猪巴氏杆菌病
高娃,林靖凯’译自《口纰础彰瓤》第彤版
潘雪男较何闪修图
中图分类号:¥855
文献标识码:A
文章编号:l001.0769(2014J增刊一0014-13
1相关性
肺炎巴氏杆菌病是多杀性巴氏杆菌感染肺脏的1880年,路易斯・巴斯德从禽霍乱病例中分结果,通常是地方性肺炎或猪呼吸道疾病综合征
离到了多杀性巴氏杆菌(Pasteurella
multocida,
(porcine
respiratory
disease
complex,PRDC)的
Pm),从而确认巴氏杆菌属为致病微生物。之后,最后阶段。此综合征是猪,特别是采用全封闭式饲以他的名字命名了这个茵属。多杀性巴氏杆菌被确养的猪最普遍和成本最高的疾病之一。在美国,认为猪呼吸系统疾病的病原体已经超过125年。然肺炎是保育猪和育肥猪死亡的首要原因(USDA,而,由于其可引起猪的渐进性萎缩性鼻炎(Atrophic2007),也是商品猪报废的最常见原因之一(USDA,Rhinitis,PAR)和肺炎,因此此细菌在世界各地持2008)。增重减少及治疗病猪的费用进一步加重了续显著影响着猪的健康。
经济损失。PH是从患有肺炎的肺部分离到的最常猪萎缩性鼻炎的特点是鼻甲骨发育受阻或完全见细菌性病因之一,育肥猪上流行性特别高(Choi消失。1880年弗兰克在德国首次报道了此病,德等,2003;Hansen等,2010)。PM一般很少是猪肺国多个地区流行着此病。此病的病原学经一个多世炎的原发性病因,而是在其它易感的原发性病因病纪的大量反复论证,现在普遍认为严重的且不可逆毒或细菌感染后的继发性感染因子。
的渐进性萎缩性鼻炎是由于多杀性巴氏杆菌的产在东半球的多个国家,在无呼吸道疾病的仔猪毒型菌株或其与支气管败血波氏杆菌(Bordetella及成年猪中出现的零星暴发的致命性、急性败血bronchlseDtlca)(de
Jong禾口Nielsen,1990)混合
症也是由PH引起(Kalorey等,2008;Mackie等,感染引发的。萎缩性鼻炎可能对猪的生长速度和
1992:Townsend等,1998b)。
饲料转化率造成不良影响(Pedersen和Barfod,2病原学
1981:Riising等,2002),不过在自然感染的猪群中观察到了不同的结果(Cowart等,1990:Donk6PH有4个亚种:多杀性、败血性、禽杀性和猫等,2005)。萎缩性鼻炎对全球养猪生产具有重要杀性(tigris)。在猪上分离到的绝大多数是多杀性的经济学意义,中等至严重的暴发可造成严重的亚种,但败血性亚种和禽杀性亚种偶尔也能分离到经济损失(Muirhead
1
979:Pedersen和Nielsen
(Blackall等,2000;Bowles等,2000;Cameron等,1983)。支气管败血波氏杆菌也可以引起幼龄猪的1996;Davies等,2003;Varga,2007)。
鼻炎和鼻甲骨萎缩,并会对猪的生长有轻微的影响,多杀性巴氏杆菌为无运动性的革兰氏阴性杆菌但其引起的鼻甲骨萎缩是可逆性的,即非进行性萎或球杆菌,长约1.0~2.O斗m。首次或低传代菌缩性鼻炎,这与前一种的鼻甲骨萎缩明显不同。
株可能会出现明显的两极着色,在连续传代培养时
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I捌4年第34卷增刊1总207M
通常看不到这个特征。该菌为兼性厌氧菌,在营养琼脂上的最适生长温度为37cc(98.6下),在血琼脂平板上,它会形成灰色、不溶血的茵落,通常呈粘液样,具有独特的“甜”味。其在麦康凯琼脂上不能生长,对氧化酶和过氧化氢酶反应呈阳性,可产生吲哚。
多杀性巴氏杆菌有A、B、D、E和F5个荚膜血清型(Carter1955;Rimler和Rhoades,1987),其中A和D型在猪的分离株中最常见。呼吸道中的一小部分离菌株无荚膜,因此,未能分型。从患肺炎的猪肺中最常见的培养菌是血清型A,而渐进性萎缩性鼻炎(PAR)最常分离到的是血清型D,但是血清型A或D也可从PAR或患肺炎的肺脏中分离到(Bethe等,2009;Choi等,2001:Davies等,2003;Ewers等,2006:Hoie等,199l:Pijoan等,1983,1984:Varga等,2007)。猪体内也很少能分离到血清型F。引起猪的急性败血性巴氏杆菌病的最常见荚膜血清型是B,但有报道D型和A型也能引起(Kalorey等人2008;Mackie等,1992;汤森等,1998b)。
随后开发出的另一种“菌体”血清分型法能够根据脂多糖(LPS)抗原(Heddleston等,1972)对其进行进一步区分。根据该方法,多杀性巴氏杆菌有16种菌体血清型,分别命名为1~16,常见的是能表达多种血清型的菌株。猪呼吸道内最常检测到的是3、5、12型(Pijoan等,1983;Rimler和Brogden等,1986)。传统上,分离株的鉴别是根据荚膜和菌体进行区分的:但是,选择性基因分型技术越来越多地得到应用,部分原因是在进行分型时很难生产出一致、高品质的、随时可用的试剂。基
于DNA的分型方法具有优秀的鉴别能力,在对疾病进行调查时,这种方法更为实用。多种依据基因组DNA片段模式分析的方法,如限制性核酸内切酶分析(Restriction
EndonucleaseAnalysis,REA)、脉
冲凝胶电泳及核糖体分型,已经应用于猪PH分离株的分型(Dziva等,2008)。随机扩增多态性DNA的聚合酶链反应(PCR)方法显示出良好的应用前景,其对设备和试剂的需求达到了最少的程度。所有这些方法的一个显著的局限性是缺乏标准化和各实验室间的数据难以进行比较。
多位点序列分型法(Multilocus
Sequence
Typing,MLST)是一种基于对从一个特定管家基因的内部短片段获得的DNA序列进行分型的方法,它
已经在许多致病性细菌的分型中取代了其它方法。
MLST能够产生明确和客观的结果,容易进行评估、比较和存档。最近,Subaaharan等(2010)介绍了禽PH分离株的MLST方法,这种方法具有高度的识别力,并能预测种属结构(该结果与选择性分型方法一致)。虽然尚未利用猪的多杀性巴氏杆菌分离株进行评估,但作者提议将此方法作为PH分型的“黄金标准”。
目前,只有一个注释基因序列,即禽霍乱菌株PM70(May等,2001)可被Pm利用。PM70基因组长度约2.25Hb,且G+C占41茗。根据预测,可编码约2000个基因产品,其中104个可能会产生毒力。546编码区没有显示有生理功能,这表明距我们对于PM70生物学的了解有相当大的差距。研究人员对PM70和多种非猪源性菌株进行了全基因组研究,以监测在模拟体内环境条件的多种不同情况
2们4年第34尝增刊1总研期I
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下基因表达上的差异。这些数据与Pm引起的猪病之间的相关性尚不明确。
1993)。Pm可以在一个猪群内存在几个月甚至是几年,有时很少表现出患病迹象。有人指出疾病的传播与受到污染的传染媒介或中间宿主有关(Goodwin等,1990)。有证据表明:可感染禽、牛、绵羊、猪的菌株偶尔出现种间传播(Davies等,2004)。通常,老鼠、猫、狗等Pm的普通携带者应被认为是猪的潜在传染源。健康的人携带者是否能将Pm传播给猪尚不清楚。
应用分子分型技术能够更好地了解猪Pm的流行病学,但是各研究之间的对比存在问题,因为目前缺乏被广泛接受的标准化方法,同时许多研究未能提供多样性的定量测定方法。然而,猪肺炎菌株的基因多样性似乎很有限。在封锁繁育或很少引种的猪场中,通常仅存在一个或少量的菌株,不过不同猪场中的菌株有差异(Blackall等,2000;Marois等,
2009;R6
3公共卫生
Pm是一种重要的人畜共患病原体,许多因动物咬伤或抓伤后引起的人感染也与Pm有关。猫和狗是主要的来源,但也有报道人被猪、兔、老鼠以及各种野生动物咬伤后发生了感染(Holst等,1992:Hubbert和Rosen,1970:Mi9110re等,2009)。人巴氏杆菌病常表现为皮肤或软组织感染,通常发病快,特征是炎症、肿胀和脓性渗出物。较为严重的表现通常局限于免疫功能低下的患者,如患有败血症、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、脑膜炎和腹膜炎的病人。
Pm并非是人上呼吸道中常见的细菌,但经常能从在猪场工作的人和生活在养猪密集区的居民体内分离在遗传学上与从带菌猪中分离到的菌株相同的菌株(Donnio等,1999:Marois等,2009)。大部分人带菌者表现健康,但Pm也可能与急性或慢性呼吸道疾病有关。有人提议将肺炎巴氏杆菌病列为职业病。那些与感染Pm的猪有接触的人应采取适当的防护措施,特别是那些免疫功能低下的人更应注意防范。
bies等,2002;Zhao等,1993)。在有猪
群流动的猪场,多个菌株很可能同时存在(Bowles等,2000)。有假设认为:高致病性菌株优先引起肺炎,但这种假设令人怀疑,因为没有确定出与毒力相关的独特特性,自健康猪和病猪体内分离到的共生菌具有类似的有限程度的遗传异质性(Bethe等,2009:Ewers等,2006)。
只有多个使用DNA分型方法进行的研究评估了与PAR相关的菌株,且这些研究同样记录到了相对有限的遗传多样性。REA和核糖分型的结果显示:在一个猪群中可发现多个PAR菌株,且某一个菌株可以在多个猪群中出现(Bethe等,2009Gardner等,1994:Harel等,1990)。
Pm在4
oc下可在液体或固体培养基上存活大
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4流仃病字
Pm能从全球各地的众多野生和家养哺乳动物(包括水生哺乳动物)及鸟类中分离到(Smith等,1978)。Pm可引起禽、牛、水牛、猪、羊、兔等暴发急性或慢性疾病。Pm通常是正常茵群的一部分,临床上不表现明显的感染特征,在许多宿主中可使无免疫力的动物暴发疾病。Pm没有已知的环境宿主。
猪Pm的流行病学还不是很清楚。实际上Pm存在于所有猪群中,并且可在健康猪的鼻和扁桃体内检测到。据说Pm可经空气传播,但从患有PAR的肥育猪群中只能回收到少数的气源性Pm(144
约1周,但在1
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cC时其活力仍可保持数个月,可
用猪粪培养长达6d,用仔猪鼻腔j中洗液培养超过
d;在15。c或更高的温度(Thomson等,1992)下活力最高。附着在微尘颗粒上的细菌,当悬浮于鼻腔冲洗液时活力至少可保持45min。在23cC和相对湿度75茗的旋转气雾室中,Pm的半衰期是
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CF咖L)
(Bmkbo和Nielsen,1988)。尽管该菌偶尔可能通过悬浮微粒传播,但是鼻一鼻接触可能是最常见的感染途径。Pm可通过垂直传播方式侵入一个猪群,种群可作为细菌的宿主,将疾病快速传播给血清阴性的猪;但在猪场内,绝大多数传播似乎是水平传播(Oritz等,1996:Fablet等,201l;Zhao等,
min(M0ller等,1992)。
适用猪场的多个消毒剂对Pm有杀菌作用,有些在有大量有机物存在时仍可杀灭Pm(Thomson等,2007)。Pm在加热到60。c经10min或在4。c下用0.5%苯酚或0.2%福尔马林溶液经一整夜可被灭活。
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20f4年第捌麓增刊1总拼期
5发病机理
5.1定植
Pm在完整的呼吸道黏膜内上定植不良(Pedersen和Elling
1984)。使用猪鼻甲渗出液或鼻腔、气管
上皮细胞进行的体外实验表明很少有或无Pm定植(Chung等,1990;Frymus等,1986iJacques等,1988;Nakal等,1988)。
Pm能够与猪呼吸道粘液成分结合(Jacques等,1993;Letellier等,1991)。当粘液的纤毛清除功能受损,细胞外基质中的成分与细菌之间的相互作用可能使其易在黏膜上皮定植。先前已经感染支气管败血波氏杆菌的猪气管环再感染Pm后,Pm的数量要比受到Pm单独感染的支气管环增加好几倍(Duga]等,1992)。当支气管败血波氏杆菌引起粘液聚集和纤毛静止时,Pm与黏膜的结合能力增强。这种现象可在利用从健康和病猪中分离到的代表产毒或不产毒的荚膜A和D型Pm进行的试验中观察到。
猪Pm分离株上的外膜蛋白A和外膜蛋白H已证明具有同源性,这些蛋白被认为或被推测为其它病原体的粘附素(Davies等,2003:Lugtenberg等,1986:Marandi和Mittal,1996)。Pm牛分离株的外膜蛋白A在体外能够介导与组织培养基的粘附,并能粘合真核细胞胞外基质成分(Dabo等,2003),但尚无研究证明外膜蛋白A或外膜蛋白H在猪体内是否可以作为粘附素。
脂多糖(LPS)是细胞外膜的~个主要成分,研究表明其与细菌的粘附有关。来自猪产毒型D型分离株纯合LPS能够附着于猪呼吸道粘液,并阻止该细菌与猪气管环的粘着(Jacques等,1993)。经体外多次传代清除荚膜后,可显著提高附着微生物的数量,这表明D型荚膜可能会干扰细菌与气管的粘附。该作者假设,在感染的初期,生物体表达少量的荚膜物质,从而暴露出参与粘附的不同的隐蔽细胞外膜成分(LPS及或许其它)。随后的一项研究表明,生长在铁离子受限制条件下(如那些在体内遇到的条件)的细胞,被一层较薄的荚膜物质覆盖,并与铁离子供应充足条件下生长的细胞相比,其与猪呼吸道粘液和冷冻猪肺和气管切片的附着能力均较强烈(Jacques等,1994)。
1
Pm的许多分离株均有血凝活性,但与体外粘附或体内定植无关(Fortin和Jacques
1987;
Pijoan和Trigo,1990:Vena等,1991)。同样,
许多产毒和不产毒的A型和D型荚膜菌株均有
茵毛,但似乎在与猪源细胞或组织的粘附中不起任何作用(Isaacson和Trigo,1995;Pijoan和
Trigo,1990)。
在肺泡水平上,上呼吸道无粘液纤毛生产系统,因此吞噬细胞、抗菌肽、补体、先天免疫防御机制在这一部位发挥着重要作用。这种差异,以及PAR与上呼吸道内的产毒型D型菌株、肺炎与肺泡内非产毒型A型菌株的总体相关性表明:两种荚膜型菌株的定植机制可能有所不同。Vena等(1991)报道:与D型菌株相比,A型菌株优先结合猪原发性肺细胞培养物。但很少有其它的研究证明不同荚膜型居住采取不同的粘附方式(Dugal等,199LFrymus等,
1
986:Letellier等,1991:Pijoan和Trigo,
1990)。其它研究很少有证据可证明具有不同荚膜类型的菌株采用明显不同的粘附策略,也没有菌株毒性和不同粘附方式之间关系的报道。有趣的是,在一项针对158株猪分离株进行的研究中,Davies等发现不管菌株属于哪种荚膜型,大部分肺炎分离株共享外膜蛋白,而PAR分离株则不同。然而,尚不知外膜蛋白上的任何差异是否在细菌的粘附或定植上发挥着一定的作用。
扁桃体,特别是扁桃体隐窝似乎是猪Pm侵入的首选位置,并且可能保护着细菌免受炎症细胞的作用,或发挥着生理屏障作用以防止细菌被吞噬(Ackermann等,1994)。有报道称:在没有黏膜损伤和长达60d的感染后,A型和D型菌株能够在实验性受感染猪的扁桃体内定植(Ono等,2003;Pijoan和Trigo,1990)。该细菌产物对在这一位点定植的必要性尚不得而知,但扁桃体可能作为细菌的储库,当上呼吸道或下呼吸道的先天防御系统功能变弱或丧失时,能够引发PRA或肺炎的菌株随后进行传播。
5.2渐进性萎缩性鼻炎
猪自然感染PAR常见的诱发因素是先感染支气管败血性博德特氏杆菌(Pedersen和Barfod,981)。能够促进Pm定植的机理还没有得到证实,但由能够引起纤毛停滞和黏膜上皮细胞损坏的支气
2Ⅲ4年第3a捌鼾u1总207
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管败血波氏杆菌释放的气管细胞毒素可能起着主要作用(Dugal等,1992;Flak等,2000)。由支气管败血波氏杆菌产生的其它毒素和效应因子也可能发挥一定的作用(见49章)。
Pm的146一K脱氧核苷蛋白毒素简称为Pm毒素
(PmToxin,PMT),是PAR发病机理中重要的致病因
在出生后几周内感染产毒性Pm的猪会受到PAR最严重的影响,但这些感染在迟到16周后才发生轻度或中度的鼻甲病变((Rutter等,1984)。显然,当健康的3月龄猪进入一个正发生严重疾病的猪场时,该猪能够出现PAR(Nielsen等,1976)。疾病的严重程度与猪的日龄有关,这部分可能与猪成熟时鼻腔内粘液素的数量和类型以及上皮层内细胞分布改变有一定的关系(Larochelle和Martineau—Doiz垂,1990,1991)。气源性污染物对幼龄猪的影响可能是最大的(Robertson等,1990)。
PAR可能会影响猪的采食量,因为患有急性鼻炎的仔猪采食困难,并逐渐消瘦和衰弱。耳廓受损的生长育肥猪采食量也可能减少。5.3肺炎
Pm能引发肺炎的毒力因子尚不清楚,并且因肺脏内所存在的其它病原体的种类和数量的不同可能有所不同。没有确切的证据说明PMT的作用,但它的重要性依然没有得到解决。Pijoan等最先从肺脏分离到产毒菌株,之后一些研究人员报道从肺脏分离到极高比例的产毒菌株(Hoie等,1991;1wamatsu和Sawada,1988),有时优先会引发急性病例(Kielstein
1986)。然而,非产毒型菌株在肺
脏中占据很大的比例,并且对它们总体比例上的变化没有一致的证据。
与其它呼吸系统疾病病原体并发感染是引起猪肺炎巴氏杆菌病的最重要因素。涉及的病原体包括猪肺炎支原体(Carvalho等,1997;Fuentes和Pijoan,1987)和猪伪狂犬病病毒(Carvalho等,1997:Fuentes和Pijoan,1987);业已证实与猪瘟疫苗具有协同效应(Pijoan和Ochoal978)。与胸膜肺炎放线杆菌并发感染或许通过干扰了猪肺泡巨噬细胞的吞噬和杀灭细菌的能力而可促进PH在肺部的定植(Chung等,1993),但随后发生的疾病可能没有胸膜肺炎放线茵单独感染的那样严重(Little和Harding,1980)。猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)似乎单独不会干扰PH,但在先感染PRRSV和支气管败血波氏杆菌的情况下,导致随后感染的非产毒型Pm在肺部定植并引起肺炎(Brockmeier等,2001:Carvalho等,1997)。先前仅感染支气管败
子。猪经鼻内或各种非肠道途径摄入PMT,可导致渐进性的鼻变短和鼻甲萎缩(1l’ina和Zasukhin,1975)。PMT可引起鼻甲、肝脏、泌尿道产生特征是退行性和增生性变化的病变。该毒素能够干扰鼻甲正常的骨再生和骨形成(Dominick和Rimler,1988:Foged等,1987:Martlneau—D01z芭鲁笋,1990),并能减少猪长骨骨骺区(Ackermann等,1996),因而也许会产生与PAR有关的生长减慢。当产毒型菌株在鼻腔内繁殖时,PMT可能直接侵袭鼻甲,但系统性的作用能力表明PMT也可能通过细菌在扁桃体或其它解剖部位的定植发挥作用。
PMT能够干扰G蛋白和Rho依赖型信号转导通路,并可刺激有丝分裂(Lax等,2004))。生物活性区域位于C末端,而细胞结合和(或)内域似乎位于N末端(Busch等,2001;Pullinger等,2001
o
PMT由toxA基因编码(Petersen和Foged,1989),基因的G+C含量与PH基因组有显著的不同(May等,2001),表明它可能是通过水平传播获得。Pullinger等(2004)完成的进一步研究表明该基因位于可诱导的原噬茵体内。PMT缺乏一个典型的信号序列,在体外生长期间不分泌,从而产生以下建议:像其它细菌毒素一样,由通过接触宿主细胞或通过在体内遭遇到的某些环境因子激发的噬菌体诱导型细胞溶解是输出的机理。噬茵体介导的转导能潜在地引起PH无毒株(甚至是其它细菌)获得和表达toxA,但这是否会发生尚不清楚。
一些环境、管理、饲养因素能够影响PAR的发生和出现(Penny,1977)。通常,更严重的疾病是因为与室内集约化生产系统的高饲养密度、卫生条件差和通风不良有关。暴露在高浓度的粉尘和氨气下可促进PH在上呼吸道内的定植或(和)加重病情(Andreasen等,2000:Hamilton等,1999)。持续不断的养猪和频繁的转群及混群也是诱发因素。
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图1临床表现为渐进性萎缩性鼻炎的17周龄患病猪出现明显的短颌突出,鼻背部皮肤褶皱和泪斑
血波氏杆菌,可导致Pm在鼻腔和扁桃体内的定植,但不会产生明显的病变,这可作为健康带菌漏检猪的一种检测方法。扁桃体内长期携带非产毒性菌株,在面对以后出现的易感因素时也许会引发肺炎。
在猪肺炎巴氏杆菌病的暴发上,荚膜可能是致病因子,但其确切的作用尚不清楚。猪的肺泡巨噬细胞对带有荚膜的微生物表现出很差的吞噬能力(Chung等,1993;Fuentes和Pijoan,1986),另外荚膜也能阻碍猪中性粒细胞捕获细菌(Rimler等,1995)。然而,其抗吞噬作用受到质疑,这被在期望模拟体内环境的限铁性生长条件下产生的荚膜物质极少证明。这些数据可被外推的程度尚不知,因为有关在感染和疾病的不同阶段存在于微环境中的Pm所处的情况知之甚少。在不同的组织内,或甚至在单个组织的不同结构内,生长条件可能显著不同,并且进一步取决于局部出现的宿主细胞损伤程度。
Pm的某些菌株能够引起胸膜炎和脓肿(Pijoan和Fuentes,1987)。能够将这些菌株与低毒力肺炎菌株区别开的因子还未得到明确。然而,一些提议显示PMT或许参与了肺脓肿形成(Ahn等,2008;1wamatsu和Sawada,1
988;Kielstein,1986)。
(Neumann等,1987)。其它的研究人员报道氨气对肺炎支原体和Pm协同感染的猪肺脏病变的发展影响较少,但处于高浓度氨气下的这些猪屠宰体重下降(Andreasen等,2000;Diekman等,1993)。业已经证明:口服内毒素或伏马毒素(可能经污染的饲料),感染Pm后有可能会引发肺炎(Halloy等,
2005a,b)。
6临床症状
6.1渐进性萎缩性鼻炎
仔猪暴发PAR的初期临床症状通常是打喷嚏,但其它可引发急性鼻炎的病原体也会出现同一症状。病猪在整个生长期可能会不断地打喷嚏、发出鼻音、鼻息声,且有不同程度的浆液性至粘液性鼻液,也可见到眼分泌物。因鼻泪管阻塞,PAR或NPAR病猪均可见到从内侧眼角形成的放射状泪斑,但仅在PAR病猪中观察到特征性的鼻出血。PAR的另一个特征是猪到达4~12周龄时鼻变形逐渐明显。PAR最常见的可见病理变化是短颌突出,即上颚比下颚短,导致鼻上翘,鼻背部皮肤通常形成皱折(图1)。当一侧头骨比另一侧头骨发生更严重的变形时,鼻的左右偏差可能会变得更明显(图2)。变形的严重程度变化各异,从很难觉察的歪曲到明显的弯曲不等。鼻变形的发病率不同发病间存在差异,并且不是所有具有明显鼻甲萎缩的猪都会发展
饲养密度高和空气质量差的大型猪群与肺炎的发病率有关(Done1991)。据报道,空气中氨气浓度过高可促进未断奶仔猪因Pm而发生肺部感染
2014年第34卷±鼾u1总∞7期I19
的猪,并且能使原发性支原体病加剧,或发展成猪呼吸道综合征(PRDC)。这些多病因性疾病过程通常会引发高发病率和低死亡率,但能使到达上市体重的时间明显延长和淘汰数增多。临床症状因所感染的病原体和疾病发生的阶段或严重程度的不同而不同,但通常表现为咳嗽、间歇热、精神不振、食欲减退、呼吸困难、心跳加快,重症时耳尖发绀或发紫。更严重的病例和临床症状可能与某些可引发脓肿和胸膜炎的Pm菌株有关。临床上,这种病例与因胸膜肺炎放线菌感染非常相似(见48章)。主要的区别是胸膜肺炎巴氏杆菌很少引起突然死亡。相反,病猪极度消瘦,但能存活较久。6.3败血性巴氏杆菌病
败血性巴氏杆菌病发病急,死亡率5茗~40%,所有年龄段猪均可发生。临床表现为:高热、呼吸困难、呼吸急促、衰竭、咽喉水肿和下领短,当腹部发紫时表明发生了内毒素性休克。
7病理变化
7.1渐进性萎缩性鼻炎
PAR的肉眼病变局限于鼻腔和临近头部的组织,不过在疾病后期,病猪也可能发育迟缓。鼻腹侧和背侧鼻甲骨出现不同程度的萎缩,是本病的特征性病变。在轻度至中度病例中,鼻腹侧卷轴是至今见到的最一贯且最广泛的受感染部位:重症病例可进一步发展为鼻甲的完全缺失和鼻隔膜偏移(图3—7)。
图2临床表现为渐进性萎缩性鼻炎的15周龄患病猪出现严重的鼻左右偏差注:I打于正常的骨发育受破坏头盖骨的解剖学结构明显异常
鼻腔内有脓性渗出物,偶尔伴有出血。
根据发病阶段,在剖检时可观察到急性、亚急性、慢性的组织病理学变化。PAR的主要镜检病变是鼻甲骨的骨小梁被纤维结缔组
织取代(Pedersen和Elling,l984)。观察到的大量破骨细胞引发了此病程。上皮细胞的损伤程度或炎症取决于发病的阶段和是否与支气管败血波氏杆菌混合感染(Duncan等,1966;Elling和Pedersen
骸明显翁二}三睦:仨PA#严重暴发吁,i霞会二]黟生长迟缓和饲料利用率下降。6.2肺炎
肺炎巴氏杆菌病更常发生于生长和肥育年龄段
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2014年第34卷增刊1总207
图518周猪鼻的横切面
注:显示中度但明显的鼻甲骨萎缩
图318周龄猪鼻横切面
注:显示鼻甲骨正常的解剖结构
图618周猪鼻的横切面
注:显示两侧鼻甲骨严重萎缩
●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
图418周猪鼻的横切面
注:鼻甲骨腹侧巷轴轻度变形,较常见
图722周猪鼻的横切面
注:所有鼻甲骨组织完全萎缩,并伴有严重的鼻中隔弯曲
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中的一个致病因子。肉眼可见的病变包括典型的红至灰色实变和细菌性肺炎特征性的卢布腹JJ,Df性分布(图8)。溃疡、胸膜炎和内脏与壁层腹膜的粘连,偶然也会发生心包炎(图9和10)。镜检变化包括呈现支气管和肺泡腔内嗜中性粒细胞浸润特征的化脓性支气管炎、间质增厚。在胸膜炎和脓肿病例中,可见纤维素性化脓性胸膜炎和坏死性化脓区的纤维包囊。其它的病变明显取决于所参与的其它病原体。例如:当有支原体感染时,可见细支气管周围淋巴细胞浸润:而当存在PRRSV感染时,则有可能看到间质性肺炎变化。
7.3败血性巴氏杆菌病
肉眼可见病变可能包括:皮下出血性水肿、淤血和浆膜表面充血,肺脏有不规则的出血性实变,腹腔脏器广泛性充血(Mackie等,1992)。在腹膜和胸膜腔内可能会有纤维蛋白存在。在新生仔猪上曾观察到心外膜广泛性出血。镜检,可见明显的血管内血栓及广泛的血管损伤。在血管内及各个受感染组织内可见细菌。
8诊断
8.1渐进性萎缩性鼻炎
PAR的确诊取决于临床和病理观察和产毒性Pm的确诊。根据典型临床症状可初步诊断为PAR。出现鼻左右侧差和(右)短颌突出的病猪,几乎都有明显的鼻甲萎缩,但
图8肺炎巴氏杆菌病
注:肺脏前腹叶实变,受感染和健康组织之间有一个清楚的界限
单独的鼻变形不是特征性病变。当这些症状不明显或患病率下降(如:经治疗后)时,甚至有经验的人也不能评估活猪的鼻甲萎缩程度。放射线照相术(Done,1976)和电子
计算机X射线断层成像技术术(Magyar等,2003),可以对活猪做出客观的观察结果且无损伤,但病猪需要服用镇静剂或进行保定。通过X射线断层成像技术可显示出在放射线照相术上不明显的更为精细
1985)。常规的猪亚急性病例表现为各种变性的、炎性的、营养不良的、修复过程的混合状态。7.2肺炎
肺部病变呈多样化,因为Pm通常只是综合感染
22
2014年第34卷增刊1总207期
图9在一例胸膜肺炎巴氏杆菌病中,肺脏与胸壁胸膜粘连注:胸膜外观呈干燥的半透明状
的变化。
鼻甲萎缩的发病率和严重程度可通过常规屠宰检查时对鼻甲进行的检查做出充分的评估。鼻应在上第一/第二上臼齿位置进行横切;按此方法切开颅骨可能会产生假阳性结果。萎缩程度可利用多个系统主观地进行评分(Cowart等,1990)。尽管利用同一个系统的不同观察者会得到不同的结果,但主观评分对监测猪群的发病状况和评估治疗效果很有用。已有客观方法能更适合进行数据分析(Gatlin等,1996)。扁桃体和鼻腔的样本应该用于评价是否有产毒Pm存在,以确保诊断的准确性。当第一次检测发现为严重的PAR时,实际上感染可能发生了数周或数个月的时间,且产毒型Pm的证据很难收集到。在这种情况下,建议对受感染不太严重的病猪(通常是日龄较小的猪)进行检测和细菌培养。
扁桃体拭子或活体组织检查可保证Pm的最高分离率(Ackermann等,1994),但鼻拭子就能满足要求。活猪应进行充分的保定,外鼻孔应进行清洗。最好使用软柄棉签以避免因动物突然移动而造成棉拭柄断裂。使用迷你棉签以便于对幼龄仔猪采样。对扁桃体进行采样时,应用棉拭擦拭其表面:或当对鼻腔取样时,用一个棉签轻轻旋转深入鼻腔的两侧进行取样。棉签应在24h内送达实验室(最好在4~8
cc条件下冷藏运输)。最好避免使用营养
性运输介质,因为可造成污染物的快速增长,但灭菌的磷酸盐缓冲盐水可以使用。
Pm的产毒型和非产毒型菌株共享许多交叉反
应的抗原,现在尚无令人满意的血清学检测方法可鉴别仅受产毒型菌株感染的动物。专为此细菌(Bowersock等,1992;Foged等,1988)设计的PMT-特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)可以适用于对血清进行检测,但在自然感染的猪体内,PMT是一种很弱的免疫原,且PMT一特异性抗体通常无法检测到。类毒素疫苗的使用限制了这种方法对无疫苗接种历猪群或检测免疫猪群中疫苗应答反应的诊断价值。
在主动暴发PAR时,幼龄仔猪会出现打喷嚏,但支气管败血性波氏杆菌或细胞肥大病毒感染期间也会出现此症状,两种病原体广泛流行。大白/约克夏种猪的一些品系会自然出现短颌突出,但通常可通过是否出现鼻甲萎缩病变来与PAR进行区分。采用猪圈饲养的母猪和小母猪因经常咬、嚼、玩弄栏杆或饮水器,会导致骨发育不对称,引发下颌的突出下颌骨错位或偏斜。这种情况可能会与PAR导致的面部变形相混肴,特别是日龄较大的猪,但仔细观察后应该可以显示下颚呈不规则的放置而不是鼻子变短或向侧面偏斜。猪群内出现轻微的鼻甲萎缩可能并不代表有PAR,或正在发展为PAR。确诊需要进行细菌培养。8.2肺炎
Pm导致的肺脏病变并不是特征性病变,不能作为确诊的唯一标准。发病史、组织病理学变化、微生物的分离可以用于对初步诊断做出确诊。
最佳的样本包括支气管分泌物拭子、取自正常
2。14年第34卷删I总2071111
23
组织病理学和其它的实验手段来完成。8.3败血性巴氏杆菌病
诊断结果取决于血液和感染组织中Pm的检测结果、是否存在多发性血栓和坏死,以及无其它可引发猝死的病因。
9多杀性巴氏杆菌的特征和鉴定
9.1细菌培养和表型方法
Pm很容易在血琼脂中生长,但非选择性培养基只适用于从正常消毒部位无菌操作取得的样本,如肺脏。对于大部分样本来说,首选是选择性培养基,以防止被其它通常以庞大数量出现的细菌过度生长所掩蔽。选择性培养基的多种配方已经得到应用,但对文献中的研究进行对比后显示:采用改良型奈特培养基(Lariviere等,1993)或KPMD培养基(Ackermann等,1994)进行培养,细菌的分离率最高。deJong和Borst(1985)介绍一种可用于培养同时从猪体内分离到的Pm和支气管败血波氏杆菌的选择性培养基。一旦分离到细菌,可以使用常规的生化试验鉴定可疑菌落。最近,VeraLizarazo等(2008)评估了一些常用于猪Pm分离株鉴定的商业用培养基性能。
Pm的荚膜分型在流行病学调查中非常有用。传统上,使用间接血凝试验对猪Pm进行血清分型(Carter,1955),但透明质酸酶试验(Carter和Rundell,1975)和吖啶黄试验(Carter和
Subronto,1973)是分别用于检测A型和D型的较简单的方法。
将Pm分为PMT阳性或PMT阴性对PAR的至关重要,并且也可能为其它疾病的证明提息。基于毒素在鼠皮肤坏死和致死作用的试能最易于操作,且通过评估在牛胚肺细胞或绿候肾细胞(verocells)上的细胞病变效应证明更为人道(Chanter等,1986;Pennin(.Storm,1984)。现在,基于利用PMT一特异’克隆抗体的ELISA试验以其快速、灵敏、特普遍取代了生物学方法(Bowersock等,19Foged等,1988)。
图10一例胸膜肺炎巴氏杆菌病的肺脏
注:肺前腹面有界限清楚的病变、多发性脓肿和广泛的叶
24
2014年第34卷增刊1总207
9.2
DNA方法
多种用于检测Pm种属特异性PCR方法已经开
发成功,但在猪分离株鉴定上的使用效果评估相对较少(Dziva等,2008)。根据已发表的报道,Townsend等(1998a)以预测的酯酶/脂肪酶kmtl基因为目标的PCR方法,因其具有高度的灵敏性和特异性均而似乎得到了最为广泛的应用。kmtl基因也已被成功地用作环介导型等温扩增技术中的目标(Sun等,2010)。这种易于损伤的方法具有可在田间用作筛选方法的潜力,因为试验中无需热循环仪,且扩增产物无需电泳即可直接看到。
一个多重的荚膜PCR方法(Townsend等,2001)已广泛地取代了血清学分型方法。它与血清学检测结果具有高度的相关性,但除抗原上相关的A型和F型外,它们采用PCR分型技术被证明更为准确。由于Pm在培养基上进行传代培养时荚膜材料会经常减少或完全丢失,所以用PCR方法比用血清学方法能检查到更多的分离株。然而,由于引物点突变或DNA序列中其它较小的变化使荚膜合成失败的菌株可能会导致PCR方法出现假阳性结果。
许多基于DNA探针(Kamps等,1990;Register等,1998)或PCR试验(KamP等,1996:L1chtenstelger等,1996;Nagal等,1994)的分析方法在检测猪产毒性猪分离株上效果良好。可同时检测支气管败血波氏杆菌和Pm产毒及不产毒菌株的多重PCR似乎也有望用于诊断实验室(Register和DeJong2006)。
(Nielsen等,1991;Petersen等,1991)或在两个关键位点上用氨基酸取代的基因修饰方法(To等,2005),已经开发出可产生重组无毒性PMT的方法。重要的是仔猪在极小的时候能够受到母猪初乳的保护,因为感染通常发生在出生后的头数周内。母猪先在分娩前4~8周随后再在2—4周接种疫苗,是一种控制本病的有效手段。PAR疫苗通常包含支气管败血波氏杆菌和Pm,以防止这两种病原体的混合感染。接种疫苗不能提供消除性免疫,但可降低病原体的负荷量,并可明显减少或消除由PAR引起的临床症状(Riising等,2002)。10.2肺炎
鉴别免疫或免疫应答反应对防止猪肺炎巴氏杆菌病的重要性难以确定。对注射和喷雾途径接种疫苗后效果的对比研究表明:呼吸道的黏膜免疫应答反应对清除病原微生物和防止肺部产生病变极为重要(M
n
ller等,2000)。大部分致力于肺炎巴氏杆
菌病的疫苗均是在除猪以外的宿主上完成的。缺少一个可靠的猪肺病模型使得疫苗的效果很难进行评估。就抵御由Pm引起的肺炎而言,母源免疫可能不如获得性免疫应答那样重要,因为本病是典型的大日龄猪病。总的来说,疫苗在控制猪肺炎巴氏杆菌病上的效果令人怀疑。
11预防和控制
10免疫力
11.1渐进性萎缩性鼻炎
1
0.1进行性萎缩性鼻炎
PMT是PAR的主要保护性抗原,单独使用PMT
要有效地治疗PAR需要对饲养管理、环境、化药治疗方案和免疫接种程序进行精心的组织。同样,没有一个单一的方法能适用于所有受感染的猪。治疗的总体目标是一举三得:第一个目标是通过母猪接种疫苗,饲料内给药和仔猪抗生素治疗,降低Pm在幼龄猪(无论是伴有或未伴有支气管败血波氏杆菌混合感染)中的流行性和负荷量;第二个目标是治疗正患有急性鼻炎的生长猪,以减少感染和减轻发育不良的严重程度,同时维持猪进行有效的生长和饲料利用。最后是控制猪舍、通风和饲养管理,以改善整体环境条件。
为了降低经母猪发生的鼻部感染的发病率和严
类毒素可减轻相关病变(Foged等,1989)。被动传递实验和仔猪从免疫母猪获得的被动抗体保护(Foged等,1989)证明,抗体在免疫防御系统中似乎非常重要(Chanter和Rutter1990)。用Pm产毒型菌株制成的菌苗能够诱导机体产生抗体,但效果各异,因为它们经常无法诱发足够的毒素特异性抗体(Chanter和Rutter1990)。因此,添加了类毒素的疫苗免疫效果优于单独使用的菌苗。由于PMT难以大量纯化和致弱,研究人员通过基因切除法
2m4mBM囊增刊1甚拼期I25
适当的通风率以降低空气中细菌、有害气体和灰尘的水平。延长母猪的使用日龄以避免新引进大量感
重性,母猪饲料可在妊娠最后一个月时添加药物。应用最广泛的药物是磺胺类和四环素。据报道:支气管败血波氏杆菌和Pm对有些磺胺类药物正逐渐产生耐药,Pm对土霉素和其它一些强效的治疗性抗生素有较高的耐药性(Lizarazo等,2006Tang等,2009)。因此,对从某一特定猪群中分离到的细菌确定抗生素耐药性图谱是明智的。哺乳仔猪最适合药物治疗,方法是在出生后头3~4周龄时战略性地以治疗量注射抗生素。Pm的常用治疗药物是头孢噻呋、恩氟沙星、泰拉霉素。然而,因为耐药性的原因,如果支气管败血波氏杆菌参与了PAR,头孢噻呋应该非首选药物。断奶仔猪的PAR可导致猪在屠宰出现严重的鼻甲萎缩,此病通过在断奶期和(或)生长期日粮中添加药物或在饮水内加入抗生素得到一定程度的控制。在应对主动发生的PAR时,这种药物治疗方法还有助于维持动物的生长和饲料转化率。在环境条件和管理措施得到改善并且采用免疫接种时,药物治疗是最有效的。
母猪接种疫苗可在初乳中产生大量的抗PAR母源抗体(Riising等,2002)。所用疫苗通常为含支气管败血杆菌和Pm菌株的联苗。PMT是PAR疫苗中一个重要的组成,那些添加了PMT类毒素的疫苗可产生出色的保护力(Foged等,1989:Hsuan等,2009;Nielsen等,1991;To等,2005)。母猪应在首次产仔前2和6周接种2次疫苗,之后在每次产仔前2周再次进行疫苗接种。由未免疫母猪所产的非免仔猪应在1和4周龄时进行免疫;然而,母源抗体可能会干扰仔猪通过非口服途径进行的免疫接种效果。大龄猪免疫接种无疑会产生强烈的体液免疫反应,但其价值尚有争议,因为感染的影响主要针对日龄较小的猪。
在没有同时意图要加强饲养管理时,决不应采用药物治疗和免疫接种。全进全出制生产系统有利于分娩母猪、断奶仔猪特别是肥猪预防本病。应该降低饲养密度,实施严格的卫生管理措施,并保持
染的母猪。还应采取措施减少仔猪应激因素,如温度变化、寒冷、贼风。清群和重新组群可根除感染;清洁猪群可通过隔离、监控和引进未感染猪群保持无PAR感染。11.2肺炎
使用抗生素治疗肺的Pm感染比较困难,因为药物难以在突变的肺炎性肺脏中达到治疗浓度。最好使用非口服类抗生素,如长效土霉素、氨苄西林、头孢噻呋、恩诺沙星、托拉霉素。由于菌株对抗生素的易感性各异,且最近报道它们对一些抗生素的耐药性有增加趋势(Lizarazo等,2006;Tang等,2009),因此在进行治疗之前应先完成抗茵谱。饲用抗生素,如金霉素,最好用于预防疾病。
在田间条件下,用疫苗预防由Pm引起的肺炎效果令人怀疑。由于肺炎巴氏杆菌性病经常出现在地方性肺炎或PRDC的最后阶段(多病因感染性疾病),通过免疫接种、药物治疗、饲养管理控制原发性病原体,如猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌或PRRSV,可能是控制本病最有效的方法。能够减少相关病原体传播的饲养管理措施,在降低肺炎发病率上可能有价值。这些措施包括早期断奶隔离、全进全出的生产、限制外来猪的引进、确定供种猪场的健康状况、减少混群和分群、减小猪舍和围栏规模以及降低饲养密度。
原题名:Pasteure]]osls(英文)原作者:Karen
B.Register、Susan
L.
Brockmeier、MartenF.de
Jong和CarlosPijoan
26
2014年第34卷增刊1总207
猪巴氏杆菌病
高娃,林靖凯’译自《口纰础彰瓤》第彤版
潘雪男较何闪修图
中图分类号:¥855
文献标识码:A
文章编号:l001.0769(2014J增刊一0014-13
1相关性
肺炎巴氏杆菌病是多杀性巴氏杆菌感染肺脏的1880年,路易斯・巴斯德从禽霍乱病例中分结果,通常是地方性肺炎或猪呼吸道疾病综合征
离到了多杀性巴氏杆菌(Pasteurella
multocida,
(porcine
respiratory
disease
complex,PRDC)的
Pm),从而确认巴氏杆菌属为致病微生物。之后,最后阶段。此综合征是猪,特别是采用全封闭式饲以他的名字命名了这个茵属。多杀性巴氏杆菌被确养的猪最普遍和成本最高的疾病之一。在美国,认为猪呼吸系统疾病的病原体已经超过125年。然肺炎是保育猪和育肥猪死亡的首要原因(USDA,而,由于其可引起猪的渐进性萎缩性鼻炎(Atrophic2007),也是商品猪报废的最常见原因之一(USDA,Rhinitis,PAR)和肺炎,因此此细菌在世界各地持2008)。增重减少及治疗病猪的费用进一步加重了续显著影响着猪的健康。
经济损失。PH是从患有肺炎的肺部分离到的最常猪萎缩性鼻炎的特点是鼻甲骨发育受阻或完全见细菌性病因之一,育肥猪上流行性特别高(Choi消失。1880年弗兰克在德国首次报道了此病,德等,2003;Hansen等,2010)。PM一般很少是猪肺国多个地区流行着此病。此病的病原学经一个多世炎的原发性病因,而是在其它易感的原发性病因病纪的大量反复论证,现在普遍认为严重的且不可逆毒或细菌感染后的继发性感染因子。
的渐进性萎缩性鼻炎是由于多杀性巴氏杆菌的产在东半球的多个国家,在无呼吸道疾病的仔猪毒型菌株或其与支气管败血波氏杆菌(Bordetella及成年猪中出现的零星暴发的致命性、急性败血bronchlseDtlca)(de
Jong禾口Nielsen,1990)混合
症也是由PH引起(Kalorey等,2008;Mackie等,感染引发的。萎缩性鼻炎可能对猪的生长速度和
1992:Townsend等,1998b)。
饲料转化率造成不良影响(Pedersen和Barfod,2病原学
1981:Riising等,2002),不过在自然感染的猪群中观察到了不同的结果(Cowart等,1990:Donk6PH有4个亚种:多杀性、败血性、禽杀性和猫等,2005)。萎缩性鼻炎对全球养猪生产具有重要杀性(tigris)。在猪上分离到的绝大多数是多杀性的经济学意义,中等至严重的暴发可造成严重的亚种,但败血性亚种和禽杀性亚种偶尔也能分离到经济损失(Muirhead
1
979:Pedersen和Nielsen
(Blackall等,2000;Bowles等,2000;Cameron等,1983)。支气管败血波氏杆菌也可以引起幼龄猪的1996;Davies等,2003;Varga,2007)。
鼻炎和鼻甲骨萎缩,并会对猪的生长有轻微的影响,多杀性巴氏杆菌为无运动性的革兰氏阴性杆菌但其引起的鼻甲骨萎缩是可逆性的,即非进行性萎或球杆菌,长约1.0~2.O斗m。首次或低传代菌缩性鼻炎,这与前一种的鼻甲骨萎缩明显不同。
株可能会出现明显的两极着色,在连续传代培养时
14
I捌4年第34卷增刊1总207M
通常看不到这个特征。该菌为兼性厌氧菌,在营养琼脂上的最适生长温度为37cc(98.6下),在血琼脂平板上,它会形成灰色、不溶血的茵落,通常呈粘液样,具有独特的“甜”味。其在麦康凯琼脂上不能生长,对氧化酶和过氧化氢酶反应呈阳性,可产生吲哚。
多杀性巴氏杆菌有A、B、D、E和F5个荚膜血清型(Carter1955;Rimler和Rhoades,1987),其中A和D型在猪的分离株中最常见。呼吸道中的一小部分离菌株无荚膜,因此,未能分型。从患肺炎的猪肺中最常见的培养菌是血清型A,而渐进性萎缩性鼻炎(PAR)最常分离到的是血清型D,但是血清型A或D也可从PAR或患肺炎的肺脏中分离到(Bethe等,2009;Choi等,2001:Davies等,2003;Ewers等,2006:Hoie等,199l:Pijoan等,1983,1984:Varga等,2007)。猪体内也很少能分离到血清型F。引起猪的急性败血性巴氏杆菌病的最常见荚膜血清型是B,但有报道D型和A型也能引起(Kalorey等人2008;Mackie等,1992;汤森等,1998b)。
随后开发出的另一种“菌体”血清分型法能够根据脂多糖(LPS)抗原(Heddleston等,1972)对其进行进一步区分。根据该方法,多杀性巴氏杆菌有16种菌体血清型,分别命名为1~16,常见的是能表达多种血清型的菌株。猪呼吸道内最常检测到的是3、5、12型(Pijoan等,1983;Rimler和Brogden等,1986)。传统上,分离株的鉴别是根据荚膜和菌体进行区分的:但是,选择性基因分型技术越来越多地得到应用,部分原因是在进行分型时很难生产出一致、高品质的、随时可用的试剂。基
于DNA的分型方法具有优秀的鉴别能力,在对疾病进行调查时,这种方法更为实用。多种依据基因组DNA片段模式分析的方法,如限制性核酸内切酶分析(Restriction
EndonucleaseAnalysis,REA)、脉
冲凝胶电泳及核糖体分型,已经应用于猪PH分离株的分型(Dziva等,2008)。随机扩增多态性DNA的聚合酶链反应(PCR)方法显示出良好的应用前景,其对设备和试剂的需求达到了最少的程度。所有这些方法的一个显著的局限性是缺乏标准化和各实验室间的数据难以进行比较。
多位点序列分型法(Multilocus
Sequence
Typing,MLST)是一种基于对从一个特定管家基因的内部短片段获得的DNA序列进行分型的方法,它
已经在许多致病性细菌的分型中取代了其它方法。
MLST能够产生明确和客观的结果,容易进行评估、比较和存档。最近,Subaaharan等(2010)介绍了禽PH分离株的MLST方法,这种方法具有高度的识别力,并能预测种属结构(该结果与选择性分型方法一致)。虽然尚未利用猪的多杀性巴氏杆菌分离株进行评估,但作者提议将此方法作为PH分型的“黄金标准”。
目前,只有一个注释基因序列,即禽霍乱菌株PM70(May等,2001)可被Pm利用。PM70基因组长度约2.25Hb,且G+C占41茗。根据预测,可编码约2000个基因产品,其中104个可能会产生毒力。546编码区没有显示有生理功能,这表明距我们对于PM70生物学的了解有相当大的差距。研究人员对PM70和多种非猪源性菌株进行了全基因组研究,以监测在模拟体内环境条件的多种不同情况
2们4年第34尝增刊1总研期I
15
下基因表达上的差异。这些数据与Pm引起的猪病之间的相关性尚不明确。
1993)。Pm可以在一个猪群内存在几个月甚至是几年,有时很少表现出患病迹象。有人指出疾病的传播与受到污染的传染媒介或中间宿主有关(Goodwin等,1990)。有证据表明:可感染禽、牛、绵羊、猪的菌株偶尔出现种间传播(Davies等,2004)。通常,老鼠、猫、狗等Pm的普通携带者应被认为是猪的潜在传染源。健康的人携带者是否能将Pm传播给猪尚不清楚。
应用分子分型技术能够更好地了解猪Pm的流行病学,但是各研究之间的对比存在问题,因为目前缺乏被广泛接受的标准化方法,同时许多研究未能提供多样性的定量测定方法。然而,猪肺炎菌株的基因多样性似乎很有限。在封锁繁育或很少引种的猪场中,通常仅存在一个或少量的菌株,不过不同猪场中的菌株有差异(Blackall等,2000;Marois等,
2009;R6
3公共卫生
Pm是一种重要的人畜共患病原体,许多因动物咬伤或抓伤后引起的人感染也与Pm有关。猫和狗是主要的来源,但也有报道人被猪、兔、老鼠以及各种野生动物咬伤后发生了感染(Holst等,1992:Hubbert和Rosen,1970:Mi9110re等,2009)。人巴氏杆菌病常表现为皮肤或软组织感染,通常发病快,特征是炎症、肿胀和脓性渗出物。较为严重的表现通常局限于免疫功能低下的患者,如患有败血症、骨髓炎、心内膜炎、肺炎、脑膜炎和腹膜炎的病人。
Pm并非是人上呼吸道中常见的细菌,但经常能从在猪场工作的人和生活在养猪密集区的居民体内分离在遗传学上与从带菌猪中分离到的菌株相同的菌株(Donnio等,1999:Marois等,2009)。大部分人带菌者表现健康,但Pm也可能与急性或慢性呼吸道疾病有关。有人提议将肺炎巴氏杆菌病列为职业病。那些与感染Pm的猪有接触的人应采取适当的防护措施,特别是那些免疫功能低下的人更应注意防范。
bies等,2002;Zhao等,1993)。在有猪
群流动的猪场,多个菌株很可能同时存在(Bowles等,2000)。有假设认为:高致病性菌株优先引起肺炎,但这种假设令人怀疑,因为没有确定出与毒力相关的独特特性,自健康猪和病猪体内分离到的共生菌具有类似的有限程度的遗传异质性(Bethe等,2009:Ewers等,2006)。
只有多个使用DNA分型方法进行的研究评估了与PAR相关的菌株,且这些研究同样记录到了相对有限的遗传多样性。REA和核糖分型的结果显示:在一个猪群中可发现多个PAR菌株,且某一个菌株可以在多个猪群中出现(Bethe等,2009Gardner等,1994:Harel等,1990)。
Pm在4
oc下可在液体或固体培养基上存活大
5
4流仃病字
Pm能从全球各地的众多野生和家养哺乳动物(包括水生哺乳动物)及鸟类中分离到(Smith等,1978)。Pm可引起禽、牛、水牛、猪、羊、兔等暴发急性或慢性疾病。Pm通常是正常茵群的一部分,临床上不表现明显的感染特征,在许多宿主中可使无免疫力的动物暴发疾病。Pm没有已知的环境宿主。
猪Pm的流行病学还不是很清楚。实际上Pm存在于所有猪群中,并且可在健康猪的鼻和扁桃体内检测到。据说Pm可经空气传播,但从患有PAR的肥育猪群中只能回收到少数的气源性Pm(144
约1周,但在1
49
cC时其活力仍可保持数个月,可
用猪粪培养长达6d,用仔猪鼻腔j中洗液培养超过
d;在15。c或更高的温度(Thomson等,1992)下活力最高。附着在微尘颗粒上的细菌,当悬浮于鼻腔冲洗液时活力至少可保持45min。在23cC和相对湿度75茗的旋转气雾室中,Pm的半衰期是
21
CF咖L)
(Bmkbo和Nielsen,1988)。尽管该菌偶尔可能通过悬浮微粒传播,但是鼻一鼻接触可能是最常见的感染途径。Pm可通过垂直传播方式侵入一个猪群,种群可作为细菌的宿主,将疾病快速传播给血清阴性的猪;但在猪场内,绝大多数传播似乎是水平传播(Oritz等,1996:Fablet等,201l;Zhao等,
min(M0ller等,1992)。
适用猪场的多个消毒剂对Pm有杀菌作用,有些在有大量有机物存在时仍可杀灭Pm(Thomson等,2007)。Pm在加热到60。c经10min或在4。c下用0.5%苯酚或0.2%福尔马林溶液经一整夜可被灭活。
16
20f4年第捌麓增刊1总拼期
5发病机理
5.1定植
Pm在完整的呼吸道黏膜内上定植不良(Pedersen和Elling
1984)。使用猪鼻甲渗出液或鼻腔、气管
上皮细胞进行的体外实验表明很少有或无Pm定植(Chung等,1990;Frymus等,1986iJacques等,1988;Nakal等,1988)。
Pm能够与猪呼吸道粘液成分结合(Jacques等,1993;Letellier等,1991)。当粘液的纤毛清除功能受损,细胞外基质中的成分与细菌之间的相互作用可能使其易在黏膜上皮定植。先前已经感染支气管败血波氏杆菌的猪气管环再感染Pm后,Pm的数量要比受到Pm单独感染的支气管环增加好几倍(Duga]等,1992)。当支气管败血波氏杆菌引起粘液聚集和纤毛静止时,Pm与黏膜的结合能力增强。这种现象可在利用从健康和病猪中分离到的代表产毒或不产毒的荚膜A和D型Pm进行的试验中观察到。
猪Pm分离株上的外膜蛋白A和外膜蛋白H已证明具有同源性,这些蛋白被认为或被推测为其它病原体的粘附素(Davies等,2003:Lugtenberg等,1986:Marandi和Mittal,1996)。Pm牛分离株的外膜蛋白A在体外能够介导与组织培养基的粘附,并能粘合真核细胞胞外基质成分(Dabo等,2003),但尚无研究证明外膜蛋白A或外膜蛋白H在猪体内是否可以作为粘附素。
脂多糖(LPS)是细胞外膜的~个主要成分,研究表明其与细菌的粘附有关。来自猪产毒型D型分离株纯合LPS能够附着于猪呼吸道粘液,并阻止该细菌与猪气管环的粘着(Jacques等,1993)。经体外多次传代清除荚膜后,可显著提高附着微生物的数量,这表明D型荚膜可能会干扰细菌与气管的粘附。该作者假设,在感染的初期,生物体表达少量的荚膜物质,从而暴露出参与粘附的不同的隐蔽细胞外膜成分(LPS及或许其它)。随后的一项研究表明,生长在铁离子受限制条件下(如那些在体内遇到的条件)的细胞,被一层较薄的荚膜物质覆盖,并与铁离子供应充足条件下生长的细胞相比,其与猪呼吸道粘液和冷冻猪肺和气管切片的附着能力均较强烈(Jacques等,1994)。
1
Pm的许多分离株均有血凝活性,但与体外粘附或体内定植无关(Fortin和Jacques
1987;
Pijoan和Trigo,1990:Vena等,1991)。同样,
许多产毒和不产毒的A型和D型荚膜菌株均有
茵毛,但似乎在与猪源细胞或组织的粘附中不起任何作用(Isaacson和Trigo,1995;Pijoan和
Trigo,1990)。
在肺泡水平上,上呼吸道无粘液纤毛生产系统,因此吞噬细胞、抗菌肽、补体、先天免疫防御机制在这一部位发挥着重要作用。这种差异,以及PAR与上呼吸道内的产毒型D型菌株、肺炎与肺泡内非产毒型A型菌株的总体相关性表明:两种荚膜型菌株的定植机制可能有所不同。Vena等(1991)报道:与D型菌株相比,A型菌株优先结合猪原发性肺细胞培养物。但很少有其它的研究证明不同荚膜型居住采取不同的粘附方式(Dugal等,199LFrymus等,
1
986:Letellier等,1991:Pijoan和Trigo,
1990)。其它研究很少有证据可证明具有不同荚膜类型的菌株采用明显不同的粘附策略,也没有菌株毒性和不同粘附方式之间关系的报道。有趣的是,在一项针对158株猪分离株进行的研究中,Davies等发现不管菌株属于哪种荚膜型,大部分肺炎分离株共享外膜蛋白,而PAR分离株则不同。然而,尚不知外膜蛋白上的任何差异是否在细菌的粘附或定植上发挥着一定的作用。
扁桃体,特别是扁桃体隐窝似乎是猪Pm侵入的首选位置,并且可能保护着细菌免受炎症细胞的作用,或发挥着生理屏障作用以防止细菌被吞噬(Ackermann等,1994)。有报道称:在没有黏膜损伤和长达60d的感染后,A型和D型菌株能够在实验性受感染猪的扁桃体内定植(Ono等,2003;Pijoan和Trigo,1990)。该细菌产物对在这一位点定植的必要性尚不得而知,但扁桃体可能作为细菌的储库,当上呼吸道或下呼吸道的先天防御系统功能变弱或丧失时,能够引发PRA或肺炎的菌株随后进行传播。
5.2渐进性萎缩性鼻炎
猪自然感染PAR常见的诱发因素是先感染支气管败血性博德特氏杆菌(Pedersen和Barfod,981)。能够促进Pm定植的机理还没有得到证实,但由能够引起纤毛停滞和黏膜上皮细胞损坏的支气
2Ⅲ4年第3a捌鼾u1总207
17
管败血波氏杆菌释放的气管细胞毒素可能起着主要作用(Dugal等,1992;Flak等,2000)。由支气管败血波氏杆菌产生的其它毒素和效应因子也可能发挥一定的作用(见49章)。
Pm的146一K脱氧核苷蛋白毒素简称为Pm毒素
(PmToxin,PMT),是PAR发病机理中重要的致病因
在出生后几周内感染产毒性Pm的猪会受到PAR最严重的影响,但这些感染在迟到16周后才发生轻度或中度的鼻甲病变((Rutter等,1984)。显然,当健康的3月龄猪进入一个正发生严重疾病的猪场时,该猪能够出现PAR(Nielsen等,1976)。疾病的严重程度与猪的日龄有关,这部分可能与猪成熟时鼻腔内粘液素的数量和类型以及上皮层内细胞分布改变有一定的关系(Larochelle和Martineau—Doiz垂,1990,1991)。气源性污染物对幼龄猪的影响可能是最大的(Robertson等,1990)。
PAR可能会影响猪的采食量,因为患有急性鼻炎的仔猪采食困难,并逐渐消瘦和衰弱。耳廓受损的生长育肥猪采食量也可能减少。5.3肺炎
Pm能引发肺炎的毒力因子尚不清楚,并且因肺脏内所存在的其它病原体的种类和数量的不同可能有所不同。没有确切的证据说明PMT的作用,但它的重要性依然没有得到解决。Pijoan等最先从肺脏分离到产毒菌株,之后一些研究人员报道从肺脏分离到极高比例的产毒菌株(Hoie等,1991;1wamatsu和Sawada,1988),有时优先会引发急性病例(Kielstein
1986)。然而,非产毒型菌株在肺
脏中占据很大的比例,并且对它们总体比例上的变化没有一致的证据。
与其它呼吸系统疾病病原体并发感染是引起猪肺炎巴氏杆菌病的最重要因素。涉及的病原体包括猪肺炎支原体(Carvalho等,1997;Fuentes和Pijoan,1987)和猪伪狂犬病病毒(Carvalho等,1997:Fuentes和Pijoan,1987);业已证实与猪瘟疫苗具有协同效应(Pijoan和Ochoal978)。与胸膜肺炎放线杆菌并发感染或许通过干扰了猪肺泡巨噬细胞的吞噬和杀灭细菌的能力而可促进PH在肺部的定植(Chung等,1993),但随后发生的疾病可能没有胸膜肺炎放线茵单独感染的那样严重(Little和Harding,1980)。猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)似乎单独不会干扰PH,但在先感染PRRSV和支气管败血波氏杆菌的情况下,导致随后感染的非产毒型Pm在肺部定植并引起肺炎(Brockmeier等,2001:Carvalho等,1997)。先前仅感染支气管败
子。猪经鼻内或各种非肠道途径摄入PMT,可导致渐进性的鼻变短和鼻甲萎缩(1l’ina和Zasukhin,1975)。PMT可引起鼻甲、肝脏、泌尿道产生特征是退行性和增生性变化的病变。该毒素能够干扰鼻甲正常的骨再生和骨形成(Dominick和Rimler,1988:Foged等,1987:Martlneau—D01z芭鲁笋,1990),并能减少猪长骨骨骺区(Ackermann等,1996),因而也许会产生与PAR有关的生长减慢。当产毒型菌株在鼻腔内繁殖时,PMT可能直接侵袭鼻甲,但系统性的作用能力表明PMT也可能通过细菌在扁桃体或其它解剖部位的定植发挥作用。
PMT能够干扰G蛋白和Rho依赖型信号转导通路,并可刺激有丝分裂(Lax等,2004))。生物活性区域位于C末端,而细胞结合和(或)内域似乎位于N末端(Busch等,2001;Pullinger等,2001
o
PMT由toxA基因编码(Petersen和Foged,1989),基因的G+C含量与PH基因组有显著的不同(May等,2001),表明它可能是通过水平传播获得。Pullinger等(2004)完成的进一步研究表明该基因位于可诱导的原噬茵体内。PMT缺乏一个典型的信号序列,在体外生长期间不分泌,从而产生以下建议:像其它细菌毒素一样,由通过接触宿主细胞或通过在体内遭遇到的某些环境因子激发的噬菌体诱导型细胞溶解是输出的机理。噬茵体介导的转导能潜在地引起PH无毒株(甚至是其它细菌)获得和表达toxA,但这是否会发生尚不清楚。
一些环境、管理、饲养因素能够影响PAR的发生和出现(Penny,1977)。通常,更严重的疾病是因为与室内集约化生产系统的高饲养密度、卫生条件差和通风不良有关。暴露在高浓度的粉尘和氨气下可促进PH在上呼吸道内的定植或(和)加重病情(Andreasen等,2000:Hamilton等,1999)。持续不断的养猪和频繁的转群及混群也是诱发因素。
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图1临床表现为渐进性萎缩性鼻炎的17周龄患病猪出现明显的短颌突出,鼻背部皮肤褶皱和泪斑
血波氏杆菌,可导致Pm在鼻腔和扁桃体内的定植,但不会产生明显的病变,这可作为健康带菌漏检猪的一种检测方法。扁桃体内长期携带非产毒性菌株,在面对以后出现的易感因素时也许会引发肺炎。
在猪肺炎巴氏杆菌病的暴发上,荚膜可能是致病因子,但其确切的作用尚不清楚。猪的肺泡巨噬细胞对带有荚膜的微生物表现出很差的吞噬能力(Chung等,1993;Fuentes和Pijoan,1986),另外荚膜也能阻碍猪中性粒细胞捕获细菌(Rimler等,1995)。然而,其抗吞噬作用受到质疑,这被在期望模拟体内环境的限铁性生长条件下产生的荚膜物质极少证明。这些数据可被外推的程度尚不知,因为有关在感染和疾病的不同阶段存在于微环境中的Pm所处的情况知之甚少。在不同的组织内,或甚至在单个组织的不同结构内,生长条件可能显著不同,并且进一步取决于局部出现的宿主细胞损伤程度。
Pm的某些菌株能够引起胸膜炎和脓肿(Pijoan和Fuentes,1987)。能够将这些菌株与低毒力肺炎菌株区别开的因子还未得到明确。然而,一些提议显示PMT或许参与了肺脓肿形成(Ahn等,2008;1wamatsu和Sawada,1
988;Kielstein,1986)。
(Neumann等,1987)。其它的研究人员报道氨气对肺炎支原体和Pm协同感染的猪肺脏病变的发展影响较少,但处于高浓度氨气下的这些猪屠宰体重下降(Andreasen等,2000;Diekman等,1993)。业已经证明:口服内毒素或伏马毒素(可能经污染的饲料),感染Pm后有可能会引发肺炎(Halloy等,
2005a,b)。
6临床症状
6.1渐进性萎缩性鼻炎
仔猪暴发PAR的初期临床症状通常是打喷嚏,但其它可引发急性鼻炎的病原体也会出现同一症状。病猪在整个生长期可能会不断地打喷嚏、发出鼻音、鼻息声,且有不同程度的浆液性至粘液性鼻液,也可见到眼分泌物。因鼻泪管阻塞,PAR或NPAR病猪均可见到从内侧眼角形成的放射状泪斑,但仅在PAR病猪中观察到特征性的鼻出血。PAR的另一个特征是猪到达4~12周龄时鼻变形逐渐明显。PAR最常见的可见病理变化是短颌突出,即上颚比下颚短,导致鼻上翘,鼻背部皮肤通常形成皱折(图1)。当一侧头骨比另一侧头骨发生更严重的变形时,鼻的左右偏差可能会变得更明显(图2)。变形的严重程度变化各异,从很难觉察的歪曲到明显的弯曲不等。鼻变形的发病率不同发病间存在差异,并且不是所有具有明显鼻甲萎缩的猪都会发展
饲养密度高和空气质量差的大型猪群与肺炎的发病率有关(Done1991)。据报道,空气中氨气浓度过高可促进未断奶仔猪因Pm而发生肺部感染
2014年第34卷±鼾u1总∞7期I19
的猪,并且能使原发性支原体病加剧,或发展成猪呼吸道综合征(PRDC)。这些多病因性疾病过程通常会引发高发病率和低死亡率,但能使到达上市体重的时间明显延长和淘汰数增多。临床症状因所感染的病原体和疾病发生的阶段或严重程度的不同而不同,但通常表现为咳嗽、间歇热、精神不振、食欲减退、呼吸困难、心跳加快,重症时耳尖发绀或发紫。更严重的病例和临床症状可能与某些可引发脓肿和胸膜炎的Pm菌株有关。临床上,这种病例与因胸膜肺炎放线菌感染非常相似(见48章)。主要的区别是胸膜肺炎巴氏杆菌很少引起突然死亡。相反,病猪极度消瘦,但能存活较久。6.3败血性巴氏杆菌病
败血性巴氏杆菌病发病急,死亡率5茗~40%,所有年龄段猪均可发生。临床表现为:高热、呼吸困难、呼吸急促、衰竭、咽喉水肿和下领短,当腹部发紫时表明发生了内毒素性休克。
7病理变化
7.1渐进性萎缩性鼻炎
PAR的肉眼病变局限于鼻腔和临近头部的组织,不过在疾病后期,病猪也可能发育迟缓。鼻腹侧和背侧鼻甲骨出现不同程度的萎缩,是本病的特征性病变。在轻度至中度病例中,鼻腹侧卷轴是至今见到的最一贯且最广泛的受感染部位:重症病例可进一步发展为鼻甲的完全缺失和鼻隔膜偏移(图3—7)。
图2临床表现为渐进性萎缩性鼻炎的15周龄患病猪出现严重的鼻左右偏差注:I打于正常的骨发育受破坏头盖骨的解剖学结构明显异常
鼻腔内有脓性渗出物,偶尔伴有出血。
根据发病阶段,在剖检时可观察到急性、亚急性、慢性的组织病理学变化。PAR的主要镜检病变是鼻甲骨的骨小梁被纤维结缔组
织取代(Pedersen和Elling,l984)。观察到的大量破骨细胞引发了此病程。上皮细胞的损伤程度或炎症取决于发病的阶段和是否与支气管败血波氏杆菌混合感染(Duncan等,1966;Elling和Pedersen
骸明显翁二}三睦:仨PA#严重暴发吁,i霞会二]黟生长迟缓和饲料利用率下降。6.2肺炎
肺炎巴氏杆菌病更常发生于生长和肥育年龄段
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2014年第34卷增刊1总207
图518周猪鼻的横切面
注:显示中度但明显的鼻甲骨萎缩
图318周龄猪鼻横切面
注:显示鼻甲骨正常的解剖结构
图618周猪鼻的横切面
注:显示两侧鼻甲骨严重萎缩
●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●
图418周猪鼻的横切面
注:鼻甲骨腹侧巷轴轻度变形,较常见
图722周猪鼻的横切面
注:所有鼻甲骨组织完全萎缩,并伴有严重的鼻中隔弯曲
2014年第34卷增刊1总207期}21
中的一个致病因子。肉眼可见的病变包括典型的红至灰色实变和细菌性肺炎特征性的卢布腹JJ,Df性分布(图8)。溃疡、胸膜炎和内脏与壁层腹膜的粘连,偶然也会发生心包炎(图9和10)。镜检变化包括呈现支气管和肺泡腔内嗜中性粒细胞浸润特征的化脓性支气管炎、间质增厚。在胸膜炎和脓肿病例中,可见纤维素性化脓性胸膜炎和坏死性化脓区的纤维包囊。其它的病变明显取决于所参与的其它病原体。例如:当有支原体感染时,可见细支气管周围淋巴细胞浸润:而当存在PRRSV感染时,则有可能看到间质性肺炎变化。
7.3败血性巴氏杆菌病
肉眼可见病变可能包括:皮下出血性水肿、淤血和浆膜表面充血,肺脏有不规则的出血性实变,腹腔脏器广泛性充血(Mackie等,1992)。在腹膜和胸膜腔内可能会有纤维蛋白存在。在新生仔猪上曾观察到心外膜广泛性出血。镜检,可见明显的血管内血栓及广泛的血管损伤。在血管内及各个受感染组织内可见细菌。
8诊断
8.1渐进性萎缩性鼻炎
PAR的确诊取决于临床和病理观察和产毒性Pm的确诊。根据典型临床症状可初步诊断为PAR。出现鼻左右侧差和(右)短颌突出的病猪,几乎都有明显的鼻甲萎缩,但
图8肺炎巴氏杆菌病
注:肺脏前腹叶实变,受感染和健康组织之间有一个清楚的界限
单独的鼻变形不是特征性病变。当这些症状不明显或患病率下降(如:经治疗后)时,甚至有经验的人也不能评估活猪的鼻甲萎缩程度。放射线照相术(Done,1976)和电子
计算机X射线断层成像技术术(Magyar等,2003),可以对活猪做出客观的观察结果且无损伤,但病猪需要服用镇静剂或进行保定。通过X射线断层成像技术可显示出在放射线照相术上不明显的更为精细
1985)。常规的猪亚急性病例表现为各种变性的、炎性的、营养不良的、修复过程的混合状态。7.2肺炎
肺部病变呈多样化,因为Pm通常只是综合感染
22
2014年第34卷增刊1总207期
图9在一例胸膜肺炎巴氏杆菌病中,肺脏与胸壁胸膜粘连注:胸膜外观呈干燥的半透明状
的变化。
鼻甲萎缩的发病率和严重程度可通过常规屠宰检查时对鼻甲进行的检查做出充分的评估。鼻应在上第一/第二上臼齿位置进行横切;按此方法切开颅骨可能会产生假阳性结果。萎缩程度可利用多个系统主观地进行评分(Cowart等,1990)。尽管利用同一个系统的不同观察者会得到不同的结果,但主观评分对监测猪群的发病状况和评估治疗效果很有用。已有客观方法能更适合进行数据分析(Gatlin等,1996)。扁桃体和鼻腔的样本应该用于评价是否有产毒Pm存在,以确保诊断的准确性。当第一次检测发现为严重的PAR时,实际上感染可能发生了数周或数个月的时间,且产毒型Pm的证据很难收集到。在这种情况下,建议对受感染不太严重的病猪(通常是日龄较小的猪)进行检测和细菌培养。
扁桃体拭子或活体组织检查可保证Pm的最高分离率(Ackermann等,1994),但鼻拭子就能满足要求。活猪应进行充分的保定,外鼻孔应进行清洗。最好使用软柄棉签以避免因动物突然移动而造成棉拭柄断裂。使用迷你棉签以便于对幼龄仔猪采样。对扁桃体进行采样时,应用棉拭擦拭其表面:或当对鼻腔取样时,用一个棉签轻轻旋转深入鼻腔的两侧进行取样。棉签应在24h内送达实验室(最好在4~8
cc条件下冷藏运输)。最好避免使用营养
性运输介质,因为可造成污染物的快速增长,但灭菌的磷酸盐缓冲盐水可以使用。
Pm的产毒型和非产毒型菌株共享许多交叉反
应的抗原,现在尚无令人满意的血清学检测方法可鉴别仅受产毒型菌株感染的动物。专为此细菌(Bowersock等,1992;Foged等,1988)设计的PMT-特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)可以适用于对血清进行检测,但在自然感染的猪体内,PMT是一种很弱的免疫原,且PMT一特异性抗体通常无法检测到。类毒素疫苗的使用限制了这种方法对无疫苗接种历猪群或检测免疫猪群中疫苗应答反应的诊断价值。
在主动暴发PAR时,幼龄仔猪会出现打喷嚏,但支气管败血性波氏杆菌或细胞肥大病毒感染期间也会出现此症状,两种病原体广泛流行。大白/约克夏种猪的一些品系会自然出现短颌突出,但通常可通过是否出现鼻甲萎缩病变来与PAR进行区分。采用猪圈饲养的母猪和小母猪因经常咬、嚼、玩弄栏杆或饮水器,会导致骨发育不对称,引发下颌的突出下颌骨错位或偏斜。这种情况可能会与PAR导致的面部变形相混肴,特别是日龄较大的猪,但仔细观察后应该可以显示下颚呈不规则的放置而不是鼻子变短或向侧面偏斜。猪群内出现轻微的鼻甲萎缩可能并不代表有PAR,或正在发展为PAR。确诊需要进行细菌培养。8.2肺炎
Pm导致的肺脏病变并不是特征性病变,不能作为确诊的唯一标准。发病史、组织病理学变化、微生物的分离可以用于对初步诊断做出确诊。
最佳的样本包括支气管分泌物拭子、取自正常
2。14年第34卷删I总2071111
23
组织病理学和其它的实验手段来完成。8.3败血性巴氏杆菌病
诊断结果取决于血液和感染组织中Pm的检测结果、是否存在多发性血栓和坏死,以及无其它可引发猝死的病因。
9多杀性巴氏杆菌的特征和鉴定
9.1细菌培养和表型方法
Pm很容易在血琼脂中生长,但非选择性培养基只适用于从正常消毒部位无菌操作取得的样本,如肺脏。对于大部分样本来说,首选是选择性培养基,以防止被其它通常以庞大数量出现的细菌过度生长所掩蔽。选择性培养基的多种配方已经得到应用,但对文献中的研究进行对比后显示:采用改良型奈特培养基(Lariviere等,1993)或KPMD培养基(Ackermann等,1994)进行培养,细菌的分离率最高。deJong和Borst(1985)介绍一种可用于培养同时从猪体内分离到的Pm和支气管败血波氏杆菌的选择性培养基。一旦分离到细菌,可以使用常规的生化试验鉴定可疑菌落。最近,VeraLizarazo等(2008)评估了一些常用于猪Pm分离株鉴定的商业用培养基性能。
Pm的荚膜分型在流行病学调查中非常有用。传统上,使用间接血凝试验对猪Pm进行血清分型(Carter,1955),但透明质酸酶试验(Carter和Rundell,1975)和吖啶黄试验(Carter和
Subronto,1973)是分别用于检测A型和D型的较简单的方法。
将Pm分为PMT阳性或PMT阴性对PAR的至关重要,并且也可能为其它疾病的证明提息。基于毒素在鼠皮肤坏死和致死作用的试能最易于操作,且通过评估在牛胚肺细胞或绿候肾细胞(verocells)上的细胞病变效应证明更为人道(Chanter等,1986;Pennin(.Storm,1984)。现在,基于利用PMT一特异’克隆抗体的ELISA试验以其快速、灵敏、特普遍取代了生物学方法(Bowersock等,19Foged等,1988)。
图10一例胸膜肺炎巴氏杆菌病的肺脏
注:肺前腹面有界限清楚的病变、多发性脓肿和广泛的叶
24
2014年第34卷增刊1总207
9.2
DNA方法
多种用于检测Pm种属特异性PCR方法已经开
发成功,但在猪分离株鉴定上的使用效果评估相对较少(Dziva等,2008)。根据已发表的报道,Townsend等(1998a)以预测的酯酶/脂肪酶kmtl基因为目标的PCR方法,因其具有高度的灵敏性和特异性均而似乎得到了最为广泛的应用。kmtl基因也已被成功地用作环介导型等温扩增技术中的目标(Sun等,2010)。这种易于损伤的方法具有可在田间用作筛选方法的潜力,因为试验中无需热循环仪,且扩增产物无需电泳即可直接看到。
一个多重的荚膜PCR方法(Townsend等,2001)已广泛地取代了血清学分型方法。它与血清学检测结果具有高度的相关性,但除抗原上相关的A型和F型外,它们采用PCR分型技术被证明更为准确。由于Pm在培养基上进行传代培养时荚膜材料会经常减少或完全丢失,所以用PCR方法比用血清学方法能检查到更多的分离株。然而,由于引物点突变或DNA序列中其它较小的变化使荚膜合成失败的菌株可能会导致PCR方法出现假阳性结果。
许多基于DNA探针(Kamps等,1990;Register等,1998)或PCR试验(KamP等,1996:L1chtenstelger等,1996;Nagal等,1994)的分析方法在检测猪产毒性猪分离株上效果良好。可同时检测支气管败血波氏杆菌和Pm产毒及不产毒菌株的多重PCR似乎也有望用于诊断实验室(Register和DeJong2006)。
(Nielsen等,1991;Petersen等,1991)或在两个关键位点上用氨基酸取代的基因修饰方法(To等,2005),已经开发出可产生重组无毒性PMT的方法。重要的是仔猪在极小的时候能够受到母猪初乳的保护,因为感染通常发生在出生后的头数周内。母猪先在分娩前4~8周随后再在2—4周接种疫苗,是一种控制本病的有效手段。PAR疫苗通常包含支气管败血波氏杆菌和Pm,以防止这两种病原体的混合感染。接种疫苗不能提供消除性免疫,但可降低病原体的负荷量,并可明显减少或消除由PAR引起的临床症状(Riising等,2002)。10.2肺炎
鉴别免疫或免疫应答反应对防止猪肺炎巴氏杆菌病的重要性难以确定。对注射和喷雾途径接种疫苗后效果的对比研究表明:呼吸道的黏膜免疫应答反应对清除病原微生物和防止肺部产生病变极为重要(M
n
ller等,2000)。大部分致力于肺炎巴氏杆
菌病的疫苗均是在除猪以外的宿主上完成的。缺少一个可靠的猪肺病模型使得疫苗的效果很难进行评估。就抵御由Pm引起的肺炎而言,母源免疫可能不如获得性免疫应答那样重要,因为本病是典型的大日龄猪病。总的来说,疫苗在控制猪肺炎巴氏杆菌病上的效果令人怀疑。
11预防和控制
10免疫力
11.1渐进性萎缩性鼻炎
1
0.1进行性萎缩性鼻炎
PMT是PAR的主要保护性抗原,单独使用PMT
要有效地治疗PAR需要对饲养管理、环境、化药治疗方案和免疫接种程序进行精心的组织。同样,没有一个单一的方法能适用于所有受感染的猪。治疗的总体目标是一举三得:第一个目标是通过母猪接种疫苗,饲料内给药和仔猪抗生素治疗,降低Pm在幼龄猪(无论是伴有或未伴有支气管败血波氏杆菌混合感染)中的流行性和负荷量;第二个目标是治疗正患有急性鼻炎的生长猪,以减少感染和减轻发育不良的严重程度,同时维持猪进行有效的生长和饲料利用。最后是控制猪舍、通风和饲养管理,以改善整体环境条件。
为了降低经母猪发生的鼻部感染的发病率和严
类毒素可减轻相关病变(Foged等,1989)。被动传递实验和仔猪从免疫母猪获得的被动抗体保护(Foged等,1989)证明,抗体在免疫防御系统中似乎非常重要(Chanter和Rutter1990)。用Pm产毒型菌株制成的菌苗能够诱导机体产生抗体,但效果各异,因为它们经常无法诱发足够的毒素特异性抗体(Chanter和Rutter1990)。因此,添加了类毒素的疫苗免疫效果优于单独使用的菌苗。由于PMT难以大量纯化和致弱,研究人员通过基因切除法
2m4mBM囊增刊1甚拼期I25
适当的通风率以降低空气中细菌、有害气体和灰尘的水平。延长母猪的使用日龄以避免新引进大量感
重性,母猪饲料可在妊娠最后一个月时添加药物。应用最广泛的药物是磺胺类和四环素。据报道:支气管败血波氏杆菌和Pm对有些磺胺类药物正逐渐产生耐药,Pm对土霉素和其它一些强效的治疗性抗生素有较高的耐药性(Lizarazo等,2006Tang等,2009)。因此,对从某一特定猪群中分离到的细菌确定抗生素耐药性图谱是明智的。哺乳仔猪最适合药物治疗,方法是在出生后头3~4周龄时战略性地以治疗量注射抗生素。Pm的常用治疗药物是头孢噻呋、恩氟沙星、泰拉霉素。然而,因为耐药性的原因,如果支气管败血波氏杆菌参与了PAR,头孢噻呋应该非首选药物。断奶仔猪的PAR可导致猪在屠宰出现严重的鼻甲萎缩,此病通过在断奶期和(或)生长期日粮中添加药物或在饮水内加入抗生素得到一定程度的控制。在应对主动发生的PAR时,这种药物治疗方法还有助于维持动物的生长和饲料转化率。在环境条件和管理措施得到改善并且采用免疫接种时,药物治疗是最有效的。
母猪接种疫苗可在初乳中产生大量的抗PAR母源抗体(Riising等,2002)。所用疫苗通常为含支气管败血杆菌和Pm菌株的联苗。PMT是PAR疫苗中一个重要的组成,那些添加了PMT类毒素的疫苗可产生出色的保护力(Foged等,1989:Hsuan等,2009;Nielsen等,1991;To等,2005)。母猪应在首次产仔前2和6周接种2次疫苗,之后在每次产仔前2周再次进行疫苗接种。由未免疫母猪所产的非免仔猪应在1和4周龄时进行免疫;然而,母源抗体可能会干扰仔猪通过非口服途径进行的免疫接种效果。大龄猪免疫接种无疑会产生强烈的体液免疫反应,但其价值尚有争议,因为感染的影响主要针对日龄较小的猪。
在没有同时意图要加强饲养管理时,决不应采用药物治疗和免疫接种。全进全出制生产系统有利于分娩母猪、断奶仔猪特别是肥猪预防本病。应该降低饲养密度,实施严格的卫生管理措施,并保持
染的母猪。还应采取措施减少仔猪应激因素,如温度变化、寒冷、贼风。清群和重新组群可根除感染;清洁猪群可通过隔离、监控和引进未感染猪群保持无PAR感染。11.2肺炎
使用抗生素治疗肺的Pm感染比较困难,因为药物难以在突变的肺炎性肺脏中达到治疗浓度。最好使用非口服类抗生素,如长效土霉素、氨苄西林、头孢噻呋、恩诺沙星、托拉霉素。由于菌株对抗生素的易感性各异,且最近报道它们对一些抗生素的耐药性有增加趋势(Lizarazo等,2006;Tang等,2009),因此在进行治疗之前应先完成抗茵谱。饲用抗生素,如金霉素,最好用于预防疾病。
在田间条件下,用疫苗预防由Pm引起的肺炎效果令人怀疑。由于肺炎巴氏杆菌性病经常出现在地方性肺炎或PRDC的最后阶段(多病因感染性疾病),通过免疫接种、药物治疗、饲养管理控制原发性病原体,如猪肺炎支原体、支气管败血波氏杆菌或PRRSV,可能是控制本病最有效的方法。能够减少相关病原体传播的饲养管理措施,在降低肺炎发病率上可能有价值。这些措施包括早期断奶隔离、全进全出的生产、限制外来猪的引进、确定供种猪场的健康状况、减少混群和分群、减小猪舍和围栏规模以及降低饲养密度。
原题名:Pasteure]]osls(英文)原作者:Karen
B.Register、Susan
L.
Brockmeier、MartenF.de
Jong和CarlosPijoan
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