幅的普通135相机和拍摄拭2张画幅的半幅135相机
(三) 照相机按取景方式分类：
1. 同轴取景照相机，又称单镜头反光照相机。
2. 旁轴取景照相机，包括俯视磨砂玻璃取景照相机、平视光学取景照相机 和平视框式取景照相机。
(四) 照相机按自动化程度分类：
手控曝光照相机。
半自动控制曝光照相机(其取景器内能显示出应选择的快门速度及光圈系数值) 。
自动快门照相机(光圈优先式) 。
自动光圈照相机(快门优先式) 。
11 /
二. 照相机的基本原理：
1. 针孔成像原理：
物体表面无数个光点所形成的反射光通过一个小孔投射到一个白色屏幕上就形成了该物体的影像，此像左右相反、上下倒置。
2. 透镜成像原理：
①照 相机的发明：透镜成像最早由米兰物理学家卡尔达诺发现于十六世纪，他把双透镜镶在小孔上，并获得了明亮的影像。十七世纪法国数学教授温特将木头做一个牛眼睛一样的球，在球中间凿出通光孔，用两个不同透镜镶在通光孔的两 端，并把这个装置安装在暗室的通光口上，不断变换其角度，在暗室后面的屏幕上就映出了透视感强、立体效果极佳的、不同位置的风景画面。温特的发明可以说是现代照机镜头的前身。
②透镜的种类和性能：
凸透镜：又称汇聚透镜，只有凸透镜才能结成影像，无论照相机镜头由多少凹凸程度不同的镜头组成，其最终仍是起着凸透镜的作用。
凹透镜：又称发散透镜，单纯使用凹透镜是不能结成影像，它在其中起着校正像差、使影像更加完美的作用。
透镜的焦距：一束平行光线( 封锁限远处的光束) 透过透镜后，汇聚在主轴上的点称为焦点，焦点至光心的距离为焦距。
像距：是物体的反射光通过前后透镜后，在胶卷平面上结成影像的距离。被摄物体离透镜越近，像距就越大; 反之就越小。
物距：是成像物体距透镜中心的距离。
1/物距 + 1/像距=1/焦距=常数
三. 照相机的主要部件：
由镜头、快门、取景器、测距器、卷片装置和机身等主要部件所构成。
1. 镜头：
⑴镜头的种类：
标准镜头：是指焦距长度等于底片对角线长度的镜头。
长焦镜头：如在135相机镜头系列中焦距为85m m 至300m m 的镜头称为普通远摄 镜头；300m m 至2000m m 的称为超远摄镜头。
广角镜头：焦距小于底片对角线长度的镜头。如135相机焦距小于35m m 的镜头为广角。 变焦镜头 ：焦距可连续、迅速地改变，兼起若干个定焦距镜头的作用，使用灵活方便易于选择画面构图方式但构造复杂，造价昂贵，成像质量上有时不如定焦距镜头。
⑵镜头的基本参数与性能指标：
焦距：是镜头的重要光学性质之一，镜头焦距一般为定值（变焦镜头除外）并用F 表示，标在镜头上，如F =25m m F =35m m F =90m m F =135m m 。
有效口径：又叫感光力，是镜头的最大通光能力。有效口径与镜头口径及焦距有关，一般来说，镜头口径愈大，通光能力愈强，焦距愈长则感 光力愈弱。
有效口径=最大口径/焦距。
在镜头上常有1:2 1:4等字样，表示该镜头的有效口径，越大越有利于在光线较暗的情况下拍摄，镜头价值越昂贵。
相对口径：是由光圈控制而可以改变的口径。相对口径=光孔口径/焦距。相对口径的倒数
12 /
值称为f 系数或光圈指数，在国际上已经标准化，如f 系数：2 2. 8 4 5. 6 8 11 16 22，每相邻两级之间光通量相差1倍。
2. 快门：是控制胶片有效曝光时间的装置，以秒为单位。其功能是与光圈配合控制镜头的光通量及用于运动物体瞬间动作的抓拍。
机械快门：因其基本结构和所在位置的不同，又分为镜间快门（镜中快门）和焦点平面快门（帘幕快门）
电子快门：一般有自动测系统，测出光量后经过电子途径自动调节快门速度或光圈大小，只需摁动快门按扭。
自拍机：是一种特殊的快门装置，具有延缓快门开启的作用，延时约10秒。
速度盘：常见标有B 、1、2、4、8、15、30、60、125、250、500、1000、数据为快门速度的倒数，即为快门开启时间的倒数，单位为1/秒每前一级的光通量为后一级的2倍。B 门为1秒以上快门。
⒊取景器：是照相机上用来观察取舍景物的一种专门装置，常见的有框式取景器、光学平视取景器、反光式取景器等。
⒋测距器：是根据像距与物距，随时调整镜头的像距，使不同距离的景物获得清晰影像的装置。
连动测距器，测距器与镜头的伸缩连动。
自测式（目测式）
全自动测距，电子控制测距系统，是利用超声和声纳作用，通过小型电脑来测距调焦。 ⒌卷片装置：
⒍机身
⒎常用附件：
闪光灯
遮光罩
三脚架
快门线
一、感光片
感光片是由透明支持物构成的片基、感光的乳剂层、起粘合作用的结合层、起保护作用的保护层及阻止光晕的防光晕层等部分构成。
乳剂层：是感光片的主效层，由卤化银和明胶组成。
三、感光片的性能
1、感光度：是胶卷感光快慢的标志。1979 年，国际标准化组织统一了世界胶片感光度标准，用I S O 表示。
中国标准制 德国定制 美国标准制
G B D I N A S A
15 ° 15 ° 25
21° 21° 100
31° 31 ° 1000
6、感光片的主要照相性能存在着内在的联系：
感光度高的胶片：反差小、宽容度大、颗粒粗、解像力差、层次少、灰雾度大、保存期短。 感光度低的胶片：反差大、宽容度小、颗粒细、解像力高、层次多、灰雾度小、保存期长。 D X 编码 ：根据印在暗盒上的12格方格的不同排列组成方格码。照相机通过触点与暗盒连
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接，自动识别胶片感光度、胶片张数和曝光范围等数据
有效期：指胶片的感光性能在一定时间内保持基本不变的期限。胶片的有效期通常为两年，专业胶片更短一些。
生物摄影
一、正确曝光：
曝光又称感光，是景物通过摄影镜头形成光影 ，使胶卷乳剂层中的卤化银发生光化学反应，以潜影形式反景物影像记录下来的过程。
二、光线运用：
顺光：光线直接射到 被拍物体上，物面全是阳光部分，没有阴影，也就是照相机拍照 的方向和光的照射方向是一致的。物体明亮清晰，反差太小，缺乏层次，不利于表现物体的立体感和质感。
侧光，也称侧面光，光线方向同镜头方向夹角成45度时，为小侧光；成90度时为大侧光。光线由侧面照 射到被拍物体上，在物体上呈现一部分是阳光，一部分是阴影，而照相机的光轴和光线照射方向成一定的角度使被照物体具有立方体感。感光时应顾及到阴影部分，就是使 阳光部分稍过，以补救阴影部分 的不足，一般是顺光感光的二倍为宜。可使景物明暗有别，层次丰富，立体感与质感强烈。
逆光：光来于镜头对面 。光线是由后射到被 拍物体上，镜上的光轴下对着光源，物体上在部分或全部是阴影，感光时，应根据阴影部分的亮度 ，使这部分的影纹显出，曝光时间相应的加长，其加长的倍数应看物体 上亮度如何及有无其他光线而定，一般应与顺光的感光相差四倍。
顶光：上明下暗，反差强烈，层次缺乏，如夏季12点左右的光线。
散光:漫射光，用来拍摄较小的动植物或特写，能取得比较 柔和的影调。
三、景深效果：景深是指在照相时，不仅对准的一点景物清楚，在被拍景物前后一定范
围也是清晰的，这个能成清晰像的景物深度称为景深。
景深与光圈成反比，光圈越大，景深越浅，反之越深。
景深与距离成正比，拍摄距离越远，景深越长，反之距离越短，景深就越浅。（在光圈 距离相同的情况下，焦距越长，景深就越小，焦早期越短，景深就越大）
实际应用时，可从三种改变景深的方法中任选其一，也可综合运用。因为各有其缺陷。如光圈的缩小会受到感光量的限制，太小，则导致曝光不足；改变摄影距离，又常会受到拍摄场地的限制、更换镜头，除了经济问题外，还会错失瞬间的拍摄 良机。总之，应根据实际情况灵活运用。
五、生物学摄影的一般步骤：
⑴装胶卷：
⑵拉出并旋转胶片感光度调定圈，使 指示窗内出现的数字和装 在照相机内胶卷的感光度符合。
⑶确定光圈系数和快门速度：光圈和快门都是控制曝光的机构，二者相互联系。（数据的确定）拍照 静态景深范围长的景物，应由光圈系数来决定快门速度；如拍照 动态景深范围短的景物，应由快门速度来定光圈系数。
⑷卷片上弦：转动卷片扳手，直到扳不动为止。
⑸取景配光 根据拍照的对象和要求，进行取景配光。
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光照的方向一般分为顺光、侧光和逆光。
⑹调焦 又叫对光。对光时，如果在取景器内观察到的影像有模糊现象，可来回转动调焦圈，直到 取景器内观察到 影像高度清晰为止。
⑺拍照 在上述操作完成后，按下快门按钮使 底片正确感光即完成整个拍照过程。拍照时避免照相机发生震动。
(8) 卸卷
二、感光片的冲洗
指从相机中取出的胶卷（感光片）经过显影、停影、定影、水洗、干燥成为底片的过程。 感光片冲洗过程需要显影液、停影液、定影液三种药液，每次转换时需水洗。
（一）、 显影
1、感光片显影液的化学组成及其性能：
⑴显影剂:能使感光片上的感光的卤化银银盐颗粒还原为黑色银粒，又叫还原剂。
米吐尔(对甲氨基酚硫酸盐, 又称衣仑) :显影效果平淡柔和
对苯二酚(几奴尼) :显影效果反差强硬。
⑵促进剂 :碱性的化学药品则有增加显影的能力
碳酸钠、碳酸钾、苛性钠、苛性钾和硼砂等，其中以碳酸钠为主。
⑶保护剂：能防止显影剂氧化、延长显影液寿命的物质，叫保护剂，
通常使用氧化能力较强的亚硫酸钠为保护剂。
⑷抑制剂：防止胶膜上未感光的溴化银颗粒被还原，抑制感光片阴暗部分的显影能力，增强反差的物质，叫抑制剂。常用的抑制剂是溴化钾。
⑴定影剂: 硫代硫酸钠，将感光材料中未感光的卤化银溶解。
⑵亚硫酸钠：保护剂。
⑶醋酸：一方面起停显作用，另一方面防止亚硫酸钠与钾明矾结合成白色沉淀。
⑷硼酸：可防止定影液被污染变色。
⑸硫酸铝钾：具有坚膜作用，可防止感光材料在液体内浸泡时间过长而出现药膜松软。
第五章 显微摄影
显微摄影的概念
一
二、显微摄影装置的成象原理：
利用专用 的显微摄影仪与显微镜配合进行摄影时，玻片标本通过显微镜的 物镜所成的放大实像落在显微摄影仪的摄影目镜的焦点之外(2倍焦距之内) ，可通过摄影目镜在另一侧成一再次放大的实象,
落在感光片上，使其感光。
第二节 一、显微镜的构造：机械系统、光学系统
⒈机械部分: 镜座、镜臂、物镜转换器和调焦装置。
15 /
⒉光学部分:目镜、物镜、聚光镜。
目镜：由两组凹透镜组成，有5× 10×、16×。不增加显微镜的分辨力。目镜的放大倍数不宜过大，否则影响观察效果。
物镜 ：是显微镜性能的关键部件，也是显微镜好坏的标志。物镜的种类按倍分为10倍以下的低倍镜; 40倍左右的高倍镜，90----100倍的油镜。
聚光镜：相当于一个凸透镜；可变光阑 有叶轮状和光圈状，控制照 明光线的强弱。
照明装置： 光源、反光镜和滤光器。
二、光学显微镜的主要性能
1、分辨力：是指一架显微镜或人眼在25 厘米明视距离处能分辨被检物体细微结构最小间隔的能力。光学显微镜最大分辨力不超过0. 2微米。
2、放大率 :：也叫放大倍数，在标准光学筒长时，显微镜的放大倍数等于目镜的放大倍数和物镜放大倍数的乘积。
3、清晰度：指显微镜造成明显物象的能力。
4、焦点深度：即景深。当显微镜通过调焦看清楚某一点时，不仅是这一物点而且是它的上下两 侧也能看清楚，能看清的这两 侧之间的厚度叫焦点深度。放大倍数越高，焦点深度越小。
5、显微镜的视场：叫视野。指所能看到 被检标本的范围。
6、工作距离：当显微镜看清标本时，物镜下缘到标本之间的距离叫工作距离 。
7、明视距离:从眼球的晶状体到放大的虚象之间的距离叫明视距离。其长度为250m m . .
8、机械筒长:从镜筒的抽管上缘到 物镜螺旋基部之间的长度就是机械筒长，其长度为160m m 。
9、光学筒长:由物镜的上焦平面到目镜的下焦平面之间的距离为光学筒长。其长度随机械筒长及物镜而异。
第三节
主要是由显微镜和显摄影仪两部分组成。
一、用于显微摄影的显微镜必备的条件：
第一是具有理想的内藏式照明光源。
第二是调焦方式为载物台升降式。
第三是镜臂为固定式。
二、 显微摄影仪：
一般包括接口、接筒、摄影目镜、取景器、摄影电暗箱等。
1、接口与接筒：
摄影目镜-----接筒-----接口-----显微镜
2、摄影目镜与目镜座：
16 /
目镜座套在摄影目镜外 ，一方面 保护目镜，另一方面连接接筒与取景器。
3、取景器：
为一供取景和 调焦用的 分支光路。
4、摄影暗箱：常有135型和120型两种。
显微摄影系统 相机-接筒-望远目镜
O l y m p u s B X -50+P M 20显微摄影系统 体视显微镜
第四节
一、感光片的选择
1、黑白胶片：根据摄影暗箱规格选择胶片的尺寸规格，一般用135胶卷。
根据被摄物体的特性选择胶片感光度，切片等静止物体拍摄中可采用低感光度胶片，如G B 14-18º，可得到较强反差和较细的颗粒。
如所用标本为活体，则应选用感光速度较快的胶片，如G B 27°，但移动太快的标本应采取措施固定或使其速度变慢。
在没有特殊要求时，G B 21 °的常规胶片可以适应一般需要。
2、彩色片：柯达胶卷适于显示黄红色调，而富士彩卷适于显示蓝绿色调。
根据所摄材料的性质选择适当的感光片。高感光度胶片感光快，颗粒粗，色彩重, 适于拍摄活动对象或光线较暗时的动物；低感光度胶片感光慢，颗粒细，色彩柔和，适于拍摄静止对象。
二、滤色片的选择
滤色片的作用：增大反差，提高分辨率。
利用适当的滤色片可以提高被摄对象与背景之间或被摄对象的某些结构之间的反差，起 到突出被摄对象中某些结构的作用。
要使某种颜色成分的结构相对变暗，可选择近于此颜色的补色的滤色片；而要使这一颜色成分的结构相对变亮，可选择接近于这一颜色的滤色片。
实验:显微拍摄番红--固绿染色的植物某器官切片。
选用绿色滤色片时染上绿色的部分变得相对明亮，而染上红色的结构变得相对深暗，反差加大。采用橙色滤色片，则红色的部分相对变亮，而绿色的部分相对变暗，反差亦加大。 使用滤色片时要尽量选择能透过短波光线的滤色片(如紫、蓝、绿色的滤光片。选择好的滤色片可安装在显微镜聚光器下的滤色片托上，或直接放在镜座上部。
柯勒照明:聚焦和调中灯丝在物镜的后焦平面和聚光镜的前焦平面上在标本的像平面上产生一个最大的散焦的灯丝的像，均匀的照亮整个视野。
1) 对光：将目镜屈光度调节环放置零位
2) 用10X 物镜将标本调焦清晰, 并将灯丝调节居中。
3) 缩小视场光阑。
4) 聚光器调中:两手柄协同
5) 调整孔径光阑—满视野
6) 观察。
17 /
换用其他物镜时应重新调整柯勒照明。
四、 曝光时间的确定
即使是带有半自动测光装置或自动曝光装置的摄影仪，其测光机构或”曝光控制系统也往往只是在采用明视野照明时起作用，而在暗视野照明和使用荧光技术等条件下，也只有通过试验来确定曝光时间；对性能不太熟悉的显微摄影装置，曝光试验可以按如下设计进行 曝光试验:
10×物镜:
¼秒、1秒 、4 秒、15秒
40×物镜:
1秒、 4秒、15秒、30秒
100×物镜:
2秒、 8秒 、30秒 、120秒
记录照明条件、摄影目镜倍率及所用物镜倍率和曝光时间，根据这一曝光试验结果，选择适当的曝光时间。
五、 手动拍摄
1、装胶卷、设置感光度数据
2、设定光源亮度
3、转换物镜，将拍摄区域移到视野正中
4、调整柯勒照明
5、根据曝光试验的数据设定曝光参数
6、调节聚焦螺旋和细调焦螺旋，使摄影望远镜中“双十字”清晰
7、按下快门针进行曝光
8、拍摄完毕，卸卷
第六章 植物组织培养技术
第一节、植物组织培养技术发展简史
1902年，德国植物学家哈伯兰特(H a b e r l a n d t ) 提出“细胞全能性”，及在试管中人工培育植物的可能性。
1937年，美国科学家怀特(W h i t e ) 配制出了植物组织培养用的培养基，并且认识到维生素和植物激素在植物组织培养中的重要作用。
1948年，我国植物生理学家崔徵和美国科学家S k o o g ，用烟草茎段和髓，发现腺嘌呤和生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。
1952年，M o r e l 和M a r t i n 首次证实通过茎尖离体培养可获无病毒植株
1953-1954年，M u i r 单倍体培养获得成功
1957年，S k o o g 和M i l l e r 提出植物激素控制器官形成的概念
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1958年，美国植物学家斯图尔德(F . C . S t e w a r d ) 用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结实。
1958-1959年，R e i n e r t 和S t e w a r d 胡萝卜愈伤组培中形成体细胞胚。
20世纪60年代以后，植物组织培养技术开始在生产上应用
1964年，G u h a 和M a h e s h w a r i 由毛曼佗罗离体花药培养胚
1971年，T a k e b e 首次由烟草原生质体获得再生植株
1972年，C a r l s o n 获得烟草的第一个体细胞杂种
第二节、组织培养的原理
一、植物组织培养常涉及的词汇
植物细胞具有全能性(c e l l u l a r t o t i p o t e n c y ) ，即任一生活细胞都包含有发展成完整植株的全部遗传信息，在适当的条件下可以培养成完整的植株
物质基础是每个细胞都有繁殖后代的全套基因。但通常情况下，只有胚性细胞具有全能性，而已分化的细胞的全能性受到限制。
在组织培养提供的条件下，已经分化的细胞可重新恢复分裂能力，即脱分化(d e d i f f e r e n t i a t i o n ) 。
C a l l u s ）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
r e d i f f e r e n t i a t i o n ）：一个成熟的植物细胞经历了脱分化后，能再分化而形成完整植株的过
程。
e m b r y o i d ）：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极
性的胚状结构。
是指利用细胞的全能性将离体培养所产生的体细胞或具有发育成完整植株能力的分生组织（胚状体，茎和茎段）包裹在一层含有营养物质并具有保护功能的外膜内形成在适宜条件下能够发育成完整植株的小颗粒。包括人工种皮，胚状体（分生组织），人工胚乳。
p r o t o p l a s t f u s i o n ) ：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。
s o m a t i c h y b r i d i z a t i o n ) ：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法称为体细胞杂交。
对称融合：父母均未处理，对后代贡献一样。
不对称融合：父母本在后代中贡献不同，须经射线处理或化学处理
胞质杂种：利用原生质体融合技术，使两种不同来源的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一
起，就形成胞质杂种。
利用植物茎尖分生组织中心部不含或含极少病毒的特点培养出无病毒植株的
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技术
二、组织培养的意义
1、基础理论研究方面:试验体系的准确性和可重复性，广泛用于细胞、组织的代谢生理及其它生化等方面的研究。
2、应用研究:无性繁殖系快速繁殖的生产、试管苗的商品化，遗传育种，种质保存，克服远缘杂交，种质资源创新，获得转基因植株等。
器官发生途径：
1、茎尖或茎段培养产生腋芽
2、直接不定芽发生
3、间接不定芽发生
胚胎发生方式：
1 、 直接胚胎发生
2 、 间接胚胎发生
球型胚（g l o b a l e m b r y o ）→ 心型胚（h e a r t -s t a g e e m b r y o ）→ 鱼雷型胚（t o r p e d o -s t a g e e m b r y o ）→ 子叶型胚（c y t o l e d o n -s t a g e e m b r y o ）
第三节、组织培养对场所和设备的要求
依所培养的对象，即外植体材料不同可分为：
1. 器官培养：选用植物器官（如茎、芽、叶等）为材料。
2. 胚胎培养：选用成熟的胚为材料进行培养，多用于育苗，提高成苗率。选用未成熟胚进行培养，则用于远缘杂交，克服胚的败育现象，使其获行新植株。
3. 子房和胚珠的培养：常用于遗传育种上，用其进行试管受精，便于远缘杂交。
4. 原生质体的培养和融合：培养裸露的植物细胞，使两个植物的原生质体融合，而形成新的个体，即进行植物体细胞的杂交。
获得无菌外植体，建立起无菌培养体系
（一） 外植体的准备
1. 外植体选择的原则：
（1）、必须含有活细胞。
（2）、幼嫩组织所含活跃分裂的细胞比例高。
（3）、母株必须健康并且无任何腐烂或生病的迹象。
（4）、母株必须活跃生长并且不会立即进入休眠。
2. 外植体的部位选择：
（1） 茎尖
（2）茎段
（3）叶
（4）花球和花蕾
（5）种子、根、块根、块茎、花瓣等
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（二）消毒：70%乙醇消毒约，1升汞消毒约
（三）培养基的制备
1、培养基的组成
化学合成培养基大致由6种成分组成：①糖类，②多种无机盐类，③微量元素，④氨基酸、酰胺、嘌呤：⑤维生素；⑥生长素。
有些培养基还可添加天然的汁液，如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麦芽浸出液等 培养基中如加入0．5～1％的琼脂即为静止培养的固体培养基，否则为悬浮培养的液体培养基。
培养基配方的种类M S （M u r a s h i g e a n d S k o o g ）培养基配方为最常用的一种基本培养基，它利于一般植物组织和细胞的快速生长。
（1）水
（2）无机成分：
无机大量元素 氮： 铵态氮、硝态氮混合
磷： 磷酸盐
钾： 钾盐
钙、硫、镁
无机微量元素
主要有：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯
（3）有机成分：
糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。
（4）植物生长调节物质：
生长素类：N A A 、I A A 、I B A 、2, 4-D
细胞分裂素类：B A P , K T ，T D z ，Z T
其他类： G A 3, A B A ， P P 333
（5）琼脂
（6）调整p H 值到5. 8
3、各营养成分的作用
（1）无机营养物
主要由大量元素和微量元素两部分组成
大量元素中，氮源通常有硝态氮或铵态氮。
磷和硫则常用磷酸盐和硫酸盐来提供。
钾是培养基中主要的阳离子。钙、钠、镁的需要则较少，钠和氯化物，由钙盐、磷酸盐或微量营养物提供。
微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即F e S O 4与N a 2—E D T A （螯合剂）的混合。
（2）培养基中的有机成分
碳源:培养基中的碳水化合物通常是蔗糖(碳源和能源，维持培养基的渗透压)
维生素:B 族，主要有维生素B 1、维生素B 6、生物素、泛酸钙和肌醇等。
有机附加物:包括人工合成或天然的有机附加物。有酪朊水解物、酵母提取物、椰子汁及各种氨基酸、琼脂等。
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(1) 植物生长素类:如吲哚乙酸（I A A ）、萘乙酸（N A A ）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D ）。
(2) 细胞分裂素:如玉米素（Z t ）、6-苄基嘌呤（6-B A 或B A P ）和激动素（K t ）。
(3) 赤霉素:组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（G A 3）。
铁盐：7. 45g N a 2-E D T A (乙二铵四乙酸二钠) 和5. 57g F e S O 4. 7H 2O 溶于1L 水中，配1L 培养基时取此液5m l
大量元素：将药品称取后分别溶解再依顺序混合定溶，配成10倍浓度的母液，每配制1L 培养基时取母液100m l
微量元素：微量元素用量少，为称取方便精确，常配成100倍或1000倍的母液，每配制1L 培养基时取母液10m l 或1m l
有机化合物：可配成100倍或1000倍的母液每配制1L 培养基时取母液10m l 或1m l 激素的配制
植物激素：配制成0. 1--0. 5m g /m l 的溶液。
萘乙酸（N N A ）可溶于热水中或先溶于少量95％酒精中再加水至一定浓度
吲哚丁酸（I B A ）可先用少量0. 4％的N a O H 溶液溶解，再加水到一定浓度
吲哚乙酸（I A A ）可先溶于少量95％酒精中，再加水到一定浓度
细胞分裂素：6---苄基嘌呤（6--B A ）、激动素（K T ）需用3. 65％的H C I 或0. 4％N a O H 溶液先溶解后再加水到一定浓度
5、培养基的制备程序
依次吸取各种溶液混合 → 将蔗糖放入溶化的琼脂中溶解 → 注入混合液→ 搅拌均匀 → 用0. 4％的N a O H 或3. 65％的H C l 调节p H (5. 7) → 分装于三角瓶等培养容器内，用锡箔纸
2等将容器口封紧包好 → 放入高压锅中灭菌(1. 1K g /c m 压力, 灭菌15—20m i n ) → 取出冷
却凝固备用。
冷却后放到培养室预培养3天，观察有没有杂菌污染
打开灭菌锅盖，向锅内加水。
加水后，将待灭菌的物品放入锅内，不要放的太多，以免影响灭菌效果。物品不要近靠锅壁，以免冷凝水顺壁流入物品中。
加盖旋紧螺旋。
打开放汽阀，加热，自开始产生蒸汽后5分钟，再关紧放汽阀，此时锅内的冷空气已由排气孔排尽，让温度随蒸汽压力的增高而上升。
5 待压力逐渐上升到所需压力时（一般为15磅/时， 1. 034×10P a ）, 灭菌20分钟。
灭菌后，待压力降至0时，开盖，取出灭菌物品。（在压力未完全下降前，切勿打开锅盖）。
（四）接种
①表面消毒。
②切割
③接种
④消毒
⑤密封
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（五）培养
开始进行一定时间的暗培养，之后先用合适的光照和温度进行培养。
培养过程中随时观察与记录，统计实验结果。
室温应控制在23～26℃，每天12～16小时光照，光照度为1000～3000勒克斯。
（六）继代培养
愈伤组织的培养:
继代培养: 在严格的无菌条件下(接种箱内) 将愈伤组织切割后转接到新的培养基上。 继代培养可多次连续进行。根据需要可随时中断继代培养，转接到分化培养基上催苗。 常用的继代培养和生芽培养基配方：M S 培养基+6B A (0. 5--1. 0 m g /L ) +N A A (0. 1--0. 15 m g /L ) 。
（七）分化培养
试管苗的培养分为生芽培养和生根培养。
生芽大约需要4～6周的时间(用上述生芽培养基) ，而生根培养1周以后就可以见到幼根了。注意，试管苗应该进行见光培养。
生根培养的培养基配方是：M S 培养基+N A A (0. 1--0. 5 m g /L ) 。 N A A 起促进生根的作用 试管苗
（八）炼苗与移栽
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